专利名称：抗cd38人抗体及其用途的制作方法
本申请要求2004年2月6日提交的美国临时申请60/541,911、2004年2月26日提交的美国临时申请60/547,584、2004年3月18日提交的美国临时申请60/553,948以及2004年8月6日提交的美国临时申请60/599,014的优先权，所述申请的内容被全文纳入本文作为参考。
背景技术：
CD38是一种II型膜糖蛋白，由于其具有ADP核糖基环化酶和cADP水解酶的酶活性，因此属于胞外酶家族。在个体发育期间，CD38出现在CD34+定型干细胞以及淋巴细胞、红系细胞和骨髓细胞的谱系定型祖细胞上。人们认为，CD38只在T细胞和B细胞发育的早期阶段在淋巴谱系中表达。
CD38的上调可作为淋巴细胞活化—尤其是B细胞沿浆细胞样途径分化的标记。CD38的(共-)受体功能推定是通过其配体CD31引起胞内信号发生或胞间通信，同时作为各种信号级联中第二信使环ADPr的胞内调质。然而，由于敲除掉鼠中的类似物或人中的抗CD38自身抗体似乎无害，因此其生理学重要性仍待阐明。
除了观察到它在造血系统中表达外，研究人员发现，CD38在衍生自B细胞肿瘤、T细胞肿瘤和骨髓/单核细胞肿瘤的各种细胞系内上调，所述肿瘤包括B-或T-细胞急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)。例如，在MM的所有患者样品中，大多数都观察到CD38的强烈表达。
因此，CD38在恶性细胞上的过度表达为免疫治疗提供了一种有吸引力的治疗靶点。特别引人注意的是，造血系统的多数早期多能干细胞是CD38阴性的，且ADCC或CDC产生的细胞毒效应程度与各靶点的表达水平良好相关。
抗CD38治疗的现有方法可分为两类体内和体外方法。在体内方法中，将抗CD38抗体给予需要这种治疗的个体，以产生抗CD38抗体介导的CD38过表达恶性细胞减少。减少可通过效应细胞产生的抗体介导的ACDD和/或CDC来获得，或通过将抗CD38抗体作为靶向部分以将细胞毒物质例如皂草素运送到靶细胞并随后内化来获得。在体外方法中，将含有CD38过表达恶性细胞的细胞群如骨髓细胞，从需要治疗的个体中移出，并与抗CD38抗体接触。靶细胞可用细胞毒物质如皂草素破坏(如在体内方法中的描述)，或通过使细胞群接触固定的抗CD38抗体来去除，由此从混合物中去除过度表达CD38的靶细胞。之后将去除了靶细胞的细胞群回输给患者。
特异于CD38的抗体可根据不同特性分成不同的类型。一些抗体与CD38分子(主要是氨基酸220-300)结合可在靶细胞内引发活性，如Ca2+释放、细胞因子释放、磷酸化事件和生长刺激，这取决于各抗体的特异性(Konopleva等，1998；Ausiello等，2000)，但未发现各种已知抗体的结合位点与它们的(非-)竞争性特性之间有确切关系(Funaro等，1990)。
关于公开的抗CD38抗体的功效了解相对较少。现在知道的是，所有已知的抗体似乎都特异性地识别CD38C末端部分的表位(氨基酸残基220-300)。到目前为止，还不知道有特异于位于CD38N末端部分、在蛋白质一级序列中远离活性位点的表位的抗体。然而，我们在临床试验中发现，当OKT10为含有人Fc部分的嵌合构建体时，其具有相对较低的亲和力和功效。此外，OKT10是一种鼠类抗体因此不适合给予人类。最近已经描述了人抗CD38scFv抗体片段(WO 02/06347)。然而，这种抗体特异于选择性表达的CD38表位。
因此，考虑到抗CD38抗体治疗的极大潜力，迫切需要有在通过ADCC和/或CDC介导杀伤CD38过表达恶性细胞方面具有高亲和力和高效力的人抗CD38抗体。
如下文所述，本发明通过提供完全人源且高效的抗CD38抗体，满足了这些需求和其它需求。
发明概述本发明的一个目的是提供可有效介导杀伤CD38过表达细胞的人和人源化抗体。
本发明的另一个目的是提供可安全地给予人的抗体。
本发明的再一个目的是提供通过使用一种或多种本发明的抗体来治疗与CD38上调有关的疾病和/或病症的方法。下文更加详细地描述了本发明的这些目的和其它目的。
一方面，本发明提供了分离的抗体或功能性抗体片段，其含有特异于CD38的表位的抗原结合区，其中，当将人PBMC细胞用作效应细胞且当效应细胞与靶细胞的比例约为30∶1至50∶1时，在相同或基本相同的条件下，所述抗体或其功能性片段能够通过抗体依赖性细胞毒性(“ADCC”)以优于具有SEQ ID NO23和24的嵌合OKT10至少2-5倍的效力介导CD38+靶细胞杀伤(LP-1(DSMZACC41)和RPMI-8226(ATCCCCL-155))。这种抗体或其功能性片段可含有抗原结合区，该抗原结合区包含SEQ ID NO5、6、7或8所示的H-CDR3区；该抗原结合区还可包含SEQ ID NO5、6、7或8所示的H-CDR2区；且该抗原结合区也可包含SEQ ID NO5、6、7或8所示的H-CDR1区。本发明的这种CD38特异性抗体可含有抗原结合区，该抗原结合区包含SEQ ID NO13、14、15或16所示的L-CDR3区；该抗原结合区还可包含SEQ ID NO13、14、15或16所示的L-CDRL区；该抗原结合区也可包含SEQ ID NO13、14、15或16所示的L-CDR2区。
另一方面，本发明提供了分离的抗体或功能性抗体片段，其含有特异于CD38的表位的抗原结合区，其中，在与上段所述相同或基本相同的条件下，所述抗体或其功能性片段能够通过CDC以优于嵌合OKT10(SEQ IDNO23和24)至少2倍的效力介导CD38转染的CHO细胞杀伤。满足这些条件的抗体可含有抗原结合区，该抗原结合区包含SEQ ID NO5、6或7所示的H-CDR3区；该抗原结合区还可包含SEQ ID NO5、6或7所示的H-CDR2区；且该抗原结合区也可包含SEQ ID NO5、6或7所示的H-CDR1区。本发明的这种CD38特异性抗体可含有抗原结合区，该抗原结合区包含SEQ ID NO13、14或15所示的L-CDR3区；该抗原结合区还可包含SEQID NO13、14或15所示的L-CDRL区；且该抗原结合区也可包含区SEQID NO13、14或15所示的L-CDR2。
本发明的抗体(及其功能性片段)可含有特异于CD38的表位的抗原结合区，其中所述表位含有CD38的氨基酸残基43-215中的一个或多个氨基酸残基，如SEQ IDNO22所示。更具体地说，所述抗原结合区结合的表位可含有选自氨基酸段44-66、82-94、142-154、148-164、158-170和192-206的一个或多个氨基酸段(amino acid stretch)中所含的一个或多个氨基酸残基。对于某些抗体，该表位可以是线型的，对于其它抗体，该表位可以是构象的(即不连续的)。具有一个或多个这些特性的抗体或其功能性片段可含有抗原结合区，该抗原结合区包含SEQ ID NO5、6、7或8所示的H-CDR3区；该抗原结合区还可包含SEQ ID NO5、6、7或8所示的H-CDR2区；且该抗原结合区也可包含SEQ ID NO5、6、7或8所示的H-CDR1区。本发明的这种CD38特异性抗体可含有抗原结合区，该抗原结合区包含SEQID NO13、14、15或16所示的L-CDR3区；该抗原结合区还可包含SEQID NO13、14、15或16所示的L-CDR1区；且该抗原结合区也可包含SEQID NO13、14、15或16所示的L-CDR2区。
本发明所公开的序列的肽变体也包含在本发明的范围之内。因此，本发明包括含有以下重链氨基酸序列的抗CD38抗体其CDR区与SEQ IDNO5、6、7或8所示的CDR区有至少60％序列相同性的序列；和/或其CDR区与SEQ ID NO5、6、7或8所示的CDR区有至少80％序列同源性的序列。还包括含有以下轻链氨基酸序列的抗CD38抗体其CDR区与SEQID NO13、14、15或16所示的CDR区有至少60％序列相同性的序列；和/或其CDR区与SEQ ID NO13、14、15或16所示的CDR区有至少80％序列同源性的序列。
例如，本发明的抗体可以是IgG(例如IgG1)，而抗体片段可以是Fab或scFv。因此，本发明的抗体片段可以是，或者可以含有具有本发明所述的一个或多个特征的抗原结合区。
本发明还涉及分离的核酸序列，每个序列都可编码人抗体或其功能性片段的抗原结合区，该抗原结合区特异于CD38的表位。这种核酸序列可编码抗体的可变重链，并含有选自下组的序列SEQ ID NO1、2、3或4，或者在高度严格条件下与SEQ ID NO1、2、3或4的互补链杂交的核酸序列。该核酸可编码分离的抗体或其功能性片段的可变轻链，并可含有选自下组的序列SEQ ID NO9、10、11或12，或者在高度严格条件下与SEQID NO9、10、11或12的互补链杂交的核酸序列。
本发明的核酸适合重组制备。因此，本发明还涉及含有本发明的核酸序列的载体和宿主细胞。
本发明的组合物可用于治疗或预防用途。因此，本发明包括含有本发明的抗体(或功能性抗体片段)以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在相关方面，本发明提供了治疗与不希望存在的CD38或CD38表达细胞有关的疾病或病症的方法。该方法包括给予有此需要的个体有效量的含有本发明所述的或预期的抗体的药物组合物。
本发明还涉及线型的或构象形式的CD38的分离表位，以及它们在分离的抗体或其功能性片段中的用途，所述抗体或抗体片段包含特异于所述表位的抗原结合区。在这方面，线型表位可包含氨基酸残基192-206，而构象(conformational)表位可包含选自CD38的氨基酸44-66、82-94、142-154、148-164、158-170和202-224的一个或多个氨基酸残基。例如，可用CD38的表位来分离抗体或其功能性片段(所述每种抗体或抗体片段包含特异于这种表位的抗原结合区)，其中包括使所述CD38的表位接触抗体文库和分离所述一种或多种抗体或其功能性片段的步骤。
在另一实施方案中，本发明提供了CD38的分离表位，该表位基本上由选自CD38的氨基酸44-66、82-94、142-154、148-164、158-170、192-206和202-224的氨基酸序列构成。在本发明中，这种表位“基本上由”上述氨基酸序列之一加上其它特征“构成”，条件是，其它特征不会在本质上影响该表位的基本特征和新颖性。
在又一实施方案中，本发明提供了CD38的分离表位，该表位由选自CD38的氨基酸44-66、82-94、142-154、148-164、158-170、192-206和202-224的氨基酸序列构成。
本发明还提供了试剂盒，其中含有(i)含有选自44-66、82-94、142-154、148-164、158-170、192-206和202-224的一个或多个氨基酸段的CD38的分离表位；(ii)抗体文库；和(iii)使用这种抗体文库来分离特异性结合这种表位的该文库的一个或多个成员的说明书。
附图简述
图1a提供了各种新抗体重链可变区的核酸序列；图1b提供了各种新抗体重链可变区的氨基酸序列。从N-到C-末端用黑体表示CDR区HCDR1、HCDR2和HCDR3；图2a提供了各种新抗体轻链可变区的核酸序列；图2b提供了各种新抗体轻链可变区的氨基酸序列。从N-到C-末端用黑体表示CDR区LCDR1、LCDR2和LCDR3；图3提供了基于各种共有序列的HuCAL抗体主基因序列的重链可变区的氨基酸序列。从N-到C-末端用黑体表示CDR区HCDR1、HCDR2和HCDR3；图4提供了基于各种共有序列的HuCAL抗体主基因序列的轻链可变区的氨基酸序列。从N-到C-末端用黑体表示CDR区LCDR1、LCDR2和LCDR3；图5提供了CD38的氨基酸序列(SWISS-PROT主登录号P28907)；
图6提供了嵌合OKT10的重链和轻链的核苷酸序列；图7提供了本发明代表性抗体的表位的示意图；图8提供了pMORPH_h_IgG1_1的DNA序列(bp 601-2100)(SEQ IDNO32)。该载体基于pcDNA3.1+载体(Invitrogen)VH-填充序列的氨基酸序列用黑体表示，而VH-梯序列最后一个阅读框及恒定区基因用非黑体表示。限制性位点表示在序列上方。测序引物的引导位点用下划线表示；图9提供了Igκ轻链表达载体pMORPH_h_Igk_1的DNA序列(bp601-1400)(SEQ ID NO33)该载体基于pcDNA3.1+载体(Invitrogen)。Vκ-填充序列的氨基酸序列用黑体表示，而Vκ-前导序列最后一个阅读框及恒定区基因用非黑体表示。限制性位点表示在序列上方。测序引物的引导位点用下划线表示；图10提供了HuCALIgλ轻链载体pMORPH_h Igλ_1的DNA序列(bp601-1400)(SEQ ID NO34)Vλ-填充序列的氨基酸序列用黑体表示，而Vλ-梯序列最后一个阅读框及恒定区基因用非黑体表示。限制性位点表示在序列上方。测序引物的引导位点用下划线表示；图11提供了增殖试验的结果将来自6个不同的健康供体的PBMC(用单独的圆点表示)在存在HuCAL抗体Mab#1(＝MOR03077)、Mab#2(＝MOR03079)、Mab#3(＝MOR03080)、参考抗体chOKT10、激动性(ag.)对照IB4、无关HuCAL阴性对照IgG1(NC)和作为IB4的匹配同种型对照的鼠IgG2a(Iso)的情况下培养3天。用BrdU标记的标准物来测量增殖活性，并通过基于化学发光的ELISA来分析其掺入(RLU＝相对光单位)；图12提供了IL-6释放试验的结果将来自4-8个不同的健康供体的PBMC(用单独的圆点表示)在存在HuCAL抗体Mab#1(＝MOR03077)、Mab#2(＝MOR03079)、Mab#3(＝MOR03080)、参考抗体chOKT10、激动性(ag.)对照IB4、无关HuCAL阴性对照(NC)和单纯培养基(培养基)的情况下培养24小时。通过基于化学发光的ELISA从培养物上清分析IL-6的量，用相对光单位(RLU)表示；图13提供了有关对CD34+/CD38+祖细胞的细胞毒性的数据将来自带有自体CD34+/CD38+祖细胞的健康供体的PBMC分别在存在HuCAL抗体Mab#1(＝MOR03077)、Mab#2(＝MOR03079)、Mab#3(＝MOR03080)、阳性对照(PC＝chOKT10)和无关HuCAL阴性对照的情况下培养4小时。之后将细胞悬液与润湿的甲基纤维素基质混合并培育2周。计数来自红系暴发集落形成单位(BFU-E；B栏)和粒细胞/红系细胞/巨噬细胞/巨核细胞干细胞(CFU-GEMM；B栏)以及粒细胞/巨噬细胞干细胞(CFU-GM；C栏)的集落形成单位(CFU)，并根据培养基对照(“无”＝培养基)标准化。A栏表示所有祖细胞的CFU总数(总CFU)。给出了至少10个不同PBMC供体的平均值。误差棒表示与平均值的标准误差；图14提供了不同细胞系的ADCC数据a单次测量(RPMI8226除外，为4次测量的平均值)；E∶T比例30∶1bNamba等，1989c抗体浓度为5g/ml(Raji除外，为0.1μg/ml)d加入维甲酸以测定对CD38表达特异性杀伤的刺激[％]＝[(期望杀伤值-中间杀伤值)/(1-中间杀伤值)]×100PC阳性对照(＝chOKT10)MM多发性骨髓瘤
CLL慢性B细胞白血病ALL急性成淋巴细胞性白血病AML急性髓细胞样白血病DSMZ德意志微生物和细胞培养物保藏中心GmbHATCC美国模式培养物保藏中心ECACC欧洲动物细胞保藏中心MFI平均荧光强度；图15提供了MM样品的ADCC数据a2-4次单独分析；图16提供了用MOR03080处理人骨髓瘤异种移植物之后平均肿瘤体积的试验结果组1运载体；组2MOR03080，第32-68天隔天给予1mg/kghIgG1；组3MOR03080，第32-68天隔天给予5mg/kg hIgG1；组4MOR03080，第32-68天隔天给予5mg/kg chIgG2a；组5MOR03080，第14-36天隔天给予1mg/kg hIgG1；组6未处理。
发明详述本发明基于发现新抗体，该抗体特异于CD38或对CD38具有高亲和力并可对个体具有治疗益处。本发明的抗体可以是人抗体或人源化抗体，可用于本发明的各个方面，这将在本说明书中进行更加详细的描述。
“人”抗体或功能性人抗体片段在此定义为非嵌合的(例如非“人源化的”)且不是来自(全部或部分)非人物种的抗体。人抗体或功能性抗体片段可来自人或者可以是合成的人抗体。“合成的人抗体”在此定义为具有如下序列的抗体其部分或全部来自基于已知人抗体序列分析的电脑合成序列。例如，可通过分析人抗体或抗体片段序列的数据库并利用从中获得的数据设计多肽序列来实现人抗体序列或其片段的电脑设计。人抗体或功能性抗体片段的另一个例子是由从人来源的抗体序列文库(即基于人天然来源的抗体的文库)中分离的核酸编码的人抗体或功能性抗体片断。
“人源化抗体”或功能性人源化抗体片段在此定义为以下抗体之一(i)来自非人来源(例如，具有异种免疫系统的转基因小鼠)的抗体，该抗体基于人胚胎系(germline)序列；或(ii)嵌合抗体，其可变区来自非人来源而恒定区来自人来源，或者(iii)CDR嫁接抗体，其可变区的CDR来自非人来源，可变区的一个或多个构架是人来源的，且恒定区(如果有的话)是人来源的。
因为结合特异性不是绝对的，而是相对的特性，因此在本说明书中，如果某抗体能够将某抗原(这里是CD38)与一种或多种参考抗原区分开，则该抗体“特异性结合于”、“特异于”或“特异性识别”该抗原。在最常规的形式中(未提到规定的参考时)，“特异性结合”是指抗体将目的抗原与无关抗原区分开的能力，例如，可用下文的方法之一来确定。这种方法包括但不限于Western印迹试验、ELISA试验、RIA试验、ECL试验、IRMA试验和肽扫描。例如，可进行标准ELISA试验。可通过标准显色反应(例如，次级抗体和辣根过氧化物，以及四甲基联苯胺和过氧化氢)进行评分。某些孔中的反应通过例如450nm的光密度评分。典型的背景(＝阴性反应)可以是0.1OD；典型的阳性反应可以是1OD。这意味着阳性/阴性之间的差异可大于10倍。通常，确定结合特异性不只使用单个参考抗原，而是使用一组约3-5个无关抗原如奶粉、BSA、运铁蛋白等来进行。
然而，“结合特异性”也指抗体区分靶抗原与一个或多个被用作参考点的密切相关抗原(例如CD38与CD157)的能力。此外，“结合特异性”可包括抗体区分其靶抗原的不同部分的能力，例如CD38的不同结构域或区域，如CD38的N-末端或C-末端区域的表位，或区分CD38氨基酸残基的一个或多个关键氨基酸残基或氨基酸段的能力。
另外，“免疫球蛋白(Ig)”在此定义为属于IgG、IgM、IgE、IgA或IgD类(或其任何亚类)的蛋白质，包括所有常规已知的抗体及其功能性片段。因此抗体/免疫球蛋白的“功能性片段”在此定义为保留了抗原结合区的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常在该抗体的一个或多个超变区，即CDR-1、-2和/或-3区中观察到；然而，可变的“构架”区也可在抗原结合中发挥重要作用，如为CDR提供支架。优选地，“抗原结合区”至少包含可变轻(VL)链的氨基酸残基4-103和可变重(VH)链的氨基酸残基5-109，更优选包含VL的氨基酸残基3-107和VH的氨基酸残基4-111，特别优选的是包含完整的VL和VH链(VL的氨基酸1-109和VH的氨基酸1-113；编号见WO 97/08320)。用于本发明的优选的免疫球蛋白类型是IgG。本发明的“功能性片段”包括F(ab′)2片段、Fab片段和scFv的结构域。F(ab′)2或Fab可设计成使CH1和CL结构域之间存在的分子间二硫相互作用最小化或被完全除去。
本发明的抗体可来自基于如下氨基酸序列的重组抗体文库其由电脑设计并由合成产生的核酸编码。例如，可通过分析人序列数据库并利用从中获得的数据设计多肽序列来实现电脑设计抗体序列。设计和获得电脑产生序列的方法在，例如，Knappik等，J.Mol.Biol.(2000)29657；Krebs等，J.Immunol.Methods.(2001)25467；和Knappik等的美国专利6,300,064中有描述，这些文献被全文纳入本文作为参考。
本发明的抗体在本说明书中，涉及到本发明的以下代表性抗体“抗体编号”或“LAC”或“MOR”3077、3079、3080和3100。LAC 3077表示具有对应于SEQ ID NO1(DNA)/SEQ ID NO5(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO9(DNA)/SEQ ID NO13(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3079表示具有对应于SEQ ID NO2(DNA)/SEQ ID NO6(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO10(DNA)/SEQ ID NO14(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3080表示具有对应于SEQ ID NO3(DNA)/SEQ ID NO7(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO11(DNA)/SEQ ID NO15(蛋白质)的轻链可变区的抗体。LAC 3100表示具有对应于SEQ IDNO4(DNA)/SEQID NO8(蛋白质)的重链可变区和对应于SEQ ID NO12(DNA)/SEQ IDNO16(蛋白质)的轻链可变区的抗体。
一方面，本发明提供了具有抗原结合区的抗体，该抗体结合区能特异性结合CD38或对CD38的一个或多个区域具有高亲和力，CD38的氨基酸序列如SEQ ID NO22所示。如果测得的亲和力至少为100nM(Fab片段的单价亲和力)，则称抗体对抗原具有“高亲和力”。本发明的抗体或抗原结合区优选以小于约100nM、更优选以小于约60nM、最优选以小于约30nM的亲和力结合CD38。再优选的是以小于约10nM、更优选以小于约3nM的亲和力结合CD38的抗体。例如，本发明的抗体对CD38的亲和力约为10.0nM或2.4nM(Fab片段的单价亲和力)。
表1总结了通过表面等离子共振(Biacore)和FACS Scatchard分析测得的本发明的代表性抗体的亲和力
表1抗体亲和力
a至少2次不同亲和力测定的平均值b用于FACS-Scatchard的RPMI8226MM细胞系参考表1，在固定的重组CD38上通过表面等离子共振(Biacore)和利用表达CD38的人RPMI8226细胞系通过流式细胞术测量LAC 3077、3079、3080和3100的亲和力。Biacore研究在直接固定的抗原(CD38-Fc融合蛋白)上进行。LAC 3077、3079、3080和3100的Fab形式在固定的CD38-Fc融合蛋白上显示出的单价亲和力在约2.4和56nM之间，LAC 3079显示出最高亲和力，然后是Fab 3100、3080和3077。
将IgG1形式用于基于细胞的亲和试验(FACS Scatchard)。表1的右栏显示了这种形式的LAC的结合强度。LAC 3080显示出最强的结合，它略强于LAC 3079和3077。
本发明的优选抗体的另一个优选特征是它们对CD38的N-末端区域内的区域具有特异性。例如，本发明的LAC 3077、3079、3080和3100可特异性结合CD38的N-末端区域。
本发明的抗体结合的表位的类型可以是线型的(即一段连续的氨基酸)或构象的(即多段氨基酸)。为了确定特定抗体的表位是线型的还是构象的，熟练的技术人员可以分析抗体与覆盖CD38不同区域的重叠肽的结合(例如13聚肽与11个氨基酸重叠的结合)。采用这种分析，发明人发现，LAC 3077、3080和3100识别CD38的N-末端区域的不连续表位，而LAC 3079的表位可被描述为是线型的(见图7)。结合本说明书所提供的知识，本领域的普通技术人员会知道如何用CD38的一个或多个分离表位来产生具有特异于所述表位的抗原结合区的抗体(例如，利用CD38的表位或CD38的细胞表达表位的合成肽)。
本发明的抗体优选与人和至少一种其它物种发生物种交叉反应，所述其它物种可以是啮齿类或非人灵长类。所述非人灵长类可以是恒河猴、狒狒和/或短尾猴。所述啮齿类可以是小鼠、大鼠和/或仓鼠。为了用相同的抗体在多种物种内进行体内研究，与至少一种啮齿类动物交叉反应的抗体可提供，例如优于已知抗CD38抗体的适应性和益处。
优选地，本发明的抗体不仅能够结合CD38，而且能够介导杀伤CD38表达细胞。更具体地说，本发明的抗体能够通过抗体-效应器功能，通过减少CD38阳性(例如恶性)细胞发挥其治疗功效。这些功能包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。
表2总结了本发明的代表性抗体的ADCC和CDC的EC50值表2抗体的EC50值
a至少2次EC50测量的平均值b一次测量c2次EC50测量的平均值d3次EC50测量的平均值
e4次EC50测量的平均值然而，发现CD38不仅在骨髓(例如单核细胞和粒细胞)和淋巴谱系(例如激活的B和T细胞、浆细胞)的免疫细胞上表达，还发现在各自的前体细胞上也表达。由于那些细胞不受抗体介导的恶性细胞杀伤的影响(这点是重要的)，因此本发明的抗体对前体细胞没有细胞毒性。
除了具有环状ADP-核糖环化酶和水解酶的催化活性外，CD38还显示出生物相关的信号转导能力(Hoshino等，1997；Ausiello等，2000)。那些功能可通过例如受体-配体相互作用或者通过与激动性抗CD38抗体交联在体内诱导，从而引起例如钙运动、淋巴细胞增殖和释放细胞因子。优选地，本发明的抗体是非激动性抗体。
肽变体本发明的抗体不限于本说明书所提供的特定的肽序列。本发明可包括这些多肽的变体。参考本发明的公开和常规可获得的技术和参考资料，熟练的技术人员将能够制备、检测和使用在此所公开的抗体的功能性变体，并能够理解那些具有介导CD38+靶细胞杀伤的能力的变体落入本发明的范围之内。文中，“介导CD38+靶细胞杀伤的能力”是指本发明的抗CD38抗体所具有的功能特性。因此，介导CD38+靶细胞杀伤的能力包括通过例如ADCC和/或CDC或通过与本发明的抗体偶联的毒性构建体介导CD38+靶细胞的杀伤的能力。
变体可以包括，例如，相对于本说明书所公开的肽序列，具有至少一个改变的互补决定区(CDR)(超变)和/或构架(FR)(可变)决定区/位点的抗体。为更好地阐述这一概念，下文对抗体结构进行简单描述。
抗体由两条肽链构成，每条含有1个(轻链)或3个(重链)恒定区和可变区(VL，VH)，后者由4个FR区和3个位于中间的CDR构成。抗原结合位点由一个或多个CDR构成，而FR区为CDR提供结构性构架，因此在抗原结合中扮演重要角色。通过改变CDR或FR区的一个或多个氨基酸残基，熟练的技术人员可方便地产生突变或改变的抗体序列，例如，可用抗原根据新的或改进的特性来筛选这些抗体序列。
表3a(VH)和3b(VL)描述了本发明的某些抗体的CDR和FR区，并相互比较以及与相应的共有序列或“主基因”序列(如美国专利6,300,064所述)比较了特定位置的氨基酸
表3aVH序列
表3bVL序列
熟练的技术人员可利用表3a和3b中的数据来设计本发明范围之内的肽变体。优选通过改变一个或多个CDR区内的氨基酸来构建变体，变体也可具有一个或多个改变的构架区。根据新抗体与其它抗体的比较，可被改变的候选残基包括，例如LAC 3080和3077可变轻链的残基4或37以及例如可变重链的残基13或43，这是因为这些位置相互之间是变化的。改变也可发生在构架区。例如，可改变肽FR结构域，在这种情况下与胚胎系序列相比残基发生变化。
根据新抗体与相应的共有序列或“主基因”序列的比较，可被改变的候选残基包括，例如，相比VLλ3，LAC 3080可变轻链的残基27、50或90，以及例如，相比VH3，LAC 3080可变重链的残基33、52和97。或者，熟练的技术人员可通过本发明所公开的氨基酸序列与相同类型的此类抗体的已知序列进行比较来进行相同的分析，例如采用Knappik等(2000)以及Knappik等的美国专利6,300,064中所述的方法来分析。
此外，可以用一种LAC作为起点通过如下优化来获得变体改变LAC中的一个或多个氨基酸残基，优选一个或多个CDR内的氨基酸残基，并筛选所得到的变体集合以得到具有改进特性的变体。特别优选的是VL的CDR-3、VH的CDR-3、VL的CDR-1和/或VH的CDR-2中一个或多个氨基酸残基多样化。多样化可通过用三核苷酸诱变(TRIM)技术(Vimeks，B.，Ge，L，Plckthun，A.，Schneider，K.C.，Wellnhofer，G和Moroney S.E.(1994)Trinucleotide phosphoramiditesideal reagents for the synthesis of mixedoligonucleotides for random mutagenesis.Nucl.Acids Res.22，5600.)合成DNA分子的集合来完成。
保守性氨基酸变体多肽变体可制备成保留本发明所述的抗体肽序列的全部分子结构。考虑到各个氨基酸的特性，熟练的技术人员会知道一些合理的取代。例如，可根据有关残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性特性的类似性进行氨基酸取代，即“保守性取代”。
例如，(a)非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和(d)负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。取代通常可在(a)-(d)组内进行。此外，由于甘氨酸和脯氨酸都能打断α-螺旋因此可相互取代。类似地，某些氨基酸如丙氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸在α-螺旋中更加常见，而缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和苏氨酸在β-片层中更加常见。甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺和脯氨酸常见于转角中。一些优选的取代可在以下组中进行(i)S和T；(ii)P和G；和(iii)A、V、L和I。结合已知的遗传密码以及重组和合成DNA技术，熟练的技术人员可方便地构建编码保守性氨基酸变体的DNA。在一个特定的实施例中，SEQ ID NO5、6、7和/或8中的氨基酸位置3可从Q变为E。
在本说明书中，两个多肽序列之间的“序列相同性”是指这两个序列之间相同氨基酸的百分比。“序列类似性”是指相同或代表保守性氨基酸取代的氨基酸的百分比。优选的本发明多肽序列CDR区的序列相同性至少为60％，更优选至少70％或80％，再优选至少90％，最优选至少95％。优选的抗体CDR区的序列类似性至少80％，更优选90％，最优选95％。
本发明的DNA分子本发明还涉及编码本发明抗体的DNA分子。这些序列包括但不限于图1a和2a所示的DNA分子。
本发明的DNA分子不限于本说明书所公开的序列，还包括其变体。本发明的DNA变体可根据其杂交物理特性来描述。熟练的技术人员会知道，由于DNA是双链的，因此可采用核酸杂交技术用DNA来鉴定其补体、其等价物或同系物。还会知道杂交可以低于100％的互补性发生。然而，假如适当选择条件，可用杂交技术根据它们与特定探针的结构关系来区分DNA序列。关于这种条件的教导，可参见Sambrook等，1989(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)Molecular CloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，USA)以及Ausubel等，1995(Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Sedman，J.G，Smith，J.A.和Struhl，K.编(1995)，Current Protocols in Molecular Biology.New YorkJohn Wiley and Sons)。
两个多肽序列之间的结构相似性可表示为这两个序列相互杂交的条件的“严格性”的函数。在本说明书中，术语“严格性”是指条件不利于杂交的程度。严格条件极其不利于杂交，只有结构最相关的分子才能在这种条件下相互杂交。相反，非严格条件有利于结构相关性程度较低的分子相互杂交。因此，杂交严格性与两个核酸序列的结构关系直接相关。以下关系式对于关联杂交和相关性是有用的(其中，Tm是核酸双链体的解链温度)a.Tm＝69.3+0.41(G+C)％b.错配碱基对的数目每增加1％则双链体DNA的Tm将降低1℃
c.(Tm)μ2-(Tm)μ1＝18.5log10μ2/μ1其中，μ1和μ2是两种溶液的离子强度。
杂交严格性是许多因素的函数，其中包括总DNA浓度、离子强度、温度、探针大小以及能打断氢键的试剂的存在情况。促进杂交的因素包括高DNA浓度、高离子强度、低温、较长探针大小以及不存在能打断氢键的试剂。杂交通常分两阶段进行“结合”阶段和“洗涤”阶段。
首先，在结合阶段，探针在有利于杂交的条件下结合靶。此阶段通常通过改变温度控制严格性。除非使用短(＜20nt)寡核苷酸探针，高严格性的温度通常在65℃和70℃之间。典型的杂交液含有6X SSC、0.5％SDS、5XDenhardt溶液和100μg非特异性载体DNA。参见Ausubel等，2.9节，增刊27(1994)。当然，许多不同的但是在功能上相同的缓冲条件是已知的。当相关性程度较低时可选择较低的温度。低严格性结合温度在25℃和40℃之间。中等严格性的温度为至少约40℃至低于约65℃。高严格性的温度至少约65℃。
第二，通过洗涤除去多余的探针。该阶段通常使用更加严格的条件。因此，“洗涤”阶段是通过杂交确定相关性最重要的阶段。洗涤液通常是低盐浓度的。一种典型的中等严格性溶液含有2X SSC和0.1％SDS。高严格性洗涤液所含的量小于约0.2X SSC(以离子强度计)，优选的严格溶液含有约0.1X SSC。与各种严格性有关的温度同上文对“结合”的讨论。在洗涤期间通常需要更换数次洗涤液。例如，典型的高严格性洗涤条件包括在55℃洗涤2次，每次30分钟，以及在60℃洗涤三次，每次15分钟。
因此，本发明包括在高严格性结合和洗涤条件下与图1a和2a所示的分子杂交的核酸分子，其中该核酸分子编码具有本发明所述的特性的抗体或其功能性片段。优选的分子(以mRNA来看)是与本发明所述的DNA分子之一具有至少75％或80％(优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％)同源性或序列相同性的分子。在本发明变体的一个具体例子中，SEQ ID NO1、2、3和/或4中第7位的核酸可从C变为G，从而密码子从CAA变为GAA。
功能等价变体本发明的另一类DNA变体可根据其编码产物来描述(见图1b和2b列出的肽)。这些功能等价基因的特征在于由于遗传密码的简并性，它们编码与图1b和2b所列序列相同的肽序列。SEQ ID NO1和31是功能等价变体的一个例子，即它们的核酸序列不同但编码相同的多肽，即SEQ IDNO5。
已知可用几种不同方法构建本发明所提供的DNA分子的变体。例如，它们可以被构建成完全合成的DNA。有效合成长度为20至约150个核苷酸的寡核苷酸的方法有很多。参见Ausubel等，2.11节，增刊21(1993)。可用Khorana等，J.Mol.Biol.72209-217(1971)首先报道的方法来合成并装配重叠寡核苷酸；也可参见Ausubel等，同上，8.2节。合成的DNA优选被设计成在基因的5’和3’端带有方便的限制性位点以便于克隆入合适的载体。
如上所述，产生变体的方法是以本发明所述的一种DNA为起始，然后进行定点诱变。见Ausubel等，同上，第8章，增刊37(1997)。在典型方法中，将靶DNA克隆进单链DNA噬菌体载体中。分离单链DNA并将其与含有所需核苷酸改变的寡核苷酸杂交。互补链得以合成并将该双链噬菌体引入宿主。所得子代中的一些将具有所需突变，这可通过DNA测序来确定。此外，存在各种提高子代噬菌体成为所需突变体的可能性的方法。这些方法是本领域的技术人员熟知的，并可用市售的试剂盒来产生这种突变体。
重组DNA构建体和表达本发明还提供了含有一个或多个本发明的核苷酸序列的重组DNA构建体。本发明的重组构建体用于与载体，如质粒或病毒载体连接，该载体中插入了编码本发明抗体的DNA分子。
可用Sambrook等(1989)和Ausubel等(1989)所述的技术制备所述编码基因。或者，可用例如合成仪通过化学方法合成DNA序列。参见，例如，OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(1984，Gait编，IRL Press，Oxford)中所述的技术，该文献全文纳入本文作为参考。本发明的重组构建体含有能够表达RNA和/或DNA所编码的蛋白质产物的表达载体。所述载体还包含调控序列，包括可操作地与开放读框(ORF)连接的启动子。所述载体还包含可选择性标记序列。为了有效翻译插入的靶基因编码序列，还可以需要特定的起动信号和细菌分泌信号。
本发明还提供了含有至少一种本发明的DNA的宿主细胞。该宿主细胞实际上可以是任何表达载体可利用的细胞。例如，它可以是高级真核宿主细胞如哺乳动物细胞、低级真核宿主细胞如酵母细胞，但优选原核细胞如细菌细胞。可用磷酸钙转染、DEAE、葡聚糖介导的转染、电穿孔或噬菌体感染将重组构建体引入宿主细胞中。
细菌表达通过将编码所需蛋白质的结构性DNA序列和合适的翻译起始信号和终止信号一起插入到带有功能性启动子的可操作性读框(reading phase)中构建细菌用表达载体。所述载体会含有一个或多个表型可选择性标记和复制起点以确保维持载体，并在需要时在宿主内扩增。合适的转化原核宿主包括大肠杆菌(E、coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各种菌。
细菌载体可以是，例如基于噬菌体、质粒或噬菌粒的。这些载体可含有来自市售质粒的可选择性标记和细菌复制起点，这些市售质粒通常含有熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的元件。在转化合适的宿主菌株并使宿主菌株生长至合适的细胞密度之后，通过合适的方法(例如，改变温度或化学诱导)抑制/诱导所选启动子并将细胞再培养一段时间。细胞通常通过离心收集，通过物理或化学方法破碎，并保留所得粗制提取物进行进一步纯化。
在细菌系统中，可根据表达的蛋白质的用途有利地选择许多表达载体。例如，当要制备大量此类蛋白质以产生抗体或筛选肽文库时，例如就需要能够表达高水平的容易纯化的融合蛋白产物的载体。
治疗方法治疗方法包括给予需要治疗的个体治疗有效量的本发明预期的抗体。“治疗有效”量在本说明书中定义为所述抗体的量，该量足以减少个体治疗区域中的CD38阳性细胞—以单剂量方案或多剂量方案、单独给予或与其它试剂联合给予，该量可缓解不利症状，但在毒理学上是可耐受的。个体可以是人或非人动物(例如，兔、大鼠、小鼠、猴或其低级灵长类动物)。
本发明的抗体可与已知药物一起给予，且在一些情况下所述抗体本身可被修饰。例如，抗体可与免疫毒素或放射性同位素结合以进一步提高其功效。
本发明的抗体在各种CD38被不利地表达或发现的疾病中可用作治疗或诊断工具。特别适合用本发明的抗体治疗的疾病和症状是多发性骨髓瘤(MM)和其它血液病，如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)。本发明的抗体还可以用来治疗炎性疾病，如类风湿性关节炎(RA)或系统性红斑狼疮(SLE)。
为治疗上述疾病，按照本发明使用的药物组合物可用一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂用常规方法制备。本发明的抗体可通过任何适合的方式给予，该方式根据被治疗的疾病的类型是可变的。可能的给药途径包括肠胃外(例如肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下)、肺内和鼻内，如果需要还包括局部免疫抑制治疗、创伤内(ihtralesional)给药。此外，本发明的抗体可通过脉冲灌输(pulse infusion)给予，例如以递减的抗体剂量给予。优选地，定量给药通过注射进行，最优选通过静脉内或皮下注射，这部分取决于给药是短期的还是长期的。给药的量取决于各种因素，如临床症状、个体的体重、是否给予了其它药物等。熟练的技术人员会知道，给药途径根据被治疗疾病或病症而变化。
按照本发明，确定新型多肽的治疗有效量很大程度上取决于特定患者的特征、给药途径以及待治疗的疾病的特性。一般教导可在例如以下文献中找到国际协调会议(International Conference on Harmonisation)的出版物以及《雷明顿药物科学》(REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES)第27和28章，第484-528页(第18版，Alfonso R.Gennaro编，Easton，Pa.Mack Pub.Co.，1990)。更具体地，治疗有效量的确定取决于药物的毒性和功效等因素。可用本领域已知的并可在上述参考文献中找到的方法来确定毒性。可用相同的方法以及以下实施例中所述的方法来确定功效。
诊断方法在某些恶性肿瘤中，CD38在血细胞中高度表达；因此，可用本发明的抗CD38抗体来显像或显现患者中恶性细胞可能聚集的部位。在这方面，可通过使用放射性同位素、亲和标记(如生物素、抗生物素蛋白等)、荧光标记、顺磁性原子等可检测地标记抗体。进行这种标记的方法是本领域熟知的。抗体在诊断成像中的临床应用可参照Grossman，H.B.，Urol.Clin.North Amer.13465-474(1986)，Unger，E.C.等，Invest.Radiol.20693-700(1985)，以及Khaw，B.A.等，Science 209295-297(1980)。
检测到带有这种可检测标记的抗体的病灶可以说明例如肿瘤发展的部位。在一个实施方案中，这种检测是通过从组织或血液中取样并在可检测标记的抗体存在时培育这些样品来完成的。在优选的实施方案中，这种技术是以非侵入性方式通过使用磁性成像、荧光自显影等来完成的。这种诊断试验可用来监测疾病治疗的成功性，其中存在或不存在CD38阳性细胞是相应的指标。本发明还考虑将本发明所述的抗CD38抗体用于体外诊断。
治疗和诊断组合物可根据已知方法将本发明的抗体制成在药物上可用的组合物，其中，本发明的抗体(包括其任何功能性片段)与药学上可接受的载体性运载体组合形成混合物。合适的运载体以及它们的制备在，例如《雷明顿药物科学》(REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES)(第18版，Alfonso R.Gennaro编，Easton，Pa.MackPub.Co.，1990)中有描述。为制成适合有效给药的药学上可接受的组合物，这种组合物将含有有效量的一种或多种本发明的抗体和适量的载体性运载体。
可用适当的方法制备制剂以控制释放所述活性化合物。可用聚合物来络合或吸收抗CD38抗体从而获得控释制剂。可通过选择合适的大分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、或者鱼精蛋白、硫酸盐)和大分子的浓度以及控制释放的掺入方法来进行控制输送。另一种通过控制制剂控制作用时间的可能方法是将抗CD38抗体掺入聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚乳酸或乙烯-乙酸乙烯酯共聚物等聚合材料。或者，除了将这些药剂掺入聚合颗粒，可以将这些材料包入微胶囊或胶状药物递送系统或者巨乳剂中，例如，微胶囊可通过凝聚技术或通过界面聚合来制备(分别例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，胶状药物递送系统例如有脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊。这些技术在《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences，1980)中有描述。
所述化合物可被制成通过注射，例如通过弹丸注射或连续灌输而肠胃外给药。注射制剂可以以单位剂型存在，例如装在安瓿或者多剂量容器中，添加有防腐剂。所述组合物可以是悬浮液、溶液或油性或水性乳剂形式，并且可含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂等配方剂。或者，所述活性成分可以是在使用之前用合适的载体例如无菌无热原水重建的粉末形式。
如果需要，所述组合物可存在于包装或分配装置内，所述包装或分配装置可包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。例如，该包装可包括金属或塑料箔，如泡包装。该包装或分配装置中还可以有使用说明书。
参考以下工作实施例可进一步理解本发明，这些实施例只是为了阐述本发明因此不对本发明构成任何限制。
实施例细胞系以下细胞系获自欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)、德国微生物保藏中心(DSMZ)或美国典型培养物保藏中心(ATCC)制造CD38小鼠IgG1单克隆抗体OKT10的杂交瘤细胞系(ECACC，#87021903)、Jurkat细胞(DSMZ，ACC282)、LP-1(DSMZ，ACC41)、RPMI8226(ATCC，CCL-155)、HEK293(ATCC，CRL-1573)、CHO-K1(ATCC，CRL-61)和Raji(ATCC，CCL-86)。
细胞和培养条件所有细胞在37℃和5％CO2的标准条件下在湿润的培养箱中培养。细胞系LP-1、RPMI8226、Jurkat和Raji在添加有10％FCS(PAN biotech GmbH，#P30-3302)、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素(Gibco，#15140-122)和2mM谷氨酰胺(Gibco，#25030-024)的RPMI1640(Pan biotech GmbH，#P04-16500)中培养，而Jurkat细胞和Raji细胞还添加有10mM Hepes(Pan biotechGmbH，#P05-01100)和1mM丙酮酸钠(Pan biotech GmbH，#P04-43100)。
CHO-K1和HEK293生长在添加有2mM谷氨酰胺和10％FCS的DMEM(Gibco，#10938-025)中。稳定的CD38 CHO-K1转染子在存在G418(PAA GmbH，P11-012)的情况下维持，而HEK293还必需添加1mM丙酮酸钠。短暂转染HEK293之后用极低IgG FCS(Invitrogen，#16250-078)代替10％FCS。细胞系OKT10培养在添加有2mM谷氨酰胺和20％FCS的IDMEM(Gibco，#31980-022)中。
从外周血制备单细胞悬液所有血液样品在得到同意后获取。用Histopaque-1077(Sigma)根据制造商的说明从健康供体分离外周血单核细胞(PBMC)。在ACK裂解缓冲液(0.15MNH4Cl、10mM KHCO3、0.1M EDTA)中于室温培育5分钟或用市售产品(Bioscience，#00-4333)除去这些细胞悬液中的红血细胞。细胞用PBS洗涤两次，然后进一步处理用于流式细胞术或ADCC(见下文)。
流式细胞术(“FACS”)所有染色在96孔圆底培养平板(Nalge Nunc)内进行，其中每个孔中含有2×105个细胞。将细胞与所示浓度的Fab或IgG抗体在50μl FACS缓冲液(PBS、3％FCS、0.02％NaN3)中于4℃培育40分钟。将细胞洗涤两次，然后与以1∶200稀释于FACS缓冲液的R-藻红蛋白(PE)偶联的羊抗人或羊抗鼠IgG(H+L)F(ab′)2(Jackson Immune Research)于4℃培育30分钟。再次洗涤细胞，将其重悬于0.3ml FACS缓冲液，然后在FACSCalibur(BectonDickinson，San Diego，CA)中通过流式细胞术分析。
为进行基于FACS的Scatchard分析，用从12.5μg/ml(IgG)终浓度起始的12种不同稀释物(1∶2n)着色。对每个浓度进行至少两次独立的测量并按照Chamow等(1994)的方法从荧光强度中值外推KD值。
表面等离子共振采用BIAcore 3000设备(Biacore，乌普萨拉，瑞典)用结合到共价固定的CD38-Fc融合蛋白的各种Fab的连续稀释液来确定动力学常数kon和koff。为了进行共价抗原固定，使用标准EDC-NHS胺偶联化学。为了直接偶联CD38Fc-融合蛋白，在10mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)中用约600-700RU涂布CM5传感器(senor)芯片(Biacore)。为了参考流动细胞，使用各种量的HSA(人血清白蛋白)。动力学测量在PBS(136mM NaCl、2.7mM KCl、10mMNa2HPO04、1.76mM KH2PO4pH 7.4)中以20μl/分钟的流速进行，Fab浓度范围为1.5-500nM。各浓度的注射时间为1分钟，然后解离2分钟。使用5μl 10mM HCl再生。用BIA评估软件3.1(Biacore)局部拟合所有传感图(sensogram)。
实施例1从HuCAL文库产生抗体为产生抗CD38的治疗抗体，用MorphoSys HuCAL GOLD噬菌体展示文库进行选择。HuCAL GOLD是一种基于HuCAL概念(Knappik等，2000；Krebs等，2001)的Fab文库，其中所有6个CDR都是多样化的，且它采用CysDisplayTM技术将Fab片段连接到噬菌体表面(Lhning，2001)。
A.噬菌粒收集，噬菌体扩增和纯化HuCAL GOLD噬菌粒文库在含有34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖的2×TY培养基(2×TY-CG)内扩增。在OD600为0.5时感染辅助噬菌体(VCSM13)(37℃不振荡30分钟；37℃以250rpm振荡30分钟)，然后将细胞甩下(4120g；5min；4℃)，重悬于2×TY/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素，并于22℃生长过夜。从上清液用PEG沉淀噬菌体，重悬于PBS/20％甘油中，并于-80℃储存。如下进行两轮淘选(panning)之间的噬菌体扩增中期-对数期TG1细胞用洗脱的噬菌体感染并涂布到添加有1％葡萄糖和34μg/ml氯霉素的LB-琼脂(LB-CG)上。在30℃培育过夜之后，刮下集落，将OD600调节到0.5并如上所述加入辅助噬菌体。
B.用HuCALGOLD淘选为了进行选择，根据不同的VH主基因将HuCAL GOLD抗体-噬菌体分成3份(第1份VH1/5λκ，第2份VH3λκ，第3份VH2/4/6λκ)。这几份在CD38表达CHO-K1细胞上各自进行3轮全细胞淘选，然后进行pH-洗脱并在CD38阴性CHO-K1细胞上进行吸附后步骤以除去无关的抗体-噬菌体。最后用剩余的抗体噬菌体来感染大肠杆菌TG1细胞。离心之后将细菌团重悬于2×TY培养基，涂布于琼脂平板并在30℃培育过夜。然后从平板上刮下选出的克隆，收集噬菌体并扩增。像第一轮一样进行第二和第三轮选择。
将所选HuCAL GOLD噬菌体的Fab编码插入片段亚克隆入表达载体pMORPHx9_Fab_FS(Rauchenberger等，2003)以便于快速表达可溶性Fab。所选克隆的DNA用XbaI和EcoRI消化从而切开Fab编码插入片段(ompA-VLCL和phoA-Fd)，并克隆入XbaI/EcoRI切割载体pMORPHx9_Fab_FS中。该载体中表达的Fab带有两个C-末端标签(FLAGTMh Strep-tagII)以供检测和纯化。
实施例2生物测定按照公开的基于流式细胞术分析的方法(Naundorf等，2002)测量抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性，如下ADCC为了测量ADCC，将靶细胞(T)调节至2.0E+05个细胞/ml，并于室温在RPMI1640培养基(Pan biotech GmbH)中用100ng/ml钙黄绿素AM(Molecular Probes，C-3099)标记2分钟。在RPMI1640培养基中洗涤3次以除去残余的钙黄绿素。同时，制备PBMC作为(自然杀伤)效应细胞(E)的来源，调节至1.0E+07并与标记的靶细胞混合，根据测定条件使最终的ET比例为50∶1或更低。将细胞洗涤一次并将细胞混合物重悬于200μl含有不同稀释度的各种抗体的RPMI1640培养基中。平板在37℃和5％CO2的标准条件下在湿润的培养箱中培育4小时。FACS分析之前用碘化丙锭(PI)标记细胞并通过流式细胞术(Becton-Dickinson)分析。每次测定计数50.000和150.000之间的事件。用下面的公式计算杀伤活性[％] 其中，EDA＝死亡细胞事件(钙黄绿素+PI染色细胞)，和ELA＝存活细胞事件(钙黄绿素染色细胞)CDC为了测量CDC，在微滴定孔板(Nunc)中加入5.0E+04 CD38 CHO-K1转染子以及1∶4稀释的人血清(Sigma，#S-1764)和各种抗体。将所有试剂和细胞稀释于添加有10％FCS的RPMI1640培养基(Pan biotech GmbH)中。将该反应混合物在37℃和5％CO2的标准条件下在湿润的培养箱中培育2小时。阴性对照是热灭活的补体或不含抗体的CD38-转染子。细胞用PI标记并进行FACS分析。
总共计数5000个事件，并用不同抗体浓度下死亡细胞的数目来确定EC50值。用下面的公式计算杀伤活性[%] 其中，EDC＝死亡细胞事件(PI染色细胞)，和ELC＝存活细胞事件(未染色的)
就每种抗体而言，总共有12种不同的抗体稀释液(1∶2n)的细胞毒性值一式三份用于ADCC，一式两份用于CDC，以便用标准分析软件(PRISM，Graph Pad Software)获得EC-50值。
实施例3产生稳定的CD38-转染子和CD38Fc融合蛋白为了产生CD38蛋白以用于淘选和筛选，不得不建立两种不同的表达系统。第一种方法包括产生CD38-Fc融合蛋白，该蛋白在短暂转染HEK293细胞后从上清液中纯化。第二种方法包括产生稳定的CHO-K1-细胞系以用高CD38表面表达通过全细胞淘选来选择抗体-噬菌体。
最初的步骤是用Jurkat细胞(DSMZ ACC282)来产生cDNA(Invitrogen)，然后用分别与CD38的前7个和后9个密码子互补的引物(引物MTE001和MTE002rev；表4)扩增完整的CD38编码序列。CD38插入序列的序列分析证实，Jackson等(1990)公开的氨基酸序列的第49位为谷氨酰胺，不同于Nata等(1997)描述的酪氨酸。为了引入限制性内切核酸酶位点并克隆入表达载体pcDNA3.1(Stratagene)的不同衍生物中，将纯化的PCR产物作为模板重新扩增其完整基因(引物MTE006和MTE007rev，表4)或部分基因(引物MTE004和MTE009rev，表4)。在后一种情况下，编码胞外域(氨基酸45-300)的片段得到扩增并将其克隆入位于人Vκ梯序列和人Fc-γ1序列之间的构架中。这种载体是产生可溶CD38-Fc融合蛋白的表达载体。另一种不含前导序列的pcDNA3.1衍生物被用来插入到CD38全长基因中。此时，Fc编码区之前的终止密码子和缺失的前导序列使CD38在表面表达。用Fc融合蛋白载体短暂转染HEK293细胞以产生可溶的CD38-Fc融合蛋白，且如果是全长衍生物则转染CHO-K1细胞以产生稳定的CD38表达细胞系。
表4 *在正义方向产生终止密码子(TGA)。
实施例4HuCACIgG1的克隆、表达和纯化为了表达全长IgG，将重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域片段从Fab表达载体亚克隆入合适的pMORPH_hIg载体中(见图8-10)。采用限制性内切核酸酶对BlpI/MfeI(制备插入片段)和BlpI/EcoRI(制备载体)将VH结构域片段亚克隆入pMORPH_hIgG1。用内切酶对EcoRV/HpaI(λ插入片段)和EcoRV/BsiWI(κ插入片段)将VL结构域片段亚克隆入各自的载体pMORPH_hIgκ_1或pMORPH_h Igλ1中。采用标准磷酸钙-DNA共沉淀技术短暂转染以使所得到的IgG构建体在HEK293细胞(ATCC CRL-1573)中表达。用蛋白质A琼脂糖凝胶柱通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化IgG。接下来的处理包括通过凝胶过滤进行缓冲液交换和无菌过滤纯化的IgG。质量控制显示纯度＞90％(通过还原性SDS-PAGE测定)、单体IgG＞90％(通过分析型大小排阻层析测定)。该物质的内毒素含量通过基于动力学LAL的测定法((Cambrex European Endotoxin Testing Service，比利时)确定。
实施例5产生和制备嵌合OKT10(chOKT10；SEQ ID NO23和24)
为构建chOKT10，用从鼠OKT10杂交瘤细胞系(ECACC#87021903)制得的cDNA通过PCR扩增小鼠的VH和VL区。采用公开的一组引物(Dattamajumdar等，1996；Zhou等，1994)。PCR产物用于Topo-克隆(Invitrogen；pCRII-载体)并对单克隆进行序列分析(M13反向引物)，分析结果显示有两种不同的κ轻链序列和一种重链序列。根据序列比对(EMBL核苷酸序列数据库)和文献(Krebber等，1997)，κ序列之一属于肿瘤细胞融合伴侣X63Ag8.653的内部成分因此不属于OKT10抗体。因此只有一个新的κ序列和一个VH片段被进一步克隆。这两个片段都被重新扩增以插入限制性内切核酸酶位点，然后再克隆入各自的pMORPHIgG1-表达载体。重链(SEQ ID NO23)和轻链(SEQ ID NO24)的序列示于图6。短暂转染HEK293细胞并用FACS分析上清中的与CD38过表达Raji细胞系(ATCC)结合的嵌合OKT10抗体。
实施例6表位作图1.材料和方法抗体以下抗CD38IgG被用于表位作图
*嵌合OKT10由人Fc和小鼠可变区构成。
CD38序列氨基酸(aa)序列(第44-300位)基于人CD38，其获自SWISS-PROT主登录号为P28907的公开序列。氨基酸第49位的Q(而不是T)被用于肽设计。
PepSpot分析以逐步方式在纤维素膜上分析抗原肽得到规定的排列(肽阵列)并将抗原肽共价结合到纤维素膜上。在肽阵列上直接进行结合试验。通常将抗原肽阵列与封闭缓冲液一起培育数小时以减少抗体的非特异性结合。在封闭缓冲液中与初级抗原肽结合)抗体一起培育，然后与选择性结合初级抗体的过氧化物酶(POD)标记的次级抗体一起培育。将抗原肽阵列与次级抗体一起培育之后直接用T(Tween)-TBS缓冲液短暂洗涤，然后进行第一化学发光试验而得到哪些抗原肽结合初级抗体的第一概况。接下来再用缓冲液洗涤数次(T-TBS缓冲液和TBS缓冲液)以除去假阳性结合(结合到纤维素膜上的非特异性抗体)。这些洗涤步骤之后进行最终的化学发光分析。像对各个肽的单次测量一样用显示信号强度的成像系统(Boehringer Light units，BLU)分析数据。为了评价次级抗体(抗人IgG)的非特异性结合，将这些抗体在不含初级抗体的情况下如第一个步骤一样与肽阵列一起培育。如果该初级抗体不显示出任何与该肽的结合则可直接用POD标记，这样可增加该系统的灵敏度(如对MOR3077进行的那样)。在这种情况下，通过游离氨基酸执行常规偶联化学。用13聚肽(11个氨基酸重叠)扫描抗原。这样可产生123个肽的阵列。结合试验在阵列上直接进行。用过氧化物酶标记的次级抗体(过氧化物酶偶联的羊抗人IgG，γ链特异的、亲和分离的抗体；Sigma-Aldrich，A6029)检测肽结合的抗体MOR03077、MOR03079、MOR03080、MOR03100和嵌合OKT10。用化学发光物质和成像系统进行作图。此外，用POD直接标记MOR03077以提高系统的灵敏度。
2.总结和结论
所有5种抗体在PepSpot分析中显示不同曲线。图7给出了示意图，其中可看出CD38的不同氨基酸序列。可清楚看出MOR03079和嵌合OKT10的表位是线型的。推定MOR03079的表位在CD38的氨基酸192-206(VSRRFAEAACDVVHV)之间，而嵌合OKT10的表位主要位于氨基酸284和298(FLQCVKNPEDSSCTS)之间。后一种结果证实了亲本鼠OKT10的公开数据(Hoshino等，1997)，该数据推定其表位在氨基酸280-298之间。然而，对于更加精确的表位确定和关键氨基酸(抗原抗体的主要相互作用位点)的确定，可采用肽VSRRFAEAACDVVHV和FLQCVKNPEDSSCTS的简化形式和对这两者进行丙氨酸扫描。
由于一些肽覆盖了不同的蛋白质位置，因此MOR03080和MOR03100的表位无疑是非连续的。这些肽包括MOR03080的氨基酸82-94和氨基酸158-170以及MOR03100的氨基酸82-94、142-154、158-170、188-200和280-296。然而，可以推定这两个表位间的一些重叠，因为两个抗体均识别氨基酸位置82-94(CQSVWDAFKGAFI；肽#20)和158-170(TWCGEFNTSKINY；肽#58)内的两个不同位点。
MOR03077的表位明显不同于后两者，也可描述成多节(multisegmented)不连续表位。其表位包括氨基酸44-66、110-122、148-164、186-200和202-224。
实施例7IL-6-释放/增殖试验1.材料和方法按照Ausiello等(2000)的方法作以下改进进行增殖和IL-6释放试验采用Histopaque细胞分离系统按照供应商(Sigma)的说明通过密度梯度离心纯化来自健康供体(得到同意之后)的PBMC，并在标准条件(5％CO2，37℃)下在添加有10％FCS和谷氨酰胺的RPMI1640培养基(“完全RPMI1640”)中培养细胞。对这两个试验使用以下抗体HuCAL抗CD38 IgG1单克隆抗体MOR03077、MOR03079和MOR03080，激动性鼠IgG2a单克隆抗体(IB4；Malavasi等，1984)，无关HuCALIgG1抗体，匹配的同种型对照(鼠IgG2a抗三硝基苯酚、半抗原特异性抗体；编号555571，G155-178克隆；BectonDickinson)或培养基对照。为了进行IL-6释放试验，在存在20μg/ml抗体时将0.5ml完全RPMI1640培养基中的1.0E+06 PBMC在15ml培养试管(Falcon)中培育24小时。收获细胞培养物上清并用Quantikine试剂盒按照制造商(R&D systems)的方法分析IL-6释放。为了进行增殖试验，在存在20μg/ml抗体时将2.0E+05PBMC在96孔平底平板(Nunc)内培育3天。每种试验进行两次。4天后在每个孔中加入BrdU，将细胞在37℃再培育24小时，然后固定细胞并按照供应商(Roche)的方法使DNA变性。在基于化学发光的装置中通过抗BrdU过氧化物酶偶联抗体测量BrdU的掺入。
2.总结和结论增殖试验除了具有环状ADP-核糖环化酶和水解酶的催化活性外，CD38显示出生物相关的信号转导能力(Hoshino等，1997；Ausiello等，2000)。那些功能可通过例如受体-配体相互作用或者通过与抗CD38抗体交联在体内诱导。那些信号发生事件引起例如钙运动、淋巴细胞增殖和细胞因子释放。然而，这种信号发生不仅依赖于抗原性表位，而且在供体和供体之间也可变化(Ausiello等，2000)。从免疫治疗的观点看来，相比激动性抗体，更优选非激动性抗体。因此，在增殖试验和IL-6(重要的MM生长因子)释放试验中进一步表征HuCAL抗CD38抗体(Mab MOR03077、MOR03079、MOR03080)，将它们与参考抗体chOKTI0和激动性抗CD38单克隆抗体IB4进行比较。
如图11和图12所示，相比激动性抗体IB4，HuCAL抗CD38抗体Mab#1、2和3以及参考抗体chOKT10和相应的阴性对照显示没有或仅有弱的增殖诱导，并且没有IL-6释放。
实施例8克隆生成试验1、材料和方法采用Histopaque细胞分离系统按照供应商(Sigma)的说明通过密度梯度离心从健康个体(得到同意之后)分离包含自体CD34+/CD38+前体细胞的PBMC，并与10μg/ml不同的HuCALIgG1抗CD38抗体(Mab MOR03077、MOR03079和MOR03080)及阳性对照(PC)chOKT10一起培育。培养基和无关HuCALIgG1作为背景对照。每次ADCC试验包括将4.0E+05PBMC在添加有10％FCS的RPMI1640培养基中于37℃培育4小时。为了进行克隆生成试验，在2.50ml“完全”甲基纤维素(CellSystems)上接种2.5E+05来自ADCC试验的细胞并在受控环境(37℃；5％CO2)下培育至少14天以形成集落。集落由两名独立的操作员来分析并分成BFU-E+CFU-GEMM(红系暴发集落形成单位和粒细胞/红系细胞/巨噬细胞/巨核细胞干细胞)和CFU-GM(粒细胞/巨噬细胞干细胞)。
2.总结和结论由于不仅在骨髓(例如单核细胞、粒细胞)和淋巴谱系(例如活化的B和T细胞；浆细胞)的免疫细胞上发现了CD38的表达，还在各自的前体细胞(CD34+/CD38+)上发现了CD38的表达，因此那些细胞不受抗体介导的杀伤影响很重要。因此，采用产克隆试验来分析对CD34+/CD38+前体的影响。
按照标准ADCC方法将来自健康供体的PBMC与HuCAL抗CD38抗体(Mab#1、Mab#2和Mab#3)或一些对照(无关HuCAL抗体、培养基和作为阳性对照的参考抗体chOKT10)一起培育，然后在润湿的甲基纤维素上继续培育以产生集落。如图13所示，相比无关抗体或参考抗体，所有HuCAL抗CD38抗体的集落形成单位未显著减少。
实施例9用不同细胞系和原发性多发性骨髓瘤细胞进行的ADCC试验1.材料和方法MM患者样品的分离和ADCC从多发性骨髓瘤患者(得到同意之后)获得骨髓吸出物。密度梯度离心(Sigma)后通过标准方法用抗CD38磁珠(Milteny Biotec)纯化恶性细胞。按上文的描述进行ADCC试验。
2.总结和结论一些衍生自不同恶性肿瘤的细胞系被用于ADCC以显示HuCAL抗CD38抗体对多种细胞系，包括不同来源和不同CD38表达水平的细胞系的细胞毒效应。如图14所示，在恒定抗体浓度(5μg/ml)及E∶T比例为30∶1时所有细胞都被ADCC杀伤。患者的一些多发性骨髓瘤样品也显示出经ADCC产生的细胞毒性。所有HuCAL抗CD38抗体能够剂量依赖性地杀伤MM细胞，其EC50值在0.006和0.249nM之间(图15)。
实施例10通过FACS和免疫组织化学(IHC)进行交叉反应性分析1.材料和方法
扁桃体的IHC为了进行IHC，将HuCAL抗CD38 Mab和无关阴性对照抗体转变成二价dHLX形式(Plückthun&Pack，1997)。用Leica CM3050恒冷切片机切得来自短尾猴、恒河猴和人(从奥地利格拉茨大学病理学研究所的档案中找到)淋巴结的5μm冷冻切片。将切片空气干燥30分钟至1小时，在冰冷的甲醇中固定10分钟并用PBS洗涤。为检测dHLX形式，组合使用小鼠抗His抗体(Dianova)及Envision试剂盒(DAKO)。为了检测抗CD38小鼠抗体(例如参考小鼠单克隆OKT10)，仅使用Envison试剂盒。
淋巴细胞的FACS分析从健康人类(得到同意之后)、恒河猴和短尾猴获得EDTA处理的血样并用Histopaque细胞分离系统按照供应商(Sigma)的说明进行密度梯度离心。为了进行FACS分析，将分裂间期的细胞和初级抗体(HuCAL抗CD38和阴性对照Mab作为鼠IgG2a或Fab形式，阳性对照鼠抗体OKT10和匹配的同种型对照)一起培育，然后和抗M2 Flag(Sigma；仅用于Fab形式)和藻红蛋白(PE)标记的抗小鼠偶联物(Jackson Research)一起培育。在门控淋巴细胞群上进行FACS分析。
2.总结和结论分析HuCAL抗CD38以了解种间CD38交叉反应性。在FACS和IHC中，所有的抗CD38 Mab都能够检测淋巴细胞上的人CD38，只有MOR03080和阳性对照OKT10与短尾猴和恒河猴CD38有额外的反应性(将表5交叉反应分析)。
表5
++强阳性染色；-无染色；NC阴性对照；PC阳性对照(即参考cMAb)实施例11用MOR03080处理小鼠(使用RPMI8226细胞系)中的人骨髓瘤异种移植物1.建立皮下小鼠模型由Aurigon Life Science GmbH(Tutzing，德国)在雌性C.B-17-SCID小鼠内建立人骨髓瘤衍生的的肿瘤细胞系RPMI8226的皮下小鼠模型，方法如下在第-1、0和1天，静脉内给予可除去SCID小鼠内的异反应性(xenoreactive)NK细胞的抗asialo GM1多克隆抗体(ASGM)(WAKO-Chemicals)，以便消除C.B-17-SCID小鼠内任何残留的特异性免疫反应。在第0天将用50μl PBS配制的5×106或1×107RPMI8226肿瘤细胞皮下接种到用ASGM(如上所述)处理或未处理的小鼠的右肋(每组5只小鼠)。所有4个接种组的肿瘤发展情况都是类似的，用或不用抗asialo GM1抗体处理或以不同细胞数接种没有发现显著差异。肿瘤似乎以大小停滞或摆动的趋势缓慢生长数天。在整个研究期间两个肿瘤的大小来回摆动，并有一个肿瘤甚至从321mm3的峰体积完全消失。用这种肿瘤模型进行的处理研究每组应有较多数量的肿瘤接种动物。
2.用MOR03080处理2.1研究目的由Aurigon Life Science GmbH(Tutzing，Germany)进行该研究以比较腹膜内施用的抗体(HuCAL抗CD38)相对于载体治疗(PBS)的抗肿瘤功效。用不同的量和治疗方案测试人抗体hMOR03080(同种型IgG1)。此外还测试了嵌合抗体chMOR03080(同种型IgG2a用与实施例5构建嵌合OKT10(鼠VH/VL和人恒定区)相类似的方法构建的含有MOR03080可变区和鼠恒定区的嵌合抗体)。选择RPMI8226癌细胞系作为模型并如上所述将其皮下接种到雌性SCID小鼠。根据体重(b.w)、肿瘤体积和临床病征判断研究终点。
2.2抗体和载体抗体以随时可用的形式提供给Aurigon，其浓度为2.13mg/ml(MOR03080 hIgG1)和1.73mg/ml(MOR03080 chIgG2a)，并于-80℃储存直到使用。将抗体解冻并用PBS稀释成各自的终浓度。运载体(PBS)以随时可用的形式提供给Aurigon并于4℃储存直到使用。
2.3动物规格说明种类小鼠品种Fox chase C.B-17-scid(C.B-Igh-lb/IcrTac)数量和性别75只，雌性供应商Taconic M&B，Bomholtvej 10，DK-8680 Ry健康状况SPF体重约18g驯化9天2.4肿瘤细胞系生长肿瘤细胞(RPMI8226细胞系)并将其送到Aurigon Life ScienceGmbH，在Aurigon分裂细胞并再生长一个细胞周期。Aurigon在接种当天制备注射用的细胞。用于繁殖细胞的培养基是添加有5％FCS、2mM L-谷氨酰胺和PenStrep的RPMI 1640。细胞显示没有不希望的生长速度或行为。
为了进行接种，将肿瘤细胞悬浮于PBS并用PBS将终浓度调至1×107细胞/50μl。注射前充分混合肿瘤细胞悬液。
2.5试验过程在第0天，将1×107RPMI8226肿瘤细胞皮下接种到75只SCID小鼠的右背肋。在接种后直接随机选择15只动物组成第一组(组5)。该组在第14-36天隔天用1mg/kg b.w.hIgG1-MOR03080处理。在第31天将所有其它60只动物分成4组，每组10只动物(肿瘤体积约92mm3)。组1-4由平均肿瘤大小和标准偏差相当的动物组成。选择显示出相对较小肿瘤体积(肿瘤体积约为50mm3)的5只动物组成另外一组(组6)以便与预处理的组5进行比较(除3只以外，所有小鼠的肿瘤体积小于10mm3，一只约22mm3，一只约44mm3，还有一只约119mm3)。组1-4在第32-68天隔天用PBS(运载体；组1)、1mg/kgb.w.hIgG1-MOR03080(组2)、5mg/kg b.w.hIgG1-MOR03080(组3)或5mg/kgb.w.chIgG2a-MOR03080(组4)处理。组6未接受任何处理(见表6)。肿瘤体积、体重和临床表征每周测量两次直到研究结束。
表6
2.6结果临床发现和致死未观察到与特定肿瘤或物质有关的临床发现或致死。在组3(hIgG1 5mg/kg)中，4只动物在采集血样时死亡(1只在第3天，1只在第34天；2只在第52天)。在组4(muIgG2a 1mg/kg)中，4只动物在采集血样时死亡(第34天)。在研究期间死亡的所有其它动物都是由于肿瘤大小(过大)被安乐死的。
体重增加与组1(载体)相比未观察到与药物有关的对体重增加的干扰。在组3(hIgG1 5mg/kg)和4(muIgG2a 5mg/kg)中，体重显著受到血样采集的影响。除了这种影响，所有组的平均体重增加都是连续的。
肿瘤发展(见图16)在组1(运载体)中，发现肿瘤生长以预期速度缓慢发展。由于这种细胞系有明确的标准偏差值，因此最大和最小的肿瘤被排除以进行进一步的统计分析。组1的动物的肿瘤生长与组6(未处理)的肿瘤生长相当，尽管组6是在第31天由平均肿瘤体积较小的动物组成的。因此，治疗对肿瘤生长速度只有轻微影响。在组1中，2只小鼠由于肿瘤大小在第83天之前被安乐死，另有1只在第87天之前被安乐死，因此肿瘤体积的平均值在第80天之后不再有代表性。在组6中，1只小鼠由于肿瘤大小在第80天之前被安乐死，2只在第83天之前，另1只在第87天之前被安乐死，因此肿瘤体积的平均值在第76天之后不再有代表性。
在用1mg/kg b.w.的hIgG1处理的组2中，1只动物由于肿瘤生长到肌肉组织内(这通常会提高肿瘤生长速度)而从进一步的分析中被排除。与对照组1(运载体)相比，平均肿瘤大小从第45天起开始显著不同直到研究结束。治疗结束(第68天)后未观察到肿瘤生长加快。
相比组1(运载体)，组3(5mg/kg b.w. hIgG1)的动物显示出肿瘤生长显著降低，在第38天起直到第83天都有统计学显著性。治疗结束后约2周平均肿瘤体积开始强烈重新生长。10个肿瘤中的1个在第45天消失，且直到治疗结束后的第19天都没有重新生长。
从92mm3肿瘤体积起始的所有治疗组的最佳表现出现在组4(5mg/kgb.w.muIgG2a)，其平均肿瘤体积明显减小，并且在观察期结束时4只动物内的肿瘤甚至消失。与组1(运载体)的平均肿瘤体积的差异从第38天起开始高度显著直到研究结束。
在第14-36天用1mg/kg b.w.hIgG1进行的早期研究(组5)显示对肿瘤发展有早期和长期影响。1只动物由于肿瘤生长到肌肉组织内而从进一步的分析中被排除。在第31天，与其它接种动物相比，只有5只动物在接种部位有可测量的肿瘤，而60只动物中只有2只对肿瘤接种无反应。肿瘤进展被延迟约31天(将对照组1第52天的情况和组5第83天的情况相比)。约50％的动物在研究结束时在接种部位未显示出肿瘤。
2.7结论相比组1(对照)，未观察到与特定肿瘤或物质有关的临床发现或致死。
未观察到与药物有关的对体重增加的干扰。
RPMI8226肿瘤细胞的肿瘤生长在治疗后的效果顺序如下减低hIgG1 1mg/kg，14-36天隔天处理(组5)＞muIgG2a 5mg/kg，32-68天隔天处理(组4)＞hIgG1 5mg/kg，32-68天隔天处理(组3)＞hIgG1 1mg/kg 32-68天隔天处理(组2)。在组2-4中，平均肿瘤体积在治疗结束后再次增加到可变程度。
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Zhou，H.，Fisher，R.J.，Papas，T.S.(1994).Optimization of primer sequences for.
权利要求
1.分离的人或人源化抗体或其功能性片段，其包含特异于CD38(SEQID NO22)的表位的抗原结合区，其中，当将人PBMC细胞用作效应细胞时，在相同或基本相同的条件下，所述抗体或其功能性片段能够以优于嵌合OKT10(SEQ ID NO23和24)至少5倍的效力通过ADCC介导CD38+靶细胞杀伤，其中所述CD38+靶细胞选自LP-1(DSMZACC41)和RPMI-8226(ATCCCCL-155)，且其中效应细胞与靶细胞的比例约为30∶1至50∶1。
2.如权利要求1所述的抗体或其功能性片段的分离的抗原结合区。
3.如权利要求2所述的分离的抗原结合区，其包含SEQ ID NO5、6、7或8所示的H-CDR3区。
4.如权利要求3所述的分离的抗原结合区，其还包含SEQ ID NO5、6、7或8所示的H-CDR2区。
5.如权利要求4所述的分离的抗原结合区，其还包含SEQ ID NO5、6、7或8所示的H-CDR1区。
6.如权利要求5所述的分离的抗原结合区，其包含SEQ ID NO5、6、7或8所述的可变重链。
7.如权利要求2所述的分离的抗原结合区，其包含SEQ ID NO13、14、15或16所示的L-CDR3区。
8.如权利要求7所述的分离的抗原结合区，其还包含SEQ ID NO13、14、15或16所示的L-CDR1区。
9.如权利要求8所述的分离的抗原结合区，其还包含SEQ ID NO13、14、15或16所示的L-CDR2区。
10.如权利要求9所述的分离的抗原结合区，其包含SEQ ID NO13、14、15或16所示的可变轻链。
11.如权利要求2所述的分离的抗原结合区，其包含选自下组的重链氨基酸序列(i)SEQ ID NO5、6、7或8；和(ii)其CDR区与SEQ ID NO5、6、7或8所示的CDR区有至少60％序列相同性的序列。
12.如权利要求2所述的分离的抗原结合区，其包含选自下组的轻链氨基酸序列(i)SEQ ID NO13、14、15或16；和(ii)其CDR区与SEQ ID NO13、14、15或16所示的CDR区有至少60％序列相同性的序列。
13.如权利要求1所述的分离的抗体，其为IgG。
14.如权利要求13所述的分离的抗体，其为IgG1。
15.分离的人或人源化抗体或其功能性片段，其包含特异于CD38(SEQID NO22)的表位的抗原结合区，其中，在相同或基本相同的条件下，所述抗体或其功能性片段能够以优于嵌合OKT10(SEQ ID NO23和24)至少2倍的效力通过CDC介导CD38转染的CHO细胞杀伤。
16.如权利要求15所述的抗体或其功能性片段的分离的抗原结合区。
17.如权利要求16所述的分离的抗原结合区，其包含SEQ ID NO5、6或7所示的H-CDR3区。
18.如权利要求17所述的分离的抗原结合区，还包含SEQ ID NO5、6或7所示的H-CDR2区。
19.如权利要求18所述的分离的抗原结合区，还包含SEQ ID NO5、6或7所示的H-CDR1区。
20.如权利要求19所述的分离的抗原结合区，其包含SEQ ID NO5、6或7所示的可变重链。
21.如权利要求16所述的分离的抗原结合区，其包含SEQ ID NO13、14或15所示的L-CDR3区。
22.如权利要求21所述的分离的抗原结合区，其还包含SEQ ID NO13、14或15所示的L-CDR1区。
23.如权利要求22所述的分离的抗原结合区，其还包含SEQ ID NO13、14或15所示的L-CDR2区。
24.如权利要求23所述的分离的抗原结合区，其包含SEQ ID NO13、14或15所示的可变轻链。
25.如权利要求16所述的分离的抗原结合区，其包含选自下组的重链氨基酸序列(i)SEQ ID NO5、6或7；和(ii)其CDR区与SEQ ID NO5、6或7所示的CDR区有至少60％序列相同性的序列。
26.如权利要求16所述的分离的抗原结合区，其包含选自下组的轻链氨基酸序列(i)SEQ ID NO13、14或15；和(ii)其CDR区与SEQ ID NO13、14或15所示的CDR区有至少60％序列相同性的序列。
27.如权利要求15所述的分离的抗体，其为IgG。
28.如权利要求27所述的分离的抗体，其为IgG1。
29.分离的人或人源化抗体或其功能性片段，其包含特异于CD38的表位的抗原结合区，其中，所述表位包含CD38(SEQ ID NO22)氨基酸残基1-215中的一个或多个氨基酸残基。
30.如权利要求29所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述表位包含选自CD38氨基酸段44-66、82-94、142-154、148-164、158-170和192-206中的一个或多个氨基酸段中所含的一个或多个氨基酸残基。
31.如权利要求29所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述表位是是线型表位。
32.如权利要求31所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区包含SEQ ID NO6所示的H-CDR3区。
33.如权利要求32所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区还包含SEQ ID NO6所示的H-CDR2区。
34.如权利要求33所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区还包含SEQ ID NO6所示的H-CDR1区。
35.如权利要求31所述的分离的抗体或其功能性片段，其包含SEQ IDNO6所示的可变重链。
36.如权利要求31所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区包含SEQ ID NO14所示的L-CDR3区。
37.如权利要求36所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区还包含SEQ ID NO14所示的L-CDR1区。
38.如权利要求37所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区还包含SEQ ID NO14所示的L-CDR2区。
39.如权利要求31所述的分离的抗体或其功能性片段，其包含SEQ IDNO14所示的可变轻链。
40.如权利要求31所述的分离的抗体或其功能性片段，其包含选自下组的重链氨基酸序列(i)SEQ ID NO6；和(ii)其CDR区与SEQ ID NO6所示的CDR区有至少60％序列相同性的序列。
41.如权利要求31所述的分离的抗体或其功能性片段，其包含选自下组的轻链氨基酸序列(i)SEQ ID NO14；和(ii)其CDR区与SEQ ID NO14所示的CDR区有至少60％序列相同性的序列。
42.如权利要求31所述的分离的功能性片段，其为Fab或scFv抗体片段。
43.如权利要求31所述的分离的抗体，其为IgG。
44.如权利要求43所述的分离的抗体，其为IgG1。
45.如权利要求29所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述表位为构象表位。
46.如权利要求45所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区包含SEQ ID NO5、7或8所示的H-CDR3区。
47.如权利要求46所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区还包含SEQ ID NO5、7或8所示的H-CDR2区。
48.如权利要求47所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区还包含SEQ ID NO5、7或8所示的H-CDR1区。
49.如权利要求45所述的分离的抗体或其功能性片段，其包含SEQ IDNO5、7或8所示的可变重链。
50.如权利要求45所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区包含SEQ ID NO13、15或16所示的L-CDR3区。
51.如权利要求50所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区还包含SEQ ID NO13、15或16所示的L-CDR1区。
52.如权利要求51所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述抗原结合区还包含SEQ ID NO13、15或16所示的L-CDR2区。
53.如权利要求45所述的分离的抗体或其功能性片段，其包含SEQ IDNO13、15或16所示的可变轻链。
54.如权利要求45所述的分离的抗体或其功能性片段，其包含选自下组的重链氨基酸序列(i)SEQ ID NO5、7或8；和(ii)其CDR区与SEQ IDNO5、7或8所示的CDR区有至少60％序列相同性的序列。
55.如权利要求45所述的分离的抗体或其功能性片段，其包含选自下组的轻链氨基酸序列(i)SEQ ID NO13、15或16；和(ii)其CDR区与SEQID NO13、15或16所示的CDR区有至少60％序列相同性的序列。
56.如权利要求45所述的分离的功能性片段，其为Fab或scFv抗体片段。
57.如权利要求45所述的分离的抗体，其为IgG。
58.如权利要求57所述的分离的抗体，其为IgG1。
59.分离的抗体或其功能性片段的可变重链，其由下列序列编码(i)包含SEQ ID NO1、2、3或4的核酸序列，或(ii)在高度严格条件下与SEQID NO1、2、3或4的互补链杂交的核酸序列，其中，所述抗体或其功能性片段特异于CD38的表位。
60.分离的抗体或其功能性片段的可变轻链，其由下列序列编码(i)包含SEQ ID NO9、10、11或12的核酸序列，或(ii)在高度严格条件下与SEQ ID NO9、10、11或12的互补链杂交的核酸序列，其中，所述抗体或其功能性片段特异于CD38的表位。
61.编码特异于CD38的表位的人抗体或其功能性片段的抗原结合区的分离的核酸序列。
62.编码分离的抗体或其功能性片段的可变重链的核酸序列，其包含(i)选自SEQ ID NO1、2、3和4的序列，或(ii)在高度严格条件下与SEQ IDNO1、2、3或4的互补链杂交的核酸序列，其中，所述抗体或其功能性片段特异于CD38的表位。
63.编码分离的抗体或其功能性片段的可变轻链的核酸序列，其包含(i)选自SEQ ID NO9、10、11和12的序列，或(ii)在高度严格条件下与SEQID NO9、10、11或12的互补链杂交的核酸序列，其中，所述抗体或其功能性片段特异于CD38的表位。
64.含有如权利要求61-63中任一项所述的核酸序列的载体。
65.含有如权利要求64所述的载体的分离细胞。
66.如权利要求65所述的分离细胞，其中，所述细胞是细菌细胞。
67.如权利要求65所述的分离细胞，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
68.药物组合物，所述药物组合物含有如权利要求1、15和29中任一项所述的抗体或其功能性片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
69.治疗与不希望存在的CD38+细胞有关的疾病或病症的方法，所述方法包括给予有此需要的个体有效量的如权利要求68所述的药物组合物。
70.如权利要求69所述的方法，其中，所述疾病或病症是血液病。
71.如权利要求70所述的方法，其中，所述血液病选自多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性骨髓性白血病和急性淋巴细胞性白血病。
72.如权利要求69所述的方法，其中，所述疾病或病症是炎性疾病。
73.如权利要求72所述的方法，其中，所述炎性疾病选自类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
74.靶向个体或细胞样品中的CD38+细胞的方法，所述方法包括使所述CD38+细胞接触如权利要求1、15和29中任一项所述的抗体或其功能性片段的步骤。
75.用CD38的表位来分离人或人源化抗体或其功能性片段的方法，其中所述抗体或其功能性片段包含特异于所述表位的抗原结合区，所述方法包括以下步骤a)使所述CD38的表位接触抗体文库；和b)分离所述抗体或其功能性片段，其中所述表位是线型表位。
76.如权利要求75所述的方法，其中，所述线型表位包含氨基酸残基192-206。
77.用CD38的表位来分离人或人源化抗体或其功能性片段的方法，其中所述抗体或其功能性片段包含特异于所述表位的抗原结合区，所述方法包括以下步骤a)使所述CD38的表位接触抗体文库；和b)分离所述抗体或其功能性片段，其中，所述表位是构象表位。
78.如权利要求77所述的方法，其中，所述构象表位包含选自CD38的氨基酸44-66、82-94、142-154、148-164、158-170和202-224的一个或多个氨基酸序列。
79.CD38的分离表位，其基本上由选自CD38的氨基酸44-66、82-94、142-154、148-164、158-170、192-206和202-224的氨基酸序列构成。
80.CD38的分离表位，其由选自CD38的氨基酸44-66、82-94、142-154、148-164、158-170、192-206和202-224的氨基酸序列构成。
81.含有CD38的分离表位和抗体文库以及使用说明书的试剂盒，所述CD38的分离表位包含一个或多个选自44-66、82-94、142-154、148-164、158-170、192-206和202-224的氨基酸段。
82.如权利要求1、15和29中任一项所述的人抗体，其中，所述人抗体是合成的人抗体。
83.如权利要求11、12、25和26中任一项所述的分离的抗原结合区，其中，所述序列相同性至少为80％。
84.如权利要求40、41、54或55所述的分离的抗体或其功能性片段，其中，所述序列相同性至少为80％。
全文摘要
本发明提供了重组抗原结合区以及含有这种抗原结合区的抗体和功能性片段，其特异于在各种疾病和症状中发挥重要作用的CD38。因此，这些抗体可用来治疗例如血液恶性肿瘤如多发性骨髓瘤。本发明的抗体还可用于诊断领域，以及用于研究CD38在恶性肿瘤相关疾病进展中的作用。本发明还提供了编码上述抗体的核酸序列、含有该核酸序列的载体、药物组合物和带有使用说明书的试剂盒。本发明还提供了CD38的分离的新表位及其使用方法。
文档编号A61P37/00GK1976950SQ200580012035
公开日2007年6月6日 申请日期2005年2月7日 优先权日2004年2月6日
发明者迈克尔·特萨, 尤特·伊格尔 申请人:莫佛塞斯公司