专利名称：：电穿孔装置及用其进行哺乳动物细胞电穿孔的方法
技术领域：
：除其他内容外，在本发明涉及电穿孔装置和它们在辅助向
背景技术：
：^;哺乳动物皮肤或皮肤组织的特点为具有细胞层并分为不同的区域(见图l)。最表面的区域为表皮(1.1),其可分为5个亚层角质层(l丄l)、,束层(l丄2)、透明层(l丄3)、颗并立层(l丄4)和基底层(1丄5)。真皮(1.2)位于表皮之下，是血管化非常丰富的区域；毛根和汗腺均位于这一层。皮下层位于真皮之下。中的功能发挥保护作用。作为宿主防御病原体的前线，皮肤有足够的装备进行免疫监督。举例而言，与其他组织相比，皮肤的表皮包含大量的郎格罕细胞，其为非常强效的未成熟树突状细胞("DC")。因此，将抗原靼向皮肤真皮可有效诱导强免疫应答。但是，表皮(1.1)(见图1)的角质层(l丄l)建立的屏障倾向于阻止抗原至表皮的有效进入。树突状细胞是皮肤中的主要抗原递呈细胞。皮肤中大量种群的DC使真皮内(intradermic,"ID")免疫称为具有吸引力的途径。体内质粒转移技术，尤其是当其涉及转移质粒至真皮内("ID")或皮下("SQ")组织或细胞，已传统地受到局限，因为棵露DNA(质粒)转移引起的体内表达水平一直较低，仅有部分是通过病毒基因转移完成。与可用于肌肉内注射("IM")的剂量相比以适用于ID或SQ的体积给予的质粒剂量较小。许多研究均已表明对向动物和人注射病毒作为DNA载体的安全性和毒理学的关注(Frederickson等，Mol.Ther.8:8-10(2003))。因此，直接注射质粒DNA已成为期望的递送技术，然而，有效传送至细胞和蛋白表达水平是一大难题。骨骼肌细胞提供了直接质粒转移DNA疫苗和其他应用的主要耙标(Prud'homme等，Curr.GeneTher.6:243-273(2006))。质粒体内递送的最近进展为电穿孔("EP")。EP可用于递送各种分子从离子到药物、染料、示踪剂、抗体和寡聚核苷酸至RNA和DNA(Gehl，ActaPhysiolScand.177:437-447(2003))。该方法将目标组织暴露于简单的电场脉冲下，其可诱导在细胞膜中形成瞬时和可逆的孔。在膜去稳定化过程中，分子例如质粒可进入细胞内。之前，报导已显示对EP方法的改良可增加转移效率并降低通过使用恒流装置体内产生目标水平抗原所需的质粒量(Draghia-Akli和Smith,GeneTherapy第245页-TherapeuticMechanismsandStrategies,N.S.Templeton和D.D.Lasic编辑，MarcelDekker,Inc.,NewYork.(2003》。使用EP增强质粒传送使得被注射组织可用做大量生产和向血流中分泌蛋白质的生物反应器和/或用于抗原递呈。与单独质粒注射相比表达水平增加了二至三个数量级，增加至可与腺病毒介导的基因传送可比的水平并且在一些情况下可达到生理学范围。电穿孔已成为基础研究的可用工具，可应用于基因传送和DNA接种领域。已成功使用电穿孔在注射质粒后转染胂瘤细胞或向人皮肤和皮下肿瘤递送抗肿瘤药物博莱霉素。电穿孔已用于在小鼠、大鼠、狗和猪中递送编码各种激素、细胞因子、酶或抗原的治疗基因。被靶向的大量的组织和器官包括肝、眼、睾丸、心肌、平滑肌、不同位置的胂瘤和骨骼肌。大型哺乳动物和人的皮肤EP的一大难题是皮肤厚度的个体差异，以及不同解剖学区域皮肤厚度的差异。例如，人三角肌皮肤厚度约为2毫米("mm"),而肩胛水平约2.6mm,腰部约1.7-1.9mm,大腿为约1.6-1.7mm。皮肤是敏感的，因此也需要调节电极规格(gauge)和配置(configuration)将不适降至最低。当用于治疗目的时，在治疗中一定程度的不适对于患者而言有时是可接受的，已建议只有相对无痛的方法可用于预防接种。针对这一难题已调整电极阵列结构和特性以及装置脉冲才莫式。已知在电穿孔中从电极尖端约2mm至距其尖端三分之一电极处的位点可产生最大均一电场。Draghia-Akli等的美国专利7245963号描述了模块电极系统模块电极系统[含多^针状电极；皮下针；可提供程序控制型'i流脉冲控制器与多个针状电极之间传导性连接的电连接器；和一个能量源。操纵器可抓起这些安装在支撑结构上的针状电极并将它们插入所选身体组织或植物。接着通过皮下针将生物分子递送至所选组织。程序控制型恒流脉冲控制器被激活并将恒流电脉冲施加至多个针状电极。所施加的恒流电脉冲辅助将生物分子引入多个电极之间的组织中。美国专利7245963的完整内容以参考形式并于本文。Smith等提交的美国专利出版物2005/0052630描述了可用于有效辅助将生物分子引入所选身体组织或植物细胞的电穿孔装置。该电穿孔装置包含电动(electro-kinetic)装置("EKD"装置)，其操作由软件或固件(firmware)设定。EKD装置基于使用者控制和脉冲参数输入在任何阵列的电极之间产生一系列的程序可控型恒流脉冲模式并允许存储和采集电流波形数据。该电穿孔装置也包含具有针状电极阵列的可替换电极盘、注射针的中心注射管道以及可移除的导盘。美国专利出版物2005/0052630的完整内容以参考形式并于本文。调整美国专利7245963和美国专利出版物2005/0052630描述的电极阵列和方法使其不仅可以深度刺入组织例如肌肉也可刺入其它组织或器官。由于电极阵列的结构，注射针(用于递送所选生物分子)也^R完全插入目标器官中，并且在电极预描绘的区域内垂直于目标组织注射。美国专利7245963和美国专利出版物2005/0052630描述的电极优选长20mm和规格为21。—般而言，电穿孔是使用跨膜电场脉冲诱导生物膜中的显微可见路径(孔)。这些孔通常称作"电孔"。它们的存在使得生物分子、离子和水从膜的一边通过至另一边。因此，电穿孔已被用于向多细胞组织引入药物、DNA或其他分子并证明对于某些疾病的治疗是有效的。然而，在活体内使用EP存在若干问题，包括所产生的热量和电孔不能重新闭合引起的细胞死亡。在发生过量细胞加热和细胞死亡的EP方法中药物或生物分子的有效作用非常有限。为了更好地理解电穿孔过程，需要了解一些简单的方程式。当在植入组织中的电极施加电势差(电压)时，它会产生电场("E"),其为施加电压("V")除以电极之间的距离("d")。E=V/d当设计电穿孔方案用于递送药物或生物分子至受试者细胞时电场强度E是一个非常重要的数值。在给定电压下电场强度与电极间距离成反比，当电极间距离减小时电场强度增加。但是，值得注意的是可在具有绝缘电极的组织中产生电场(即离子的流动不一定产生电场)。虽然不愿意受到理论的束绰，人们认为离子流打开了电孔并使得在电穿孔过程中分子运动至受试者细胞内。在导体中和具有电势差的两点之间的介质中电荷的流动称作电流。电才及间的电流由组织中的离子或带电颗粒实现，其在组织和患者之间存在差异。而且，组织中导电离子的流动可从电脉冲开始至电脉冲结束在电极之间变化。当组织具有小比例的导电离子时电阻增加，产生热量并杀死细胞。欧姆(Ohm's)定律表达了电流('T，)、电压("V")和电阻("R")之间的关系R=V/I两个电极之间组织中的电阻随着其中存在的带电颗粒而变化。因此，组织中的电阻从电脉冲开始至电脉冲结束发生变化。加热是电极间阻抗的乘积(即电阻与电抗的组合并以欧姆测量)并与电流乘积、电压和月永冲时间成正比。加热也可表示为电流的平方和脉冲时间("t",时间)。例如，在电穿孔中，支持组织中产生的加热或功率("W",瓦)可由下列等式表示W=I2Rt—般而言，将金属或电解质电极与组织接触并在电极上施加预定电压的短脉冲使细胞开始瞬时开放膜孔。目前描述的电穿孔方案就所得电场强度E定义，其取决于与电极间距离成正比的电压的短脉冲并与电流或组织电阻无关。因此，无法测定净皮电穿孔组织的阻力或加热，这导致不同脉冲电压电穿孔方案各种各样的(varied)成功。确定的是，可辅助有效电穿孔的电穿孔方案和引起细胞死亡的电穿孔方案之间的电压脉冲的上限振幅差异是很小的。此外，已观察到由短电压脉冲的上限振幅引起的细胞死亡和加热之间的确定联系。因此电极间细胞的过度加热成为任何给定电穿孔电压脉冲方案无效的主要原因。此外，电极间电流而不是电才及间的电压成为任何给定脉冲方案有效性的主要决定因素。当电流递送至受试者细胞时，电流的剂量可根据下式由电荷("Q，，)精确描述，其为电流('T，)和时间("t"):Q=It如果电流不是桓定的，Q表示I的时间积分。在这一方面，带电颗粒，无论是离子或分子，具有相似的行为方式。举例而言，当将银离子沉积在电极上以定义电荷的标准单位(库伦)时，只有电荷(如上所定义)是重要的。必须存在某一最小电压以产生电流，但不能从预测定电压测定沉积离子的量。相应地，递送至电穿孔器中细胞的带电颗粒的量也不能衍生自施加于电极的电压。电穿孔的有效性受限于这一事实脉冲强度存在阈值和上限，阈值之下不发生电穿孔而高于上限会破坏细胞。实验数据显示上限和下限之间的差异;[艮小以致于;f艮难设计有效的脉冲方案而不存在不适当的实验。这使得该技术使用困难，主要是当目标组织天然具有非均一的细胞组分时，例如不同厚度的表皮和真皮中的皮肤细胞以及层(strata)、脂肪、筋膜(fascia)的数量，不同大小的血管从毛细血管至小血管；只有可以即时(instantaneously)分析个体与个体之间以及个体皮肤表面位点之间的即时条件变化的精确(true)软件驱动装置可以满足这些要求。而且，电极应该适应皮肤形态学并防止皮肤损伤和出血。针对电穿孔装置的参考文献例证了电极装置和体内电穿孔方法的可用性。相应地有4艮多美国专利主张特异电极或电穿孔方法。例如，Zhang,等人的美国专利6302874描述了电辅助局部递送用于美容应用的试剂的方法。Hofman等人的美国专利5676646教导了经电穿孔装置的流动将分子植入患者的活血细胞中。Hofman等人的美国专利6241701和6233482描述了电穿孔介导的递送药物和基因的方法和装置。更具体而言，他们描述了用电穿孔和化疗剂组合治疗肿瘤以产生体内胂瘤退化的电穿孔疗法("EPT，，)的方法和装置。Hofman等人的美国专利6216034描述了编程用于组织电穿孔疗法的针状电极阵列的程序化方法。Hofman等人的美国专利6208893描述了具有连接电极才莫板的电穿孔装置。Hofman等人的美国专利6192270描述了装置的电才及组件和3争表面分子递送的方法。Hofman等人的美国专利6181964描述了最小侵入性装置和电穿孔递送药物和基因至组织的方法。Nanda等人的美国专利6150148描述了根据使用者特定脉冲和温度曲线方案通过产生和应用电场以控制过程中的温度的电穿孔装置。Hofman等人的美国专利6120493描述了使用电场电穿孔装置引入治疗药剂的方法。Hofman等人的美国专利6096020描述了根据使用者特定脉冲方案以产生和施加电场的电穿孔方法和装置。Hofman等人的美国专利6068650描述了用于体内电穿孔疗法的选择性应用针阵列结构的方法以及Hofman等人的美国专利5702359描述了应用电穿孔至患者身体的一部分并具有感应元件感应电极间距离并产生与所述电才及之间的距离成正比的距离信号的电极装置，以及对所述距离信号具有响应性用于应用高振幅电信号脉冲至与所述电极间距离成比例的电极的方法。Mathiesen等人的美国专利出版物2005/0070841公开了电穿孔装置和注射装置。所有这些引用专利均以参考形式并于本文。与本文所示新颖皮肤电极组合使用并用于本文所述实验中的装置主张于美国专利出版物2004/0167458和美国专利出版物2005/0052630,其各自的完整内容以参考形式并于本文。最近报导了通过使用电穿孔增强体内质粒表达以及分泌型蛋白所达到生理学水平的进展(Draghia-Akli等，TechnologyinCancerResearch&Treatment1:365-371(2002)。研究显示注射表达生长激素释放激素("GHRH")的质粒然后电穿孔是可扩展的并且代表了用于稳定生产治疗大型哺乳动物的分泌蛋白的方法(Dmghia-Akli等，JournalofAnimalScience81:2301-2310(2003);Dmghia-Akli等，FASEBJ17S26-528(2003))。仍然需要电穿孔技术的其他改进，尤其是用于接种目的和基因治疗的有效皮肤电穿孔以及侵入性和疼痛降低的电穿孔。之前的研究者已使用电穿孔装置用于质粒DNA转移，其概念性的基于恒定电压系统，使用电极间的预设定电压。因为包埋在组织中的电极之间的阻抗在不同情况下和不同组织中存在差异，预设定电压不能产生预定电流。除了丧失完美的方波功能，预定电压脉冲引起在脉冲持续中流经肌肉组织的电流未经调节的增长。相反，恒流电源事实上可以维持流经肌肉组织的方波功能恒定电流。但是，现有的市售电穿孔装置不具有经设计可测定细胞所暴露的精确电流量的固件。传统电穿孔装置产生的未调节电流可能在在组织中生成很容易杀死细胞的大量热量。例如，流经典型的25欧姆("。")负载阻抗的平均电流为5安培("A"或"Amp")的典型的50毫秒(ms)电脉冲理论上可将组织温度升高7.5。C,这足以杀死细胞。Lee等人综述了电休克引起的组织损伤物理学(Lee等，Annu.Rev.Biomed.Eng2:477-509.:477-509(2000))。因此，需要通过提供有效控制递送至细胞的电量避免与恒定电压电穿孔相关的技术问题并藉此达到熟练的电穿孔同时限制对细胞的破坏。许多电极存在的问题根源于这一事实脉冲能量浓缩在阵列中央，即放置被转染材料的位点。结果，能量传送的空间分布具有非常不均一的特性。因此，只有电极组件所包容体积中的一部分细胞被电穿孔。因此也需要一些应用以通过精确控制与细胞膜中的管道碰撞的离子流提供有效控制递送至电极间空间的细胞的电流量的方法。而且，用于大型动物应用和人类的现有市售电极都不允许ID或SQ粑向树突状细胞，因为它们通常太长并且具有不适当的规格和不适宜的斜面方向。因此，需要皮肤电穿孔仪的某些应用，可以辅助内体递送生物分子(例如质粒)至皮肤组织，例如动物的ID或SQ空间。此外，可商业购买的电穿孔装置和针阵列不允许控制组织电阻、厚度和局部条件的个体间和个体内差异。使用这些仪器，将预设定电压递送至电极，不考虑个体的组织电阻或厚度。因此，需要允许能考虑到脉冲之前或过程中个体差异的适应性电穿孔的电穿孔装置和皮肤电才及。此外，使用皮肤和肌肉侵入性可替换针阵列作为电极递送电流的电穿孔装置在发生针阵列替换时需要维持无菌条件。这从医疗实践和调控顺应性角度而言都是必要的。同时，需要一次性(disposable)皮肤电极以允许更低的生产成本和在治疗和预防目的的大规模接种中使用。因此，需要提供允许简易替换针皮肤阵列(needleskinarray)的皮肤电极盘。发明概述在本发明的一方面提供了通过向组织递送恒定电流对哺乳动物组织进行电穿孔的电穿孔装置，其中该组织优选皮肤组织。在一些实施方案中，将电穿孔装置配置成可以向期望的哺乳动物组织递送能量脉冲并产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流。电穿孔装置包含电穿孔组件和皮肤电极组件。电穿孔组件可递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲并包括反馈机制。皮肤电极组件包括在空间排布中具有多个皮肤电极的电极阵列，其中所述皮肤电极组件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并将其通过皮肤电极递送至期望组织。在能量脉冲传送中多个皮肤电极的至少一个为中性(neutral)并测定期望组织中的阻抗并将该阻抗传递至电穿孔组件。反々贵才几制可接受已测定的阻抗并可调节由电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒流。在本发明的一方面提供了经配置向期望哺乳动物组织递送能量脉冲以在期望组织产生与使用者输入的预设定电流相似的电穿孔手柄组件。该手柄组件包含在空间排布中具有多个皮肤电极的电极阵列，其中所述皮肤电极组件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并将其通过皮肤电极递送至期望组织。与皮肤电极阵列联通的控制器。该控制器可控制经皮肤电极的能量脉冲的传送；以及实施反馈机制的方法，其中通过软件或硬件实施反馈机制，其接受来自中性皮肤电极的已测定阻抗并按需要调节所递送的能量脉冲以维持恒定电流。在本发明的一个方面提供了使用本发明的电穿孔装置向哺乳动物的组织细J包递送生物分子的方法。在一些实施方案中，该方法包括使用本文描述的皮肤电穿孔装置向期望皮肤组织递送能量脉冲以产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流。该类方法包括将多个针状皮肤电极插入皮肤组织中而基本不刺入肌肉组织；将能量脉冲施加至多个针状皮肤电极以递送与皮肤组织中预设定电流相同的电流；用多个针状皮肤电极中的一个中性电极测量阻抗并使用电穿孔装置中的反馈机制响应已测阻抗调节施加的能量脉冲以维持递送至皮肤组织的电流恒定。在本发明的一些实施方案中提供了包含以下步骤的方法提供具有多个针状皮肤电极的皮肤电极组件；与电流波形发生器电连接的皮肤电极组件；将哺乳动物皮肤与多个针状皮肤电极接触而基本上不刺入哺乳动物的肌肉组织；将电流波形发生器的电能量脉冲施加至多个针状皮肤电极一段时间并在可将所接触皮肤组织有效暴露在基本恒定电流的条件下进行。附图简述通过参考附图本领域技术人员可更好地理解本发明的多个目标和优点。图1显示了皮肤结构示意图。最表面的区域为表皮(1.1),其可进一步分为5层角质层(l丄l)、岸束层(l丄2)、透明层(l丄3)、颗粒层(l丄4)和基底层(l丄5)。真皮(1.2)位于表皮之下，是血管化非常丰富的区域；毛根和汗腺均位于这一层。皮下层位于真皮之下。图2A显示了本文所述EP装置优选实施方案的图解。图2B显示了可为本文所述EP装置一部分的控制器的实例。图2C显示了在脉冲序列末端下载的实际脉沖序列记录，使射至25kg猪的ro和SQ皮^层之后递送电脉冲；("2.1")、显示通过红外线端口下载至个人电脑上或便携装置上的文件名；("2.2")显示了受试者数量，通过数字键盘直接输入皮肤EP装置，作为EP过程可以开始之前的前提条件；("2.3")显示了操作人员选择的电脉冲特性，包括脉冲序列中的脉冲数量，脉冲之前和之间的等待时间(以秒计算，"s，，)，脉冲宽度(以毫秒计，"ms"),脉冲电流振幅(以安培计，"A");("2.4")显示了在各次脉冲中各电极的电荷國对于各皮肤电极l、2、3任何下列位置都是可能的"正极"，"pos";负极，"neg";或关闭"off，-"关闭，，电极在各次脉冲之前、过程中和之后向装置输入信息("反馈")；("2.5")显示了在脉冲序列的各次脉冲中的实际安培("A")、电压("V")和注射区域的皮肤电阻，Z("欧姆")；由于每0.1-0.2ms(并且这种情况下脉冲长度为52ms)产生反馈，所以为了举例目的仅包括了一小部分反馈文件。图3显示了通过皮肤EP装置使用皮肤电极递送电脉冲时所下载数据的图解显示实例。该图描述了脉冲1("3.1")中皮肤EP装置测定的电压("3.1.1")和电流("3.1.2")以及脉冲2("3.2")中通过皮肤EP装置测定的电压("3.2.1")和电流("3.2.2")。也显示了脉冲l("3.1")和脉冲2("3.2")的组织电阻(在电脉冲过程中测定)。图4显示了通过皮肤EP装置使用大电极阵列向皮肤递送电脉冲时所下载数据的图解显示实例。该图描述了脉冲1("4.1")中皮肤EP装置测定的电压("4.1.1")和电流("4丄2"),脉冲2("4.2")中通过皮肤EP装置测定的电压("4.2.1")和电流("4.2.2")以及脉冲3("4.3")中通过皮肤EP装置测定的电压("4.3.1")和电流("4.3.2")。也显示了脉冲1("4.1")、脉冲2("4.2")和脉冲3("4.3")的组织电阻(在电脉冲过程中测定)。图5显示了皮肤电极阵列的图解表示，包括详细的特性("5.1")侧视图描述了单个针状电极的长度和插入末端的角度；("5.2")前视图描述了反套针点(revere-trocharpoint)的角度和程度；("5.3")表明了针状电极的规格。图6显示了皮肤电极手柄的视觉展示("6.1")和图解("6丄1")用于活化阻抗检查和电穿孔序列的触发器；("6.1.2")当皮肤EP装置准备治疗或出现错误时"LED"分别显示绿色或红色。("6.1.3")固定于位置的皮肤电极阵列；("6丄4")包含单股电线的电缆以及皮肤电穿孔手柄和皮肤EP装置单位之间的信号；("6丄5")单股电线，其细节描述于图8的电线图解中；("6.2.1")触发器图解；("6.2.2")LED图解；("6.2.3")描述了用于在完的脊(raisedridge)的图解；("6.2.4")皮肤电极阵列的针状电极图解；("6.2.5")固定于手柄上的皮肤电极阵列的侧视解；("6.2.6")锁臂和锁销(手柄上)的图解；("6.2.7")描述用于接收和进行回路连接接触的皮肤电极内部插座的图解；("6.2.8")描述包含单股电线的电缆的图解，该电线的细节显示于图8。图7显示了安装于手柄上的皮肤电极阵列("7.1")用于接的单个插座的侧视解。图8显示阵列和手柄组件的电线图解。图9显示了允许治疗受试者之间无菌加载手柄的多个皮肤电极阵列蛤壳式折叠包装容器("9.1")盖子；("9.2")基底，包括用户设计的用于放置阵列的单个的孔；("9.3")孔的侧视图；以及图IO显示了GEP在注射了不同量的质粒pSP5-12-GFP并使用皮肤电极阵列和皮肤特异性EP条件(MA)用EP装置电穿孔的动物中的平均表达水平，与通常用于向骨骼肌(LA)递送质粒的电极和条件相比。图11显示了三电极针阵列，其中距离L-kxn,其中n表示电极数量而k表示比例常数。始11天中SEAP表达水平(pg/mL/kg)的图片。、^图13显示了多个样品第11天的SEAP表达水平以及相关ELISA结果(平均抗体稀释)一起的图片。图14显示了使用各自的表达IGF-1质粒从电穿孔的时间开始11天中IGF-1表达水平(mg/mL)的图片。图15展示了在猪的皮肤中给予ID/SQ质粒接着进行电穿孔(EP)之后的绿色荧光蛋白的荧光图像。以不同剂量和体积使用通常用于IM+EP(A)的较大EP阵列或皮肤EP(B)递送质粒。图16展示的图片显示了给予pSEAP之后的4-11天猪血清中检测到的分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的水平。动物以浓缩制剂(10mg/mL)或常规制剂(2mg/mL)(n-5/组)接受相同的质粒剂量(lmg)。数据以小组平均应答土SEM表示。图17图解了非人灵长类的实验设计图17A显示了在第0和第4周用低剂量(各抗原0.2mg)HIV-1免疫原和质粒编码的猕猴IL-12免疫猕猴两次；接着在第8和12周用高剂量(各抗原1.0mg)免疫两次。约每两周采集血样用于免疫分析。每次免疫之后的两周进行ELISpots并且在第O、4、8、12和18周进行ELISAs。图17B展示了电极阵列和手柄的图解。皮肤EP由具有3个无菌不锈钢，规格26电极(3-5nm长)的单次使用阵列组成。将阵列连接至装置的手柄施用器；可通过按压手柄施用器上的触发器按钮启动EP过程。图18展示的图片显示了ID/SQ共注射质粒编码的IL-12之后进行EP对HIV-1免疫原的细胞免疫应答增强。各次免疫后两周进行IFNyELISpots。对env的应答用白色柱形表示而gag表示为黑色柱形，数据以叠加小组平均应答±SEM表示。图19的图片显示了使用ID/SQEP对HIV-1免疫原的记忆应答增强。最后一次免疫后10周进行ELISpost测定法以检测ID/SQ和ID/SQ+EP组中对gag和env的抗原特异性记忆应答。数据以小组平均应答±SEM。图20的图片显示了ID/SQ免疫HIV-lgag、env和质粒rhlL-12之后对Tpd而不是TH2介导的细胞应答的诱导。10周时进行IL-4ELISpot以检测对gag或evn-特异TH2应答的诱导。对env的应答以白色柱形表示，gag以黑色柱形表示，数据以叠加小组平均应答土SEM。图21的图片展示了p24(21A)和gpl60(21B)抗体的诱导。在第0、4、8、12和18周收集血清。分别通过p24和gpl60ELISA测定ID/SQ和ID/SQ+EP免疫组中的gag和env抗体滴度。数据以小组平均应答±SEM表示。图22的柱形图显示了在不同小鼠肌肉中测定的SEAP表达。将10pgC5-12-SEAP质粒注射入小鼠的胫骨前肌(TA)和腓肠肌(G)并在4s或80s延迟后进行EP。也给小鼠注射IO|ugC5-12-SEAP而不进行EP(未EP)。与接受质粒而未EP的对照小鼠相比TA肌和G肌注射小鼠的血清SEAP水平更高(*P<1.3E-21)。注射了不含质粒骨架(NB)的表达盒并接着进行电穿孔的小鼠比未EP的NB组具有更高的SEAP水平。但是，NB组显著低于在相同肌肉给予C5-12-SEAP的小鼠(NB4s与TA4s相比"P<0.008;NB80s与TA80s相比一P<0.004)。进行TA肌注射的小鼠比进行G肌注射的小鼠产生更高的表达并且将TA肌注射与EP之间的延迟从80s降低至4s不影响表达。图23的条形图显示了分别以2mg/mL或1Omg/mL以总体积25或5j^L肌肉(IM)或皮下(ID)注射50|ugCMV-EGFP质粒之后在小鼠中定量的平均GFP表达。与给予2mg/mL浓度((ID和IM/P=0.01)的动物相比给予1Omg/mL浓度的小组中GFP表达最高，尽管相互比较时ID和IM注射位点得到相似的总体评分。图24的柱形图显示了由普遍存在的CMV启动子驱动在各种电流设置下在小鼠不同肌肉中测定的SEAP表达。检测质粒制剂盐水、盐水+LGS或水+LGS。TA肌肉中于0.1A的盐水+LGS制剂产生最高表达。接受配制于水中的质粒并以0.2A电穿孔的动物产生与相同肌肉接受0.1A的动物相比显著较低的SEAP水平(TA，*P<0.05;G，"P<0.001)。当水+LGS用作质粒制剂时，TA肌肉的血清SEAP水平的差异不显著，而G肌肉的差异显著(一P〈0.04)。图25显示了治疗后14天测定的抗SEAP抗体的滴度，其在用O.IA电流在G肌肉(当质粒配制于(A)盐水+LGS中时)和在TA肌肉(当配置于水+LGS中时)处理的小鼠中最高。图26显示了继电接触矩阵实施方案的图解。图27A显示了电穿孔功能性电流流程图的第一部分。图27B显示了电穿孔功能性电流流程图的第二部分。优选实施方案详述提供以下缩略或简写定义以帮助理解本发明的优选实施方案。本文提供的缩略定义并不是详尽的并且不与本领域所理解的定义或字典意义相悖。本文提供缩写定义以补充或更明确地定义本领域已知的定义。术语"恒定电流，，在本文中用于定义组织或组成所述组织的细胞在递送至相同组织的电脉沖过程中接受或经受的电流。电脉沖递送自本文所述电穿孔装置。该电流在电脉冲过程中在所述组织中维持恒定安培因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选即时反馈。反馈元件可测定在整个脉沖过程中组织(或细胞)的电阻并使电穿孔装置改变其电能输出(例如增加电压)使得相同组织中的电流在整个电脉冲过程中以及脉冲与脉冲之间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包含控制器。术语"反馈"或"电流反馈"可替换使用并意指所提供皮肤EP装置的活性应答，其包括测定电极之间组织的电流并据此改变由EP装置递送的能量输出以将电流维持在恒定水平。恒定水平由使用者在起始脉冲序列或电子治疗之前预先设定。优选通过皮肤EP装置的电穿孔组件例如控制器完成反馈，因为其中的电流回路可以持续监控电极间组织的电流并将所监测电流(或组织内的电流)与预设定电流对比并持续进行能量输出调节以维持所检测电流在预设定水平。在一些实施方案中，反馈环为即时的因为其为类比(analog)闭环反馈。本文术语"生物分子"用于指核酸序列、蛋白质、脂类、微泡(例如载药嚢泡)和药物。术语"电穿孔"、"电透化作用，，或"电动(electro-kinetic)增强，，("EP")在本文中可替换使用并指使用跨膜电场脉冲诱导生物膜中的显微路径(孔)；它们的存在允许生物分子例如质粒、寡聚核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一边通过至另一边。术语"分散(decentralized)电流"在本文中用于定于由本文描述的电穿孔装置的各种针状电极阵列递送的电流模式(pattern),其中该模式最小化或优选消除在被电穿孔组织任何区域电穿孔相关加热的发生。术语"皮肤区域"(或"皮肤组织")在本文中用于指皮肤组织、真皮、真皮下和真皮内("ID")、皮内，皮下("SQ")层。皮肤区域不包括肌肉组织。术语"基本不刺入"在本文中指所关注物体(例如针)刺入不超过约lmm至2mm,并优选不超过约5mm。术语"反馈机制，，在本文中用之于指由软件或硬件(或固件)执行的过程，该过程接受和对比期望组织的阻抗(递送脉沖能量之前，之间和/或之后)与现有数值，优选电流，并调节所递送的脉冲能量以达到预设定的数值。术语"阻抗"在本文中在描述反馈机制时使用并可根据欧姆定律转化成电流值，从而可与现有电流比较。在优选的实施方案中，通过类比闭环回路进行"反馈机制"。本发明的一方面设计本发明的电穿孔装置和它们向期望哺乳动物组织递送能量脉冲并维持其中的恒定电流的能力，该组织优选为皮内或皮下组织。优选地，电穿孔装置为皮肤电穿孔装置("皮肤EP装置")。皮肤EP装置在EP过程中优选刺入皮肤组织而基本不刺入肌肉组织。该装置通过可此图皮肤组织例如皮内和皮下组织的皮肤针状电极递送能量脉冲并传送能量脉冲以及在能量脉冲过程中和整个电穿孔过程中维持组织中的恒定电流。本文描述的可维持被处理组织中恒定电流的皮肤EP装置的响应性通过皮肤EP装置的反馈机制达成，其可防止组织加热并降低组织受损、疼痛以及促进所提供皮肤电穿孔技术的整体成功。该反馈机制是本文描述的某些软件或硬件(或固件)的功能并优选为硬件的功能。在反馈机制为软件一部分的实施方案中，该类软件与控制皮肤EP装置操作的控制器电子连接并接受来自中枢皮肤电极的阻抗、比较现有电流与该阻抗并调节递送至期望组织的脉冲以在组织中维持恒定电流。在本发明的一个实施方案中提供了经装配可向期望组织递送能量脉沖并产生与使用者输入的现有电流相似的恒定电流的电穿孔装置。该电穿孔装置包含电穿孔组件和皮肤电极组件。电穿孔组件可包括以及并入一个或多个皮肤EP装置的各种元件，包括控制器、电流波形发生器、阻抗检测器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆组件、电源和电源开关。在一些实施方案中，电穿孔组件可作为皮肤EP装置的一个元件发挥功能，其它元件为与电穿孔组件相连的单独元件(或组件)。在一些实施方案中，电穿孔组件可作为皮肤EP装置的一个或多个元件发挥作用，其可进一步连接至与该电穿孔组件分离的皮肤EP装置的其他元件。本发明不受作为机电或机械装置一部分的皮肤EP装置的限制，因为这些元件可作为相互之间相连的装置或分离元件。电穿孔组件可递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲并包括反馈机制。皮肤电极组件包括在空间排布中具有多个皮肤电极的电极阵列，其中该皮肤电极组件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并通过皮肤电极将其递送至期望组织。在能量脉冲递送中至少多个皮肤电极之一为中性的，测定期望组织中的阻抗并将阻抗传递至电穿孔组件。该反馈机制可接受已测定的阻抗并可调节电穿孔组件递送的能量脉沖以维持恒定电流。在一些实施方案中，期望组织为皮肤组织并优选皮下组织或皮内组织。图2A显示了本文提供的EP装置的优选实施方案的体系图解。该图解显示了EP装置的主要功能元件，但是仅用做说明目的因为并不是所有功能元件对于所有的实施方案都是必需的。以各元件的硬件功能描述各元件。由硬件启用的事件序列可由软件控制，如本文所述。该装置的中心元件为该实施例中的控制器。控制器的一个实例图解显示于图2B,其为微控制器，其在一些实施方案中为TexasInstrumentsmsp43OF149或Motorola68HC908AZ60A。其它可选择的控制器为电子工程领域技术人员已知并可轻易取代上述例证性实例。在一些实施方案中，皮肤电极为针状电极、导电杆或导电薄膜区域并优选针状电极。优选地，针状电极可与皮内或皮下组织接触并基本不刺入肌肉组织。在一些实施方案中，该组织电才及可安装于基座上，其可为塑料材料，形成具有皮肤电极阵列(或皮肤阵列或皮肤针阵列)的可替代或可替换皮肤电极，其可与本文所述的皮肤EP装置相连使用。在一些实施方案中，该皮肤电极的长度可为约lmm至20mm;lmm至12mm;2mm至10mm;2mm至7mm;或长约5mm。在一些实施方案中该皮肤电极可为规格22或28;规才各23至27;规格24至27,或约规格26。优选地，该皮肤电极长约5mm并为规格26。在一些实施方案中该皮肤电极仅为真正与患者皮肤接触的皮肤EP装置的一部分(以防止交叉污染)。可向所选区域递送疫苗制剂，该区域;故皮肤阵列包围并且皮肤电极插入皮肤中。该皮肤阵列优选在插入皮肤的皮肤电极四周产生均一压力，并藉此辅助在目标区域的EP过程中生成均一的电场。在一些实施方案中，该皮肤电极组件进一步包含活化器开关以及可报告皮肤电极组件活化的状态指示器。在一些实施方案中，该电极阵列包含至少三个皮肤电极并优选具有三角形空间排布的三个电极。优选地，该三角形为等腰三角形。在一些实施方案中，电极阵列包含空间排列成等腰三角形的三个皮肤电极，其腰长为5mm并且底边长3mm。在一些实施方案中，该电极阵列为一次性的并与皮肤电极组件可移除性地相连。优选地，该一次性电极阵列为皮肤电极盘并更优选该皮肤电极盘为无菌的。在一些实施方案中，多个皮肤电极可以分散模式递送能量脉冲。在一些实施方案中，该多个皮肤电极可在程序化序列下通过控制皮肤电极以分散方式递送能量脉冲，并且该程序化序列由使用者输入值电穿孔组件中。在一些实施方案中，该程序化序列包含按序列传送的多个脉冲，其中多个脉冲的各脉沖由至少两个(一个中性电极测定阻抗)活性皮肤电极递送，并且其中多个脉冲的后续脉沖由至少两个活性电极的另外一个递送并具有一个中性皮肤电极测定阻抗。在一些实施方案中，反馈机制由硬件或软件执行。优选地，该反馈装置由类比闭环回路执行。优选地，该反馈每50ius、20|iis、10)US或1JLIS发生但是优选实时反馈或即时(即由测定响应时间的可用技术测定为基本即时)。在一些实施方案中，中性电极测量期望组织中的阻抗并将阻抗传递至反馈机制，反馈机制响应该阻抗并调节能量脉冲以将恒定电流维持在与现有电流相似的数值。在一些实施方案中，该反馈机制可在能量脉冲的传递中持续和即时维持恒定电流。在一些实施方案中，该皮肤电穿孔装置也包括接受来自使用者的输入的控制器并控制电穿孔组件根据输入递送能量脉冲。在一些实施方案中，该控制器接受来自使用者的输入并控制电穿孔组件根据输入递送能量脉冲。优选该控制器为单芯片微控制器。在一些实施方案中，皮肤EP的元件为控制器，其可控制与其连接或与其相连的各种外接装置。该控制器用于管理电穿孔程序，其包括以下操作(1)通过控制电流波形生成器为电极组件生成电穿孔点火序列或恒定电流脉冲模式；(2)进行阻抗检测以确定是否进行电脉冲；(3)传感和处理使用者指令；(4)提供使用者状态信息；(5)通过通信端口将电穿孔数据传递至外部电子装置；(6)保存和检索电穿孔数据(例如，电压和电流曲线)至存储器。控制器可通过软件或固件应用操作，其允许使用者输入期望脉冲参数和程序化序列(包括电极点火序列)并控制皮肤EP装置的操作。在一些实施方案中，该控制器包括或使用可有效处理来自使用者和进行皮肤EP的组织的信息并控制电能量输出以向組织递送恒定电流的软件程序化。程序化内容可包括在电穿孔之前预选的多个脉冲参数任何之一，包括预设定电流、程序化序列(电极点火序列)、脉冲持续时间、脉冲数量(在脉冲串(train)中)，预设定电流周围的允许误差。该接受和加工输入并产生相同的以确定电子输出的过程可发生在电脉冲持续期间并可优选发生在l毫秒(ms)之内，更优选100毫秒(ius)之内，更优选IOius之内并且甚至更优选lilis之内。在一些实施方案中，该过程实时或即时发生。在本文描述的EP皮肤装置操作的实例中，该控制器可根据程序化序列通过至少将期望恒定电流设置成现有电流递送能量脉冲。在一个实施方案中，类比闭环反馈回路通过调节施加至电极的电压(由于目标组织电阻变化，优选皮肤)维持期望的恒定电流。当通过设定期望输出电流至O满足脉沖时长时控制器可结束脉冲。当脉冲序列结束时，控制器可复查波形数据并在期望组织的电流超出电穿孔序列中预定电流周围的误差时提醒使用者。控制器可为单芯片微控制器，优选具有一个或更多以下性质的处理器充足的I/0,板上外设(on-boardperipherals),低耗电和大记忆容量。在一些实施方案中，该控制器包含TexasInstrumentsprocessormsp43OF149。软件可指导电穿孔过程的步骤并指导与硬件的连接步骤，优选固件因为其永存其中并从单芯片微控制器运行。在一些实施方案中，该软件执行一种算法，其包括接受装置使用者的输入，接受脉冲接受组织中电阻上的来自针状电极的信息或其中的电流并基于在各电脉沖中的输入调节电流输出。在一些实施方案中，皮肤电穿孔装置也包括与电穿孔组件连接并与皮肤电极组件电子连接的电流波形发生器；该电流波形发生器生成经皮肤电极组件递送的电流脉冲串波形的电流波形发生器。在一些实施方案中，使用者输入程序化序列至电穿孔组件，其将程序化序列传递至电流波形发生器；其中该电流波形发生器可根据所提供的程序化序列生成电脉冲串波形。优选地，该电流波形生成器为功率晶体管类比回路。该电流波形生成器可根据程序化序列生成通过电极阵列电极的电脉冲串波形。该脉冲串优选方形并且脉冲的数量受限于软件或固件并优选1至10个脉冲，更优选2至5个脉沖，更优选2至3个脉冲。向各电极组合施加一个脉冲。在一些实施方案中，脉冲持续时间为20ms至52ms并且以lHz的速率发生。该脉冲串的振幅可由操作者程序设计并且范围从0.1安培(A或Amp)至1.5A增量为0.1A。在本发明的一个实施方案中，脉冲振幅低于0.4A并优选0.1至0.2A之间(见图2和3)。可以个体组织电阻(个体之间以及相同个体身体不同区域，优选皮肤组织)调节脉冲串的振幅。电流波形发生器可包含一般功率晶体管类比回路，其可在控制器的指导下发挥功能。在一些实施方案中，皮肤电穿孔装置也包括可检测皮肤电极和期望组织之间电子连接建立的阻抗冲企测器。阻抗冲企测器可用于测定皮肤EP装置的回路是否与组织之间建立了适当的电子连接。这一检测验证所插入的皮肤电极已与手柄建立了良好的连接以及皮肤电极与组织之间具有良好连接。EP治疗之前可进行阻抗检测。如果任何阻抗测量落在电阻程序化范围之外(以欧姆测量，Q),阻抗冲企测失败并且不启动电穿孔序列。参见图27A的电穿孔功能流程图，尤其是决策箱27A.10,如果阻抗被启用(即电极和期望组织之间的电子接触未建立)其可导致点火延迟。阻抗检测具有操作器程序控制特点，由在操作中可禁用的软件或固件控制。阻抗检测器由功能受控制器指导的一般运算放大器类比回路组成。阻抗检测器可在皮肤EP装置中作为安全装置发挥功能。它可以指示，例如，是否所有的电极都已插入相同的组织并且可建立一个回路。与空气接触尤其是干燥空气接触的电极具有极高的电阻。如果开始电穿孔并且一个或多个电极未刺入皮肤(使用皮肤电极和进行皮肤EP操作时真正存在的可能性)，所得电极电压可为上万伏特，其对受试者可能具有致死或损伤后果并且也损伤皮肤EP装置。由于这一原因，可实施过载电压保护以防止电极上的过量电压。在一些实施方案中，电穿孔装置包括安全特征(safetyfeature),当调整能量脉冲将得到高于电压限(voltagecap)的电压时该安全特征为防止装置向组织递送能量脉冲的电压限。不考虑电负荷(例如，空气、皮肤或肌肉组织)，如果Vij在多于lms的时间内超过200V可使用过电压保护(或触发安全限(safetycap))。Vi』为电极i和j之间的电压，其中i,j-l至5。如果使用过电压保护(或触发安全限)，V^接近OV直至点火下一个电穿孔脉冲。当皮肤EP装置为关闭状态时任何电极对之间的电压优选不超过IOV。在一些实施方案中，皮肤电穿孔装置也包括与电穿孔組件连接的波形记录器。优选地，该波形记录器可在能量脉冲过程中持续记录电穿孔电压和电流波形。更优选地，该波形记录器可以2000个样品每秒的速度记录电穿孔电压和电流波形。通过取样和监控电穿孔操作的参数，波形记录器使得使用者能够接受并处理可能的问题并调节电穿孔操作失败或不能达到预期结果这些事件中的设置。示例性取样速度为2000个样品每秒，52毫秒(ms)的2-3个电脉冲约104个样品。示例性总取样时间为2208ms,取样起始于点火笫一次脉冲前约50ms并以2-脉冲^t式在最后一次脉冲后50ms结束。电压和电流波形以具有±1个最低有效位("LSB")线性的12位数字表示法定量。电流波形分辨率优选至少10毫安(mA)并且电压波形分辨率应当优选至少1.0V。波形记录器可由一般的运算放放大器类比回路和适用于控制器的模拟-数字("A/D")转换器组成。皮肤转输DNA制剂特性的波形记录器的实例列于表2C(请参考"2.5")。在一些实施方案中，皮肤电穿孔装置也包括与使用者和电穿孔组分直接通信的输入装置该输入装置可接受输入指令并将该输入指令传递至电穿孔组件。优选地，该输入装置为数字键盘或触屏。在一个实例中，可由操作者通过数字4建盘(例如Grayhill88AB2)输入EP装置操作参数。在优选的实施方案中，输入键盘的数字显示在液晶显示器("LCD")上。可程序控制的典型参数为电穿孔脉冲电流、阻抗检测启用/禁用和电穿孔点火延迟。与键盘相关的装置也可由控制器指导。可用于使用所述皮肤EP装置之一进行电穿孔的信息实例包括受试者识别号码、顺序中的脉冲数量、预等待时间(秒，s,sec)、脉冲宽度(ms)、脉冲电流(Amp)以及皮肤电极阵列针状电极的转换类型(受试者识别号码以及所有电穿孔条件为自动记录并可用于分析)。可用于使用所述皮肤EP装置之一进行电穿孔的信息实例见图2C(注意受试者识别号码以及所有电穿孔条件为自动记录并可用于分析)。在一些实施方案中，皮肤EP装置可进一步包括用于显示或提醒操作者系统状态的状态报告元件。在一些实施方案中，皮肤电穿孔装置也包括与电穿孔组件通信的状态报告元件。优选地，状态报告元件为信息显示板、语音提示、发光二极管或其组合。该状态报告元件可报告能量脉冲生成的确认和恒定电流的递送。这些状态报告元件可包括信息显示板，例如液晶显示器("LCD")(例如，LumexLCM-S02004DSF)。LCD优选为特征显示类型并优选可以显示4行20个字。LCD也优选安装有可由肘节开关打开和关闭的背景光。状态信息也由语音提示器提供，例如以各种音调发声的蜂鸣器(例如，CUICEP-2202AS)。各音调优选具有不同的含义，由软件或固件控制。例如，蜂鸣器的音量可具有3个程序可控的设置并且距蜂鸣器1米处的范围大略为60-80dB。提供声压水平范围仅作为参考。如果设定至其最高水平在嘈杂环境中(例如农场或军事围地(militarycompound))可以听见并且当设定至其最低水平在安静环境中(例如办公室)声音不是很高那么该声音水平是可接受的。此外，皮肤EP装置可安装发光二极管("LED")(例如，LumexSSI-LXR1612ID或任何安装于面板的红色LED)以指示元件是打开还是关闭。优选地，状态报告元件包括在完成电脉沖序列后在LCD上对成功生成电场的可^L化确认。在一个实施方案中，在每次电穿孔过程(或电穿孔序列)后，LCD将显示一列三至五个数字，或"1"或"0"，各用于电穿孔序列的各脉冲。"0"表示脉冲正常，"1"表示脉冲不正常。更具体而言，各脉冲必须达到所述设定电流的至少90%才是正常的或者LCD上显示"0"。如果某一脉冲小于设定电流的90%,该脉冲不正常并且显示"1"。此外，显示不正常脉冲的最低和平均电流。举例而言，对于设定于0.5Amp电流的五次脉冲电穿孔序列而言，如果脉冲3和5仅分别达到0.4Amp和0.3Amp,将显示"00101"以及"低:60%平均80%"。在一些实施方案中，皮肤电穿孔装置也包括与电穿孔组件通信的通信端口。在一些实施方案中该通信端口可用于上传电穿孔波形数据至外部电子装置，例如便携个人电脑(例如，"PocketPC")、个人数据助手("PDA")或个人电脑("PC")用于复查。优选地，该通信端口为串行通信端口，例如红外("IR")端口(例如，收发器(Transceiver):ACTiSYSACT画IR220LN115,或ZilogZH1201;编码器(Encoder):MicrochipMCP2120或TITIR1000)。在一些实施方案中，皮肤电穿孔装置也包括与电穿孔组件通信的存储器组件。存储器组件可储存电穿孔波形数据和操作参数。优选地，该存储器组件(例如，AtmelAT45DB321B或AT45DB321C-TU)为非易失的，意味着即使关闭皮肤EP装置仍然保留这些数据。为了保存存储器，仅可在电穿孔脉冲序列的活化阶段将电穿孔波形数据保存至存储器。在非活化阶段，只有任一波形超过特定阈值时才可将取样数据存储在存储器中。举例而言，这些阈值可为2V的电压阈值和1OmA的电流阈值。在电脉冲序列的非活化阶段存储至存储器的数据可能具有时戳(timestamped)这样一旦重构波形即可知数据的时间指数。存储量可存储脉冲序列的非活化阶段发生的多至40个样品(20ms)的数据。存储可限制于20ms因为软件可设定如果超过任一阈值的累积时间多于20ms将停止之后的电穿孔序列。当实施上述压缩技术时电穿孔波形数据设置需要约2kB的内存。皮肤EP装置的存储器组件优选包含足够的内存保存至少8000个脉冲(各脉沖单独存储)。在一些实施方案中，皮肤电穿孔装置也包括与电穿孔组件相连的能量源。优选地，该能量源为电池，更优选为例如锂离子、镍金属氢化物、铅酸或镍镉电池这样的电池。在一些实施方案中，该能量源优选为电池(例如，两个6VPanasonicLC-R064R5P4.5Ah,两个6VgenesisNP7-66V7.0Ah)并用于向皮肤装置的各回路提供电源。这些回路包括用于控制器及其外围的低电压/低功率容量电源，阻抗检测器的低电压和低功率容量电源以及电流波形发生器的高功率容量电源。电源开关(例如，E-SwitchR5CBLKBLKEF0,或任何DPDT10A安装于面板的翘板开关)控制皮肤EP装置的电源并可打开或关闭。在关闭位置，与电极组件的所有电连接在关闭电源5秒内为电中性。在本发明的一方面提供了电穿孔手柄组件(或"手柄组件")，其经配置向哺乳动物的期望组织递送能量脉冲以在期望组织中产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流。手柄组件包含具有在空间排列中的多个皮肤电极的皮肤电极，其中至少一个皮肤电极在传送输能量脉冲过程中为中性并测量期望组织中的阻抗；与皮肤电极阵列通信的控制器，该控制器控制经皮肤电极的能量脉冲的传送；执行反馈机制的工具，其中该反馈机制由软件或硬件执行，其接受从中性皮肤电极测定的阻抗并在需要时调节所递送的能量脉冲以维持恒定的电流。在一些实施方案中，皮肤EP装置也包括皮肤电极手柄组件。优选地，该手柄组件包括三个元件皮肤电极阵列(优选皮肤针状电极阵列)、用于报告皮肤EP装置状态的状态指示器和活化器开关。该阵列可包括任何数量的具有一种或更多种不同空间排列的针状电极并优选包括奇数个电极并且优选较低数量的电极，优选7个电极或更少。在优选的实施方案中，针状皮肤电极阵列为环形并包含以等腰形式放置的三个针状皮肤电极，长边为5mm,底为3mm;这一放置形式^C认为对于脉冲模式和电场生成以及最终皮肤EP的质量是重要的。优选在手柄组件上通过使用状态指示器指示皮肤EP装置的状态，例如一个或多个LED,其可具有多种颜色并经程序化间歇闪烁以指明电极点火序列的多个步骤。手柄组件活化器开关优选用于起始电极点火序列的多个步骤("6丄1")。在一些实施方案中，手柄组件是无线的并可由电穿孔组件(或控制器)远程操作。该无线手柄组件可接受来自电穿孔组件(或控制器)的信息，包括程序化序列和脉冲参数并向期望组织递送能量脉冲并在相同组织内维持恒定电流。无线手柄组件可包括维持其操作电荷的内置电池或电容器。优选地，该无线手柄组件将包括反馈机制，优选类比闭环回路。无线手柄组件可与电穿孔组件对接并交换信息以提供本文描述的皮肤EP装置的一个或多个功能。在一些实施方案中，电极阵列为一次性的并与皮肤电极组件可移除式连接。优选地，该一次性电极阵列为皮肤电极盘并且更优选地，该皮月夫电才及盘为无菌的。在本发明的一个实施方案中，皮肤EP装置包括可替换皮肤电极盘，其可移除地安装于手柄组件中。在优选的实施方案中，该可替换的皮肤电极盘安装在皮肤EP装置的手柄组件上。图6.1和6.2描述了电极阵列的侧视图("6.2.3"和"6.2.5")。在图6.1和6.2中，该电极盘具有以空间排列安装于支架结构上的针状皮肤电极用于刺入所选组织尤其是皮肤。在优选的实施方案中，该空间排列为环形皮肤阵列。皮肤电极盘上手柄一侧上的针状阵列中的单个皮肤电极为钝头并经去毛刺用于插入手柄中的互补电接触配件中。手柄优选安装从针状皮肤电极至脉冲发生器或皮肤装置的电连接。在优选的实施方案中，皮肤EP装置皮肤电极组件以及可替换皮肤电极盘中的针状皮肤电极为环形阵列。在优选的实施方案中，该多个针状皮肤电极由三个针状皮肤电极组成。在另一优选的实施方案中，三个针状皮肤电极的中心落于由2条5mm的边和一条3mm的小的底形成的形状中的环形阵列中。在优选的实施方案中，针状皮肤电极在特定的包装系统(图9)中无菌保存，该系统允许在接受治疗的受试者之间快速改变皮肤电极阵列并同时维持各皮肤电极阵列无菌。在一些实施方案中，提供了用于操作皮肤EP装置的程序化序列，其控制各皮肤针状电极阵列是否可作为正极、负极或中性电极发挥功能。例如，如图2C所示，在程序化序列中各电极可以正极、负极或关闭状态发挥作用。描述了图2C中的完整序列，其中电极1至3相继成为正极电极，皮肤阵列对角具有两个负电荷电极("2.4"-第二列)，或者一个电极关闭，一个正极，一个负极("2.4"-第四列)。在一些实施方案中，电穿孔组件包含控制器；与该控制器电连接的波形发生器；与该控制器电连接的波形记录器；以及与波形发生器连接的电池。控制器可接受使用者的输入，根据输入命令波形发生器递送能量脉冲至期望组织并根据递送的能量脉冲将数据传送至波形记录器；并且其中该电池向波形发生器传送电荷，电池为锂离子、镍金属氢化物、铅酸或镍镉电池。优选地，该装置为便携式。可通过电池组操作便携装置并适用于治疗或预防目的的大规模接种。在本发明的一些实施方案中提供了使用本文描述的皮肤电穿孔装置向期望皮肤组织递送能量脉冲以产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流的方法。这些方法包括将多个针状皮肤电极插入皮肤组织而基本不刺入肌肉组织；向多个针状皮肤电极施加能量脉冲以递送与皮肤组织中的预设定电流相等的电流；用多个针状皮肤电极中的一个中性电极测量皮肤组织的阻抗并响应所测定的阻抗使用电穿孔装置中的反馈机制调节所施加的能量脉冲以维持传送至皮肤组织的电流恒定。在一个优选的实施方案中，使用皮肤EP装置的方法包括按照例如图27A和27B提供的流程图描述的电穿孔功能序列进行。具体而言，图27B中的27B.10显示了"产生电脉沖"步骤的放大(blow-up)并描述了反馈机制，其优选由类比闭环回路执行并实时(或即时)操作。在一些实施方案中，这些方法进一步包括在施加能量脉冲之前测定阻抗以确定是否在期望皮肤组织和针状皮肤电极之间建立了电连接。在一些实施方案中，本发明方法用于将至少一种DNA疫苗与所述皮内或皮下组织接触。在一些实施方案中，本发明方法包括记录由电穿孔装置编辑的向期望皮肤组织递送能量脉冲的数据。在本发明的一些实施方案中提供了包含以下步骤的方法提供具有多个针状皮肤电极的皮肤电极组件，与电流波形发生器电子相连的皮肤电极组件；将哺乳动物的皮肤与多个针状皮肤电极接触而基本不刺入哺乳动物的肌肉组织；并将来自电流波形发生器的能量电脉冲施加至多个针状皮肤电极一段时间并在可将皮肤组织有效暴露于基本恒定电流的条件下。在一些实施方案中，施加电能量脉冲包括以下步骤用多个针状皮肤电极中的一个中性电极测量所接触皮肤组织的阻抗；将所测阻抗传递至与电流波形发生器相连的反馈机制，其中该反馈机制响应所测阻抗并调节传送自电流波形发生器的能量脉冲以维持基本稳定的电流。在一些实施方案中，由作为电穿孔装置一部分的类比闭环回路执行反馈抑制并在能量脉冲的整个过程中即时进行测量和通信步骤。本发明的一方面涉及皮肤EP装置，其可进行生物分子(例如DNA质粒)的体内电穿孔至期望皮肤组织或皮肤细胞。在一些实施方案中该皮肤EP装置向所关注皮肤组织经皮肤电极针状阵列提供恒流电场并辅助将生物分子引入所选皮肤组织的细胞中，优选皮下(SQ)和/或皮内(ID)组织。该皮肤EP装置产生与程序化序列一致的通过皮肤电极针状阵列的电极的电脉冲串波形并可在操作中监控和记录。针状电极可接触皮肤组织，例如SD或ID组织而基本不刺入肌肉组织。该皮肤EP装置产生与程序化序列一致的通过皮肤电极针状阵列的电极的电脉冲串波形并可在操作中监控和记录(见图2C)。针状电极可接触皮内或皮下组织而基本不刺入月几肉组织。美国专利7245963号和美国专利出版物2005/0052630公开了根据本发明可使用的某些电穿孔组件的系统图解，其中它们可适用于皮肤EP装置中或作为其一部分。本文以该元件的硬件功能描述各元件。这些出版物的完整内容以参考形式并于本文。由硬件启用的事件序列由软件或固件或二者的组合控制，如本文所述。在一些实施方案中，皮肤EP装置的电穿孔组件包括电极-连接继电器(relay)矩阵，其可辅助程序化序列并可操作皮肤电极组件中电极的点火。继电器矩阵可控制各电极，优选针状电极，这样各电极处于五种状态之一关闭、正极低电压、阻抗测量输入、正极高电压和负极(调控)高电压。在一个实施方案中，继电器矩阵包括ll个双极、可产生切换矩阵的双掷(DPDT)继电器。这些继电器中的IO个由一组与串行外设接口(SPI)端口连接作为SPI至并行端口的移位寄存器驱动。SPI从入主出(SIMO)与两个74VHC595(或经认可的等同芯片)的移位寄存器的数据输入引脚连接。74VHC595具有两个时钟输入。通用串行同步/异步通信接口时钟(UCLK)信号与用于转移数据至寄存器的寄存器移位寄存器时钟输入(SCK)引脚连接。单独的通用输入输出(GPIO)引脚通向存储寄存器时钟(RCK)的时钟输入，用于将移位寄存器数据并行时钟(clock)至输出寄存器。结果是相同的串行数据移动(shifted)到两个移位寄存器中，但随后数据仅被时钟(clockedinto)到待变的输出寄存器中。为了驱动实际的继电器线圈，SPI端口回路的输出(feed)2个ULN2003A(或经认可的同等物)8信道继电器线圏驱动器。该芯片主要为集电极开路双极结晶体管(BJTs)阵列。各信道输出也具有横跨的内部回程二极管-不需要外部二极管。继电器线圏的正极面限制在15伏，线圈的阴极面经ULN2003A部件接地。接触矩阵中有3组继电器。继电器接触矩阵的实例可见图26。第一组实际上为lDPDT继电器。一组接触将正极电压从低电压即阻抗测量电压转换200V供给的输出。相同继电器中的另一组接触转换阻抗测量回路和脉冲电流控制回路之间的负极电压。因此，该继电器的位置设定正极和负极电压二者以形成电脉冲或进行阻抗测量。下一组继电器为极性继电器的5继电器组。这些继电器(每个电极一个)转换该电极的极性至正极或负极电压。最后一组继电器为线内组接触以允许各接触相互分离为正极或负极。为了延长继电器接触的寿命，该矩阵仅用于以期望方式将荷载连接至适当的电极上。接着脉冲或阻抗回路通过电压或电流至荷载。然后在打开接触之前移除电压或电流。由于施加电流时接触事实上不会转换，因此可大大延长接触的寿命。由皮肤EP装置产生的电脉冲的实例显示于图3.1和3.2。图3.1和3.2显示了各电脉冲的波形。波形参数为厨期(tp):1000ms土250ps.上升时间(tr):最大值20ps置位(settling)时间(ts):最大值20ias脉冲宽度(tw):52ms±100|us衰减(fall)时间(tf):最大值20|us额定电流(In):Ine(0.1A,0.2A,0.3A.1,5A)±10%^过程中的In并且R^100n。Rj为图3.3和3.4显示的任一3电极组合之间的负载电阻。图3.1和3.2中仅限定了电流波形。电压波形的形状取决于电脉冲点火时电极的阻抗(th过程中)。th过程中没有限定电压波形因为在这一阶段阻抗是未知的。th过程中经过任何电极组的电压为0V。尽管不希望受到理论的束缚，据信电穿孔利用相同的结构并迫使高离子流经过这些结构，打开和扩大导管。金属或电解质电极与组织接触并且向它们施加与电极间距离成正比的预设定电压。用于电穿孔的方案就其所得电场强度定义，根据式E-V/d,其中("E"为电场。("V")为施加电压，("d")为电极间的距离)。当形成用于递送药物或生物分子至受试者细胞的电穿孔方案时电场强度E具有重要价值。因此，可以通过时间与电极间距离成正比的预设定电压脉冲计算各种方案的电场强度。但是，值得注意的是可在具有绝缘电极的组织中产生电场(即离子流动不一定产生电场)。尽管不希望受到理论的束缚，电流对成功EP是必要的，而不是电场本身。皮肤EP装置的电流波形发生器的活化将恒定电流电脉冲分布至多个针状皮肤电极这样分散EP事件发生在不产生一致EP重叠点的区域。分散EP区域细胞的通透性增加并且生物分子被递送至受试者细胞中而不会过度加热和损害细胞或组织。本发明一方面涉及向动物的一个或多个细胞尤其是皮肤中引入生物分子的皮肤EP装置，用于ID或SQ接种目的。优选地，该皮肤EP装置向皮肤组织例如ID或SQ组织中？I入生物分子，其方式为在整个电脉冲传送过程中在相同的组织中递送和维持恒定电流。在一些实提供向所选组织尤其是皮肤组织植入针状皮肤电极组件的简ii方法。使用在手柄上具有搭锁式固定装置(snap-onmounts)的一次性针状皮肤电极盘使得使用者可以快速连接和分离针状皮肤电极盘并允许在接受治疗的受试者之间的快速(并且无菌)转换。皮肤EP装置的电源可使用在电源插座和其他电源的获得和使用是危险的或不方便的情况下(例如在生物恐怖袭击中的大规模接种)使用的电池组。递送至皮肤组织细胞例如SQ和ID组织中的生物分子包括DNA质粒、DNA疫苗(DNA质粒和DNA疫苗不互相排斥)、基因、治疗药物或其他试剂，不论是补充剂或增强剂。优选地，该生物分子为可在目标皮肤组织细胞中表达的DNA质粒，用于皮肤EP递送的生物分子可包括多于一种生物分子。在一些实施方案中，该生物分子为DNA质粒。与本发明一起使用的DNA质粒可用于基因疗法中，即将所选基因递送至宿主用以预防、緩解或治疗损伤或疾病状态。使用皮肤EP装置DNA质粒可在哺乳动物中表达相关基因以緩解疾病症状，降低疾病的致病性、消除疾病的根本诱因或预防疾病的发生。DNA质粒中的编码基因可为获自外源性来源的外源基因。基因疗法可用于基因相关疾病，例如嚢性纤维化或肌肉萎缩症。基因疗法也可用于肿瘤的治疗。优选地，DNA质粒的基因编码释放生长激素的激素或胰岛素生长因子I,无论是合成或天然形式或其全长或功能片段。在一些实施方案中，与本发明一起使用的DNA质粒可引入哺乳动物细胞用于接种目的或接种抵抗感染性疾病，例如肝炎、流感、登革热、日本脑炎和HIV。在一些实例中DNA质粒可表达病毒蛋白免疫原性片段的多肽。可作为生物分子通过皮肤EP递送至皮月夫组织的药物的实例包括具有抗肿瘤或细胞毒性作用的化疗药物，包括博来霉素、新制癌菌素、苏拉灭、多柔比星、卡铂、紫杉醇、丝裂霉素C和顺铂。其它化疗药物为本领域技术人员已知并可在包括默克索引的参考文献中找到。此外，有助于跨膜递送的试剂("递送剂")也可作为生物分子考虑进行递送并包括N-烷基醇酰胺和对氯苯曱酸汞。在生物分子为DNA质粒或DNA疫苗的实施方案中，与DNA质粒或DNA疫苗同时递送，在其之前或之后递送的另一生物分子可为附加的一个或多个DNA质粒或DNA疫苗。在其中的生物分子为预期表达诱导免疫应答的靶蛋白的DNA质粒或DNA疫苗的实施方案中，与DNA质粒或DNA疫苗同时、在其之前或之后递送的另一生物分子可为进一步增强对该靶蛋白的免疫应答的一个或多个蛋白的基因。该类基因的实例为编码其它细胞因子和淋巴因子者，例如oc干扰素、y干扰素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFa、TNFP、GM-CSF、内皮生长因子(EGF)、IL國1、IL國2、IL-4、IL國5、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-18、MHC、CD80、CD86和I1^15,包括信号序列缺失的IL-5并任选包括来自IgE的信号肽。可使用的其他基因包括编码以下者MCP-1、MIP-1、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA隱1、Mac-l、p150.95、PECAM、ICAM隱1、ICAM-2、ICAM國3、CD2、LFA画3、M-CSF、G画CSF、IL國4、IL画18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-l、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、CaspaseICE、Fos、c-jun、Sp-l、Ap画l、Ap國2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、InactiveNIK、SAPK、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANKLIGAND、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。普通技术人员理解可对皮肤EP装置进行很多改变和修改而不偏离本发明精神和范畴。皮肤EP装置可包括任何数量的电极例如不同形式的三电极阵列，其可参见图11.选择距离L这样点B的能量强度是点A的三分之一。三次脉冲之后(1至2,2至3,3至1),点B接受了与点A相等的累积剂量。由于阵列中电极数量增加，产生均一能量分布所必须的距离L也成比例增长。L=kxn，其中n为电极数量，k为比例常数。因此，通过选择更大数量的电极可包围更大体积的组织。皮肤电极最佳数量的选择取决于被转染材料的体积和其在注射和电穿孔之间分散的远近。实施例进一步在以下实施例中例证本发明。应理解的是虽然实施例指明了本发明的优选实施方案但是仅用于说明目的。从上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的基本特点并对本发明进行各种改变和4务改以适应各种应用和条件而不偏离其并奇神和范畴。因此，除本文所显示和描述者之外的本发明各种修改对于本领域技术人员是显而易见的。这些修改也应属于附属权利要求的范畴。优选地，与本文所述皮肤EP装置一起使用的DNA制剂应具有高DNA浓度，优选最佳用于递送至皮肤的小体积内包括毫克量DNA的浓度，优选小注射体积，理想为25-200微升()LiL)。在一些实施方案中，该DNA制剂具有高DNA浓度。例如lmg/mL或更高(mgDNA/制剂体积)。更优选地，DNA制剂具有可在200^iL制剂中提供克量DNA的浓度并且更优选在100nL制剂中提供克量DNA。与本发明皮肤EP装置一起使用的DNA质粒可使用已知装置和技术的组合配制或生产，但是优选使用描述于共同拥有的未决美国临时申请美国序列60/939792号(2007年5月23日申请)的经优化的质粒生产技术生产。在一些实施例中，可以大于或等于10mg/mL的浓度配制用于这些研究中的DNA质粒。这些生产技术也包括或并入本领域技术人员熟知的各种装置和方案，除美国序列60/939792号所描述之外还包括共同拥有的美国专利7238522号(2007年7月3日颁布)所描述者。与本发明皮肤EP装置和递送技术一起使用的高浓度质粒可以适当的低容量给予质粒至ID/SC空间并辅助增强表达和免疫作用。共同拥有申请和专利即美国序列60/939792号和美国专利7238522号均以其完整内容并于本文。实施例l皮肤电穿孔电动装置("皮肤EP装置")的操作首先将皮肤EP装置的电源打开。固件维持空闲状态直至接收到使用者的输入。为了起始电穿孔顺序，输入密码在LCD上获得介绍性提示以起始电穿孔序列。这时，按压手柄组件活化器开关。接着使用者输入数字，优选受试者识别号码，其与各次脉冲一起被记录并保存用于之后的下载。优选使用数字键盘输入号码。然后以适当的小注射体积以ID或SQ注射给予生物分子制剂，理想为25-200皮肤升(skinliters)并且将皮肤电极阵列插入皮肤以完全包围轻易可见的注射面积。接着使用者在蜂鸣器"蜂鸣声(beep)"的提示下按压活化器开关以继续电穿孔序列。当按压活化器开关之后，固件确立阻抗检测器是否被启用。如果阻抗检测器被启用，软件立即执行一系列的阻抗测定。固件检测低DC电压电极之间的阻抗。将电极插入目标组织后并且在阻抗检查阶段，处理器在电极水平检查组织的传导性。这样做以确保电极与患者的目标组织发生数，通常小于2秒。在阻抗检测过程中，手柄组件上的红色LED发光。如果任何阻抗测定失败，表示错误的长蜂鸣声响起，手柄LED仍为红色，LCD将显示错误并且固件返回至空闲状态。如果所有的测量均通过，发出短蜂鸣声，手柄上绿色LED发光并且该显示提示使用者按压活化器开关以继续。固件等待再次按压手柄活化器开关以继续顺序。如果这时按压了键盘上的任何键，将响起错误长蜂鸣并且该单元将返回空闲状态。固件按照所选脉冲程序设定执行点火序列。在各电脉冲或能量脉冲的递送过程中，EP装置根据目标组织(例如皮肤)中的所测电阻持续调节其输出以维持预期电流。实质上，处理器通过将预期输出电流水平设置至使用者输入的预设定电流值以起始脉冲。由于目标组织电阻变化硬件反馈环(例如类比闭环回路)通过调节在电极间施加的电压持续维持预期输入电流。在能量脉冲的递送过程中，处理器记录脉冲波形。当通过此时设定预期输入电流至零满足脉冲时间长度时处理器终止脉冲。当脉冲序列结束，处理器复查波形数据并当电穿孔序列过程中电流不在设定参数之内时提醒操作者；藉此告知使用者电穿孔序列或处理是否错误。当成功完成EP序列时，皮肤EP装置回复至空闲状态。在完成电脉冲序列之后LCD上会进一步可视确认成功生成电场。每次序列之后，LCD将显示一列三或五个数字，其为"0"或'T，，各数字表述电穿孔序列的各次脉冲。"0"指示脉冲正常而"1"指示脉冲不正常。更具体而言，各次脉冲必须达到设定电流的至少90。/。才称之为正常或在LCD上显示"0"。如果某一脉冲达到小于设定电流的90%,该脉冲为不正常并且显示"1"。而且，显示不正常脉冲的最低和平均电流。例如，对于设定于0.5安培电流的五次脉冲电穿孔序列，如果脉冲3和5分别仅达到0.4安培和0.3安培，将显示"00101"以及"低60%平均80%"。当递送治疗或预防应用的疫苗时这一控制机制是必须的。如果疫苗递送不足，很有可能达不到治疗或保护需要的抗体或细胞应答并且受试者可能生病(Roth等，2005)。实施例2数据采集和存储皮肤EP装置软件或硬件可实现实时数据采集并存储至非易失性存储器中。图2C显示了在电穿孔过程中釆集的第一部分数据。文件标题的第一部分包含文件名称("2.1")和动物编号("2.2")。分栏(columnar)数据("2.3")描述了脉冲序列，脉冲前的等待时间，脉冲宽度和三个电极各自的脉冲电流。图2.4显示了数据的第二部分，其鉴定在给定脉沖序列中各电极的结构。图2.5显示了相同电穿孔的原始数据第三部分的格式化版本。该文件以MicrosoftExcelCSV文件下载自皮肤EP装置。拷贝数据并粘贴至模板MicrosoftExcelSpreadsheet文件。Spreassheet的列显示电脉冲过程中测定的电压(V)和电流(Amps)以及计算的组织电阻(Ohms)。将较小电极用于猪皮肤之后下载的数据比使用较大电极(700Q至2200Q)之后得到的皮肤电阻几乎增力口一倍。实施例3质粒设计、递送方法以及在猪中的实验性研究质粒构建。用于本文所述实^r中的pEGFP-Nl编码野生型GFP的红移变异体，其经优化具有更亮的荧光和在哺乳动物细胞中更高的表达(最大激发光二488nm;最大发射光二507nm)。EGFP-N1编码包含Phe-64至Leu和Ser-65至Thr两个氨基酸替换的GFPmutl。EGFP基因的编码序列包含多于190个沉默碱基变化，其与人密码子使用偏好一致。侧接EGFP的序列^皮转化成Kozak—致序列翻i奪起始位点以进一步增加在真核生物细胞中的翻译效率。EGFP基因下游的SV40多腺苷酸化信号指导EGFPmRNA3'端的适当加工。载体骨架也包含用于在哺乳动物细胞中复制的SV40复制起点并表达SV40T抗原。新霉素耐药盒(neor,由SV40早期启动子、Tn5的新霉素/卡那霉素抗性基因和疱渗单纯胸苷激酶基因的多腺苷酸化信号组成)使得可使用G418篩选稳定转化的真核生物细胞。这一盒上游的细菌启动子在大肠杆菌中表达卡那霉素抗性。pEGFP-N1骨架也提供在大肠杆菌中增殖的pUC19复制起点和用于单链DNA生产的fl起点。电穿孔条件。在所有实验中使用方波脉冲。单独说明各实验的电穿孔条件。在所有情况下，恒定电流为0.1-0.4Amps,具有2或3个脉冲并持续20或52毫秒/脉冲，脉冲之间相隔一秒。控制皮肤EP装置电穿孔装置(之前用于向骨骼肌递送生物分子)包含5个等空间分布的规格21固体不锈钢针状电极的环形阵列(直径lcm),安装于非传导性材料上。皮肤电穿孔皮肤电极由以等腰三角形排列的三个规格26固体不锈钢针状电极组成(两个长边长5mm,短边长3mm),安装于非传导性材料上。将质粒DNA肌肉内注射至猪。在GFP实验中使用三至六周大，重量在15-40公斤的混合性别的幼杂种猪。在可随意获取食物和水分的单独围栏中饲养动物。在无菌水中稀释不含外毒素的质粒制剂并用经HPLC纯化的低分子量多聚L谷氨酸(平均MW10900)配制成1%重量/重量。在实验的第O天，手工控制动物并如所述直接ID/或SQ注射GFP质粒溶液。在一个方4各的距左上角中心2cm处划下标记，其中注射位点在该方;f各的中间，这样可容易地识别和剖割各注射位点。当发现适当的注射位点时应避免所有主要的表面血管。皮肤收集。将猪放血并识别注射位点。立即在各注射位点剖割2.5cm方形面积的皮肤、皮下组织和少量下层的肌肉。使用紫外光于365nm波长在暗室中观察剖割区域。表达区域的照相分析。使用数码相机给显示足够荧光的样品照相。对没有或荧光量很少的样品不进行照相。由三名不了解该处理的观察者对荧光在0-5范围内评分。O分评给无荧光者，l分评给经观察具有少量荧光并没有被照相者，3-5分评价自被照相的荧光。保存样品用于组织学检查。实施例4对照研究将所有检测条件的数据制表。图10仅表示平均分高于或等于2的条件，而最大可能评分为5(对评分的解释可参见段落)。如数据所示，使用皮肤特异性皮肤阵列(图IO,第一行)达到了最好的整体结果。虽然下一组(图IO,第二行)具有相同的分数，但是应注意皮肤阵列("MA")仅使用配置于50viL中的50pg质粒，而大阵列("LA")使用两倍的量即配置于100^iL中的100pg质粒。此外，对皮肤电极阵列使用经优化的条件显著降低了操作时间当使用MA时所观察到的注射和EP之间的操作时间为4秒(见图IO,第四列)，使用LA为80秒。分析质粒剂量、制剂体积、延迟时间、电流振幅和脉冲长度的许多其他条件并列于图IO。如一般规律，具有足够质粒剂量的较小体积(更浓缩的溶液)具有更好的结果。实施例5猪的皮内递送与肌肉内递送的对比对比在猪中皮内(ID)或M^肉内(IM)递送浓缩剂量的CMV-GHRH和CMV-SEAP质粒理的递送和表达。使用两种分泌蛋白(SEAP,GHRH)以及检测第一次在猪中的SEAP免疫原性结果显示了哪一种递送方法可获得猪中的最高表达。单独铜养动物并使其适应7天。在实-验一开始将动物称重、采血，然后麻醉。以各种浓度和电流强度给猪(11=4/组)注射lmgCMV-SEAP和CMV-GHRH+O.P/。多聚L谷氨酸盐(表l)。4秒钟后使用CELLECTRATM电穿孔装置(VGXPharmaceuticals,Inc.,BlueBell,PAl9422)((5个针，52毫秒脉冲，脉冲之间间隔l秒，总共3次脉冲)以不同电流(0.1至0.5Amp)对动物进行电穿孔。使猪从麻醉中恢复并监控24小时以确保完全恢复。记录任何没有在2或3个小时内恢复的动物。第2、4、7、9和11天将猪称重和采血。在整个实验过程中可随意获得食物和水。采集血液用于SEAP、SEAP抗体ELISAs、GFRF和IGF-I。表l实^r组摘要<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>使用化学发光试剂盒Phospha-LightChemilurninescentReporterAssayKit(AppliedBiosystems,Bedford,MA)才艮据操作i兌明在血清样品中测定SEAP表达，见图12。该测定法的检测下限为3pg/mL。给予稀释质粒组的SEAP水平高于以0.5Amp电穿孔的IM注射浓缩质粒的动物(高出43%,*P=0.024)。在ID注射的动物血清中发现极低水平的可斥企测SEAP蛋白。用于本实验的SEAP为人蛋白质并且因此其在猪中诱导免疫应答。使用ELISA进行抗体应答的检测，结果见图13所示的图中。第11天血清样品中的抗体应答与11天的血清SEAP结果一起作图。浓缩质粒样品得到最高的平均抗体滴度。在GHRH轴中使用下游激素测量GHRH表达，即胰岛素样生长因子I或IGF-I。结果可见图14显示的图中。IGF-I是血清中较稳定的蛋白质并可4吏用IGFI-RIA方便地冲全测。与IM给予浓缩质粒组相比IM给予非浓缩质粒(C-IM-0.5A)组注射后第11天的血清IGF-I(D國IM画0.5A)水平更高。结果表明注射体积和途径对已表达和分泌的蛋白质的表达和对这些蛋白的免疫原性具有重要影响。就表达相对于免疫原性而言，浓缩和非浓缩DNA具有显著差异。IM注射并以0.5Amps电流强度电穿孔的动物中IGF-I表达更高。更低的电流强度得到更低的表达水平，但是小数量的动物使得该差异为非统计学差异。实施例6在猪中的皮肤EP研究材料和方法动物在前期实验中使用三至六周大，重量在25-40kg的混合性别的幼杂交猪(11=5/纟且)。才艮4居AmericanAssociationforAccreditationofLaboratoryAnimalCare的标准在Stillmeadow,Inc.,Sugarland,TX饲养动物。在可随意获取食物和水的围栏中按组饲养动物。在开始实验之前寸吏动物适应5天。质粒pEGFP-Nl或pSEAP画2基础载体(ClontechLaboratories,Inc.,PaloAlto，CA)分别用于实验1和2。用于实验l(Exp.l)的pEGFP-Nl编码野生型绿色焚光蛋白(GFP)的红移变异体，其经优化在哺乳动物细胞中具有更亮的荧光和更高的表达(最大激发光-488nm;最大发射光二507nm)。普遍存在的细胞巨化病毒启动子(CMV)驱动pSEAP-2基本载体中分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的表达；该质粒用于猪实验2(Exp.2)。使用可商业购买的试剂盒(QiagenInc.,Chatsworth,CA,USA)获取质粒。内毒素水平经KineticChromagenicLAL(Endosafe,Charleston,SC)测定小于0.01EU/iug。在无菌水中稀释质粒制剂并用多聚L谷氨酸钠盐(MW-10.5kDa平均)配制成1。/。重量/重量(Sigma,St.Louis,MO),在VGXPharmaceuticals,ImmuneTherapeuticsDivision(TheWoodlands,TX)进一步HPLV纯化。皮内/皮下(ID/SQ)给予质粒和电穿孔(EP)在实验1的第0天，将动物称重并用异氟烷(5%诱导，2-3%维持)麻醉。将两侧肋上的两个3"x3"位点剃毛并仔细清理。用紋身墨水标记一英寸的区域用于之后识别。在该区域的中央进行各质粒注射。动物接受ID/SQ注射；在不同EP条件下(见下文)、注射体积和剂量质粒剂量、注射体积(50|ug/50|uL、50|ug/100|uL、100|iig/100|uL和200jug/100iliL)、电流振幅和脉冲长度均变化并且由不了解处理组身份的独立观察者对经处理区域的活组织检查评分。对剖离的皮肤区域照相并在注射后5天测量荧光。基于分布面积和荧光强度计算数字分数，与具有最高表达的样品相比(0=无荧光，无分布；5=最亮荧光，最大分布)。在所有实验中使用方波脉冲并使用皮肤EP装置CELLECTRATM装置(VGXPharmaceuticals,ImmuneTherapeuticsDivision,TheWoodlands,TX)给予。其可递送适当的恒定电流(如下层组织经受的恒定电流)。在所有情况下，适当的恒定电流参数为0.1-0.4Amps之间，具有2或3次脉冲，持续20毫秒/脉冲或52毫秒/脉冲，并且脉冲间相隔一秒。在实验1中使用两种阵列类型之前用于肌肉内(IM)EP的电极阵列，其为5个等空间排列的规格21固体不锈钢针状电极的环形阵列(直径lcm),安装于非传导性材料上；ID/SC皮肤针状电极由三个长3mm以等腰三角形(两个长边长5mm，短边长3mm)排列的安装于非传导性材料上的规格26固体不锈钢针状电极组成(见图17B)。在实,险2中，ID/SQ注射动物并用lmgpSEAP(或者为2mg/mL的标准质粒制剂(500|uL，与IM注射相似)或者为10mg/mL的浓缩质粒制剂)进行皮肤EP,测量SEAP表达直至给予质粒后11天。血液收集和SEAP测定法在实验2的第0、4、7和11天，于8:30AM称重动物并通过颈静脉穿刺收集血液至MICROTAINER血清分离管中。使血液在室温下凝结10或15分钟，接着3000xg离心10分钟并将血清-8(TC保存用于进一步分析。将血清样品冻融并使用Phospha-LightChemiluminescentReporterAssayKit(AppliedBiosystems，Bedford,MA)才艮才居才喿4乍i兌明只于50juL进行分析。该测定法的检测下限为3pg/mL。测定SEAP活性之前7t,1、窟A;杏T±M.1fl"^r搭承(由4点AAAt、:杏；):主旦/f击田TTTlV/fT"orno1ov、,^.计(BMGLabtechnologies,Offenburg,Germany)读数所有样品。结果实验l使用皮肤针状电极和IM电极均得到最高GFP评分。但是，使用IM电极的最佳结果需要以相同的浓度将质粒剂量加倍，即与用于皮肤针状电极阵列的配置于50jliL的50iug质粒相比为配置于100iliL的100)ug质粒(图15)。此外，使用0.2Amps、2次脉冲、52ms/脉冲、脉冲间相隔l秒(其为我们经过测定用于皮肤EP的最佳条件)，可大大减少操作时间当使用皮肤电极时操作时间仅为4-5秒，当使用IM阵列时为80秒。如一般规律，具有足够质粒剂量的较小体积(更浓缩的溶液)具有更好的结果。实验2使用在之前实验中确定的最适于与皮肤EP联用的ID/SQ质粒递送的条件处理猪，即0.2Amps、2次脉冲、52ms/脉冲、脉冲间相隔1秒。给予动物相同的质粒量，lmgpSEAP，使用小体积制剂或IM+EP注射常用的体积。使用浓缩质粒制剂和较低注射体积得到更高的SEAP数值(图16),P〈0.05.在非人类灵长类动物中进一步验证这些条件。实施例7灵长类实验用低剂量DNA(0.2mg/抗原)免疫两次猕猴，然后用高剂量DNA(O.lmg/抗原)通过ID/SQ注射免疫三次，之后进行皮肤EP。经IFNyELISpot测定在单独ID/SQ组和ID/SQ注射接着进行皮肤EP(ID/SQ+EP)的组中两次低剂量免疫得到弱细胞免疫应答。但是，三次免疫后在ID/SQ组中DNA剂量的增加将应答提高至1000SFU/106PBMCs。ID+EP组比ID/SQ组的IFNY产生细胞多50%。ID/SQ+EP组免疫原性的增强也表现于记忆T细月包应答，其中ID/SQ+EP组比ID/SQ组的抗原特异性IFNY产生细胞多50%。单独ID/SQ免疫未得到gag或env抗体滴度的显著产生(<终点滴度)。但是用EP进行质粒递送得到8800的峰gag终点滴度和1600的env终点滴度。最后，同时给予质粒编码的rhlL-12也可得到经IL-4ELISpot测定法测定的THl特异性免疫应答。4n'丄ju—、、t,i卩《i,c"々动物才艮据AmericanAssociationforAccreditationofLaboratoryAnimalCare的标准在可随意获取食物和水的条件下在BIOQUAL,Inc.(Rockville,MD)单独祠养猕猴(Macacamw/a"a)。在任何实验之前允许动物在隔离区适应30天。质粒本实-睑中使用pGag4Y、pEY2El-B和WLV104质粒。pGag4Y包含编码HIVgag蛋白的表达盒。将Gag4Y基因亚克隆至表达载体pVax(Invitrogen,Carlsbad,CA)用于进一步研究。pEY-2El-B包含编码HIVcladB包膜的表达盒。WLV104M为编码猕猴IL-12基因的质粒。使用可商业购买的试剂盒(QiagenInc.,Chatsworth,CA,USA)获得质粒。经KineticChromagenicLAL(Endosafe,Charleston,SC)测定内毒素水平小于0.01EU/)Lig。在无菌水中稀释质粒制剂并用多聚L谷氨酸钠盐配制成l。/。重量/重量(MW40.5kDa平均)(Sigma,StLouis，MO),在VGXPharmaceuticals,ImmuneTherapeuticsDivision(TheWoodlands,TX)进一步HPLC纯化。免疫在非人灵长类中使用(n-3/组)和不使用(11=3/组)EPID/SQ递送HIVDMA疫苗，其中使用CELLECTRATM适应性恒定电流EP装置(如上文中实施例3)和皮肤针状电极阵列。在四周内分别进行免疫并且每两周采集动物血液以测量抗体和T细胞应答。前两次免疫递送0.2mg的两种HIV抗原(gag和evn)并且将IL-12表达质粒作为佐剂，体积为200iuL,分开用于每只动物的两个ID/SQ注射位点。使用lmg各HIV疫苗和更高质粒浓度(10mg/mL)的IL-12质粒(总共3mg)进行接下来的两次免疫以在与之前两次免疫相同的体积中达到更高的质粒剂量。电穿孔条件为0.2Amps恒定电流、2次脉冲、52ms脉冲长度，脉冲间隔1秒。血液收集在实马全过程中每两周采集动物血液。将10mL血液收集至EDTA试管中。通过标准Ficoll-hyp叫ue离心分离PBMCs并接着重悬于入+立关苴,A古，…"N/I7TT《各貼乂,'长"T1no,Anj*、'水AAn厶土丄、、春乂U工,口"7|-^t>V&厶ii丄丄vi/LL^r—^sc、rj^乂|_j、、—/v—lv/u/'",'";乂、/口w'j/ju|juj^/fj、100IU/mL青霉素、100lug/mL链霉素和55|liM/Lp巯基乙醇的RPMI1640)中。用ACK裂解緩冲液(CambrexBioScience,EastRutherford,NJ)裂解RBC。酶联免疫测定法(ELISA)用100ng/孑L的重组HIV-1IIIBp24或gbl20(IrnrnunoDiagnostics,Woburn,MA)包净皮96孔板过夜以分别测定HIVgag和env应答。包被了100ng/孔胎牛血清白蛋白的板作为阴性对照。用3%BSA-PBST于37。C封闭板1小时。接着将板子与四倍系列血清稀释液于37。C温育1小时。然后以1:10000稀释度向板中加入羊抗猴IgG辣根过氧化物酶结合抗体(MPBiomedicals,Aurora,OH)并于37'C温育1小时。使用四甲基联苯胺(R&Dsystems,Minneapolis,MN)显色并用2NH2S04终止反应。然后测定光密度(OD)。IgG终点滴度定义为可以得到比BSA孔的平均OD值大两4咅的ODj直的交互血清稀释(reciprocalserumdilution)。酶联免疫斑点测定法(ELISpot)使用IFNY或IL-4捕获和检测抗体(MabTech,Sweden)进行ELISpot。通过用包含肽的孔数减去阴性对照的空数测定抗原特异应答。结果以三个孔的平均值(点/百万脾细胞)表示。统计学分析使用PrismGraphpad软件分析数据并表示为平均值±SEM。非人灵长类实验设计根据图17A说明的设计用经优化的HIV-1gag和env构建体和质粒编码的猕猴IL-12免疫猕猴；用于猪实验的装置也用于非人灵长类(图17B)。ID/SQ注射免疫三只动物，ID/SQ注射结合皮肤电穿孔(ID/SQ+EP)免疫三只动物。在第0、4、8、12、16周免疫动物5次。每两周采集血液，每次免疫后两周进4亍ELISpot测定，而每次免疫后四周进行ELISA测定。ELISpot分析通过IFNyELISpot测定每次免疫之后细胞免疫应答的诱f阅1e、An，mrr直^"店AA—、》/W"糸l善各6TrwoimTrvQrvu"RT3\J、1U/OU.V",N、HVV、K、N/1一7",u乂'l「U乂'J_Vi组均具有弱应答(分别为72土11SFU/106PBMCs和85土34SFU/106PBMCs)。第二次低剂量免疫使ID/SQ组中IFNy产生细胞的数量加倍(173±77SFU/106PBMCs)并且使ID/SQ+EP组的应答增加至三倍(287±34SFU/106PBMCs)。已在两次低剂量免疫后观察到较弱的细胞应答，我们使用高剂量DNA进行接下来的三次免疫。ID/SQ组第三次免疫的免疫应答并未显著增加(176±72SFU/106PBMCs)。但是ID/SQ+EP组确实在较高剂量将IFNY产生细胞的数量提高至两倍(383±162SFU/106PBMCs)。用lmg剂量的DNA第四次免疫动物。与之前免疫相比在ID/SQ组中观察到IFNY应答的三倍增长(376±210SFU/106PBMCs)。在第三次接种时，使用皮肤EP递送高剂量DNA得到双倍的IFNy应答(1466±762SFU/106PBMCs)。在最后的免疫中维持了这些高水平的抗原特异应答(1453±873SFU/106PBMCs)。最后一次免疫进一步加倍了ID/SQ组中IFNY产生细胞的数量(927±191SFU/106PBMCs)。记忆T细胞应答诱导强效的T细胞应答是成功免疫的一个重要方面。为了评价ID/SQDNA免疫谦导的记忆T细胞群，在最后一次DNA接种后IO周进行ELISpot分析(图19)。ID/SQ+EP组的记忆IFNy应答是ID/SQ组强度的两倍(分别为998±290和449±108SFU/106PBMCs)。TH2T细胞应答使用基因枪用于皮肤免疫的研究已例证对TH2偏倚(biased)T细胞应答的诱导。但是已显示如果也递送IL-12可将这一偏倚逆转至THl应答。在IDDNA免疫中一起递送给猕猴IL-12以确定其共递送是否可引起对THl偏倚应答的诱导(图20)。在最后一次免疫后10周通过IL-4ELISpot测定法测定对抗原特异TH2应答的诱导。仅进行ID/SQ的组中所有动物具有阴性IL-4应答(>50SFU/106PBMCs)并且ID/SQ+EP组中仅有一只动物具有阳性IL-4应答(136SFU/106PBMCs),表明显著的THl应答。体液应答DNA免疫的一个弱点在于其不能在非人灵长类和人类临床实验中诱导抗体应答。通过ELISA测定法测定各组诱导对重组p24和gbl60抗原的HIV-gag和evn特异抗体滴度的能力(图21)。对两种抗原而言，ID/SQ组未显示显著的抗体滴度(<50终点滴度)。ID/SQ+EP组在第二次低剂量免疫后具有低水平的抗体(终点滴度100±50)。但是在使用高剂量DNA的笫三次免疫中增加所递送DNA的剂量之后观察到更大的抗体诱导(2220±1000)。第四次免疫中提高了抗体滴度(8800±4000)。env抗体应答也反映了我们在有低滴度(<50终点滴度)的ID/SQ组观察到的gag抗原的结果并且ID/SQ组达到最大终点滴度1600土800。IM相对ID/SQ电穿孑L用相同的HIVgag、env和rhlL-12构建体(如上所述)以1.0mg/mL通过IM免疫将猕猴免疫三次。与细胞免疫应答诱导相比，前两次免疫之后IM和ID/SQ途径二者具有相似水平的IFNy产生细胞。相反的，与IM+EP相比在第一次高剂量免疫之后ID/SQ+EP免疫得到高水平的HIVgag抗体滴度。在两次免疫之后，ID/SQ+EP组的HIVgag终点滴度是IM+EP组的两倍。在这些实验中，我们使用皮肤针状电极递送至ID/SD区室,并比较所得免疫应答与IM+EP之后得到者(见表l)。表l.经IM或ID/SQ途径通过电穿孔诱导的免疫应答的比较。显示了3次高剂量(l.Omg/抗原)免疫后IFNYELISpot和HIVgagELISA结<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>实施例8使用皮肤EP在小鼠中进行DNA接种A.质粒构建体在实验1和3中(Exp.l和Exp.3)使用普遍存在的细胞巨化病毒(启动子)或肌肉特异性合成启动子(SPc5-12)驱动人分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)在pSEAP-2基本载体中的表达。野生型绿色荧光蛋白(GFP)表达质粒pEGFP-Nl的红移变异体(其经优化在哺乳动物细胞中具有更亮的荧光和更高的表达(最大激发光-488nm;最大发射光二507nm))用于报告基因实验中(Exp.2)。使用可商业购买的试剂盒(QiagenInc.,Chatsworth,CA)获得质粒。经KineticChromagenicLAL(Endosafe,Charleston,SC)测定外毒素水平低于0.01EU/)iig。通过分析在近几年内被证明对人具有致死性的16H5病毒的原始病毒序列和多于40种人NI病毒生成一致序列HA和NA。从LosAlamosNationalLaboratory's流感序列数据库下载这些序列。在生成一致序列之后，将构建体优化用于哺乳动物表达，包括添加Kozak序列、密码子优化和RNA优化。然后将这些构建体亚克隆至pVAX载体(Invitrogen,CarlsbadCA)。除非另外指明，在无菌水中稀释质粒制剂并用多聚L谷氨酸钠盐配制成l。/。重量/重量(MW-10.5kDa平均)(Sigma,StLouis,MO)，在VGXPharmaceuticals,ImmuneTherapeuticsDivision(TheWoodlands,TX)进一步HPLV纯化。B.小鼠中的报告基因表达这一实马全检测SEAP或EGFP表达质粒的递送和表达以确定哪些电穿孔参数(最低有效电流)、延迟时间(注射和开始电穿孔之间的时间)、制剂和目标肌肉影响表达和抗体水平。使用CELLECTRATM皮肤EP装置(包括使用3x规格26电极)用各种电流和用于IM或ID注射的延迟时间电穿孔动物。在第一个实验(Exp.l)中，将10pg在肌肉特异性合成启动子(pSPc5-12-SEAP)控制下表达SEAP的质粒注射至C57/B16小鼠组的胫骨前肌(TA)或腓肠肌(G)肌肉中，延迟时间为4或80秒，恒定电流为0.1A。对照组TA注射质粒而不进4亍EP(无EP)。其它组的动物TA或G肌肉接受等摩尔的无质粒骨架(NB)但是具有相同的启动子、转基因和3'多腺普酸化信号的表达盒，不进行EP。在第二个实验(Exp.2)中，给小鼠组(n=4)IM或ID注射总体积分别为5或25iuL的50pgpCMV-EGFP,终质粒浓度为10mg/mL或2mg/mL。对剖离组织和肌肉部分照相并在注射后5天测量荧光。对经处理组的身份不了解的独立观察着对经处理区域评分。与具有最高表达的样品相比基于分布面积和荧光强度计算数字评分(0=无荧光，无分布；5=最亮荧光、最大分布)。在笫三个小鼠实验(Exp.3)中,总共使用80只小鼠，分为16组，每组5只(表2)。以不同制剂(盐水、盐水+P/oLGS、水、水+1%LGS)和电流强度给小鼠(11=5/组)注射50|ugCMV-SEAP(10mg/mL)。以4秒延迟时间和不同电流(0.1A至0.2A)对TA或G肌肉IM注射的动物进行电穿孔。表2小鼠中CMV-SEAP制剂实验的分组组制剂浓度(mg/mL)总剂量(ILlg/动物)EPn1盐水10500.22盐水10500.13盐水10500.254盐水10500.15盐水+LGS10500.26盐水+LGS10500.1了盐水+LGS10500.258盐水+LGS10500.159水10500.210水10500.111水10500.25<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>在所有情况下，使动物适应三天，称重并在耳朵进行标记。在整个实验过程中可随意获取食物和水。在研究一开始称重动物、采血并使用啮齿类组合麻醉剂麻醉，即甲苯噻溱(37.5mg/mL;0.05mL/30克体重)、氯胺酮(1.9mg/mL;0.016mL/10克体重)、乙酰丙嗪(0.37mg/mL;0.025mL/15克体重)，根据设计给予质粒并进行电穿孔。对于实验1和实验3，眼眶后釆血并使其凝结。离心所有收集的血液以分离血清和血浆，接着分装至置于水上的试管中用于SEAP测定法和抗-SEAPELISA,如之前所进行并存在较小的修改。笫14天后，在手术麻醉计划下将动物放血。C.分析血液收集在第0、4、7和ll天称重小鼠并分别眼眶后釆血至樣t量离心管中。4吏血液在室温下凝结10至15分钟并接着于3000xg离心10分钟，将血清储存于-80。C用于进一步分析。SEAP测定法将血清样品冻融并使用Phospha-LightChemiluminescentReporterAssayKit(AppliedBiosystems,Bedford,MA)才艮才居才喿4乍i兌明只于50faL进行分析。该测定法的检测下限为3pg/mL。测定SEAP活性之前在小鼠血清中1:10稀释更浓缩的血清样品。使用LUMIstarGalaxy光度计(BMGLabtechnologies,Offenburg,Germany)读数所有样品。SEAP间接ELISA在小鼠中使用以下经修改的操作测定对人SEAP蛋白的免疫原性。用经纯化的PBS中的人胎盘碱性磷酸酶(每IOOjuL包含100纳克/孔的人胎盘碱性磷酸酶(Sigma))在4。C包被NuncMaxisorb(Rochester.NY)板过夜。倾倒板子并洗涤三遍。用含有P/oBSA(Sigma)和0.05。/o吐温20的PBS封闭板子并于室温下温育2小时。将样品1:100稀释并接着在单独的稀释板中用含有1。/。BSA(Sigma)和0.05%吐温20的PBS以1:4序列稀释。将封闭液从板中倾倒出。向各孔中加入100luL经稀释的待测血清并于室温下温育2小时。倾去血清稀释液并洗涤三次。在含有1Q/。BSA(Sigma)和0.05。/o吐温20的PBS中以1:1000稀释第二抗体(与辣根过氧化酶结合的兔抗小鼠抗体)并于试问下温育l小时。倾倒板子并洗涤。将每孔IOOiuL的邻苯二胺(OPD)底物加入(0.67mg/mL)O.IM柠檬酸緩冲液中并温育8分钟；加入IOO|uL1MH2S04终止反应。在SpectramaxPlus384读板仪(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)上于490nm测量吸光度。D.小鼠中的结果SEAP表达依赖于目标肌肉与G肌肉相比如果将SEAP表达质粒注射剂给予TA(图22),注射和使用皮肤EP装置进行EP之间的时间为80s和4s,则表达增加。当将SPc5-12-SEAP质粒注射至TA肌肉时，血清SEAP水平比在不进行EP条件下接受质粒的对照动物高285倍(P<1.3E-21);未发现80s和4s延迟时间对于TA月几肉的差异(357±6vs.357±6.2pg/mL/g);在相同条件下注射至G肌肉得到比对照高90至182倍的SEAP水平(G80svs.无EP对照，P<0.003;G4svs.无EP对照，P<7.7E-0.6)。当以等摩尔制剂将仅包含表达盒的质粒片段注射至TA和G(无骨架(NB),但是具有相同的启动子、转基因和3'多腺苷酸化信号)，表达水平比未接受IM+EP的对照组高210-250倍((80svs.无EP,P<1.8E國08;4svs.无EP,P<3.8E画05)。TA80s中的SEAP表达比NB80s组高24%(PO.004)。给予C5-12-SEAP和NB而不进行EP(无EP)的两组均显示可忽略不计的SEAP表达。GFP表达仔细剖离注射部位后观察GFP表达并由不了解处理组的观察者评分。ID(4.63±0.24vs.3.25±0.14,P=0.01)和IM注射动物中给予浓缩质粒的组与非浓缩质粒组相比GFP评分更高(图23)。在这些研究中浓缩制剂(高至10mg/mL)与更高的总体表达相关。基于这一实验的结果，实验3中以1Omg/mL的浓度使用质粒。SEAP表达依赖于制剂和电流强度当SEAP转基因由普遍存在的启动子(相对于实验1中使用的肌肉特异性启动子)控制时评价SEAP水平的差异。与之前的实验一致，与G肌肉(P-0.05)相比如果质粒注射-EP操作在TA中进行(图24)则表达增加。在这一具体实验中，与盐水制剂相比盐水+LGS制剂得到更高的血清SEAP水平(分别为41.1±7.9pg/mL/gvs.31.0±5.9pg/mL/g),尽管由于组内差异性并未达到统计学显著性。总体而言，与接收相同LGS质粒制剂并以0.2A恒定电流递送的动物相比以0.1A电流设置进行电穿孔的动物得到更高的SEAP表达。此外，接受0.2A以水配制的质粒的动物与相同肌肉接受0.1A的动物相比得到显著较低的SEAP水平(对TA，PO.05;对G，PO.001)。当将LGS加入水制剂时对TA肌肉的差异并不显著但是对G肌肉仍然保持(PO.04)。抗SEAP抗体的诱导SEAP质粒与盐水+LGS的制剂得到更高的蛋白表达，但是与注射用水+LGS配制的SEAP质粒的动物相比抗SEAP抗体的滴度更低(图25),尽管由于组内差异性并未达到统计学显著性。实施例9灵长类中皮内递送和肌肉内递送的比较灵长类血清lQ/o马血清中A/vietnam/2003/04HI滴度组灵长类ID试验组第6周的HI滴度H5+M2MCELLECTRAlmg每质粒4497C804498C804499c404500c804501c<20H5+M2IDCELLECTRA丽lmg每质粒4520D1604521D804522D1604523D404534D160<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>DNA构建体1.HIVEvnCladeA2.HIVEvnCladeC3.HIVEvnCladeD4.HIVGag5.HIVPol6.FluH57.FluNA8.FluM2NP9.HPV16E6/E710.HPV18E6/E711.IL2<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>在这些实验中免疫猕猴。在起始实验之前使动物适应2个月。按以下进行实验第O周进行第一次免疫(质粒剂量给予)和基线采血；第2周进行采血；第三周进行第2次免疫(质粒剂量给予)；第5周进行釆血；第6周进行第三次免疫(质粒剂量给予)和采血；笫8周进行采血。所有质粒均以水配制为10mg/mL,用于注射+1Q/qLGS,如之前实施例所描述，并与各实验组的单溶液混合物(A-H组，上表中)。计算命名为IMCELLECTRAIDCELLECTRATM和IM注射器的各组的准确注射体积。对于ID给药，如果所要求注射剂量超过每个位点IOO)liL,将制剂分至数个注射位点(2、3或6,取决于总共给予多少毫克的疫苗)。接受IM注射的动物将在一个注射位点给予全部制剂。在上述实施例中用于猪实马全和非人类实-验的CELLECTRATM适应性恒流装置也用于这些非人灵长类实验中。电穿孔条件如下对于IM注射和电穿孔组，条件为0.5Amps,52毫秒/脉冲，三次脉冲，质粒注射和电穿孔之间4秒延迟。对于ID注射和电穿孔组，条件为0.2Amps，52毫秒/脉沖，三次脉冲，质粒注射和电穿孔之间4秒延迟。红细胞凝集抑制反应测定法-通过用三份血清稀释一份酶并于37。C水浴中温育过夜用受体破坏酶(RDE)处理猴血清。在56。C温育30分钟使酶失活，然后加入6份PBS最终达到1/10稀释。在V底96孔微量滴定板中进行HA测定法，使用病毒的HA单位和1%马血红细胞。本文显示的数据为第二次免疫后的结果(在笫三次免疫之前采血)。权利要求1.一种电穿孔装置，其经装配以向哺乳动物期望组织递送能量脉冲，所述能量脉冲产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流，该电穿孔装置包括可递送在期望组织中产生恒定电流的能量脉冲的电穿孔组件，该电穿孔组件具有反馈机制；包括具有空间排列的多个皮肤电极的电极阵列的皮肤电极组件，其中所述皮肤电极组件接受来自电穿孔组件的能量脉冲并将其经皮肤电极递送至期望组织；其中多个皮肤电极的至少一个在递送能量脉冲过程中是中性的并测定期望组织中的阻抗并将所述阻抗传递至电穿孔组件；以及其中所述反馈机制可接受已测定阻抗并调节电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。2.权利要求l的装置，3.权利要求l的装置，织。4.权利要求3的装置，电薄膜区域。5.权利要求3的装置，6.权利要求5的装置，而基本不刺入月几肉组织。7.权利要求5的装置，活化器开关，以及其中所述针状电极可接触真皮内或皮下组织其中所述皮肤电极组件进一步包括报告皮肤电极组件活化的状态指示器。8.权利要求5的装置，其中所述电极阵列包括至少三个皮肤电极。9.权利要求8的装置，其中所述三个皮肤电极具有三角形的空间排列。10.权利要求9的装置，其中所述三角形为等腰三角形。11.权利要求10的装置，其中所述等腰三角形具有5mm长的边和3mm长的底。12.权利要求5的装置，其中多个皮肤电极可以分散模式递送能量脉冲。量脉冲以维持恒定电流。13.权利要求12的装置，其中多个皮肤电极可在程序化序列下通过对皮肤电极的控制以分散模式递送能量脉冲，所述程序化序列由使用者输入至电穿孔组件。14.权利要求13的装置，其中所述程序化序列包括按序列递送的多个脉沖，其中由至少两个活性皮肤电极递送多个脉冲的各脉冲，所述活性皮肤电极中的一个为测量阻抗的中性皮肤电极；并且其中多个脉冲的后续脉冲由至少两个活性皮肤电极的另一个递送，所述活性皮肤电极中的一个为测量阻抗的中性电极。15.权利要求5的装置，其中反馈机制由硬件或软件执行。16.权利要求5的装置，其中反馈机制由类比闭环电路执行。17.权利要求16的装置，其中中性电极测量期望组织中的阻抗并将该阻抗传递至反馈机制，反馈机制响应该阻抗并调节能量脉冲以将恒定电流维持在与预设定电流相似的值。18.权利要求17的装置，其中电穿孔装置包括安全特征，所述安全特征为当对能量脉冲的调节会得到高于电压限的电压时防止装置向组织递送能量脉冲的电压限。19.权利要求17的装置，其中反馈机制在能量脉冲的递送过程中持续并即时地维持恒定电流o20.权利要求19的装置，其进一步包括接受使用者的输入并控制电穿孔组件以根据输入递送能量脉冲的控制器。21.权利要求3的装置，其进一步包括接受使用者的输入并控制电穿孔组件以根据输入递送能量脉冲的控制器。22.权利要求21的装置，其中所述控制器为单芯片微控制器。23.权利要求3的装置，其进一步包括与电穿孔组件相连并与皮肤电极组件电子相连的电流波形发生器；所述电流波形发生器产生经皮肤电极组件递送的电流脉冲串波形。24.权利要求23的装置，其中使用者输入程序化序列至电穿孔组件，其将程序化序列传递至电流波形发生器；其中所述电流波形发生器可根据所提供的程序化序列生成电流脉冲串波形。25.权利要求23的装置，其中所述电流波形发生器为功率晶体管类比电路。26.权利要求3的装置，其进一步包括可检测皮肤电极与期望组织之间是否建立电子连接的阻抗检测器。27.权利要求3的装置，其进一步包括与电穿孔组件连接的波形记录器。28.权利要求27的装置，其中所述波形记录器可在能量脉冲递送过程中持续记录电穿孔电压和电流波形。29.权利要求27的装置，其中所述波形记录器可以每秒2000个样品的速度记录电穿孔电压和电流波形。30.权利要求3的装置，其进一步包括与使用者和电穿孔组件直接通信的输入装置，所述输入装置可接受输入指令并将该输入指令传送至电穿孔组件。31.权利要求30的装置，其中所述输入装置为数字式键盘或触屏。32.权利要求3的装置，其进一步包括与电穿孔组件连接的状态报告元件。33.权利要求32的装置，其中所述状态报告元件为信息显示面板、语音提示、发光二极管或它们的组合。34.权利要求33的装置，其中所述状态报告元件报告能量脉冲产生和恒定电流递送的确^人。35.权利要求3的装置，其进一步包括与电穿孔组件相连的通信端。36.权利要求3的装置，其进一步包括与电穿孔组件相连的存储器组件。37.权利要求3的装置，其进一步包括与电穿孔组件相连的能量源。38.权利要求37的装置，其中所述能量源为电池。39.权利要求3的装置，其中所述电极阵列为一次性的并与皮肤电极组件可移除地连接。40.权利要求39的装置，其中所述一次性电极阵列为皮肤电极盘。41.权利要求40的装置，其中所述电极阵列盘为可灭菌的。42.权利要求6的装置，其中所述电穿孔组件包括控制器；与该控制器电子连接的波形发生器；与该控制器电子连接的波形记录器；以及与波形发生器电子相连的电池；其中所述控制器接受来自使用者的输入，指示波形发生器根据输入向期望组织递送能量脉冲并根据所递送的能量脉冲将数据传送至波形记录器并且其中所述电池向波形发生器发送电荷，所述电池为锂离子、镍金属氢化物、铅酸或镍镉电池。43.权利要求42的装置，其中所述装置为便携式的。44.一种电穿孔手柄组件，其经装配以向哺乳动物期望组织递送能量脉冲以在期望组织中产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流，其包括具有在空间排列的多个皮肤电极的皮肤电极阵列，其中所述皮肤电极的至少一个在能量脉冲递送过程中为中性并测量期望组织中的阻抗；与皮肤电极阵列相连的控制器，所述控制器控制经皮肤电极的能量脉冲的递送；以及进行反馈机制的装置，其中所述反馈机制由软件或硬件执行，其接受来自中性皮肤电极的所测量阻抗并在需要时调节递送的能量脉沖以维持恒定电流。45.权利要求44的手柄组件，其中所述皮肤电极阵列为一次性的并与手柄组件可移除地连接。46.权利要求44的手柄组件，其中所述皮肤电极阵列包括以三角形空间排列的三个皮肤电极。47.权利要求44的手柄组件，其中所述皮肤电极长5mm并且规格为26。48.权利要求44的手柄组件，其中在能量脉冲递送过程中多个皮肤电极中的至少两个是活性的并且多个皮肤电极之一为中性。49.向哺乳动物期望皮肤组织递送能量脉冲以在所述期望组织细胞中引起电穿孔发生的方法，该方法使用经装配以递送能量脉沖的电穿孔装置，产生与使用者输入的预设定电流相似的恒定电流，其包括将多个针状皮肤电才及插入皮肤组织而基本不刺入肌肉组织；向多个针状皮肤电极施加能量脉冲以向皮肤组织递送与预设定电流相等的电流；使用多个针状皮肤电极中的一个中性电极测量皮肤组织中的阻抗并响应所测量阻抗使用电穿孔装置中的反馈机制调节施加的能量脉冲以维持递送至皮肤组织的电流恒定。50.权利要求49的方法，其中所述期望皮肤组织为皮下或真皮内组织。51.权利要求50的方法，其进一步包括在施加能量脉冲之前测量阻抗以确定是否在期望皮肤组织和针状皮肤电极之间建立了电子连接。52.权利要求50的方法，其中至少一种DNA疫苗与所述真皮内或皮下组织接触。53.权利要求49的方法，其进一步包括记录由电穿孔装置编辑的来自向期望皮肤组织递送能量脉冲的数据。54.包括以下步骤的方法提供具有多个针状皮肤电极的皮肤电极组件，所述皮肤电极组件与电流波形发生器电子连接；将哺乳动物皮肤组织与多个针状皮肤电极接触而基本不刺入哺乳动物的月几肉组织；以及在可将所接触皮肤组织有效暴露于基本恒定电流的条件下，将来自电流波形发生器的电子能量脉冲施加至多个针状皮肤电极一段时间。55.权利要求54的方法，其中施加电子能量脉冲的步骤包括用多个针状皮肤电极的一个中性电极测量所接触皮肤组织中的阻抗；所述反馈机制响应已测阻抗并调节从电流波形发生器递送的能量脉冲以维持基本恒定的电流。56.权利要求55的方法，其中所述反馈机制由作为电穿孔装置一部分的类比闭环电路执行并且其中在能量脉沖持续过程中即时进行测量和通信步骤。57.权利要求44的方法，其进一步包括设定安全特征，所述安全特征为当对能量脉冲的调节会得到高于电压限的电压时防止装置向组织递送能量脉冲的电压限。58.权利要求54的方法，其进一步包括设定安全特征，所述安全特征为当对能量脉冲的调节会得到高于电压限的电压时防止装置向组织递送能量脉冲的电压限。全文摘要本发明涉及电穿孔装置和用该装置有效促进将生物分子导入身体特定组织(特别是皮肤例如真皮内或皮下组织)的细胞的方法。在某些方面，本发明是皮肤EP装置，其产生能量脉冲，用皮肤电极阵列将能量脉冲递送至皮肤组织，并基于使用者的输入在该皮肤组织维持恒定电流，包括预设定电流，并能够存储和获取电流波形数据。文档编号A61N1/32GK101563132SQ200780046652公开日2009年10月21日申请日期2007年10月17日优先权日2006年10月17日发明者A·S·韩,M·A·波普,P·A·布朗,R·德雷希亚-阿克利申请人:Vgx药品公司