专利名称：以i型疱疹病毒作为载体的兽用狂犬病重组疫苗及制备方法
技术领域：
本发明涉及一系列以多片段间同源重组的方式构建的表达狂犬病病毒保护性抗原 的重组I型疱疹病毒，尤其是公开了一种以I型疱疹病毒作为载体的兽用狂犬病重组疫 苗，可以用于犬和猫等动物狂犬病的免疫接种，属于动物用疫苗制备技术领域。
背景技术：
狂犬病是一种重要的人兽共患传染病，96% 98%的人狂犬病由犬咬伤引起， 一旦发 病，死亡率100%。预防人狂犬病发生的根本措施在于有效的预防犬的狂犬病。预防犬狂 犬病最有效的途径，是采用适当的狂犬病疫苗对犬进行有效的免疫接种。目前，常用的 狂犬病疫苗分为灭活疫苗和弱毒活疫苗，灭活疫苗由于价格昂贵，影响其推广使用；而 弱毒活疫苗由于含有活的病毒颗粒，存在毒力返祖的潜在危险，无论对免疫犬还是对接 触犬的人，都是一种威胁。在发达国家，弱毒疫苗在家养动物中早已停止使用。为了研 制适合在我国和其他发展中国家使用的狂犬病疫苗，已有以犬腺病毒为载体的狂犬病重 组疫苗研制成功，经过实验室试验和安全评价，证明该疫苗不仅安全、有效，而且适于 口服，免疫期也较长，但是由于犬腺病毒在犬科动物中自然感染率较高，免疫时受已存 在抗体影响较为明显，因此，研制以自然感染率低、可诱导较高免疫水平的病毒为载体 的狂犬病重组疫苗，可以克服犬腺病毒抗体的影响是本发明的目的。 发明内容-本发明公开一种以I型疱疹病毒作为载体的兽用狂犬病重组口服疫苗，可以用于犬 和猫等动物狂犬病的口服免疫接种，具有自然感染率低、可诱导较高免疫水平特点。 本发明还提供了上述疫苗的制备方法。本发明的技术方案是以I型疱疹病毒为载体，在病毒复制非必需区插入狂犬病病 毒保护性抗原表达盒，通过基因组片段间同源重组，获得重组疫苗。将I型疱疹病毒基因组分成若干段，使相邻片段间含有一定长度的同源序列，将每条片段分别克隆到pPoiyii，得到重组pP:ioyii。然后，根据i型疱疹病毒复制非必需基因所在的位置，将狂犬病病毒保护性抗原基因插入到重组pPloyII中，最后，将所有 重组pPloyII在脂质体介导下共转染I型疱疹病毒敏感细胞系，通过多片段间的同源重 组获得重组病毒。上述的I型疱疹病毒分别选自猪I型疱疹病毒、猫I型疱疹病毒和犬I型疱疹病毒 中的一种。I型疱疹病毒活载体——狂犬病重组疫苗的具体制备方法1. 重组疫苗的构建利用pPloyII载体，在多克隆酶切位点处插入人工合成的Linker BE(依次含有BamH I、 EcoRI、 Sacl、 Xbal、 Smal、 Bgl II、 Xho I和EcoR V酶切位点)，形成pPloyII-BE 载体。将I型疱疹病毒基因组分成若干段，根据每一片段的首尾两端分别设计两对特异 引物，扩增片段大小在l.lkb左右，分别将首尾两端的扩增产物克隆入pPloy11-BE载 体的多克隆酶切位点处，与I型疱疹病毒基因组共转化到DH5a感受态细胞中，根据细 菌内同源重组的机制，获得5个中间转移载体。根据猪I型疱疹病毒基因组中复制非必 需区所在的位置，将目的基因插入相应的中间转移载体，再与其它中间转移载体在脂质 体介导下共转染敏感细胞，隔天传代，直至出现典型的细胞病变，获得重组疫苗。2. 重组疫苗的免疫效力检测2.1利用敏感细胞大量制备重组疫苗，并测定疫苗的TCID5 。取无狂犬病免疫史的 家犬或猫为试验动物，分别两侧股内侧肌肉注射和口服接种。2.2免疫时，每只犬或猫肌肉注射或口服重组疫苗，免疫一次，免疫前及免疫后每 周采血并分离血清。2.3采用荧光抗体狂犬病病毒中和试验(FAVN)法，检测免疫犬或猫血清中和抗体 效价；采用Reed-Muench法检测免疫后血清中抗I型疱疹病毒的中和抗体。在狂犬病病毒中，糖蛋白是唯一一种可以诱导机体产生中和抗体的保护性抗 原成分。而猪I型疱疹病毒是一种极具开发潜力的疫苗载体，基因背景清楚，遗传稳 定性好，含有许多病毒复制的非必需基因(TK， gl, gC， gE， gG， PK， gM， gN)，外源 基因容量大(30kb);具有广泛的宿主范围，可以感染猪、犬、牛、羊等多种家畜和野 生动物，但不感染人。猪I型疱疹病毒疫苗株目前已在国内普遍销售，用于猪伪狂犬病的预防，经过数年 的临床应用证明对环境中的其他动物不具致病性和其他副作用，通过在犬和猫的试验发 现，该疫苗株可以通过口服的方式使犬获得免疫。因此，利用该疫苗作为狂犬病的重组 疫苗载体，研制相应的狂犬病口服疫苗具有良好的前景。犬和猫I型疱疹病毒也是疱疹病毒科的主要成员，宿主范围有限，只对本动物易感， 其自然弱毒株的TK、 gl和gE是病毒的复制非必需区，可以插入外源基因表达盒，适合 开发成相应的犬和猫用狂犬病口服重组疫苗。本发明的积极效果在于疫苗使用安全、有效、方便，而且适于口服，免疫期持久， 自然感染率低、可诱导较高免疫水平。具体实施方案下面结合实施例，对本发明做进-一步描述。其作用被理解为是对本发明的阐释而非 对本发明的任何形式的限制。 实施例1猪I型疱疹病毒活载体——狂犬病重组疫苗 1.重组疫苗的构建 1.1引物设计根据猪I型疱疹病毒基因组序列，对每段片段的首尾两端设计两对引物。引物序列 如下-引物Fl: 5- gaatccGAGGATCAGCTCTCATATGAGC-3, 引物Rl: 5- tctagaCCATCGTTCGCACATCAAC-3 ， 引物Fl， 5-tctagaCACGAGATCATGCCCACTAG-3， 引物RJ， 5- agatctCATCGTCGACGTGTAGCTCG-3, 引物F2: 5- gaatccCACGAGATCATGCCCACTAG-3 ， 引物R2: 5- tctagaCATCGTCGACGTGTAGCTCG-3 ， 引物F2， 5- tctagaCCCCGCTTTATACCGTTCGTCA-3 ， 弓l物R2， 5-agatctGACCCGCTGTTCACCTCCATCA-3， 引物F3: 5- gaatccCCCCGCTTTATACCGTTCGTCA-3, 引物R3: 5- tctagaGACCCGCTGTTCACCTCCATCA-3, 引物F3， 5- tetagaGCAGGAGACGGTGACGAACA丁G-3, 弓I物R3 ， 5- agatctGGGCGTG A AG A ACTTG A AGCAG-3 ， 引物F4: 5- gaatccGCAGGAGACGGTGACGAACATG-3, 引物R4: 5- tctagaGGGCGTGAAGAACTTGAAGCAG-3， 引物F4': 5- tctagaGGGGTCTTTCTGCCTGAGCG-3, 引物R4， 5陽agatotATCCAAGGCGTGGCTGTCC-3 ， 引物F5: 5- gaatccGGGGTCTTTCTGCCTGAGCG-3 ， 引物R5: 5- tctagaATCCAAGGCGTGGCTGTCC-3 ， 引物F5': 5- tctagaAGGGAACTGCCGTTGCAACCAT-3, 弓I物R5， 5- agatctGAAAAAAGGGGGCGGGGCTTAA-3 。在TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95。C预变性5min， 94。C变性45s, 59。C退火 45s， 72。C延伸lmin，共30个循环，获得扩增片段。将引物扩增的片段连入pMD18-T Vector中，测序正确后，利用引物中设计的酶切 位点将片段1与1' ， 2与2' ， 3与3' ， 4与4' ， 5与5'分别克隆入pPloyll-BE 中，得到5个重组质粒，每个重组质粒分别与猪I型疱疹病毒基因组共转化到DH5a感 受态细胞中，经过鉴定，获得阳性同源重组质粒，命名为pPloyll-1、 pPloyll-II、 pPloyll-III、 pPloyIHV和pPloyll-V。将含有狂犬病病毒保护性抗原基因表达盒插入含有该复制非必需基因片段的阳性同 源重组质粒。使该质粒与其它同源重组质粒共转染PK-15细胞，隔天传代，直至出现典 型的细胞病变，获得重组疫苗命名为PHV-RVG。1. 2重组疫苗基因组鉴定PCR鉴定取50ml培养瓶内已呈典型病变的单层PK-15细胞，倾弃培养基，以PBS洗涤2次，加入800y 1新鲜配制的细胞裂解液(0.6%SDS， 10mM EDTA， 100ug/ml蛋白酶K), 37。C温育lh，加入200y 1 5M NaCl，轻轻混匀后，冰水浴lh。将全部混合物移入离心管，于4r， 12000rpffl离心40niin，上清移入加一离心管，以等体积酚氯仿抽提2次，加入终浓度O. 25M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，12000rpm离心10min， DNA沉淀以70%乙醇洗涤1次，无菌风干后，溶于50tU去离子水。以基因组为模板设计引物，扩增外源基因，测序鉴定。鉴定用PCR引物序列如下 TKF: 5'- ATGCGCATCCTCCGGATCTA-3'; TKR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3'。 PKF: 5'- ATGTTGGCGATGTGGAGATG-3'; PKR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3'。 gEF: 5,-ATGCGGCCCTTTCTGCTGCG-3'; gER: 5，-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3，。 gIF: 5'-ATGATGATGGTGGCGCGCGA-3'; gIR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3'。 gGF: 5，- ATGAAGTGGGCAACGTGGAT-3'; gGR: 5，-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3，。 gCF: 5，- ATGGCATCACTAGCTCGTGC-3，； gCR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3，。 gMF: 5，- TTATTCAAAGCCGAGGTTCT-3， gMR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3'。 gNF: 5'-AGAGCTCGAAGACGTAGTCC-3'; gNR: 5'-GCGGCTCTACATGCATCTGG-3'。PCR反应条件同上。Southern blotting鉴定根据狂犬病病毒cDNA序列设计一对引物(F: 5， -GTTGTGGAGGATGAAGGA-3， ； R: 5， -GGTGTMTCGTGGTTAGTTG-3 ，)，反应条件为94°C 5min， 94°C 45s， 48°C 40s， 72°C 30s, 30循环，72°C 10min，扩增片段长度为444bp。6将PCR产物用用酚、氯仿抽提后，用乙醇沉淀，溶于去离子水中进行探针的标记。按上 述重组疫苗基因组提取方法提取重组病毒基因组，转移到NC膜上，用标记好的探针杂 交液与NC膜反应显色以确定目的基因的存在。 1.3 TCIDs。的测定将1X107PK-15细胞传入96孔细胞培养板，每孔内细胞约1X1015，补加培养基至 100ul。次日，接入待测病毒样品。在1 11孔内，进行10—' 10-"稀释，A H列为同 浓度重复。7天后，以KSrber法计算待测重组疫苗的TCID5 。 1.4毒力鉴定取4 5月龄狂犬病病毒抗体阴性犬20条，按接种量不同分为2组，每组10条，分 别用含10^0105 和10711:105。的重组疫苗细胞培养液各肌肉注射10条犬。注射后，观察 注射犬的饮食、精神状态等表现，测量体温、计数白细胞数量和其它临床表现等，并在 4周后解剖注射犬，观察犬体病理变化，并进行肝等主要脏器的组织切片观察。 1. 5稳定性鉴定1X106PK-15细胞传入25crf细胞培养瓶内，细胞长成单层后，按培养瓶内培养基体 积的0.5%接入重组疫苗，接种后3 4天收毒，对各种重组疫苗分别连续传代40次，标 记并保存每次的培养液，同时每隔5代提取重组病毒基因组，通过PCR和DNA测序鉴定 外源基因的大小、方向和位置。 1.6免疫原性鉴定(Western blotting)取含狂犬病病毒CVS-1]株的细胞裂解液50 u丄，加等量2XSDS-PAGE上样缓冲液， 沸水浴10min，冷却至室温，短暂离心后进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕，将胶上蛋白样 品电转移到硝酸纤维素膜上，分别与犬抗重组疫苗的多抗及阳性和阴性对照多抗、HRP 标记兔抗犬二抗反应，最后以DAB/H^显色，根据显色带出现与否及其位置判定重组疫 苗是否表达狂犬病病毒保护性抗原。 1.7结果(1) 重组疫苗基因组内均正确插入了狂犬病病毒保护性抗原，转录方向与病毒基因 组转录方向一致；(2) 0. hil重组疫苗的TCID;',与载体病毒无明显差别，为106 5 107;(3) 重组疫苗表达了狂犬病病毒保护性抗原，抗体可以与狂犬病病毒糖蛋白特异性 5口 pj ;(4) 毒力检测结果显示，注射犬未出现饮食和精神表现异常，体温在正常范围内 (37.5 38. 5'C)。体内白细胞计数显示，白细胞总数(7. 5 16.0X107L)分类计数均在正常范围内，注射犬未出现蓝眼或厌食等临床表现。解剖未见主要组织器官出现异常 变化，重组疫苗注射犬肺、肝和肾等组织切片与健康犬的组织切片无明显区别。(5) 稳定性鉴定结果表明，重组疫苗经过40代传代，基因组(包括外源基因的大小、方向和位置)保持不变，外源基因序列未发生改变。 2.重组疫苗效力检测 2.1实验动物狂犬病病毒抗体阴性的4 5月龄犬20条，3 6月龄猫20只，均随机分为2组， 每组10只。 2. 2动物免疫分别以TCID5。为l(f 5的重组疫苗PHV-RVG对4组动物进行免疫，其中肌肉注射10 条犬和10只猫，lml/条；口服10条犬和10只猫，2ml/条。 2. 3免疫检测免疫前及免疫后每周分别采集少量静脉血，分离血清，以FAVN检测受试犬狂犬病病 毒中和抗体水平。2. 4攻毒试验免疫6周后，每组随机抽取5只动物，以100 0)5 狂犬病标准强毒株(^3-24接种。 隔离观察至接种后40天，详细记录各组动物的发病及死亡情况。 2.5结果(1) 所有受试动物的免疫前血清内检不出抗狂犬病病毒的特异性抗体；(2) 所有犬和猫免疫后2 3周，其血清中均可检出抗I型疱疹病毒抗体，至6周时， 抗体仍维持在较高水平；(3) 所有受试犬和猫免疫后3 4周时，其血清中均可检出狂犬病中和抗体，抗体消 长规律与I型疱疹病毒抗体一致；(4) 受试犬和猫能抵抗狂犬病强毒的攻击，存活率为95%。3. 结论口服和肌肉注射重组疫苗PHV-RVG均可诱导犬和猫产生针对I型疱疹病毒和狂犬病 病毒的特异性中和抗体，对I型疱疹病毒和狂犬病病毒感染具有保护作用。 实施例2猫I型疱疹病毒活载体——狂犬病重组疫苗 1.重组疫苗的构建 1.1引物设计根据猫I型疱疹病毒基因组序列，对每段片段的首尾两端设计两对引物。引物序列 如下引物Fl: 5-gaatccAACGTCCACCCGGGGTGGGT-3; 引物Rl: 5- tctagaCACGTCACCAGTGGAGATAG-3; 引物F，5- tctagaTAACCCGGTT]TGAGGGTTA-3: 引物Rl， 5- agatctAGTCAACATCCTCGATACAA-3:引物F2:5-gaatccGAATTCCCAGGCGACCCGAC -3;引物R2:5-tctagaA AAC ATATTAGTCGCACGAC-3;引物F2':-tctagaCCCCGCTTTATACCGTT'CGTCA-3;引物R2':-agatctAATCTTTTATCTGG AACTAC-3;引物F3:5-gaatccGAGCTCCCGGAGGAGG ATAT-3;引物R3:tctagaGATCCATCGCCTGGGGA ATT-3:引物F3':&-tctagaTCGAAGAGTTATAACCATCG-3;引物R3':-agatctCGACATATTAAGTATTATGC-3;引物F4:5-gaatccGTGGAATCTACGCACTGCGG-3;引物R4:5-tctagaGGCGAGTAAACCGTGTCATT-3;引物F4':5..tctagaCTTTTAGTCGATGGGG AT'GG-3;引物R4':隱agatotTACATCTGGATGTCCAATCG-3;引物F5:5-gaatccCCGGATCTGGGTACAGTGTA-3;引物R5:5-tctagaTAAGCA ATTATCATCTGTGG-3;引物F5':5-■ tctagaTATTACACCA ACTATATGGT-3;引物R5':5.-agatctGAAAAAAGGGAGTGGAACGAC-3。在TaKaRa Ex T叫DNA聚合酶作用下，95。C预变性5min， 94。C变性45s， 59。C退火 45s， 72。C延伸lmin，共30个循环，获得扩增片段。将引物扩增的片段连入pMD18-T Vector中，测序正确后，利用引物中的设计的酶 切位点将片段l与l， ， 2与2' ， 3与3' ， 4与4' ， 5与5，分别克隆入pPloylI-BE 中，得到5个重组质粒，每个重组质粒分别与猫I型疱疹病毒基因组共转化到DH5ci感 受态细胞中，经过鉴定，获得阳性同源重组质粒，命名为pPloyII-I， 、 pPloyl1-II，、 pPloyII-m， 、 pPloyII.-IV'和pPloyl1-V'。将含有狂犬病病毒保护性抗原基因表达盒插入含有该复制非必需基因片段的中间转 移载体中。使该中间转移载体与其它中间转移质粒共转染FK-81细胞，隔天传代，直至 出现典型的细胞病变，获得重组疫苗命名为FHV-RVG。 1.2重组疫苗基因组鉴定PCR鉴定取50ml培养瓶内已呈典型病变的单层FK-81细胞，倾弃培养基，以PBS 洗涤2次，加入800y 1新鲜配制的细胞裂解液(0.6%SDS， 10mM EDTA， 100ng/ml蛋 白酶K)， 37。C温育lh,加入200y 1 5M NaCl，轻轻混匀后，冰水浴lh。将全部混合物 移入离心管，于4。C， 12000rpra离心40min，上清移入加一离心管，以等体积酚氯仿抽 提2次，加入终浓度0. 25M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，12000rpm离心10min， DNA沉淀以70%乙醇洗涤1次，无菌风干后，溶于50"1去离子水。以基因组为模板设计引物， 扩增外源基因，测序鉴定。鉴定用PCR引物序列如下 TKF: 5'- TACATACACAA丁CAGGTCGG-3'; TKR: 5'-TCGGTAAACCAGTCAACATC-3'。 gEF: 5'- ATgggACTgCTTgTTACCAT -3，； gER: 5'-CTACGCGACTGTAATCTGG-3'。 gIF: 5，- ATGTCGTCGATAGCCTTCAT -3'; gIR: 5'- AATCACGGTTAACTGACTTC -3，。PCR反应条件同上。Southern blotting鉴定根据狂犬病病毒cDNA序列设计一对引物(F: 5' -GTTGTGGAGGATGAAGGA-3' : R: 5' --GGTGTAATCGTGGTTAGTTG-3，)，反应条件为94°C 5tnin, 94°C 45s， 48°C 40s， 72°C 30s, 30循环，72°C 10min，扩增片段长度为444bp。 将PCR产物用用酚、氯仿抽提后，用乙醇沉淀，溶于去离子水中进行探针的标记。按上 述重组疫苗基因组提取方法提取重组疫苗的基因组，将其转移到NC膜上，用标记好的 探针杂交液与NC膜反应显色以确定目的基因的存在。 1.3 TCID5。的测定将1X107FK-81细胞传入96孔细胞培养板，每孔内细胞约lXl(f，补加培养基至 衡l。次n,接入待测病毒样品。在J U孔内，进行10—' 10—"稀释，A H列为同 浓度重复。7天后，以Kirber法计算待测S组疫苗的TCID5。。 1.4毒力鉴定取3 5月龄猫I型疱疹病毒和狂犬病病毒抗体阴性猫20只，按接种量不同分为2 组，每组10只，分别用含108TC'ID5。和1()"TC瓜5。的重组疫苗细胞培养液各肌肉注射10 只猫。注射后，观察注射犬的饮食、精神状态等表现，测量体温、计数白细胞数量和其 它临床表现等，并在4周后解剖注射猫，观察猫体病理变化，并进行肝等主要脏器的组 织切片观察。 1.5稳定性鉴定1X106FK-81细胞传入25cm2细胞培养瓶内，细胞长成单层后，按培养瓶内培养基体 积的0.5%接入重组疫苗，接种后3 4天收毒，对各种重组疫苗分别连续传代40次，标 记并保存每次的培养液，同时每隔5代提取感染细胞中的重组病毒基因组，通过PCR和 DNA测序鉴定外源基因的大小、方向和位置。 1.6免疫原性鉴定(Western blotting)取含狂犬病病毒CVS-11株的细胞裂解液50 "1,加等量2XSDS-PAGE上样缓冲液， 沸水浴10rain，冷却至室温，短暂离心后进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕，将胶上蛋白样 品电转移到硝酸纤维素膜上，分别与猫抗重组疫苗的多抗及阳性和阴性对照多抗、服P 标记兔抗猫二抗反应，最后以DAB/HA显色，根据显色带出现与否及其位置判定重组疫苗是否表达狂犬病病毒保护性抗原。 1.7结果(1) 重组疫苗基因组内正确插入了狂犬病病毒保护性抗原，转录方向与病毒基因组转录方向一致；(2) 0. lml重组疫苗的TCID.a,与载体病毒无明显差别，为10" 107;(3) 重组疫苗均表达了狂犬病病毒保护性抗原，抗体可以与狂犬病病毒糖蛋白特异 性结合；(4) 毒力检测结果显示，注射猫未出现饮食和精神表现异常，体温在正常范围内 (37.2 38.化)。体内白细胞计数显示，白细胞总数(7. 5 16. 0X107L)分类计数均在正常范围内，注射猫未出现厌食等临床表现。解剖未见主要组织器官出现异常变化， 重组疫苗注射猫肺、肝和肾等组织切片与健康猫的组织切片无明显区别。(5) 稳定性鉴定结果表明，重组疫苗经过40代传代，基因组(包括外源基因的大 小、方向和位置)保持不变，外源基因序列未发生改变。2.重组疫苗效力检测 2. 1实验动物狂犬病病毒抗体阴性的3 5月龄猫2()只，随机分为2组，每组10只。 2. 2动物免疫分别以TCIDs。为106邻重组疫苗FHV-对2组猫进行免疫，其中肌肉注射10只， 0.5ml/条；口服10只，lml/条。2. 3免疫检测免疫前及免疫后每周分别采集少量静脉血，分离血清，以FAVN检测受试犬狂犬病病 毒中和抗体水平。 2.4攻毒试验免疫6周后，每组随机抽取5只猫，以100LD5u狂犬病标准强毒株CVS-24接种。隔 离观察各猫至接种后40天，详细记录各组猫的发病及死亡情况。 2.5结果(1) 所有受试猫的免疫前血清内检不出抗及狂犬病病毒的特异性抗体；(2) 所有猫免疫后2 3周，其血清中均可检出抗I型疱疹病毒抗体，至6周时，抗 体仍维持在较高水平；(3) 所有受试猫免疫后3 4周时，其血清中均可检出狂犬病中和抗体，抗体消长规 律与I型疱疹病毒抗体---致；(4) 受试猫能抵抗狂犬病强毒的攻击，存活率为95%。3. 结论重组疫苗FHV-RVG可诱导机体产生针对I型疱疹病毒和狂犬病病毒的特异性中和抗体，对I型疱疹病毒和狂犬病病毒感染具有保护作用。 实施例3犬I型疱疹病毒活载体一-~S犬病重组疫苗 1.重组疫苗的构建 1.1引物设计根据犬I型疱疹病毒基因组序列，对每段片段的首尾两端设计两对引物。引物序列如下引物Fl: 5- gaatccGAATTCACATTTATCAAAAAC -3; 引物Rl: 5- tctagaATATCATCACCATTTATAGG-3; 引物F，5- tctagaGTTCTAAATTAATAGTAC八T -3; 引物R1， 5- agatctTAAATAGATTTCTATAGTAG-3; 引物F2: 5- gaatccATTATTTATACTTTA ATA AT -3; 引物R2: 5- tctagaTCTCCTGA A AG A ATATGAGT-3; 引物F2， 5- tctagaACGTTTGAAAAATGTAAATG -3; 引物R2， 5-agatctTTGGATGTAGATGCTGAAGT-3; 引物F3: 5- gaatccTATGAATGAAATCTATGAAT -3; 引物R3: 5- tctagaTTGCATGGGGTGAAACCTAT-3; 引物F3': 5- tctagaAAATGAATTTC'CATCTGATT -3; 引物R3 ， 5- agatctTTATTCCATAGCTCAGTATT-3; 引物F4: 5- gaatccTACTGAGTTTTCCCCACATG -3 -, 引物R4: 5- tctagaGGGCGTGAAGAACTTGAAGCAG-3; 引物F4， 5- tctagaACGATTATTTTCAAGGCGCG -3; 弓I物R4': 5- agatctG AAA A A AGGGAGTGGA ACG AC-3 。在TaKaRa Ex T叫DNA聚合酶作用下，95。C预变性5ndn， 94。C变性45s， 59'C退火 45s， 72。C延伸lmin,共30个循环，获得扩增片段。将引物扩增的片段连入pMD18-T Vector中，测序正确后，利用引物中的设计的酶 切位点将片段l与l' ， 2与2' ， 3与3' ， 4与4'分别克隆入pPloyII-BE中，得到 4个重组质粒，每个重组质粒分别与犬I型疱疹病毒基因组共转化到DH5 a感受态细胞 中，经过鉴定，获得阳性同源重组质粒，命名为pPloyll-1' ' 、 pPloylI-n''、 pPloyll-III''和pPloyII-IV，'。将含有狂犬病病毒保护性抗原基因表达盒插入含有该复制非必需基因片段的中间转 移载体中。使该中间转移载体与其它中间转移质粒共转染MDCK细胞，隔天传代，直至出现典型的细胞病变，获得重组疫苗命名为CHV-RVG。1.2重组疫苗基因组鉴定PCR鉴定取50ml培养瓶内已呈典型病变的单层MDCK细胞，倾弃培养基，以PBS洗涤2次，加入800y 1新鲜配制的细胞裂解液(0.6% SDS， lOmM EDTA， 100ug/ml蛋白酶K)， 37。C温育lh，加入200u 1 5M NaCt,轻轻混匀后，冰水浴lh。将全部混合物移入离心管，于4'C， r2000rpm离心40min,上清移入加一离心管，以等体积酚氯仿抽提2次，加入终浓度0. 25M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，12000rpm离心10min, DNA沉淀以70%乙醇洗涤1次，无菌风千后，溶于5()nl去离子水。以基因组为模板设计引物，扩增外源基因，测序鉴定。鉴定用PCR引物序列如下 TKF: 5，- GTTCTAAATTAATAGTACAT-3'; TKR: 5'-TAAAAACCTTTTCGATGTTG-3，。 gEF: 5'- TTTACGATGTTTCGTTTATT -3'; gER: 5' -CATTCTGGATTGATTTTAAG-3'。 gIF: 5，网ATTCATGTACCTACAACTTT-3'; gIR: 5'-GTTTCAAGAGATGTCTCCCT-3'。PCR反应条件同上。Southern blotting鉴定根据狂犬病病毒cDNA序列设计一对引物(F: 5' -GTTGTGGAGGATGAAGGA-3' ; R: 5， -GGTGTAATCGTGGTTAGTTG-3，)，反应条件为94°C 5min， 94°C 45s， 48。C 40s， 72°C 30s， 30循环,72°C 10min，扩增片段长度为444bp。 将PCR产物用用酚、氯仿抽提后，用乙醇沉淀，溶于去离子水中进行探针的标记。按上 述重组疫苗基因组提取方法提取重组疫苗的基因组，将其转移到NC膜上，用标记好的 探针杂交液与NC膜反应显色以确定目的基因的存在。 1.3TCIDs。的测定将1X107MDCK细胞传入96孔细胞培养板，每孔内细胞约1X106，补加培养基至 100yl。次日，接入待测病毒样品。在1 11孔内，进行10—' 1(T稀释，A H列为同 浓度重复。7天后，以KS.rber法计算待测重组疫苗的TCID別。 1.4毒力鉴定取4 5月龄狂犬病病毒抗体阴性犬2()条，按接种量不同分为2组，每组10条，分 别用含10"TCIDs。和1()7TCIQ3。的重组疫苗细胞培养液各肌肉注射IO条犬。注射后，观察 注射犬的饮食、精神状态等表现，测量体温、计数白细胞数量和其它临床表现等，并在 4周后解剖注射犬，观察犬体病理变化，并进行肝等主要脏器的组织切片观察。 1.5稳定性鉴定lXl(fMDCK细胞传入25cm2细胞培养瓶内，细胞长成单层后，按培养瓶内培养基体 积的0.5%接入重组疫苗，接种后3 4天收毒，对各种重组疫苗分别连续传代40次，标 记并保存每次的培养液，同时每隔5代提取感染细胞中的重组病毒基因组，通过PCR和DNA测序鉴定外源基因的大小、方向和位置。 1.6免疫原性鉴定(Western blotting)取含狂犬病病毒CVS-11株的细胞裂解液50 u 1，加等量2XSDS-PAGE上样缓冲液， 沸水浴10min，冷却至室温，短暂离心后进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕，将胶上蛋白样 品电转移到硝酸纤维素膜上，分别与犬抗重组疫苗的多抗及阳性和阴性对照多抗、HRP 标记兔抗犬二抗反应，最后以DAB/H必,显色，根据显色带出现与否及其位置判定重组疫 苗是否表达狂犬病病毒保护性抗原。 1.7结果(1) 重组疫苗基因组内正确插入了狂犬病病毒保护性抗原，转录方向与病毒基因组 转录方向一致；(2) 0.1ml重组疫苗的TCID5。载体病毒无明显差别，为106 5 107;(3) 重组疫苗表达了狂犬病病毒保护性抗原，抗体可以与狂犬病病毒糖蛋白特异性^b人5口 口 ；(4) 毒力检测结果显示，注射犬未出现饮食和精神表现异常，体温在正常范围内 (37. 5 38. 5°C)。体内白细胞计数显示，白细胞总数(7. 5 16. 0X107L)分类计数均在正常范围内，注射犬未出现蓝眼或厌食等临床表现。解剖未见主要组织器官出现异常 变化，重组疫苗注射犬肺、肝和肾等组织切片与健康犬的组织切片无明显区别。(5) 稳定性鉴定结果表明，重组疫苗经过40代传代，基因组(包括外源基因的大 小、方向和位置)保持不变，外源基因序列未发生改变。2.重组疫苗效力检测 2.1实验动物狂犬病病毒抗体阴性的4 5月龄犬20条，随机分为2组，每组10条。 2. 2动物免疫分别以TCIDs。为1(fs的重组疫苗CHV-RVG对2组犬进行免疫，其中肌肉注射10条， lml/条;口服10条,2ml/条。 2. 3免疫检测免疫前及免疫后每周分别采集少量静脉血，分离血清，以FAVN检测受试犬狂犬病病 毒中和抗体水平。 2. 4攻毒试验免疫6周后，每组随机抽取5条犬，以100U)5。狂犬病标准强毒株CVS-24接种。隔 离观察各犬至接种后40天，详细记录各组犬的发病及死亡情况。 2.5结果(1) 所有受试犬的免疫前血清内检不出抗狂犬病病毒的特异性抗体；(2) 所有犬免疫后2 3周，其血清中均可检出抗I型疱疹病毒抗体，至6周时，抗体仍维持在较高水平；(3) 所有受试犬免疫后3 4周时，其血清中均可检出狂犬病中和抗体，抗体消长规 律与疱疹病毒抗体一致；(4) 受试犬能抵抗狂犬病强毒的攻击，存活率为95%。 3.结论重组疫苗CHV-RVG可诱导机体产生针对:[型疱疹病毒和狂犬病病毒的特异性中和抗体，对疱疹病毒和狂犬病病毒感染具有保护作用。实施例4I型疱疹病毒活载体——狂犬病重组疫苗联合免疫效果检测 1.重组疫苗效力检测 1. 1实验动物狂犬病病毒抗体阴性的4 5月龄犬2()条，3 6月龄猫20只，均随机分为2组， 每组10条。1. 2动物免疫分别以TC.IDs。为l(f 5的重组疫苗〖)HV-RV(;对4组动物进行免疫，其中肌肉注射10 条犬和10只猫，1ml/条;口服10条犬和10只猫，2ml/条。免疫4周后，以TCIDs。为 10"的重组疫苗FHV-RVG对2组猫进行加强免疫,其中肌肉注射10只猫，0. 5ml/条； 口服10只猫，lml/条；再以TCID^为10"的重组疫苗CHV-RVG对2组犬进行加强免疫， 其中肌肉注射10条犬，lml/条；口服10条犬，2ral/条。 1.3免疫检测免疫前及免疫后每周分别采集少量静脉血，分离血清，以FAVN检测受试犬狂犬病病 毒中和抗体水平。 1.4攻毒试验免疫6周后，每组随机抽取5只动物，以IOO LD5。狂犬病标准强毒株CVS-24接种。 隔离观察至接种后40天，详细记录各组动物的发病及死亡情况。 1.5结果(1) 所有受试动物的免疫前血清内检不出抗狂犬病病毒的特异性抗体；(2) 所有犬和猫免疫后2 3周，其血清中均可检出抗猪I型疱疹病毒抗体；(3) 所有受试犬和猫免疫后3 4周时，其血清中均可检出狂犬病中和抗体，抗体消 长规律与猪I型疱疹病毒抗体一致；(4) 所有受试犬和猫分别免疫FHV-RV(;和CHV-RVG 2周后，其血清中和抗体水平明 显升高，加强免疫效果好于1次免疫。(5) 受试犬和猫均能抵抗狂犬病强毒的攻击，存活率为100%。2. 结论重组疫苗PRV-RVG可诱导机体产生针对I型疱疹病毒和狂犬病病毒的特异性中和抗 体，以FHV-RVG或CHV-RVG加强免疫后，狂犬病病毒的特异性中和抗体水平明显升高， 对狂犬病病毒感染具有]00%保护作用。实施例5将实施例1 3所得获得重组疫苗，经常规工艺(如中华人民共和国2000年药典相 应药物制剂项下规定)将重组病毒冻干后，制备成注射或口服疫苗制剂，该类疫苗可经 不同免疫途径尤其是口服途径对犬和猫进行狂犬病免疫，使犬和猫等获得对狂犬病的免 疫保护。
权利要求
1、一种以I型疱疹病毒作为载体的兽用狂犬病重组疫苗，其特征在于以I型疱疹病毒为载体，在病毒复制非必需区插入狂犬病病毒保护性抗原表达盒，通过基因组片段间同源重组，获得重组疫苗。
2、 根据权利要求1所述的重组疫苗，其特征在于所述的I型疱疹病 毒分别选自猪I型疱疹病毒、猫I型疱疹病毒和犬I型疱疹病毒中的一种。
3、 根据权利要求1所述重组疫苗的制备方法，包括以下步骤-利用pPloyII载体，在多克隆酶切位点处插入人工合成的Linker BE， 依次含有BamHI、 EcoRI、 Sac I、 Xbal、 Sma I、 Bgl II、 XhoI和EcoRV酶切位点，形成pPloyII-RE载体；将I型疱疹病毒基因组分成若干段，根据每一片段的首尾两端分别设计 两对特异引物，扩增片段大小在l.lkb左右，分别将首尾两端的扩增产物克 隆入pPloyII-BE载体的多克隆酶切位点处，与I型疱疹病毒基因组共转化 到DH5(x感受态细胞中，根据细菌内同源重组的机制，获得5个中间转移 载体；根据I型疱疹病毒基因组中复制非必需区所在的位置，将目的基因插入 相应的中间转移载体，再与其它中间转移载体在脂质体介导下共转染敏感 细胞，隔天传代，直至出现典型的细胞病变，获得重组疫苗。
4、 根据权利要求1所述的重组疫苗，其特征在于为注射和口服两种方 式对犬进行免疫接种，重组猫I型疱疹病毒可以注射和口服两种方式对猫进 行免疫接种。
全文摘要
本发明公开一种以I型疱疹病毒作为载体的兽用狂犬病重组疫苗及制备方法，将I型疱疹病毒全基因组分为若干片段，各片段分别克隆入载体pPolyII中，得到相应若干个重组pPolyII，将重组pPolyII共转染病毒的敏感细胞系时，能够通过多片段间同源重组的方式获得感染性I型疱疹病毒全基因组；本发明利用这一技术路线，在重组pPolyII中的I型疱疹病毒复制非必需区内插入狂犬病病毒保护性抗原表达盒，然后以同源重组的方式构建了多种重组I型疱疹病毒；经常规工艺将重组病毒冻干后，制备成疫苗制剂，该类疫苗可经不同免疫途径尤其是口服途径对犬和猫进行狂犬病免疫，使犬和猫等获得对狂犬病的免疫保护。
文档编号A61P31/14GK101259268SQ200710056128
公开日2008年9月10日 申请日期2007年9月30日 优先权日2007年9月30日
发明者晔 刘, 菲 张, 张守峰, 扈荣良, 袁子国 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所