专利名称：儿茶素类的酯化物、其制造方法及含有该酯化物的饮食品或化妆品的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗菌活性，可望应用于饮食品或化妆品领域的儿茶素类或茶提取物的脂肪酸酯类。
背景技术：
在强烈渴求食品的安全·安心的时代，确保食品的安全性至关重要。随着对健康追求的提高，在一般食品中发展低盐化·低糖化的同时，食品中的水分活性上升，反而创造了微生物易于繁殖的环境。有文献报道，产生食物中毒的原因中约87％或87％以上是细菌性的[加藤洋次，2001，月刊食品化学(FOOD CHEMICALS)(monthly)8月号，第195页]。并且，虽说低温流通系统已很发达，但人们仍强烈希望确保食品的保存性、安全性。而且，饮料等虽经过加热杀菌处理，但同时耐热性芽孢菌又成为酸败的原因。
以往，以防止食品、化妆品的腐败和变质为目的，把对羟基苯甲酸、苯甲酸、山梨酸等作为化学合成保存剂使用。其添加于食品中时，被定义为食品添加物中的保存剂，使用时有严格的限制。同时还将果胶分解物、鱼精蛋白(protamine)、溶菌酶、茶提取物、日柏醇等作为食品添加物中的保存期延长剂使用。因这些天然抗菌剂抗菌活性弱，为完全防止腐败等需大量添加。另外，因其有效成分为精油成分的较多，芳香独特强烈及水溶性低，所以其使用范围和量均受到限制。
茶提取物虽安全且具有适当的水溶性，但使其充分发挥抗菌效果的浓度存在以下问题，即作为抗菌成分的儿茶素自身所产生的苦味和涩味等会影响食品的香味。为解决此问题，有文献公开了与环状糊精并用的方法(日本特开平3-168046)及使用蛋白质的方法[使用蛋白或植物蛋白质等的方法(日本特开平2-202900)及与脱脂蛋黄并用的组合物(日本特开2001-31669)]。同样，也有文献公开了以降低苦味和涩味、提高水溶性为目的，将茶提取物用环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶使儿茶素类α糖苷化(日本特开平8-298930)及用蔗糖磷酸化酶制造儿茶素类的α-糖苷(日本特开平5-176786)。但对这些经糖苷化了的物质在有损食品香味方面所得到的改善以及保持或提高抗菌性的方面，却完全未予记载。另外，在日本特开平11-116418中亦有如下记载，其以提供来自安全性高且廉价的天然物的抗菌物质为目的，通过致力研究绿茶饮料的加热温度和加热时间等可制造来自儿茶素类的抗菌物质。
同时，也有报道是关于茶儿茶素类、茶黄素类可使抗耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)的抗生物质的抗菌力增强(日本特开平9-132532)的内容。
如上所述，虽从抗菌性及安全性方面对以儿茶素类为主要成分的茶提取物进行了种种研究，但却均未达到既保持抗菌性、又不损伤食品香味及色泽的品质方面的深度。
因此，为适应消费者安全·安心的需求，更需要浓度低且具抗菌活性的抗菌材料。
并且，已知作为儿茶素类的脂肪酸酯衍生物是表没食子儿茶素的3位羟基的脂肪酸酯(S.Uesato et al，Bioorg.Med.Chem.Lett，10(2000)1673-75、及US Pat.2003/0105030A1)。其中虽记载了其具有促进抗肿瘤性活性或抑制5-α还原酶活性，但对抗菌活性未加记载。同时，上述S.Uesato et al中虽通过羧基酯酶进行酶合成，但其基质是由称为脂肪酸p-硝基苯酯的、反应性高的活性酯进行的酶反应，而不是通常的脂肪酸、烷基酯或甘油三酯。
特别是已知儿茶素的3位羟基的脂肪酸酯是癸酰基及棕榈酰酯(日本特开昭54-81274)。并记载了其对预防肝脏坏死及防止脂肪过氧化有效。但对儿茶素类的脂肪酸酯衍生物具有抗菌活性却丝毫未予记载。且未显示有关儿茶素及表儿茶素的辛酸酯的实施例。
专利文献1日本特开平3-16804专利文献2日本特开平2-202900专利文献3日本特开2001-31669专利文献4日本特开平8-298930
专利文献5日本特开平5-17678专利文献6日本特开平11-116418专利文献7日本特开平9-132专利文献8日本特开昭54-812非专利文献1加藤洋次，2001，月刊食品化学(FOODCHEMICALS)(monthly)8月号，第195页非专利文献2S.Uesato et al，Bioorg.Med.Chem.Lett，10(2000)1673-非专利文献3US P.0105030A1(2003年)发明内容本发明着眼于儿茶素类的抗菌活性，并在提高其活性的同时减少儿茶素类所具有的苦味·涩味，由此提供一种可用于饮料或加工食品的保存期延长及化妆品防菌，且作为对耐热性芽孢菌有抗菌活性的物质的儿茶素类中链脂肪酸酯类。
发明还提供本发明的儿茶素类中链脂肪酸酯类的制造方法。
本发明还进一步提供以儿茶素类中链脂肪酸酯类为有效成分的抗菌剂。
本发明者等以含有儿茶素类的茶提取物及儿茶素类为基础，锐意研究通过变换使用酶法或化学方法后，能否提高对耐热性芽孢菌的抗菌活性的结果，发现了通过使用绿原酸酯酶和中链脂肪酸、其酯或其甘油三酯处理儿茶素类，或通过化学方法使中链脂肪酸与儿茶素类进行酯化反应后，比原本的茶提取物或儿茶素类提高了对于耐热性芽孢菌的抗菌活性，使本发明得以完成。
因此本发明是指儿茶素类中至少一个羟基与中链脂肪酸形成酯的酯型儿茶素(在本说明书中，有时简称为儿茶素类中链脂肪酸酯类)。
因在饮食时，本发明中的儿茶素类中链脂肪酸酯类易在消化道内被脂肪酶水解成原本的茶提取物及儿茶素类，所以是安全性极高的抗菌剂。即本发明的物质及含有其物的组合物不仅可望应用于医药保健品，还可望应用于化妆品或饮食品的保存及保存期延长等方面。
在本发明的儿茶素类中链脂肪酸酯类中，形成酯的中链脂肪酸的碳数优选为8～12，最优选为8。中链脂肪酸为直链或支链、饱和或不饱和均可，但优选为直链饱和脂肪酸，例如可例举为正辛酸、癸酸或月桂酸等的中链脂肪酸。最优选为正辛酸。
从抗菌活性强方面优选的中链脂肪酸酯类的非限定示例可例举如下至少3位、5位或7位羟基中的任一个形成酯的酯型儿茶素。
只有2处羟基形成酯的酯型儿茶素(3’位和4’位的2处同时形成酯时，抗菌活性会稍有减弱，但也包含于本发明中)。
更具体地说，可例举如下。
脂肪酸与儿茶素类，优选与儿茶素或表儿茶素的3位羟基形成酯的单酯，脂肪酸与儿茶素类，优选与儿茶素或表儿茶素的5位及3’位或4’位形成酯的二酯，脂肪酸与儿茶素类，优选与儿茶素或表儿茶素的3位及3’位或4’位形成酯的二酯，以及脂肪酸与儿茶素类，优选与儿茶素或表儿茶素的7位及3’位或4’位形成酯的二酯。
具体实施例方式
在本说明书中，作为原料使用的儿茶素类可优选儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、没食子儿茶素(gallocatechin)、表没食子儿茶素(epigallocatechin)，特别是还可使用儿茶素没食子酸酯(catechingallate)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin gallate)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate)及表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)。上述物质具有羟基，可与中链脂肪酸形成酯。儿茶素类的部分或全部羟基可接受不影响其反应性能的酯化等的修饰。
儿茶素类因含有于茶提取物中，所以将茶提取物直接作为本发明的原料使用正合适。对茶提取物无特别限制，例如可例举为称为煎茶、烘焙茶、玉露、冠茶、蒸制茶的绿茶类的不发酵茶，总称为嬉野茶、青柳茶、烹茶的各种中国茶等的不发酵茶，包种茶、乌龙茶等的半发酵茶，红茶、阿波番茶、碁石茶、普洱茶等的发酵茶及马黛茶等的提取物。另外，茶提取物也可使用市场销售的太阳化学株式会社制的SUNPHENON(绿茶儿茶素)、三井农林株式会社制的POLYPHENON、三得利株式会社制的SUNOOLONG。
通过酶反应的制造从儿茶素类中制造儿茶素类中链脂肪酸酯类，可利用酶反应。
儿茶素类可作为水溶液用于反应。也可直接使用富含儿茶素类的茶提取液。反应时pH为3～7。还可在反应体系中不使用水，而将儿茶素类作为粉末添加于反应体系中使用的方法。
反应中可使用的酶为酯酶，例如包含绿原酸酯酶及阿魏酸酯酶。已知这些酯酶是来自Asp.japonicus或Lactobacillus acidophilus的酶，并作为食品加工用酶由市场销售。
例如，使用绿原酸酯酶(kikkoman公司制)或阿魏酸酯酶(日本Biocon公司制)均适合。
使用上述酯酶，可在儿茶素类的羟基上酯化中链脂肪酸。中链脂肪酸可使用游离的酸，也可使用中链脂肪酸中碳数为1～3的烷基酯，或中链脂肪酸的甘油三酯的形态。中链脂肪酸可在溶剂为正己烷、苯、甲苯等的反应中与惰性非极性溶剂混合，在有水存在或无水存在的状态下进行反应。在无水条件下，儿茶素类如上所述以粉末形态添加于反应体系。
反应可在儿茶素类的水溶液及中链脂肪酸、其酯、及甘油三酯类的有机溶剂中，或在无上述溶剂的物质中将酶以粉状或溶解于水后添加，再经静置、搅拌、振荡及混合来进行。反应温度应为10～60℃，优选为30～50℃左右。反应时间为4～48小时虽已足够，但也可经时分析反应液中的油层，当酯化物的产量达最高时中止反应。儿茶素类的量、中链脂肪酸的量及酶的量，作为标准可使用1∶2～10∶0.5～10(w/w)。
酶也可使用固定于载体的固定化酶代替粉状酶。酶的固定化方法采用公知的方法，固定用载体可使用硅胶、硅藻土(celite)、k-角叉菜胶、甲壳质、藻酸纳等公知的载体{生物反应器(Bioreactor)，福井三郎监修·主编，讲谈社Scientific(1985年)；实践生物反应器(Bioreactor)，食品产业生物反应器系统(Bioreactor System)技术研究组合编食品化学新闻社(1990年)}。而且也可将酶固定在用于水处理的离子交换树脂上使用。其他的还可将酶固定于吸附色谱法及疏水吸附色谱法中使用的树脂上后使用，一般地，可吸附蛋白质的树脂载体均可用于固定。
以儿茶素或表儿茶素作为原料进行酶反应时，可得到3位的羟基与中链脂肪酸酯化后的产物。酯化产物可去除溶剂后直接使用，也可由硅胶色谱法及/或高速液相色谱法精制后使用。精制后的酯化产物为固状(粉状)物。
通过化学合成制造通过将儿茶素类，例如儿茶素或表儿茶素与中链脂肪酸在脱水缩合剂如碳化二亚胺衍生物的存在下，或中链脂肪酸氯化物和三乙胺或吡啶等的盐基的存在下，在非质子溶剂中或无溶剂时，进行0～60℃、2～24小时的反应，可得到从儿茶素类中一个羟基被酯化后的产物到全由脂肪酸酯化的产物的混合物。这些混合物在必要时，例如可通过硅胶色谱法或更进一步通过高速液相色谱法等的通常方法精制，以分离目的位置被酯化的产物。
完全被酯化了的儿茶素类在氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾等的碱性金属或碱性有机物和水、酒精等的质子溶剂中，通过0～50℃、2～48小时的处理，可转化为儿茶素类中部分羟基被酯化的产物。此时，所得到主要是3位羟基被酯化的产物。
抗菌活性本发明的儿茶素类中链脂肪酸酯类中，由1个或2个中链脂肪酸酯化了的产物，对于芽孢菌例如杆菌属的菌或为耐热性嗜酸菌的嗜酸性乳杆菌(L.Acdophilus)，与原本原料的儿茶素或表儿茶素相比显示了强的增殖抑制作用。除上述菌外，还可期望对其他一般细菌的增殖抑制。
抗菌活性的测定法可采用公知的适当的方法，例如可用实施例6的方法进行。
本发明的儿茶素类的中链脂肪酸酯类，作为单体或组合物，可在食品领域的绿茶、无醇饮料、酒精饮料等的清凉饮料中，或调味剂、点心类、糖浆类、果实加工品、蔬菜加工品、肉制品、罐·瓶装类等的一般食品中用于保存或延长保存期。另外在化妆品领域可用于防止化妆乳膏(cream)、软膏、化妆液等的腐败及变质。
实施例以下以实施例为基础进一步具体说明本发明，但其不限定本发明的范围。
实施例1 酯化儿茶素的化学合成将儿茶素水合物(3.05g、10.5mmol)溶解于20ml四氢呋喃(THF)中，加入吡啶2.5ml(30.9mmol)。将混合液用冰冷却，添加正辛酸氯化物3.6ml(21.1mmol)。添加后，置于室温搅拌一夜。在反应液中加入乙酸乙酯(AcOEt)，用饱和硫酸氢钾水溶液、水、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水顺次洗净，再用无水硫酸钠干燥后减压馏出溶剂。把所得到的残渣用硅胶色谱法分离(AcOEt/正己烷＝1/2～2/1)。在二酯组分中，用TLC(乙酸乙酯/正己烷＝1∶1)得到为高纯度组分的3’，4’-O-二辛酰儿茶素1.25g。并且，作为单酯组分，可得到高纯度的3’(及4’)-O-辛酰儿茶素0.78g。连接于3’或4’上的辛酰基相互转移，成为基本上为1∶1的混合物。
3，4’-O-二辛酰-(+)-D-儿茶素(105)白色结晶，1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.87(6H，m)，1.2-1.4(16H，m)，1.60(4H，m)，2.39(1H，dd)，2.55(4H，t)，2.75(1H，dd)，3.86(1H，m)，4.65(1H，d)，5.11(1H，d)，5.72(1H，d)，6.00(1H，d)，7.2-7.4(3H，m)，8.99(1H，s)，9.24(1H，s)。
3’-O-辛酰及4’-O-辛酰-(+)-D-儿茶素(107)无定形物，1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.87(3H，t)，1.2-1.4(8H，m)，2.16(2H，m)，1.63(2H，m)，2.37(1H，m)，2.54(2H，t)，2.69(1H，m)，3.83(1H，m)，4.55(1H，dd)，5.00(1H，dd)，5.70(1H，d)，5.90(1H，s)，6.7-7.1(3H，m)，9.05(1H，s)，9.20(1H，s)，9.59(1H，s)。
实施例2 酯化儿茶素的化学合成将儿茶素水合物(3.04g、47.0mmol)溶解于20ml四氢呋喃(THF)中，加入吡啶3.8ml(30.9mmol)。将混合液用冰冷却，添加正辛酸氯化物5.4ml(31.6mmol)。添加后，置于室温搅拌一夜。在反应液中加入乙酸乙酯(AcOEt)，用饱和硫酸氢钾水溶液、水、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水顺次洗净，再用无水硫酸钠干燥后减压馏出溶剂。把所得到的残渣用硅胶色谱法分离(AcOEt/正己烷＝1/2～2/1)。在二酯组分中，用TLC(乙酸乙酯/正己烷＝1∶1)得到为高纯度组分的3’(或4’)，5-二-O-辛酰儿茶素0.17g及3’(或4’)，3-二-O-辛酰儿茶素0.10g。并且，作为其他组分，可得到2成分的组分(0.54g)，把一部分用HPLC(色谱柱Develosil C30-UG5、10×250mm、洗脱液80％乙腈水溶液)精制，得到3’(或4’)，7-二-O-辛酰以及3’，4’-O-二辛酰儿茶素。
3’(或4’)，5-二-O-辛酰-(+)-D-儿茶素(109)1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.85(6H，m)，1.2-1.4(16H，m)，1.63(4H，m)，2.18(1H，m)，2.36(1H，m)，2.54(4H，m)，3.86(1H，m)，4.63(1H，dd)，5.13(1H，dd)，6.0-6.2(2H，m)，6.7-7.1(3H，m)，9.5-9.7(2H，m)。
3’(或4’)，3-二-O-辛酰-(+)-D-儿茶素(110)1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.86(6H，m)，1.1-1.4(18H，m)，1.62(2H，m)，2.15(2H，m)，2.70(1H，m)，4.9-5.2(2H，m)，5.78(1H，d)，5.94(1H，s)，6.7-7.0(3H，m)，9.08(1H，d)，9.36(1H，s)，9.69(1H，s)。
3’(或4’)，7-二-O-辛酰-(+)-D-儿茶素(111)1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.86(6H，m)，1.2-1.4(16H，m)，1.60(4H，m)，2.38(1H，m)，2.55(4H，t)，2.75(1H，m)，3.90(1H，m)，4.6-4.8(1H，m)，5.0-5.2(1H，m)，5.7-6.2(2H，m)，6.7-7.4(3H，m)，8.9-9.8(2H，m)。
实施例3 酯化儿茶素的化学合成将儿茶素水合物(3g、10.3mmol)溶解于15ml四氢呋喃(THF)中，加入吡啶6.3ml(77.9mmol)。将混合液用冰冷却，添加正辛酸氯化物9.7ml(56.8mmol)。添加后，置于室温搅拌一夜。在反应液中加入乙酸乙酯(AcOEt)，用饱和硫酸氢钾水溶液、水、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水顺次洗净，再用无水硫酸钠干燥后减压馏出溶剂。把所得到的残渣用硅胶色谱法分离(AcOEt/正己烷＝1/20～1/4)。减压浓缩后，可得到7.0g的5-O-辛酰儿茶素及1.3g的5，7，3’，4’-四-O-辛酰儿茶素。将5-O-辛酰儿茶素(7.0g、7.6mmol)溶解于20ml二氯甲烷中，加入(1.74ml、28.8mmol)的乙醇胺，置于室温下搅拌一夜。将反应液用AcOEt/正己烷＝1/4稀释后直接用硅胶色谱法分离(AcOEt/正己烷＝1/4～2/1)。将二酯再用色谱分离法(二氯甲烷/丙酮＝10/1～4/1)精制，得到高纯度的3，7-二-O-辛酰儿茶素(75mg)。并且，将单酯组分浓缩后，得到1.46g的3-O-辛酰儿茶素。
3，7-二-O-辛酰-(+)-D-儿茶素(116)1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.85(6H，m)，1.1-1.4(18H，m)，1.59(2H，m)，2.15(2H，t)，2.4-2.6(4H，m)，5.00(1H，d)，5.13(1H，q)，6.13(1H，d)，6.21(1H，d)，6.56(2H，dd)，6.6-6.7(2H，m)，8.95(2H，s)，9.60(1H，s)。
3-O-辛酰-(+)-D-儿茶素(115)无定形结晶。1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.85(3H，t)，1.1-1.5(10H，m)，2.16(2H，m)，2.64(1H，dd)，4.90(1H，d)，5.10(1H，q)，5.77(1H，d)，5.93(1H，d)，6.57(1H，dd)，6.7-6.8(2H，m)，8.91(2H，bs)，9.05(1H，s)，9.32(1H，s)。
实施例4 酯化儿茶素的化学合成将5-O-辛酰儿茶素(6.6g、7.2mmol)溶解于20ml二氯甲烷中，加入乙醇胺(1.21ml、20.0mmol)，置于室温下搅拌一夜。将反应液用AcOEt/正己烷＝1/4稀释后直接用硅胶色谱法分离(AcOEt/正己烷＝1/4～2/1)。在二酯组分内，用TLC得到作为高纯度的组分的3，5-二-O-辛酰儿茶素(180mg)。
3，5-二-O-辛酰-(+)-D-儿茶素(126)0.85(6H，m)，1.0-1.4(16H，m)，1.48(2H，t)，1.61(2H，t)，2.19(2H，t)，2.5-2.7(4H，m)，4.9-5.3(2H，m)，6.11(1H，d)，6.15(1H，d)，6.57(1H，dd)，6.6-6.8(2H，m)，9.06(2H，b)，9.86(1H，b)。
实施例5 酯化儿茶素的化学合成将4-O-辛酰儿茶素(3.5g、4.4mmol)溶解于10ml二氯甲烷中，加入乙醇胺(0.47ml、7.8mmol)，置于室温下搅拌一夜。将反应液用AcOEt/正己烷＝1/4稀释后直接用硅胶色谱法分离(AcOEt/正己烷＝1/4～2/1)。在二酯组分内，用TLC得到高纯度的5，7-二-O-辛酰儿茶素(0.3g)。
5，7-二-O-辛酰儿茶素-(+)-D-儿茶素(121)1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.87(6H，m)，1.2-1.4(16H，m)，1.6-1.7(4H，m)，2.4-2.7(4H，m)，3.93(1H，q)，4.71(1H，d)，6.51(2H，dd)，6.59(1H，dd)，6.6-6.8(2H，m)，8.90(2H，bs)。
实施例6 抗菌活性的测定将用实施例1～5及后述参考例1制造的本发明物质及儿茶素在二甲亚砜中溶解成种种浓度，在平底的96孔型多孔平板(CORNING&COSTAR公司制)中加入2μL后，再加入在预制的芽孢形成培养基{多聚蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、碳酸钙15.0g、琼脂15.0g、无机盐水溶液5.0mL、蒸馏水1000mL；但其无机盐水溶液的组成为硫酸镁·7水合物4.0g、硫酸锰·5水合物0.216g、硫酸铁·7水合物0.2g、氯化钠0.2g、蒸馏水100mL}中配制的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的芽孢为1×107个/mL的生理盐水悬浮液50μL。在其中加入肉汤液体培养基(pH为7.0，日水制药株式会社制)50μL，置于37℃培养一整夜。在培养开始时和培养开始后，用酶标仪(Microplate Reader)(Thermo Labsystems公司制，芬兰)计算测量690nm时的吸光度。以由下式算出的增殖抑制率为基础，把抑制率和试剂浓度作为两轴制成分布图，求出本发明物对芽孢菌的50％抑制浓度(IC50)。
增殖抑制率(％)＝100×{Δ690(无添加)-Δ690(添加试剂)}/Δ690(无添加)，在此Δ690(无添加)表示培养开始前后的无添加组690nm时值的差，Δ690(试剂)表示培养开始前后的试剂添加组690nm时值的差。结果如表1所示。
对于耐高温嗜酸性芽孢细菌酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)，亦可其变更培养温度条件和液体培养基两种类后同法进行，求出活性{培养温度45℃；液体培养基干燥酵母膏(DifcoLaboratories制)0.4％、可溶性淀粉(nacalai tesque株式会社制)0.4％、葡萄糖(nacalai tesque株式会社制)1％、用1N硫酸调整到pH为3.8}。
结果如表1所示。
实施例7 3-O-辛酰-(+)-D-儿茶素(酶合成)在3-O-辛酰基儿茶素的化学合成品的HPLC系统(日立D-7000型、Diode-Array检测器L-7451型)、色谱柱Develosil C30-UG-5(野村化学株式会社制、4.6×150mm、流动相5％-90％乙腈/0.1％TFA、0-15分钟梯度洗脱、流速1.0ml/分钟、检测波长230nm或280nm)中，以保留时间14.2分钟为指标，对市场销售的脂肪酶、酯酶酶剂进行了鉴别。而且，酶反应体系是将儿茶素5mg溶解于20mM乙酸缓冲液(pH5.0)0.3ml中之后，添加酶剂、再添加辛酸0.3ml，在37℃下振荡反应。对反应液的油层部分进行HPLC分析的结果，发现绿原酸酯酶(kikkoman公司制)具有对儿茶素的酯转移活性。结果显示辛酸的峰(12.9分钟)之后出现了14.2分钟位置的峰，通过与化学合成品进行混合色谱分析，其保留时间与3-O-辛酰基儿茶素一致。
实施例8 3-O-辛酰-(+)-D-儿茶素(酶合成)将儿茶素5g溶解于300ml缓冲液中，加入绿原酸酯酶50g、再加上辛酸300ml用搅拌器边搅拌边进行20小时的反应。将反应液分液，把油层水洗后，减压蒸馏(120℃、2mmHg)，去除辛酸后，将蒸馏残渣用硅胶色谱法[用二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇(1％-30％的梯度)洗脱]部分精制，得到1.3g的粗生成物。将其一部分用Develosil ODS-HG-5分取色谱柱(野村化学株式会社制、10×250mm、流动相70％乙腈/0.1％TFA、流速1.3ml/分钟、1.3ml分离)分离提取，得到高纯度的上记化合物。NMR及质谱分析与相对应的合成品一致。
实施例9 3-O-辛酰-(+)-D-表儿茶素的酶合成将表儿茶素5g溶解于300ml缓冲液中，加入绿原酸酯酶50g再加上辛酸乙酯300ml用搅拌器边搅拌边进行20小时的反应。将反应液分液，把油层水洗后，用无水硫酸钠干燥，之后用硅胶色谱法[用二氯甲烷洗脱正辛酸甲酯后，用二氯甲烷-甲醇(1％-30％的梯度)洗脱]部分精制，得到1.1g的粗生成物。将其一部分用Develosil C30-UG-5分取色谱柱(野村化学株式会社制、10×250mm、流动相60％乙腈/0.1％TFA、流速1.3ml/分钟、0.65ml分离)分离提取，得到高纯度的上记化合物。
实施例10 由各种脂肪酸供体进行的酯化物的酶合成将辛酸(C8)、辛酸乙酯(C8Et)、辛酸甘油三酯(MCT)作为脂肪酸供体与实施例8同样进行酶反应，对于反应液中的油层部分经时进行HPLC分析的结果，确认了各自的酯化物峰的增加。
C儿茶素、EC表儿茶素、C8辛酸、C8Et辛酸乙酯、MCT辛酸甘油三酯由上述结果可确认，根据本发明的酶法，除游离的辛酸外，辛酸乙酯及辛酸甘油三酯也成为脂肪酸供体，生成儿茶素及表儿茶素的各脂肪酸酯化物。
参考例1 3-O-癸酰基-(+)-儿茶素的合成与实施例4相同，从儿茶素水合物(6.3g、21.8mmol)、及己酸氯化物25g(131.1mmol)中得到粗5-O-癸酰基儿茶素(23.5g)。将其中的6g溶解于20ml二氯甲烷中，加入乙醇胺(1.75ml、29.0mmol)，置于室温下搅拌一夜。将反应液用AcOEt/正己烷＝1/4稀释后直接用硅胶色谱法分离(AcOEt/正己烷＝1/4～2/1)。将所得到的单酯组分浓缩后，得到1.25g的3-O-癸酰基儿茶素(无定形结晶)。
1H-NMR(DMSO-d6、ppm)0.85(3H，t)，1.1-1.5(12H，m)，2.1-2.2(2H，m)，2.6-2.7(1H，m)，4.90(1H，d)，5.10(1H，q)，5.76(1H，d)，5.92(1H，d)，6.56(1H，dd)，6.6-6.8(2H，m)，8.88(1H，s)，8.93(1H，s)，9.05(1H，s)，9.32(1H，s)。
权利要求
1.一种抗菌剂，其含有作为有效成分的由儿茶素类中至少一个羟基与中链脂肪酸形成酯的酯型儿茶素的至少一种。
2.权利要求1的抗菌剂，其形成酯的中链脂肪酸的碳数为8～12。
3.权利要求2的抗菌剂，其形成酯的中链脂肪酸的碳数为8。
4.权利要求1～3中任一项的抗菌剂，其儿茶素类中至少3位的羟基形成酯。
5.权利要求1～3中任一项的抗菌剂，其儿茶素类中至少5位的羟基形成酯。
6.权利要求1～3中任一项的抗菌剂，其儿茶素类中至少7位的羟基形成酯。
7.权利要求4～6中任一项的抗菌剂，其有2处的羟基形成酯。
8.权利要求1～3中任一项的抗菌剂，其含有作为有效成分的且从含有下述酯脂肪酸与儿茶素的3位羟基形成酯的单酯，脂肪酸与儿茶素的5位及3’位或4’位形成酯的二酯，脂肪酸与儿茶素的3位及3’位或4’位形成酯的二酯，以及脂肪酸与儿茶素的7位及3’位或4’位形成酯的二酯的群中选出的酯型儿茶素的至少一种。
9.权利要求1～8中任一项所述的抗菌剂，其为用于食品、饮料、化妆品或医药品的抗菌剂。
10.权利要求1～9中任一项的抗菌剂，其对耐热性芽孢菌具抗菌活性。
11.一种制造酯型儿茶素的方法，其在从含有中链脂肪酸、其酯或甘油三酯的群中选出的脂肪酸供体的存在下，通过绿原酸酯酶或阿魏酸酯酶，使儿茶素类或其酯衍生物形成酯或进行酯交换反应，从而由儿茶素类的至少一个羟基与中链脂肪酸形成酯。
12.权利要求11的方法，其酯形成或酯交换反应在pH为3～7的缓冲液中，温度为30～50℃时，进行4～48小时。
13.权利要求11或12的方法，其脂肪酸供体为辛酸、辛酸乙酯或辛酸甘油三酯。
14.权利要求11～13中任一项的方法，儿茶素的3位与中链脂肪酸形成酯。
15.权利要求11～14中任一项的方法，儿茶素类以茶提取物的状态用于反应。
16.酯型儿茶素，其儿茶素类中至少一个羟基与中链脂肪酸形成酯(但不包括3-O-癸酰基儿茶素)。
17.权利要求16中的酯型儿茶素，其形成酯的中链脂肪酸的碳数为8～12。
18.权利要求17中的酯型儿茶素，其形成酯的中链脂肪酸的碳数为8。
19.权利要求16～18中任一项的酯型儿茶素，其儿茶素类中至少3位的羟基形成酯。
20.权利要求16～18中任一项的酯型儿茶素，其儿茶素类中至少5位的羟基形成酯。
21.权利要求16～18中任一项的酯型儿茶素，其儿茶素类中至少7位的羟基形成酯。
22.权利要求19～21中任一项的酯型儿茶素，其有2处的羟基形成酯。
23.权利要求16～18中任一项的酯型儿茶素，其由含有下述酯脂肪酸与儿茶素的3位羟基形成酯的单酯，脂肪酸与儿茶素的5位及3’位或4’位形成酯的二酯，脂肪酸与儿茶素的3位及3’位或4’位形成酯的二酯，以及脂肪酸与儿茶素的7位及3’位或4’位形成酯的二酯的群中选出。
全文摘要
本发明提供一种可用于饮料、加工食品的保存期延长及化妆品防菌，且对耐热性芽孢菌有抗菌活性的物质。本发明是儿茶素类中至少一个羟基与中链脂肪酸形成酯的酯型儿茶素。本发明中儿茶素类的中链脂肪酸酯类作为单体或组合物，对耐热性芽孢菌显示了强的增殖抑制，并通过添加于饮食品中，可防止饮食品腐败及变质，且还通过添加于化妆品中，可防止化妆品的腐败及变质。
文档编号A61K8/30GK1810166SQ20061000264
公开日2006年8月2日 申请日期2006年1月26日 优先权日2005年1月26日
发明者深见治一, 中尾正宏, 并川耕士, 前田满 申请人:三得利株式会社