专利名称：胸腺素α原基因的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及胸腺素α原基因的新用途，特别是涉及胸腺素α原基因在作为DNA疫苗免疫原性增强佐剂中的应用。
背景技术：
胸腺素α原(Prothymosin α，ProTα)是由109～113个氨基酸残基组成的小分子蛋白。ProTα分子氨基酸残基总数的约50％为酸性氨基酸残基，且成簇分布于ProTα分子的中部，使分子具有很强的亲水性。ProTα分子中不含有分泌信号，而含有由两部分组成的核定位信号，主要分布在核内，与细胞增殖功能有关，血清中仅含有少量ProTα(约占全血ProTα的10％)。大鼠ProTα由111个氨基酸残基组成，人ProTα由110个氨基酸残基组成。人淋巴母细胞(PHA激活的淋巴细胞)膜表面存在着两类ProTα受体，说明ProTα具有免疫调节作用。
1985年，Haritos等发现大鼠ProTα能增强小鼠抗白色念珠菌(Candidaalbicans)感染的能力，后来又发现ProTα能刺激转移抑制因子(MIF)的释放。1987年，Salvin等发现腹腔注射ProTα能增强RF/J小鼠产生抗体的能力，锌能加强这种作用，能使青年大鼠和老年大鼠的细胞免疫和体液免疫都增强。ProTα能延长白血病模型DBA/2小鼠的存活期，当腹腔注射ProTα时，能够增强巨噬细胞、NC细胞、LAK细胞的活性，并诱导IL-2和TNFα的产生，从而产生非特异性肿瘤杀伤作用，同时，诱导肿瘤特异性细胞毒T细胞(CD8+)和辅助性T细胞(CD4+)的特异性抗肿瘤作用。另外，ProTα还具有诱导CD4+T淋巴细胞产生IL-2和IL-2R(IL-2受体)的能力，增强人和小鼠淋巴细胞的MHC II类抗原和mRNA的表达。
DNA疫苗是指携带有抗原蛋白基因及表达必要的调控元件的质粒DNA的表达载体。将其导入到宿主的有机体中，可诱导机体产生免疫应答，达到免疫的目地。这种方法与传统的活病毒疫苗或亚单位疫苗相比，有如下优点易于构建；规模化生产成本低廉；以天然抗原形式被免疫系统识别，可诱导产生细胞和体液免疫；可诱导机体产生长期持久的免疫力；制剂稳定；可组建多价复合疫苗联合免疫。但是，有些抗原基因的免疫原性比较弱，单独注射这些疫苗不能诱发足够的保护性免疫。因此，寻找合适的DNA疫苗佐剂，提高免疫反应及其免疫效果，意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供胸腺素α原基因在作为DNA疫苗免疫原性增强佐剂中的应用。
本发明发明人的实验证实，ProTα能够显著改善动物对DNA疫苗的反应性，可以用作DNA疫苗免疫原性增强佐剂。
在实际应用中，胸腺素α原基因的来源是广泛的，可以是人源的，也可以是鼠源的，还可以是其它动物来源的。胸腺素α原基因与DNA疫苗的基因可以存在于不同的重组质粒中，使用时联合注射，也可以使胸腺素α原基因与DNA疫苗的基因融合，形成一个重组质粒，使用起来会更方便。当然，在制备该佐剂时，也不排除添加其它药学上可接受的辅料及载体。
胸腺素α原基因可以使各种DNA疫苗免疫原性得到增强，具有广谱性，是一种不可多得的DNA疫苗免疫原性增强佐剂，在DNA疫苗的生产和应用中意义重大。
图1为质粒pThα和TLH的酶切鉴定图谱。
图2为质粒pS2S的酶切鉴定图谱。
具体实施例方式
实施例1质粒的制备1、含有胸腺素α原基因的重组质粒pThα的构建使用上游引物5’cgcggatccatgtctgatgcagctgtagatacc-3’(BamHI)，下游引物5’ccggaattcgtc atcctcgtcggtcttctg-3’(EcoRI)，以人胎肝cDNA文库为模板，扩增胸腺素α原基因(1)95℃，5分钟；(2)95℃，30秒，55℃，20秒，72℃，30秒，25个循环；(3)72℃，5分钟。PCR产物经凝胶电泳后回收，再用KpnI和EcoRI酶切得到的基因片段，将其克隆入同样酶切的质粒载体pcDNA3(Invitrogen，USA)上，得到重组质粒pThα。转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆，经DNA序列分析正确(序列1)，其编码的氨基酸序列为序列表中的序列2。该质粒的酶切鉴定图谱如图2所示，图中1为pTha，约330bp；2和4分别为Marker DL-2000和DL-15000。
2、含有乙肝表面抗原基因的重组质粒pS2S的构建使用上游引物B2 5’GGAAGATCTCAGGCCATG CAGTGGA ATT-3’(BglII)；和下游引物S3 5’AGGGGGCCCAGCCCATGAAGTTTAGGGAA-3’(ApaI)，从HBV2质粒(张彤等；中华微生物和免疫学杂志。1997，16(6)421-424)扩增出乙肝表面抗原中蛋白(preS2.S)基因片段，PCR程序如下(1)95℃，5分钟；(2)95℃，30秒，58℃，30秒，72℃，50秒，25个循环；(3)72℃，5分钟。PCR产物经凝胶电泳后回收，然后用BamHI和ApaI酶切该基因片段，克隆入pcDNA3(Invitrogen公司)载体的多克隆位点BamHI和ApaI之间，得到重组质粒pS2S。转化大肠杆菌DH5α，挑选正确克隆，经DNA序列分析正确后用于后述研究，其酶切鉴定图谱如图1所示，图中1为pS2S，约841bp；2为Marker DL-2000.
3、含有胸腺素α原和乙肝表面抗原融合基因的重组质粒TLH的构建用于构建融合基因的pS2S引物上游引物S1 5’CCCaagcttCA GG C CA TG CAGTGGAATT-3’(HindIII)，下游引物S25’TTTTCCTTTTgcggccgc AGCCCAT GAA GTTTAGG GA-3’(NotI)，以HBV2质粒为模板，其PCR程序如下(1)95℃，5分钟；(2)95℃，30秒，55℃，30秒，72℃，55秒，25个循环；(3)72℃，5分钟。PCR产物经凝胶电泳后回收，然后使用HindIII和NotI双酶切该基因片段，与Linker(其核苷酸及编码蛋白的序列分别为序列表中的序列3和序列4)一起在T4连接酶的作用下，克隆入胸腺素α原基因下游，形成pTha-Linker--pS2S重组质粒，命名为TLH。Linker上游引物5’gaattcttcggtggcggctccggtgggggca-3’(EcoRI)。下游引物5’gaggccaccgccgaggccacccccgttcgaa-3’(HindIII)。Linker的两条引物为互补序列，只须经过变性和复性过程，即可形成带酶切位点双链片段。其PCR程序如下95℃，5分钟；50℃，50分钟即可。该质粒的酶切鉴定图谱如图2所示，图中3为TLH切出pTha和pS2S两个片段；2和4分别为Marker DL-2000和DL-15000。
4、含有疟疾多表位抗原基因的重组质粒AWTE的构建使用上游引物5’cgcggatccatgaacgctaaccctgg tgat-3’(BamHI)，下游引物5’agggggcccttacgatggtaccacaacgtt-3’(ApaI)。从CTB-AWTE重组质粒上扩增AWTE片段(钟辉等。科学通报.43(13)1417-1422.)。其PCR程序如下(1)95℃，5分钟；(2)95℃，30秒，45℃，20秒，72℃，30秒，5个循环；(3)95℃，30秒，55℃，20秒，72℃，30秒，25个循环，(4)72℃，5分钟。PCR产物经凝胶电泳后回收，然后使用(BamHI)和ApaI双酶切该基因片段，将其克隆入同样酶切的质粒载体pcDNA3(Invitrogen，USA)上，得到重组质粒AWTE。转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性克隆，经DNA序列分析正确。
5、含有胸腺素α原与疟疾多表位抗原融合基因的重组质粒pTha-ATWE的构建使用疟疾多表位抗原基因(AWTE)的上游引物5’ccggaattcatgaacgctaaccctggtgat-3’(EcoRI)，下游引物5’agggggcccttac gatggtaccacaacgtt-3’(ApaI)，从pCMV-AWTE重组质粒(钟辉等。科学通报.43(13)1417-1422.)上扩增AWTE片段。其PCR程序如下(1)95℃，5分钟；(2)95℃，30秒，45℃，20秒，72℃，30秒，5个循环；(3)95℃，30秒，55℃，20秒，72℃，30秒，25个循环，(4)72℃，5分钟，PCR产物经凝胶电泳后回收，然后使用(EcoRI)和ApaI双酶切该基因片段，将其克隆入pTha基因下游，构成融合基因重组质粒pTha-ATWE。
实施例2胸腺素α原基因对乙肝病毒表面抗原DNA疫苗免疫原性的增强作用小鼠C57BL/6，雌性，4-6周龄(19-21g)。
分组(1)空载体组(pcDNA3)，6只；(2)乙肝蛋白疫苗组(rHBsAg)，6只；(3)pS2S组，30只；(4)pS2S+pThα佐剂组，10只；(5)TLH(乙肝表面抗原基因与胸腺素α原基因融合)质粒组，6只。
免疫方案(1)空载体组pcDNA3200ug/只/次；(2)乙肝蛋白疫苗组(rHBsAg)400ng/只/次；(3)pS2S组100ug pS2S+100ug pcDNA3/只/次；(4)pS2S+pThα佐剂组100ug pS2S+100ug pThα。(5)TLH质粒组100ug TLH。
在小鼠麻醉状态下(75mg/kg sodium pentobarbital IP)，在小鼠的两后肢的股四头肌肉各注射50ul样品，然后用活体基因导入仪(浙江新芝公司生产)，在注射部位进行电击，电压为120V/cm，时长2ms，2次。
免疫次数共两次，初次免疫后，在第14天加强免疫一次。初次免疫后，每隔2周，取血检测抗HBsAg抗体产生的滴度。ELISPOT检测IFN-γ产生情况。
结果表明，含有胸腺素α原质粒佐剂的第4组初次免疫后2周的HBsAb阳性率为50％，加强免疫后2周，HBsAb阳性率为80％；第5组初次免疫后2周的HBsAb阳性率为30％，加强免疫后2周，HBsAb阳性率为60％；而未加佐剂的第3组初次免疫后2周的HBsAb阳性率为10％，加强免疫后2周，HBsAb阳性率为27％。14周后，第4、5组的HBsAb阳性率均为100％，而未加佐剂的第3组的HBsAb阳性率仅为50％。ELISPOT检测结果第4组产生的IFN-γ是第3组的2-3倍。因此，可以明显看出，胸腺素α原无论是以融合基因的形式还是以单独质粒的形式，均显著增强乙肝表面抗原质粒在小鼠激发的体液免疫和细胞免疫反应。
实施例3、胸腺素α原基因对疟疾多表位抗原DNA疫苗免疫原性的增强作用小鼠Balb/c，雌性，4-6周龄(19-21g)。
分组(1)空载体组(pcDNA3)，6只；(2)AWTE质粒组，6只；(3)AWTE质粒+胸腺素α原(pThα)质粒佐剂组，6只；(4)pTha-ATWE(疟疾多表位抗原基因与胸腺素α原基因融合)质粒组，6只。
免疫方案(1)空载体组pcDNA3 200ug/只/次；(2)AWTE质粒组100ug AWTE+100ug pcDNA3/只/次；(3)AWTE质粒+胸腺素α原质粒佐剂组100ug AWTE+100ugpThα。(4)pTha-ATWE质粒组100ug pTha-ATWE。
在小鼠麻醉状态下(75mg/kg sodium pentobarbital IP)，在小鼠的两后肢的股四头肌肉各注射50ul样品，然后用活体基因导入仪(浙江新芝公司生产)，在注射部位进行电击，电压为120V/cm，时长2ms，2次。免疫次数共两次，初次免疫后，在第14天加强免疫一次。初次免疫后，每隔2周，取血检测抗AWTE抗体产生的滴度。末次免疫3周后，取脾淋巴细胞进行CTL细胞活性检测。
结果表明，含有胸腺素α原质粒佐剂的第3组初次免疫后2周的AWTE滴度为1∶200，加强免疫后2周，AWTE阳性率为1∶5000；第2组初次免疫后2周的AWTE滴度检测不到，加强免疫后2周，AWTE阳性率为1∶100；第4组初次免疫后2周的AWTE滴度为1∶100，加强免疫后2周，AWTE阳性率为1∶2000。CTL活性检测在效应细胞/靶细胞为100∶1时，第3组为67％，第2组为20％，第4组为52％。可以明显看出，胸腺素α原不论是单独使用，还是以融合基因的形式，均可以显著增强疟疾多表位抗原免疫原性，诱导体液和细胞免疫。
序列表<160>4<210>1<211>333<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>1atgtctgatg cagctgtaga taccagctcc gaaatcacca ccaaggactt aaaggagaag 60aaggaagttg tggaagaggc agaaaatgga agagacgccc ctgctaacgg gaatgctaat120gaggaaaatg gggagcagga ggctgacaat gaggtagacg aagaagagga agaaggtggg180gaggaagagg aggaggaaga agaaggtgat ggtgaggaag aggatggaga tgaagatgag240gaagctgagt cagctacggg caagcgggca gctgaagatg atgaggatga cgatgtcgat300accaataagc agaagaccga cgaggatgac taa 333<210>2<211>110<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>2Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp1 5 10 15Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Gly Arg Asp20 25 30Ala Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Glu Glu Asn Gly Glu Gln Glu Ala35 40 45Asp Asn Glu Val Asp Glu Glu Glu Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Glu50 55 60Glu Glu Glu Glu Gly Asp Gly Glu Glu Glu Gly Gly Asp Glu Asp Glu65 70 75 80Glu Ala Glu Ser Ala Thr Gly Lys Arg Ala Ala Glu Asp Asp Glu Asp85 90 95Asp Asp Val Asp Thr Lys Lys Gln Lys Thr Asp Glu Asp Asp100 105 110<210>3
<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3ttcggtggcg gctccggtgg gggc 24<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly。
权利要求
1.胸腺素α原基因作为DNA疫苗免疫原性增强佐剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述胸腺素α原基因为人胸腺素α原基因。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述胸腺素α原基因与DNA疫苗的基因存在于不同的重组质粒中。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述DNA疫苗为乙肝病毒表面抗原DNA疫苗。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述DNA疫苗为疟疾多表位抗原DNA疫苗。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述胸腺素α原基因与DNA疫苗的基因是融合基因，存在于同一重组质粒中。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述DNA疫苗为乙肝病毒表面抗原DNA疫苗。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述DNA疫苗为疟疾多表位抗原DNA疫苗。
9.胸腺素α原基因在制备DNA疫苗免疫原性增强佐剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了胸腺素α原基因的新用途。本发明发明人的实验证实，ProTα能够显著改善动物对DNA疫苗的反应性，可以用作DNA疫苗免疫原性增强佐剂。胸腺素α原基因可以使乙肝病毒表面抗原DNA疫苗、疟疾多表位抗原DNA疫苗等各种DNA疫苗免疫原性均得到增强，具有广谱性，是一种不可多得的DNA疫苗免疫原性增强佐剂，在DNA疫苗的生产和应用中意义重大。
文档编号A61K48/00GK1806848SQ200510002000
公开日2006年7月26日 申请日期2005年1月17日 优先权日2005年1月17日
发明者马清钧, 靳彦文, 曹诚 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所