专利名称：一种表达trail蛋白质的大肠杆菌在制备肿瘤治疗药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌的医疗用途，具体地说涉及一种表达TRAIL蛋白质的大肠杆菌在制备肿瘤治疗药物中的用途。
背景技术：
肿瘤是严重威胁人类健康的主要疾病，目前在肿瘤治疗上存在两大难题一是肿瘤治疗有效的手段与方法。传统的肿瘤治疗模式如手术切除，放、化疗等，具有治疗效果差，副反应大等缺点，随着分子生物学与基因工程学的发展，出现了许多新的而有效的治疗方法如单克隆抗体，促细胞凋亡因子，血管生成抑制剂，细胞因子及自杀基因等的应用。这些方法的出现，给肿瘤治疗带来了新的契机，同时，也带来了新的问题，即肿瘤治疗上的第二大难题——肿瘤治疗的靶向性问题，如何让新的肿瘤治疗试剂能在肿瘤特定的部位发挥更强大的作用，无疑会给肿瘤治疗带来一个飞跃性的发展。随着对细菌的深入认识，人们发现，很多细菌如梭状芽胞杆菌、双岐杆菌、霍乱弧菌、利斯特菌、沙门菌及大肠杆菌等具有特异的聚集于肿瘤组织，并可在肿瘤组织中生长繁殖的特性，有些细菌还具有抑制肿瘤生长的作用(Pawelek J.M，LowK.B，Bermudes D.Bacteria as tumor-targeting vectors.Lancet Oncol，2003，4548-556.；Zhao Ming，Yang Meng，Xiao Ming，et aI.Tumor-targeting bacterial therapywith amino acid auxotrophs of GFP-expressing Salmonella typhimurium.PNAS，2005，102755-760)。利用这一特性，掀起了一场关于细菌在肿瘤靶向治疗中应用的重大变革。
厌氧菌属的芽胞杆菌、双岐杆菌和兼性厌氧属的沙门氏菌用于肿瘤治疗各有其本身的不足，要么就是毒性太大，要么就是其肿瘤靶向性受到肿瘤大小的限制。所以目前迫切的需要寻找一类即无毒又不受肿瘤大小的限制，同时又具有良好的肿瘤靶向性的细菌用于肿瘤方面的治疗。
大肠杆菌(E.coli)属革兰阴性杆菌，是寄生于人类和动物体内的正常菌群。目前常用的大肠杆菌工程菌主要有DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802、K803等，它们的基因组稳定，遗传背景清楚，更重要的是其无毒，广泛用于基因工程的各个方面，如作为克隆载体或是某些效应基因的表达载体等。大肠杆菌应用于肿瘤的诊断及治疗，除具有细菌本身的优势外，还有其独有的特点首先，大肠杆菌属胞外菌，比胞内菌更易被抗生素清除；其次，非致病性大肠杆菌是无毒的细菌，不须先对细菌进行减毒或弱毒改造即可应用；再次，对大肠杆菌的基因组了解比较全面，改造起来更容易；最后，大肠杆菌是兼性厌氧菌，即可在肿瘤的坏死区域聚集，也可在氧性丰富的部位聚集，在肿瘤的选择方面不受肿瘤大小及肿瘤内是否缺氧的限制。
大肠杆菌也像其它细菌一样，具有肿瘤靶向性，当静脉注射细菌于荷瘤小鼠体内时，在注菌的第二天，即可在肿瘤组织中发现有细菌的存在，但大肠杆菌本身是否具有抑制肿瘤生长的作用则未见报道。研究还发现，原位接种MCF-7肿瘤的小鼠在静脉给予大肠杆菌后，大肠杆菌不仅能到达原位肿瘤处，在对侧的转移瘤处也发现有细菌的存在(Yong A Yu，Shahrokh Shabahang，Tatyana M Timiryasova，et al.Visualization of tumors and metastases in live animalswith bacteria and vaccinia virus encoding light-emitting proteins.nature biotechnology，2004，22(3)313-321)，提示大肠杆菌在肿瘤的诊断与发现上具有不可比拟的优势。
TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand)是新近发现的肿瘤坏死因子(TNF)家族中的一个成员，其在结构上与FasL非常相似，人与鼠的TRAIL分别有281和291个氨基酸，同源性达65％。人TRAIL分子量为32.5kD，为II型跨膜蛋白，由胞浆区(14个氨基酸)，跨膜区(26个氨基酸)和胞膜外区(241个氨基酸)组成。可溶性TRAIL分子(sTrail)由膜外区的95～281位氨基酸组成，参与特异性的受体结合，研究者发现，从95位、104位或114位残基开始构建克隆表达出的蛋白质均具有生物学活性。
TRAIL具有较强的促细胞凋亡作用，体外实验表明，无论是膜结合型还是可溶性的TRAIL，都能迅速诱导表达TRAIL特异受体的细胞发生凋亡，其诱导细胞凋亡是通过与细胞表面的受体结合，通过受体的胞内死亡结构域(death domain，DD)启动细胞凋亡途径。迄今为止，人们已发现TRAIL的5种特异性受体TRAIL-R1(DR4)，TRAIL-R2(DR5)，TRAIL-R3(DcR1)，TRAIL-R4(DcR2)和osteoprotegerin(OPG)。其中，DR4和DR5是2种具有完整胞质区的受体，与TRAIL结合可引起细胞凋亡，而DcR1和DcR2缺少完整的胞内死亡结构域，是2种缺陷型膜受体，同TRAIL结合后不能传递凋亡信号，且可竞争抑制TRAIL诱导细胞凋亡的功能(Sheridan JP，Marsters SA，Pitti RM.Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoyreceptors.Science，1997，277818-821.)。
体外实验证实TRAIL可以杀伤多种肿瘤细胞，如白血病细胞、乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、黑色素瘤细胞，恶性胶质瘤细胞及HIV患者的淋巴细胞等(Griffith T S，Chin W A，Jackson G C.Intracellular regulation of TRAIL-inducedapoptosis in human melanoma cell.J Immunol，1998，161(6)2833～2840)。因此，TRAIL被认为是一种很有前途的广谱抗癌药物。
TRAIL不仅在体外能诱导多种肿瘤细胞凋亡，在小鼠和非人类灵长目类动物的临床前实验中也证实TRAIL能特异性的诱导肿瘤细胞凋亡，且对正常组织和器官无毒副作用。但M.Jo等研究发现，TRAIL在体外能引起人类肝细胞凋亡，而对大鼠、小鼠或恒河猴的肝细胞无毒，TRAIL在人体内是否能引起肝损伤或其他脏器的损伤则尚无定论。故使TRAIL能在特定的部位发挥促肿瘤细胞凋亡的作用具有更为重要的生物学意义。
目前，把大肠杆菌与TRAIL联系起来，利用大肠杆菌的肿瘤靶向性把TRAIL带到肿瘤部位，在特定部位发挥TRAIL的抗肿瘤作用尚无报道。
发明内容
为了使TRAIL能在肿瘤特定的部位发挥其抗肿瘤作用，解决TRAIL对正常组织与器官的毒性作用问题，本发明公开了一种具有肿瘤靶向性的大肠杆菌，该大肠杆菌携带TRAIL基因。
本发明还公开了上述表达TRAIL蛋白质的大肠杆菌在制备肿瘤治疗药物中的用途。
本发明的大肠杆菌包括大肠杆菌各个种及其经过遗传工程改造的大肠杆菌工程菌如DH5α、BL21、JM109等。
本发明的大肠杆菌包含携带有TRAIL基因的载体。其中的TRAIL基因包括TRAIL全长以及可溶性TRAIL(sTrail)的各个片段，包括95～281aa片段及114～281aa片段等。TRAIL全长氨基酸序列如序列表中序列8所示。95～281aa片段及114～281aa片段的氨基酸序列如序列表中序列6和序列7所示。其中携带有TRAIL基因的载体为各种原核表达载体，如pGEX-KG、pET-28a(+)及pBV220等。
本发明所述的肿瘤为各种实体瘤，包括鼠黑色素肿瘤B16-F10-luc-G5、人乳腺癌MCF-7-luc-F5、人肝癌BEL-7405-luc及SMMC-7721-luc、人前列腺癌PC-3、鼠神经胶质瘤C6、鼠膀胱肿瘤MB-49及人纤维肉瘤HT1080等。
本发明的携带TRAIL基因的大肠杆菌的制备方法包括如下步骤1、合成引物，通过PCR反应，制备如上所述的TRAIL全长及sTrail片段；2、将获得的TRAIL全长及sTrail片段克隆入上述原核表达载体，获得重组表达载体；3、将获得的重组表达载体转化上述的大肠杆菌，获得携带TRAIL基因大肠杆菌。
其中获得的重组原核表达载体包括由IPTG诱导表达的GST-sTrail融合蛋白pGEX-sTrail(95～281aa)载体或6His-sTrail融合蛋白pET-sTrail(95～281aa)载体或由温度控制诱导表达非融合蛋白pBV220-sTrail(114～281aa)载体。
本发明公开的携带TRAIL基因的大肠杆菌在制备肿瘤治疗药物中的用途通过如下实验验证。
1、首先制备小鼠肿瘤模型及转移瘤模型，上述模型是通过先培养肿瘤细胞，然后将肿瘤细胞接种小鼠制备的。其中小鼠为BALB/C小鼠和nu/nu裸鼠，肿瘤为上述的各种实体瘤；2、然后构建发光细菌并进行检测，其中发光细菌是通过将发光质粒pXen-1(luxABCDE)转化到大肠杆菌中构建，然后通过IVIS成像系统进行检测；3、观察细菌在动物体内的分布特征及肿瘤定位特性。将上述制备的发光细菌注射荷瘤小鼠，观察到细菌分布于肿瘤组织，细菌可在肿瘤中定位。
4、将上述制备的携带TRAIL基因大肠杆菌尾静脉注射于荷瘤小鼠，观察大肠杆菌对肿瘤生长的作用。实验证明上述大肠杆菌能延缓或抑制肿瘤生长或使肿瘤消失。
5、将上述制备的携带TRAIL基因大肠杆菌注射小鼠转移瘤模型，证明其具有定位于转移瘤的能力。
本发明的携带TRAIL基因大肠杆菌，可以特异性定位于机体肿瘤及转移的肿瘤组织，将TRAIL带到肿瘤特定的部位，发挥抗肿瘤作用。本发明的大肠杆菌加入药学上可接受的辅料，以维持该大肠杆菌的活性及稳定性，可以制备用于肿瘤诊断或治疗的药物。
该药物可以制成适于本发明所述大肠杆菌发挥抗肿瘤作用的各种剂型，如片剂、散剂、胶囊剂、栓剂、注射剂、混悬剂等，优选注射剂。给药途径为口服、肌肉注射、静脉注射等多种，优选静脉注射。
本发明利用大肠杆菌的肿瘤靶向性，把TRAIL带到肿瘤部位，这样解决了TRAIL对正常组织与器官的毒性作用，也使TRAIL能在肿瘤局部发挥更强、更持久的作用，同时发挥了大肠杆菌的抗肿瘤作用，用于制备肿瘤诊断或治疗的药物，具有非常广阔的市场前景。
图1为发光细菌在正常小鼠中的分布图。其中A图是尾静脉注射E.coliDH5α(1×109cfu/100ul/鼠)于正常小鼠10～20分钟后的成像情况，可见发光细菌分布于小鼠的双肺，B图是尾静脉注射E.coli DH5α(1×109cfu/100ul/鼠)3天后的成像情况，可见发光细菌分布于小鼠的肝脏，其他大肠杆菌工程菌在正常小鼠或裸鼠中的分布情况与此相类似。
图2为发光细菌在荷瘤小鼠中的分布图。其中A图是尾静脉注射E.coliDH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠1天时的成像情况，B图是尾静脉注射E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠2天时的成像情况，圈中所示的是小鼠肿瘤接种的部位，即肿瘤接种于小鼠右后腿皮下，发光的区域是发光细菌聚集于肿瘤组织，其他大肠杆菌工程菌在黑色素瘤小鼠或荷有其他实体瘤小鼠中的分布情况与此相类似。
图3为尾静脉注射E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠13天后小鼠的解剖情况。其中A图是不同器官的曝光情况1-肝脏，2-肺脏，3-心脏，4-肾脏，5-脾脏，6-胃及肠，曝光时间300s，所有器官未见有发光细菌的存在。B图是整个肿瘤的曝光情况，曝光时间30s，可见有大量发光细菌的存在。C图是一切为二的肿瘤曝光情况，曝光时间30s，从C图可以看出发光细菌主要存在于肿瘤的边缘区域，在肿瘤中间的坏死区域则存在的很少。其他大肠杆菌工程菌在荷有黑色素瘤或其他实体瘤小鼠中的情况与此相类似。
图4为大肠杆菌DH5α(GST-sTrail)对荷有黑色素瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用图，此工程菌对荷有其他实体瘤小鼠肿瘤的作用与此相类似。
图5为大肠杆菌BL21(6his-sTrail)对荷有黑色素瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用图，此工程菌对荷有其他实体瘤小鼠肿瘤的作用与此相类似。
图6为大肠杆菌JM109(GST-sTrail)对荷有黑色素瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用图，此工程菌对荷有其他实体瘤小鼠肿瘤的作用与此相类似。
图7为注射表达有GST-sTrail的E.coliDH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠28天后肿瘤生长的情况。其中A图为空载体组小鼠即注射E.coliDH5α(pGEX-KG)的小鼠，圈中所示小鼠肿瘤长的很大，且出现溃烂、坏死的现象；B图是实验组小鼠即注射E.coliDH5α(GST-sTrail))的小鼠，圈中所示小鼠肿瘤明显缩小，仅能在皮下看到一小团黑色肿瘤细胞。
图8为E.coli DH5α定位于裸鼠黑色素瘤肺转移灶。其中A图是取自注菌4天后的黑色素瘤转移模型裸鼠的肺脏，可见肺上布满了大大小小的黑色肿瘤转移灶；B图是将左图的肺脏，曝光120s后，可见发光细菌定位于肺脏的肿瘤转移灶，而在没有肿瘤转移灶的其他脏器，则未见有发光细菌的存在。其他大肠杆菌工程菌在转移瘤中的定位情况与此相类似。
具体实施例方式
实施例一 动物肿瘤模型及转移瘤模型的建立一、材料(一)细胞、细菌及培养基肿瘤细胞B16-F10-luc-G5、MCF-7-luc-F5、BEL7405-luc及SMMC7721-luc购于Xenogen公司，PC-3、C6、MB-49及HT1080购于ATCC公司，E.coli DH5α、BL21、JM109市购，本实验室保存。细胞培养基RPMI-1640、DMEM，胎牛血清为Sigma公司产品。细菌培养基LB中各成分蛋白胨、酵母提取物购于OXOID公司，氯化钠为国产分析纯。
(二)质粒、载体及文库pXen-1(luxABCDE)质粒购于Xenogen公司，pGEX-KG、pET-28a(+)及pBV220市购，由本实验室保存，人乳腺cDNA文库购于Clotech公司。
(三)实验动物BALB/C小鼠和nu/nu裸鼠由军事医学科学院动物中心提供。BALB/C小鼠均为雄性，nu/nu BALB/C裸鼠雌雄各半，5～6周龄，体重在20±5g。
(四)仪器设备IVIS成像系统(Xenogen公司)；UV-1601型紫外分光光度计(Bio Rad公司)；Steri-cycle CO2培养箱(Thermo ELECTRON公司)；低温超速离心机(Sigma公司)；OLYMPUS显微镜；PCR仪(Biometra公司)(五)引物设计由军事医学科学院生物工程医学研究所合成以下引物pGEX-TRAIL引物设计如下P1如序列表中序列1所示；P2如序列表中序列2所示。pGEX-sTrail(95～281aa)及pET-sTrail(95～281aa)引物设计如下P1如序列表中序列3所示；P2同TRAIL全长的P2引物设计。酶切位点为BamH1和XholI。
pBV220-sTrail(114～281aa)的引物设计如下P1如序列表中序列4所示；P2如序列表中序列5所示。
酶切位点为EcoRI和PstI。
二、方法(一)肿瘤细胞的培养及制备B16-F10、MCF-7、PC-3、MB-49及HT1080细胞的培养基组成成分与比例为DMEM 90％，FBS 10％。C6神经胶质瘤、BEL7405及SMMC7721细胞的培养基组成成分与比例为RPMI-1640 90％，FBS 10％。将细胞置于37℃ 5％CO2培养箱中培养，根据细胞生长状态进行换液或传代。
常规方法消化、收集细胞，1200rpm离心10min，弃上清，并用生理盐水洗细胞三次，最后以血球计数板计数细胞。最终将细胞重悬于生理盐水中，使其终浓度为5×107cell/ml或5×106cell/ml。
(二)肿瘤模型及转移瘤模型的建立BALB/C小鼠及裸鼠肿瘤模型均采用右后腿皮下接种肿瘤细胞(5×106cell/100μl/鼠)，裸鼠的肿瘤转移模型均采用尾静脉注入肿瘤细胞的方式(5×105cell/100μl/鼠)。
三、结果BALB/C小鼠及裸鼠的肿瘤模型在接种肿瘤细胞的7～10天后即能形成可触及的肿瘤；裸鼠的转移瘤模型在静脉注入肿瘤的细胞的7～14天后形成，转移部位肺转移占80％以上，其他如肝、淋巴结、脂肪、骨等也可有转移灶。
实施例二 发光细菌的构建及检测一、材料同实施例一。
二、方法(一)发光细菌的制备细菌培养基LB按常规配制，大肠杆菌DH5α，BL21，JM109等感受态细胞按常规制备。
按常规方法将pXen-1(luxABCDE)分别转化到大肠杆菌DH5α，BL21，JM109中，涂板后采用IVIS成像系统观察克隆的发光情况及效率。
(二)实验前细菌的处理①在给小鼠注菌的前一天，挑取发光效率较高的单克隆菌落于带有Amp抗性的LB中培养过夜，次日按1∶100转接该菌，继续摇至对数生长中后期即OD600＝0.6～1.0。
②按1OD＝8×108cfu/ml计算菌量，然后离心，去除LB，并用无菌生理盐水彻底洗三遍，最终稀释到1×109cfu/ml。
③从制备好的菌液中取100μl用于小鼠的尾静脉注射。
(三)注菌于荷瘤小鼠当小鼠接种肿瘤7～10天后，以尾静脉注射的方式给小鼠注菌，注菌剂量是1×108cfu/100μl/鼠。
三、结果通过以上方法制备的发光细菌，发光效率较高，注入到动物体内后，可在活体情况下，观察细菌在动物体内的分布，从而追踪细菌的定位(见附图1～2)。
实施例三 细菌在动物体内的分布特征及肿瘤定位特性研究一、材料同实施例一。
二、方法与结果(一)细菌在正常小鼠中分布的特点静脉给予2×109cfu/100μl/鼠或1×109cfu/100μl/鼠细菌于正常小鼠体内的10～20min内，可见细菌分布于肺，然后细菌渐向肝脏聚集，并定位于肝脏(见附图1)。大部分小鼠不能耐受大于1×109cfu/100μl/鼠剂量的细菌，多数小鼠于注菌的第二天死亡，尸检结果显示细菌主要聚集于小鼠的肺脏与肝脏，未死或数天后死亡的小鼠尸检结果则显示细菌只分布于肝脏。静脉注射1×108cfu/100μl/鼠细菌的小鼠则能全部存活，且细菌的分布最终也只分布于肝脏。
(二)细菌在荷瘤小鼠中分布的特点静脉注射1×108cfu/100μl/鼠细菌于荷瘤小鼠，注菌之初，细菌在荷瘤小鼠体内的分布与在正常小鼠中的分布类似，但在注菌的第二天，荷瘤小鼠的肿瘤部位即有光的存在(见附图2)。解剖小鼠，分别取正常组织与肿瘤组织，发现只有肿瘤部位有较强的光，正常组织如肝、肺、心、肾及胃肠等则无光，提示细菌全部分布在肿瘤组织。而且我们也发现，对于较大的肿瘤，细菌主要分布于肿瘤组织的周边，在肿瘤中心的坏死区域，细菌则分布的较少，说明大肠杆菌主要聚集于氧份比较丰富的肿瘤区域(见附图3)。我们的研究还发现，尾静脉注射1×107cfu/100μl/鼠细菌的荷瘤小鼠在注菌的第二天进行解剖后，肿瘤部位就有光的存在，而在正常组织则无光，提示较少的细菌也可在肿瘤中定位。以上的结果也提示转化有pXen-1的大肠杆菌并未改变其肿瘤靶向性。
实施例四 表达载体的构建及诱导表达一、材料同实施例一。
二、方法与结果(一)pGEX-TRAIL、pGEX-sTrail(95～281aa)及pET-sTrail(95～281aa)克隆的构建及诱导表达(1)PCR反应以人乳腺cDNA文库为模板，按下述条件进行PCR反应①94℃预变性1min；②94℃变性1min；③55℃退火1min；④72℃延伸1min；⑤72℃延伸10min；⑥4℃停止②③④循环30次，整个反应体系50μl，所加的酶是Taq DNA聚合酶。
(2)高效表达载体和工程菌的构建将PCR反应产物电泳，回收所需片段，用BamH1和XholI双酶切，电泳后回收Trail或sTrail片段分别克隆入原核表达载体pGEX-KG和pET-28a(+)的BamH1和XholI位点，构建成pGEX-sTrail(95～281aa)及pET-sTrail(95～281aa)重组体，分别转化感受态大肠杆菌DH5α和BL21，在含有抗性筛选标记的LB培养板上挑取单菌落，30℃摇床培养8h后，行菌落PCR，批出目的基因片段的菌株即为阳性克隆。将阳性克隆的菌液转接到LB培养液中，30℃摇床培养过夜，提取质粒，用BamH1和XholI双酶切，进一步鉴定出目的菌株，最后通过DNA测序确定阳性克隆。
(3)目的基因的诱导表达取工程菌单菌落接种于5ml LB培养液(含抗性筛选标记)30℃摇床培养过夜，次日以1∶100的比例转接到新鲜LB中，继续在30℃摇床中培养至对数生长中期(OD600为0.4～0.6)，在终浓度为0.1mmol/l的IPTG诱导下，20℃摇菌14～16h，离心收集菌体，以超声裂菌法裂菌，并行SDS-PAGE分析表达产物及表达形式。
诱导表达后，pGEX-sTrail(95～281aa)SDS-PAGE显示在约46KD处有一条新生条带，而pET-sTrail(95～281aa)SDS-PAGE显示在约26KD处有一条新生条带，表达量均约占菌体总蛋白的60％，表达形式为部分可溶性表达。
(二)pBV220-sTrail(114～281aa)克隆的构建及诱导表达(1)PCR反应以pGEX-sTrail(95～281aa)载体为模板，按上述条件进行PCR反应。
(2)重组载体的构建将PCR反应产物电泳，回收所需片段，并与T载体相连，于16℃连接2～4h。
(3)高效表达载体和工程菌的构建将连接后的T载体用EcoRI和PstI双酶切，电泳后回收sTrail片段克隆入原核表达载体pBV220的EcoRI和PstI位点，构建成pBV220-sTrail重组体，转化感受态大肠杆菌DH5α或JM109，在含Amp的LB培养板上挑取单菌落，30℃摇床培养8h后，行菌落PCR，批出目的基因片段的菌株即为阳性克隆。将阳性克隆的菌液转接到LB培养液中，30℃摇床培养过夜，提取质粒，用EcoRI和PstI双酶切，进一步鉴定出目的菌株，最后通过DNA测序确定阳性克隆。
(4)目的基因的诱导表达取工程菌单菌落接种于5ml LB培养液(含Amp 100mg/L)，30℃摇床培养过夜，次日以1∶100的比例转接到含Amp的培养液中，继续在30℃摇床中培养至对数生长中期(OD600为0.4～0.6)，迅速升温至39℃诱导表达4h，离心收集菌体，以超声裂菌法裂菌，并行SDS-PAGE分析表达产物及表达形式。
诱导表达后，SDS-PAGE显示在约18.5KD处有一条新生条带，表达量约占菌体总蛋白的20％，表达形式为部分可溶性表达。
实施例五 基因工程改造菌对肿瘤生长的作用一、材料同实施例一。
二、方法与结果在接种肿瘤的第7～10天，将15只小鼠随机的分为三组，分别是空白对照组，空载体组及实验组，每组5只。其中空白对照组给予100ul生理盐水/鼠，空载体组分别给予1×108cfu/100μl/鼠DH5α(pGEX-KG)、DH5α(pBV220)、BL21(pET-28a(+))或JM109(pGEX-KG)，实验组对应空载体组分别给予1×108cfu/100μl/鼠DH5α(pGEX-sTrail)、DH5α(pBV220-sTrail)、BL21(pET-sTrail)或JM109(pGEX-sTrail))，观察携带sTrail的E.coli对肿瘤生长的作用。观测的指标是小鼠肿瘤体积的增长变化，肿瘤体积的计算公式为V＝L×W2×0.5(其中L为肿瘤的长轴，W为肿瘤的短轴)。统计方法采用单因素方差分析，进行样本均数的两两比较，方法采用的是Student-Newman-Keuls检验，即q检验。
实验结果表明小鼠肿瘤体积的增长变化在空载体组与对照组间无明显差别(P＞0.05)，但在实验组与空载体组间或是与对照组间则差别明显(P＜0.05)。静脉注射携带sTrail的E.coliDH5α(pGEX-sTrail)的小鼠，其肿瘤生长较空载体组及对照组缓慢，在注菌后的第21天，实验组的5只小鼠中，有3只小鼠的肿瘤体积缩小、变平的较为明显，到了第27天，肿瘤几乎完全消退，仅在小鼠接种肿瘤处的皮下见一点黑色素瘤细胞；另外2只小鼠的肿瘤体积虽未完全消退，但也有减小的趋势，而对照组与空载体组小鼠的肿瘤体积则持续增长，且有的小鼠肿瘤出现溃烂坏死之现象，见附图7。提示体外诱导大肠杆菌表达GST-sTrail，当以静脉注射的方式将细菌打到小鼠体内时，大肠杆菌可以将sTrail特异地带到肿瘤部位，使其发挥强大的抗肿瘤作用。其他携带有sTrail的工程菌如DH5α(pBV220-sTrail)、BL21(pET-sTrail)、JM109(pGEX-sTrail)等也有不同程度的延缓或抑制小鼠各类肿瘤生长的作用(见附图4～6)。
实施例六 基因工程改造菌在转移瘤发现中的应用一、材料同实施例一。
二、方法与结果按上述方法构建裸鼠黑色素瘤、肝癌及乳腺癌等转移瘤模型，1～2周后，按0.1ml/10g腹腔注射底物，活体成像后，可以判断转移瘤模型是否构建成功。
当模型构建成功后，按上述方法，尾静脉注菌，观察基因工程改造E.coli是否具有定位于转移瘤的能力。
结果尾静脉注射黑色素瘤，肝癌及乳腺癌等肿瘤细胞于裸鼠体内，10天后活体成像可见肺脏转移瘤构建成功，尾静脉注入1×108cfu/100μl/鼠的大肠杆菌3～4天后，解剖小鼠可见肺脏布满了大小不同的黑色转移灶，成像显示，在肺脏转移灶有发光细菌存在，说明大肠杆菌可定位于肿瘤的转移灶(见附图8)。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院生物医学分析中心<120>一种表达TRAIL蛋白质的大肠杆菌在制备肿瘤治疗药物中的用途<130>
<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>27<212>DNA<213>
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权利要求
1.一种表达TRAIL蛋白质的大肠杆菌在制备肿瘤治疗药物中的用途。
2.根据权利要求1所述用途，其中大肠杆菌为大肠杆菌各个种及其在此基础上经过遗传工程改造的大肠杆菌工程菌。
3.根据权利要求1或2所述用途，其中大肠杆菌为DH5α、BL21或JM109。
4.根据权利要求1所述用途，其中大肠杆菌包含携带有TRAIL基因的载体。
5.根据权利要求4所述用途，其中TRAIL基因为TRAIL全长或其可溶性TRAIL的各个片段，TRAIL全长氨基酸序列如序列表中序列8所示。
6.根据权利要求5所述用途，其中TRAIL基因为TRAIL的95～281aa片段或114～281aa片段，其氨基酸序列分别如序列表中序列6和序列7所示。
7.根据权利要求4所述用途，其中载体为原核表达载体。
8.根据权利要求7所述用途，其中载体为pGEX-KG、pET-28a(+)或pBV220。
9.根据权利要求1所述用途，其中肿瘤为实体瘤。
10.根据权利要求1或9所述用途，其中肿瘤为鼠黑色素肿瘤B16-F10-luc-G5、人乳腺癌MCF-7-luc-F5、人肝癌BEL-7405-luc、人肝癌SMMC-7721-luc、人前列腺癌PC-3、鼠神经胶质瘤C6、鼠膀胱肿瘤MB-49或人纤维肉瘤细胞HT1080。
全文摘要
本发明公开了一种表达TRAIL蛋白质的大肠杆菌在制备肿瘤治疗药物中的用途。本发明利用大肠杆菌的肿瘤靶向性，制备了携带TRAIL基因大肠杆菌，该大肠杆菌可以定位于机体肿瘤及转移的肿瘤组织，在肿瘤组织集聚，把TRAIL带到肿瘤部位，避免了TRAIL对正常组织与器官的毒性作用，也使TRAIL能在肿瘤局部发挥更强、更持久的作用。本发明表达TRAIL蛋白质的大肠杆菌能抑制或延缓肿瘤组织的生长，可以用于制备肿瘤治疗的药物，具有非常广阔的市场前景。
文档编号A61K35/66GK1903373SQ20051008711
公开日2007年1月31日 申请日期2005年7月27日 优先权日2005年7月27日
发明者张学敏, 张海英, 梁冰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物医学分析中心