包含CNDAC(2′-氰基-2′-脱氧-N⁴-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶)和细胞...的制作方法

专利名称：包含CNDAC(2′-氰基-2′-脱氧-N⁴ -棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶)和细胞 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物的用途，(i)与多种其它治疗剂组合用于治疗皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)，或(ii)以单一治疗方式用于治疗皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)。
在一个优选实施方案中，2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶的代谢产物为1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基(arabino-pentafuranosyl))-胞嘧啶(也称作CNDAC)。
如上所述，本发明的一个方面涉及组合，其包含2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，和选择的细胞毒剂，所述细胞毒剂为HDAC抑制剂。
组蛋白是小的带正电荷的蛋白质，其富含碱性氨基酸(在生理pH下带正电)。有5种主要类型的组蛋白，即H1、H2A、H2B、H3和H4，它们表现出高度的结构相似性。虽然这些细菌的DNA与功能和组蛋白大致相似的其它蛋白质结合以在细菌细胞中组装DNA，但真细菌(如，E.coli)中没有发现组蛋白。然而，古细菌含有组装它们DNA的组蛋白，它们的DNA与真核生物染色体的结构相似(G.M.Cooper，“The Cell-A Molecular Approach”，第2版，第II章)。
大多数组蛋白在细胞周期的S期合成，且新合成的组蛋白迅速进入细胞核与DNA结合。在合成的几分钟内，在核小体结构中新的DNA与组蛋白结合。
组蛋白的氨基末端尾区域可以通过甲基(加入到赖氨酸和精氨酸基团)、乙酰基(加入到赖氨酸基团)、或磷酸基团(加入到丝氨酸基团)的翻译后加入而被酶促修饰(Spencer等人，Gene，1999，240(1)，1)。这导致组蛋白的净正电荷减少，随后削弱了组蛋白与DNA的结合。
对于组蛋白脱乙酰剂(HDACs)以及抑制HDACs的化合物的研究已经表明一些疾病状态作用的机理。例如，在寻找新的抗疟疾化合物中，天然存在的apicidin表现出通过高乙酰化组蛋白抑制恶性疟原虫(P.falciparum)的体外生长(K.T.Andrews等人，Int.J.Parasitol.，2000，30(6)，761)。
因此，认为HDACs与大量不同的疾病相关，所述疾病包括增殖性疾病，如白血病(Lin等人，Nature，1998，391，811)、黑色素癌/鳞状细胞癌(Gillenwater等人，Int.J.Cancer，1998，75217；Saunders等人，Cancer Res.，1999，59，399)，乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌(Gelmetti等人，Mol.Cell Biol.，1998，18，7185；Wang等人，PNAS，1998，951，10860)和结肠癌(C.A.Hassig，等人，1997，Chem.Biol.，4，783；S.Y.Archer等人，PNAS，1998，95(12)，6791)。
至今，没有公开本申请中要求保护的具体组合，更不用说这些组合会用于治疗癌症，如皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)和非小细胞肺癌(NSCLC)的任何说明。
在一个优选实施方案中，HDAC抑制剂选自丁酸钠，或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠、丙戊酸、制毛藓素A(trichostatin A)(TSA)、PXD101、LAQ824、MS-275、CI-994、SB939、MGCD0103和缩酚酸肽(depsipetide)。
在本发明的尤其优选的实施方案中，HDAC抑制剂为丁酸钠，或其前药。
在更优选的实施方案中，丁酸钠的前药为丁酸新戊酰氧基甲基酯(pivaloyloxymethyl butyrate)。
在另一个尤其优选的实施方案中，HDAC抑制剂为N-辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydramic acid，SAHA)。
在另一个尤其优选的实施方案中，HDAC抑制剂为丙戊酸钠或丙戊酸。
在另一个尤其优选的实施方案中，HDAC抑制剂为制毛藓素A(TSA)。
在一个更优选的实施方案中，所述组合包含sapacitabine和SAHA。
在另一个更优选的实施方案中，所述组合包含CNDAC和SAHA。
在一个更优选的实施方案中，所述组合包含sapacitabine和丙戊酸钠或丙戊酸。
在另一个更优选的实施方案中，所述组合包含CNDAC和丙戊酸钠或丙戊酸。
如上所述，本发明的另一方面涉及组合，其包含2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂，所述细胞毒剂为拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药。
DNA分子空间上可以卷曲和折叠，导致拓扑改变，包括形成负或正超卷曲。在原核细胞和真核细胞中，控制DNA拓扑的酶作用于复制的几个不同步骤。有两类拓扑异构酶，即拓扑异构酶I和拓扑异构酶II。因此，在一个优选实施方案中，拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶I抑制剂，而在另一个优选实施方案中，拓扑异构酶抑制剂为拓扑异构酶II抑制剂。
I型拓扑异构酶通过切开(nicking)然后使双链DNA的一条链闭合从而松弛DNA。II型拓扑异构酶通过使双链DNA断裂和重新连接而改变DNA拓扑(Molecular Cell Biology，第4版，Eds.H.Lodish等人，2000，WH Freeman&Company)。认为拓扑异构酶抑制剂结合至DNA，拓扑异构酶，或在DNA-蛋白质共价连接的形成中涉及的酶的区域或靠近该区域的分子(Holland&Frei Cancer Medicine 6，Eds.Kufe等人，2003，BC Decker Inc.)。
在一个更优选的实施方案中，拓扑异构酶抑制剂为SN-38，或其前药。
SN-38[(+)-(4S)-4，11-二乙基-4，9-二羟基-1H-吡喃并[3′，4′6，7]-吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮]，也称为7-乙基-10-羟基-20(S)-喜树碱，具有下述结构。

SN-38 SN-38是伊立替康(也称为CPT-11)的活性代谢产物，其为半合成的，水溶性的喜树碱衍生物，用于治疗癌症，即CPT-11为SN-38的前药，其代谢成其活性形式，SN-38。
在更优选的实施方案中，本发明的组合包含SN-38的前药。优选地，所述前药为伊立替康。

伊立替康 伊立替康为DNA拓扑异构酶I抑制剂，其诱导双链断裂。伊立替康在体内转化为其活性形式SN-38，通过与DNA-相关的核酶拓扑异构酶I(top1)结合并抑制该酶而实现细胞毒作用，由此稳定top1 DNA可裂解的三元复合物(Tanizawa，A.等人，J.Natl.Cancer Inst.，86836-42，1994)。这妨碍了DNA-再连接反应，并导致DNA双链断裂，最终导致细胞凋亡(Kjeldsen，E.等人，J.Mol.Biol.，2281025-30，1992)。
伊立替康被批准用于治疗患有晚期结肠直肠癌的患者，(i)在没有事先接受晚期疾病化疗的患者中与5-氟尿嘧啶和亚叶酸组合；和(ii)在对已建立的含5-氟尿嘧啶的治疗方案响应失败的患者中作为单一药物。
在另一优选实施方案中，所述拓扑异构酶抑制剂为依托泊苷。
依托泊苷[4’-去甲基鬼臼乙叉甙9-[4，6-O-(R)-亚乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷]是半合成的鬼臼毒素(在美国盾叶鬼臼(American May apple)中发现的毒素)衍生物。依托泊苷具有下述化学结构
依托泊苷 依托泊苷被批准用于与其它批准的化疗剂组合，(i)在患有顽固性睾丸肿瘤患者中，该患者已经接受的合适的手术、化疗和放疗；和(ii)在小细胞肺癌作为第一线治疗的患者中(来源www.rxlist.com)。
在另一优选实施方案中，所述拓扑异构酶抑制剂为托泊替康。
托泊替康盐酸盐是半合成的喜树碱衍生物，且为具有拓扑异构酶I-抑制活性的抗肿瘤药物。托泊替康具有下述结构，且化学名称为(S)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4，9-二羟基-1H-吡喃并[3′，4′6，7]吲嗪并[1，2-b]喹啉-3，14-(4H，12H)-二酮单盐酸盐。

托泊替康 其分子式为C23H23N3O5·HCl，且分子量为457.9。其可溶于水，且熔点为213°至218℃(分解)。
拓扑异构酶I通过诱导可逆的单链断裂而缓减DNA中的扭转力。托泊替康与拓扑异构酶I-DNA复合物结合，并防止这些单链断裂的再连接。认为托泊替康的细胞毒性是由于DNA合成过程中产生的双链DNA损伤而造成的，此时复制酶与由托泊替康、拓扑异构酶I和DNA形成的三元复合物相互作用。哺乳动物细胞不能有效修复这些双链断裂。
至今，没有给药包含sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂的组合的启示，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药。
许多抗癌药以组合的方式给予以最优化治疗方案。药物组合的作用本身是难以预测的，且通常偏向于一种药物部分或完全地抑制另一种药物的作用。
本发明基于惊人的发现，即基于同时、分开或连续给药组合(其包含sapacitabine，或其代谢产物，或可药用盐，以及细胞毒剂)不引起任何两种药物间的显著的或明显的不良相互作用。意想不到的不存在任何此类拮抗相互作用对于临床应用是非常重要的。
优选地，本发明的组合为协同组合(synergistic combination)，其包含sapacitabine，或其代谢产物，或可药用盐，以及细胞毒剂，即具有协同作用的组合。
在优选实施方案中，sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂的组合与单独给药每种药物相比产生增强的作用。该发现出人意料的性质与根据现有技术的预期是不同的。有利地，协同作用使得向患者给予的每种成分的剂量更低，因此降低了化疗的毒性，同时产生和/或保持相同的治疗效果。因此，在尤其优选的实施方案中，每种成分可以以亚治疗量给药。
在另一优选实施方案中，sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂以减轻或消除与在单一治疗中使用单个成分或以已知组合使用时相关的不良副作用的方式相互作用。
如上所述，本发明的一个方面涉及药物产品，其包含(i)2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，和(ii)细胞毒剂，其选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药，作为在治疗中同时、连续或分开使用的组合制剂。
该组合包含2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂，该组合可同时、连续或分开(作为给药方案的一部分)给药。
如本文所用的“同时”是指两种药物同时给药。因此，“连续”给药可在另一种药物给药后5分钟、10分钟或几小时内给药一种药物，条件是在第一次给药的药物的循环半衰期内使得它们同时以治疗有效量存在。给药成分之间的时间延迟将根据成分的确切性质、它们之间的相互作用和它们各自的半衰期而变化。
与“连续”不同，本文使用的“分开”是指在给药一种药物和另一种药物之间有明显的间隙，即当给药第二种药物时，第一次给药的药物已经不再以治疗有效量存在于血液中。
在一个优选实施方案中，在给药第一种药物后至少2小时，更优选至少4小时，甚至更优选至少8小时，甚至更优选至少12或24或48小时，给药第二种药物。在一个尤其优选的实施方案中，在给药第一种药物后至少24小时给药第二种药物。
本发明的一个方面涉及2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述治疗包括同时、连续或分开向受试者给药细胞毒剂，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药。
优选地，sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂连续或分开给药。
优选地，在给药sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，至少2小时，更优选至少4小时，甚至更优选至少8小时，甚至更优选至少12或24或48小时后，给药细胞毒剂。在一个尤其优选的实施方案中，在给药sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐至少24小时后，给药细胞毒剂。
在一个优选实施方案中，sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂同时给药。
在另一方面，本发明涉及细胞毒剂在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药，其中所述治疗包括向受试者同时、分开或连续给药2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐。
在一个优选实施方案中，细胞毒剂和sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐同时或连续给药。
在一个更优选的实施方案中，在给药细胞毒剂后至少2小时，更优选至少4小时，甚至更优选至少8小时，甚至更优选至少12或24或48小时，给药sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐。在一个尤其优选的实施方案中，在给药细胞毒剂后至少24小时，给药sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐。
在另一优选实施方案中，细胞毒剂和2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐同时给药。
本发明的另一方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括向受试者同时、分开或连续给药2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药。
优选地，所述受试者为哺乳动物，更优选为人。
在一个优选实施方案中，sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂，各自以相对于单个成分的治疗有效量给药。
在另一种优选实施方案中，sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂，各自以相对于单个成分的亚治疗有效量给药。
术语“亚治疗有效量”是指低于对于单独用sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，或细胞毒剂治疗产生的治疗效果通常需要的量。
在尤其优选实施方案中，sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂同时给药。
在另一尤其优选的实施方案中，sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐连续或分开给药。
在更优选的实施方案中，sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，在细胞毒剂前连续或分开给药。
在另一更优选的实施方案中，细胞毒剂在sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐前连续或分开给药。
另一方面涉及本发明的组合在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途。
如本文所用的短语“制备药物”包括使用一种或多种上述成分直接作为药物，或用于制备药物的任何阶段。
增殖性疾病 本文所用的术语“增殖性疾病”是广义的术语，其包括任何需要控制细胞周期的疾病，例如心血管疾病，如再狭窄和心肌病，自身免疫疾病，如肾小球肾炎和类风湿性关节炎，皮肤病，如牛皮癣，抗炎、抗真菌、抗寄生虫疾病，如疟疾、肺气肿和脱发。在这些疾病中，本发明的化合物可根据需要导致细胞凋亡或在希望的细胞中保持停滞。
对于所有上述方面和实施方案，增殖性疾病优选为癌症。
在一个尤其优选的实施方案中，所述癌症为淋巴瘤，优选为非何杰金氏淋巴瘤，更优选皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)。
皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL；也称为蕈样肉芽肿病，塞扎里综合征或皮肤网状细胞肉瘤)是尤其罕见的淋巴瘤类型，其中癌性T细胞在皮肤内生长。
CTLC是未知原因的少见的病症。每1百万人中仅有约4例，且大多数患者在40至60岁。该病症在男性中发病是在女性中的2倍，且在黑人中稍多。其仅能通过活检和对于癌性T细胞的显微镜下检测确诊。
该疾病有4个主要阶段。阶段1仅影响皮肤；在阶段2中，淋巴结增大，但其中没有癌症迹象；在阶段3中，淋巴结中存在淋巴瘤细胞；且在阶段4中，淋巴瘤扩散到身体器官。
CTCL的预后依赖于该疾病的发展。如果少于10％的皮肤被感染，那么很有机会完全治愈或长期控制。如果大于10％的皮肤被感染，或如果淋巴瘤已经扩散到淋巴结或身体器官，那么该疾病通常不可治愈，但可通过长期治疗来控制。
CTCL的治疗依赖于所诊断的疾病的阶段。至今，常规治疗包括局部化疗，用紫外光治疗(PUVA；补骨脂素紫外治疗)、放疗、电子束治疗(EBT)和口服或注射化疗。当为晚期CTLC时，通常仅使用化疗。CTLC对于化疗反应良好，但效果时间很短。研究的其它治疗包括干扰素、地尼白介素(Ontak)、Campath 1H(Alemtuzumub)、贝沙罗汀和缩酚酸肽(FK228)。
在另一尤其优选的实施方案中，所述癌症为肺癌，更优选非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌(SCLC)，甚至更优选NSCLC。
在另一尤其优选的实施方案中，所述癌症为结肠直肠癌。
在一个优选实施方案中，所述增殖性疾病为白血病。优选地，所述白血病选自急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)、急性淋巴细胞性白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)、慢性髓细胞性白血病(chronicmyelogenous leukemia，CML)和慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocyticleukemia，CLL)。
在一个更优选的实施方案中，所述细胞毒剂为N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)，且所述增殖性疾病为非何杰金氏淋巴瘤或肺癌。
在另一更优选的实施方案中，所述细胞毒剂为丁酸钠，且所述增殖性疾病为肺癌。
在另一更优选的实施方案中，为细胞毒剂为伊立替康，且所述增殖性疾病为结肠直肠癌。
在另一尤其优选的实施方案中，所述细胞毒剂为伊立替康，且所述增殖性疾病为肺癌。
在另一优选实施方案中，所述细胞毒剂为依托泊苷，且所述增殖性疾病为肺癌或睾丸癌。
在尤其优选实施方案中，所述细胞毒剂为依托泊苷，且所述增殖性疾病为肺癌。
在一个更优选的实施方案中，所述组合包含sapacitabine和SAHA，且所述增殖性疾病选自NSCLC、AML和CTCL。
在另一优选实施方案中，所述组合包含sapacitabine和丙戊酸钠，且所述增殖性疾病选自CTCL和AML。
在另一优选实施方案中，所述组合包含CNDAC和托泊替康，且所述增殖性疾病为小细胞肺癌(SCLC)。
在一个更优选的实施方案中，所述组合包含CNDAC和SAHA，且所述增殖性疾病选自NSCLC和AML。在一个尤其优选的实施方案中，所述增殖性疾病为AML，且对于该具体实施方案，甚至更优选CNDAC预治疗。
在另一优选实施方案中，所述组合包含CNDAC和丙戊酸钠，且所述增殖性疾病选自CTCL和AML。
本发明的另一方面涉及2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，在制备用于治疗皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)的药物中的用途。
类似地，本发明还涉及一种在受试者中治疗皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)的方法，所述方法包括向所述受试者给药治疗有效量的2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐。
在本发明的一个优选实施方案中，所述2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐与可药用的载体、稀释剂或赋形剂组合给药。
在本发明的一个优选实施方案中，2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐与一种或多种其它抗增生药物组合给药。
药物组合物 在尤其优选实施方案中，本发明的药物产品为药物组合物形式，其包含可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
即使本发明的化合物(包括它们的可药用盐、酯和可药用溶剂合物)可单独给药，但通常它们将与药物载体、赋形剂或稀释剂混合给药，尤其用于人治疗。药物组合物可在人和兽医用药中用于人或动物。
对于多种不同形式的本文所述的药物组合物，该适合的赋形剂的实例可见于“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第2版，(1994)，A Wade和PJWeller编。
治疗使用的可接受的载体或稀释剂是药学领域中公知的，且描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编.1985)。
适合的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等。适合的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可根据给药途径和标准药学实践选择。药物组合物可包含除了载体、赋形剂或稀释剂外的任何适合的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、助溶剂。
适合的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖，如葡萄糖，无水乳糖、自由流动的乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成的胶，如阿拉伯胶、西黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
适合的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。
防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂可加入该药物组合物中。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。也可以使用抗氧化剂和助悬剂。
前药 本发明还包括前药形式的本发明的药物。这些前药通常为其中一个或多个适合的基团以下列方式被修饰的化合物当向人或哺乳动物受试者给药后该修饰为可逆转的。该逆转通常通过受试者中天然存在的酶进行，虽然也可能与该前药同时给药第二种药物使得在体内进行逆转。该修饰的实例包括酯(例如，任何上述那些)，其中该逆转通过酯酶等进行。其它这种体系是本领域技术人员公知的。
例如，在一个优选实施方案中，丁酸钠的前药为丁酸新戊酰氧基甲基酯。优选地，SN-38的前药为伊立替康。
盐/酯 本发明的药物可作为盐或酯存在，尤其是可药用的盐或酯。
本发明药物的可药用盐包括适合的酸加成盐或其碱盐。适合的药物盐的综述可见于Berge等人，J Pharm Sci，66，1-19(1977)。例如与下述酸形成盐，强无机酸例如无机酸，如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，如未取代或被取代(例如被卤素取代)的1-4个碳原子的烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸(tetraphthalic)；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，如未被取代或被取代(例如被卤素取代)的(C1-C4)-烷基-或芳基-磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。
使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯，这依赖于被酯化的官能团。有机酸包括羧酸，如未取代或被取代(例如被卤素取代)的1-12个碳原子的烷羧酸，如乙酸；饱和或不饱和的二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，如未被取代或被取代(例如被卤素取代)的(C1-C4)-烷基-或芳基-磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。适合的氢氧化物包括无机氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括未取代或被取代(例如被卤素取代)的1-12个碳原子的烷醇。
对映异构体/互变异构体 本发明也包括(如果合适)所述药物的所有对映异构体和互变异构体。本领域技术人员会识别具有光学性质(一个或多个手性碳原子)的化合物或互变异构特性。相应的对映异构体和互变异构体可通过本领域已知的方法拆分/制备。
立体和几何异构体 本发明的一些药物可作为立体异构体和/或几何异构体存在-如它们可具有一个或多个不对称和/或几何中心，且可以两种或更多种立体和/或几何异构形式存在。本发明包括那些抑制剂的所有单个立体异构体和几何异构体，及其混合物的用途。权利要求书中使用的术语包括这些形式，条件是所述形式保持适合的功能活性(虽然不必具有相同的程度)。
本发明也包括所述药物或其可药用盐的所有适合的同位素变体。本发明的药物或其可药用盐的同位素变体定义为下述物质其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子量与自然界常见的不同的原子替代。可以加入到所述药物及其可药用盐中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别例如2H、3H、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F和36Cl。所述药物及其可药用盐的一些同位素变体，例如下述那些，其中加入放射活性同位素，如3H或14C，其用于药物中和/或底物组织分布研究中。为了方便制剂和检测，尤其优选氚，即3H，和碳-14，即14C同位素。而且，用同位素如氘，即2H取代可提供一些治疗优势，这是由于更高的代谢稳定性，例如体内半衰期增加或剂量需求降低，且因此在一些情况下是优选的。本发明的药物及其可药用盐的同位素变体通常可通过常规方法使用适合试剂的适合同位素变体制备。
溶剂合物 本发明也包括溶剂合物形式的本发明药物。权利要求书中使用的术语包括这些形式。
多晶型物 本发明还涉及不同结晶形式、多晶型形式和无水/含水形式的本发明的药物。在药学工业中明确的是，化学化合物可通过稍微改变纯化和/或从合成制备这些化合物中所用的溶剂中分离的方法而分离出任何这些形式。
给药 本发明的药物组合物可适合用于口服、直肠、阴道、胃肠外、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、鼻内、含服或舌下途径给药。
对于口服给药，具体使用为制成压片、丸剂、片剂、凝胶剂、滴剂和胶囊。优选地，这些组合物每剂量含有1-2000mg，且更优选50-1000mg的活性成分。
其它给药形式包括溶液或乳液，其可通过静脉内、动脉内、鞘内、皮下、皮内、腹膜内或肌内注射，且从无菌或可灭菌溶液中制备。本发明的药物组合物也可为下述形式栓剂、阴道栓剂、混悬剂、乳剂、洗剂、软膏、乳膏、凝胶、喷雾剂、溶液或扑粉。
经皮给药的可替代方式为通过使用透皮贴片。例如，将活性成分加入到包含聚乙二醇或液体石蜡的水性乳剂的乳膏中。活性成分也可以1-10％重量的浓度加入到含有白蜡或白软石蜡以及可能需要的稳定剂和防腐剂的软膏中。
可注射的剂型每剂量可包含10-1000mg，优选10-500mg的活性成分。
组合物可配制成单位剂型，即含有单位剂量或多剂量或亚单位剂量的分散部分的形式。
在优选实施方案中，sapacitabine以口服给药。
在另一优选实施方案中，伊立替康以静脉内给药。
在另一优选的实施方案中，依托泊苷以口服或静脉内给药。
剂量 本领域普通技术人员能够简单地确定向受试者给药本发明组合物中的一种的适合剂量，而不用过多实验。通常，医师将确定对于个体患者最适合的实际剂量，且该剂量将依赖于多种因素，包括所用具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、药物组合、具体病症的严重程度和个体接受的治疗。本文公开的剂量是示例性的平均案例。当然对于个体实例，更高或更低的剂量范围可能是有利的，且这些也在本发明的范围内。
根据需要，给予的药物的剂量为0.1-30mg/kg体重，如2-20mg/kg，更优选0.1-1mg/kg体重。
指导性地，sapacitabine通常根据医师指导给药，对于成人患者剂量为0.05-5g。优选地，口服剂量为1-120mg/m2体表面。所述剂量可以1周给予5天，共给4周，或1周给予3天，共给4周。Sapacitabine也可以1-500mg每剂量给药，1天2次。优选地，这些剂量可在治疗周期中给予，所述治疗周期包括sapacitabine每周给药2至约6天，3周中给予2周。更优选地，sapacitabine可每周给药3-5天，给予2周停用1周。甚至更优选地，sapacitabine可以每周连续给药3、4或5天，给予2周停用1周。或者，在治疗周期中可以给予sapacitabine，所述治疗周期包括sapacitabine每21天给药7天或14天，更优选每21天连续给药7天或14天，甚至更优选连续给药7天然后停用2周。使用的剂量和频率通常适应于患者的一般医疗情况和所引起不良作用的严重程度，尤其要适应于引起造血、肝和肾系统不良作用的严重程度。sapacitabine的总日剂量可作为单一剂量或分为各个剂量给药，优选每天给药2、3或4次。
指导性地，细胞毒剂通常根据医师指导给药，剂量为所述细胞毒剂批准剂量的范围内。对于每种药物所述剂量来自产品特征概述(Summary ofProduct Characteristics)，其来自生产厂商或来自如www.emea.eu.int/htms/human/epar/a-zepar.htm。
优选地，当细胞毒剂为依托泊苷时，通过输注给药，更优选地，通过静脉输注。优选地，依托泊苷的给药剂量为100-120mg/m2/每天，通过连续输注30-60分钟。
优选地，当细胞毒剂为伊立替康时，通过输注给药到外周或中央静脉，更优选通过静脉输注。优选地，给药伊立替康的剂量为100-400mg/m2，更优选150-350mg/m2，甚至更优选150-200mg/m2。优选地，伊立替康经30-90分钟的时间给药。
优选地，当细胞毒剂为托泊替康时，以口服或静脉给药的剂型。对于口服剂型，推荐剂量为2.3mg/m2/天，每天1次连续5天，每21天重复1次。对于静脉输注剂型，推荐的剂量为1.5mg/m2，通过每天30分钟的静脉输注，连续5天，21天1循环。
指导性地，HDAC抑制剂通常根据医师指导给药。Pivanex(丁酸新戊酰氧基甲基酯)的给药剂量通常为约2.34g/m2每天。Pivanex优选静脉内给药。N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)通常的给药剂量为约100-600mg每天。N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)优选口服给药。丙戊酸通常的给药剂量为约10-60mg/kg(口服给药)，或约10-150mg/kg(静脉内给药)。HDAC抑制剂的总日剂量可以以单一剂量给予或分开为各个剂量，优选每天给药2、3或4次。
试剂盒 本发明的另一方面涉及试剂盒，其包含 (i)2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，任选与可药用的稀释剂、赋形剂或载体混合；和 (ii)细胞毒剂，其选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药，任选与可药用的稀释剂、赋形剂或载体混合。
优选地，sapacitabine，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂各自为单位剂型。优选地，试剂盒包含多个各个成分(即上述成分(i)和(ii))单位剂型。
任选地，试剂盒还可包含特利于适用定剂量方案的工具，例如指示何时、怎样和以什么频率使用单位剂型的每种成分的说明。
本发明进一步通过实施例的方式描述，且参考下述附图，其中

图1表示CNDAC和SAHA在sub-G1Hut78细胞中诱导剂量依赖性增加。
图2表示来自sapacitabine和伊立替康(CPT-11)或SAHA的组合的异种移植数据。在各栏中，符号表示个体小鼠，且横线表示该组的平均值。误差线表示平均值的标准偏差。在开始处理后第22天得到这些数据。该时间点为21天处理方案完成后立即进行。
图3表示CNDAC和SAHA在Hut78细胞中诱导sub-G1DNA含量的协同增加(％总细胞vs处理)。
图4表示在死亡和凋亡细胞中的Annexin V染色(细胞数％vs处理)。该染色表明CNDAC和SAHA在死亡/正在死亡的Hut78细胞中诱导加和增加。
图5表示通过在Hut78细胞中蛋白质印迹(Western Blotting)进行的CNDAC/SAH组合的分析。PI和Annexin V染色表明CNDAC/SAH组合诱导Hut78细胞死亡的较弱协同增加。
图6表示在P388小鼠模型中对于多种处理组合的小鼠数vs接种后天数，(溶媒(对照)、CYC68220mg/kg PO QD x 5 x 2、SAHA 75mg/kg IP QD X 12、或CYC682+SAHA)。
实施例 材料和方法 CNDAC由Cyclacel Ltd.(Dundee，UK)提供。依托泊苷由Sigma提供。SN-38由Abatra technology Co Ltd，Xi ′an，China提供。伊立替康由Pfizer提供。丁酸钠、丙戊酸和丙戊酸钠得自Sigma；制毛藓素A(TSA)得自AG Scientific，Inc.；SAHA得自Toronto Research Chemicals，Inc。细胞系H1299、H460、Hut78、MV4-11、HL-60和PL-21得自ATCC。
sapacitabine的制备 Sapacitabine根据Sankyo Company Limited的EP 536936的实施例1和2中描述的方法制备。
细胞培养 实验在96-孔板中进行，且将细胞系以下述密度接种，2500/孔(对于H1299)，2500/孔或3000/孔(对于H460)，5000/孔(对于HL-60细胞)，和8,000细胞/孔(对于Hut78、MV4-11和PL-21细胞)。在实体瘤细胞系(H460和H1299)中，使用Alamar蓝测试测定对于每种化合物的处理24小时和处理72小时的IC50值，而在混悬细胞系(Hut78、MV4-11、HL60和PL21)中仅获得72小时的IC50值。然后使用下述三种不同的处理方案检测每种化合物与CNDAC的组合共同(concomitant)，CNDAC预处理然后HDAC抑制剂/拓扑异构酶抑制剂处理，和HDAC抑制剂/拓扑异构酶抑制剂预处理然后CNDAC处理。在Hut78细胞中，在用CNDAC、SAHA或无药物培养基预处理24小时后，使用共同处理方案。
Calcusyn药物组合方案 在不同的检测细胞系中使用稍不同改变的组合方案，这是因为一些细胞系不贴壁，不能进行抽吸。
对于H460和H1299细胞中的共同处理方案，接种后24小时，将2倍连续稀释的CNDAC、HDAC抑制剂/拓扑异构酶抑制剂，或同时两种药物加入到细胞中，然后置于37℃下72小时。在预处理方案中，接种细胞2小时后加入第一种药物，然后放置24小时。抽吸培养基，并用含第二种药物的新鲜培养基替换，并培养72小时。对于每个连续处理的2个对照组涉及使用培养基代替一种药物处理。在Hut78细胞中使用相似的方案，但省略培养基抽吸步骤(因为其为混悬的细胞系，预处理的药物不能从这些细胞中移除)。AML细胞系(HL60、MV4-11、PL21)基本上如对于Hut78细胞所述进行组合分析，除了在AML细胞系中将药物培养时间从72小时减少到48小时，以校正它们的快速生长速度。
药物处理后，使用下列方法估算每孔中的细胞数通过将细胞在含10％alamar蓝(Roche，Lewes，East Sussex，U.K.)的培养基中培养1小时，然后在544-595nm读取吸光度值。使用商用软件包Calcusyn分析药物相互作用，该软件基于Chou和Talalay(Chou，T.C.&Talalay，P.(1984)Adv.EnzymeRegul.22，27-55Quantatative analysis of dose-effect relationshipsthe combinedeffects of multiple drugs or enzyme inhibitiors)的半数有效模型(median effectmodel)。组合指数(C.I.)为1表示有相加和的药物相互作用，而C.I.大于1为拮抗作用，且分数小于1为协同作用。
流式细胞术 将Hut78细胞以大约5×105细胞/板接种到10cm板中，然后放置2小时。将CNDAC、SAHA或两种药物以所示浓度加入，保持所示时间(16-72小时处理)。处理后，收获细胞并进行细胞周期分析。离心沉淀细胞，在PBS中洗涤2次，然后在70％(v/v)乙醇中，于-20℃固定过夜。细胞用50μg/ml碘化丙锭(propidium iodide)染色20分钟，然后在流式细胞仪上进行DNA含量分析。根据厂商说明书所示对活的没有固定的细胞进行Annexin V染色。
协同活性的统计学分析和测定 使用Chou和Talalay方法评估药物组合的作用，该方法基于半数有效原理(Chou TC，Talalay P.Quantitative analysis of dose-effect relationshipsthecombined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.Adv Enzyme Regul.1984；2227-55)。该方法包括利用下述方程对于每种药物以及对于多重稀释、固定比例的组合绘制剂量-作用曲线fa/fu＝(C/Cm)m，其中fa为被药物浓度C影响的细胞分数(如，如果细胞生长抑制90％，则为0.9)，fu为未受影响的部分，C为药物浓度，IC50为对于最大作用的一半(即，抑制50％细胞生长)所需的浓度，且m为浓度-作用曲线的sigmoidicity系数。基于在组合中每种药物的曲线的斜率，可以确定药物是否具有相互的非独有的作用(如，独立的或相互作用的方式)。
然后通过下述方程测定组合指数(CI) CI＝[(C)1/(Cx)1]+[(C)2/(Cx)2]+[α(C)1(C)2/(Cx)1(Cx)2]， 其中(Cx)1为产生单独使用药物的x百分比作用所需的药物1的浓度，且(C)1为在与(C)2组合中产生相同的x百分比作用所需的药物1的浓度。如果药物的作用方式是互相独有的或非独有的，那么α分别为0或1。CI值将根据该方程使用不同的fa值(即，对于不同程度的细胞生长抑制)计算。CI值＜1表示协同作用，该值为1表示相加和的作用，且该值＞1表示拮抗作用。在IBM-PC计算机上使用用于微机的浓度-作用分析软件(Biosoft，Cambridge，UK)分析这些数据。对于统计学分析和图像，我们将使用Instat和Prism软件(GraphPad，San Diego，USA)。对于所检测药物(单个或配对组合)的剂量-作用关系，进行半数有效曲线分析(median-effect plot analysis)以确定它们在各个所选细胞系中的相对效力(IC50)、形状(shape)(m)，和顺应性(r)。如上所述，IC50和m值分别用于计算基于CI方程的协同和拮抗作用。结果表示为至少进行3组实验(每组一式两份)的平均值±标准偏差。在各个实验中，如上所述使细胞与配对组合接触48小时。使用Student’s t-检验(双侧p值)比较平均值和标准偏差。
蛋白质印迹分析 从10cm板中得到蛋白质溶胞产物，所述板以大约5×105细胞/孔接种于含有10％FCS的培养基中。细胞用CNDAC、SAHA、或两种化合物以所示浓度和时间培养，然后收获。通过离心收集细胞(5分钟x2,000g)，用冰冷的缓冲液A(50mM HEPES，pH 7.0，20mM NaCl，1mM DTT，蛋白酶抑制剂，10mM焦磷酸钠，10mM氟化钠和1mM原钒酸钠)洗涤一次，且重新悬浮于0.3ml相同的缓冲液中。通过超声处理(用具有探针的超声仪进行2x 3s破裂)，将细胞裂解，且使用BCA测试测定每管的蛋白质浓度。将溶胞产物(20-30μg加载的蛋白质/孔)置于(resolved)含有10或12％丙烯酰胺的Bis-Tris凝胶上，且转移至硝基纤维素用于蛋白质印迹分析。在室温下使膜在含0.02％(v/v)Tween 20和5％(w/v)脱脂奶粉的PBS中阻断1小时。抗体在含0.02％(v/v)Tween 20(PBST)含3％(w/v)奶粉的PBS中于2-8℃培养过夜。用下述抗体探测硝基纤维素膜 然后将膜在PBST中洗涤3次，然后与适宜的辣根过氧化物酶结合的二次抗体(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody)(Perbio)(以1∶5,000稀释)培养1小时。最后，膜在PBST中洗涤3次，然后使用改进的化学发光试剂盒(Amersham Corporation，Buckinghamshire，U.K.)或MilliporeImmobilon HRP底物显像(development)。
结果 CNDAC和SAHA对皮肤T-细胞淋巴瘤细胞系(Hut78)的抗增生作用 表1表示使用3种不同处理方案，CNDAC和SAHA抗皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)细胞系Hut78细胞的作用。示出了对于各个药物处理在ED50、ED75和ED90值(即在曲线上其中50％、75％和90％细胞被杀死的点)时的组合指数值。数据为3个独立实验的平均值。
这些结果表明CNDAC和SAHA对于Hut78细胞在3种检测的处理方案中均有高度的协同作用。使用SAHA或CNDAC预处理表现出轻微地提高了共同处理方案。这些数据表明CNDAC与SAHA组合对于处理皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)细胞为有前景的处理方案。
考虑到在使用混悬细胞系的工作中的困难，先测试一种药物，然后测试两种药物的组合。该方法相当于先检测第一种药物，然后在其中第一种药物的半衰期使得当使用第二种药物时第一种药物仍然存在的情况下检测另一种药物。
CNDAC和SAHA导致sub-G1Hut 78细胞的剂量-依赖性增加 图1表明CNDAC和SAHA导致sub-G1Hut 78细胞的剂量-依赖性增加。Hut78细胞用0.5 X-2 X IC50 CNDAC，0.5-2X IC50 SAHA，或0.5-2XIC50 CNDAC+SAHA培养72小时。在Hut78细胞中1 X IC50值对于CNDAC为0.36μM，且对于SAHA为0.46μM。药物处理后，收获细胞，用碘化丙锭染色，然后通过流式细胞术分析它们的DNA含量。单独的SAHA对于细胞周期几乎没有作用，除在2 X IC50浓度外，此时导致通常死亡或正经历凋亡的sub-G1细胞(那些与正常二倍体细胞相比含有较少DNA的细胞)的小幅增加。CNDAC处理导致sub-G1细胞的剂量-依赖性增加，其通过加入SAHA被协同增强。这些数据表明CNDAC和SAHA导致死亡或正在死亡的细胞数目的协同增加。
CNDAC和SAHA导致sub-G1Hut78细胞的时间-依赖性增加 图4表明CNDAC和SAHA导致sub-G1Hut78细胞的时间依赖性增加。Hut78细胞用1 X IC50CNDAC、1 X IC50SAHA、或1 X IC50CNDAC+SAHA培养16、24、48或72小时。在Hut78细胞中1 X IC50值对于CNDAC为0.36μM，且对于SAHA为0.46μM。处理后，收获细胞，用碘化丙锭染色，然后通过流式细胞术分析它们DNA含量。单独的SAHA对于细胞周期几乎没有作用，且导致通常死亡或正经历凋亡的sub-G1细胞(＜2n DNA)小幅增加。CNDAC处理导致sub-G1细胞的时间-依赖性增加，这通过48小时的处理变得明显，且在72小时诱导几乎30％的细胞群。CNDAC和SAHA导致sub-G1细胞的协同增加，其在48小时变得明显，且在72小时影响大约70％的细胞群。这些数据表明CNDAC和SAHA导致死亡或正在死亡的细胞数目的协同增加，且该作用在48小时处理时间是显著的。CNDAC处理也导致DNA内含物(含有2-3n DNA(S-期)，其能表示S-期细胞或从G2期死亡的细胞(4n DNA)的亚群)中的细胞群离散(discrete)。如果后者的解释是正确的，那么CNDAC可能导致与图4所示相比更大比例的死亡/正在死亡细胞。总体来说，这些数据表明CNDAC/SAH组合导致死亡或正在死亡的细胞的协同或加和增加。
CNDAC和SAHA对非小细胞肺癌细胞(H460和H1299)的抗增殖作用 表2表示CNDAC和SAHA抵抗H460和H1299细胞的作用。使用3种不同的处理方案测试CNDAC。示出了对于各个药物处理在ED50、ED75和ED90值(即在曲线上其中50％、75％和90％细胞被杀死的点)时的组合指数值。数据为至少2个独立实验的平均值。这些结果表明CNDAC和SAHA对H1299细胞在所有3种检测的处理方案中具有协同作用。这些数据表明CNDAC与SAHA组合可产生用于处理非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系的有用的处理方案。
CNDAC和丁酸钠对抗非小细胞肺癌细胞(H460和H1299)的抗增殖作用 表3表示CNDAC和丁酸钠抵抗H460和H1299细胞的作用。这些结果表明CNDAC和丁酸盐在所有3种处理方案中均在H460和H1299细胞中产生中等至强的协同作用，显示为积极的药物相互作用。尤其是，这些结果表明CNDAC预处理和共同处理方案对于H460细胞的协同作用。在H1299细胞中，丁酸盐预处理产生了协同的药物相互作用。这些结果表明CNDAC与丁酸盐组合可产生用于处理非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系有用的处理方案。
CNDAC和拓扑异构酶抑制剂对非小细胞肺癌细胞(H460和H1299)的抗增殖作用 表4表示CNDAC和拓扑异构酶抑制剂抵抗H460和H1299细胞的作用。这些结果表明CNDAC与拓扑异构酶抑制剂，依托泊苷或SN38(衍生自伊立替康的活性剂)组合在H1299细胞中产生协同作用。ED50、ED75和ED90为当50、75和90％的细胞群被杀死时的点。这些数据表明CNDAC与拓扑异构酶抑制剂组合可产生用于处理非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系有用的处理方案。
急性骨髓性白血病(AML)细胞系中的CNDAC和HDAC抑制剂的组合 在AML细胞系HL60、PL21和MV4-11中，使用3种不同处理方案(表5和6)测试与所示HDAC抑制剂组合的CNDAC。示出了对于各个药物处理在ED50、ED75和ED90值(即在曲线上其中50％、75％和90％细胞被杀死的点)时的组合指数值。数据为3个独立实验的平均值。
CNDAC和SAHA在所有3种所检测的细胞系中产生中等至强的协同作用，没有证据表明化合物间存在任何拮抗作用。CNDAC预处理对于该组合为勉强够格的最好的处理方案。
CNDAC和丙戊酸盐也在所有3种AML细胞系中产生中等至强的协同作用。对于该组合，没有证据表明哪种处理方案是最佳的。
这些结果支持CNDAC与HDAC抑制剂组合用于AML细胞系的想法，因为大多数该组合产生协同作用，而没有观察到明显的拮抗作用。而且，从丙戊酸盐和SAHA得到与CNDAC组合时相当的数据，表明所观察到的协同作用是由于CNDAC与HDAC抑制剂的组合，而不是由于具体HDAC抑制剂的独特性质决定的。
CNDAC和SAHA在凋亡/死亡Hut78细胞中导致加和增加 Hut78细胞用IC50CNDAC、SAHA或CNDAC+SAHA培养24小时、48小时或72小时。然后收获细胞，用Annexin V染色，然后在流式细胞仪上分析。数据代表两个独立的实验的数据。Annexin V标记正经历凋亡或已经死亡的活细胞。SAHA处理导致死亡/正在死亡的细胞的增加可以忽略不计。图3表明单独的CNDAC药物处理和组合均对于凋亡/死亡细胞产生时间-依赖性增加。而且，CNDAC处理和组合对凋亡/死亡细胞产生相似比例的增加，其强度与组合中观察到的sub-G1峰相当(图3)。总之，这些数据表明图3中的PI染色低估了(underestimated)CNDAC处理导致的sub-G1细胞比例，且组合仅产生凋亡细胞的加和增加。因此，在calcusyn分析中检测到的协同作用(表1)很可能主要是由于细胞增殖的抑制。
在Hut78细胞中通过蛋白质印迹分析CNDAC和SAHA组合 Hut78细胞用1X IC50CNDAC、SAHA或CNDAC+SAHA处理所示的时间。收获细胞，且所得细胞溶胞产物使用所示抗体通过蛋白质印迹分析。数据表示2个独立实验的数据(图5)。SAHA处理导致乙酰基-组蛋白H4增加，证实了HDAC抑制剂在该实验中是有活性的。该组合导致裂解的PARP的加和/协同增加，这与上述annexin V数据(图4)是一致的。凋亡的增加可能是由于抗凋亡蛋白的向下调节所致，因为CNDAC导致Mcl-1减少，以及该组合导致XIAP和存活蛋白(surviving)的向下调节。CNDAC导致H2A.X在丝氨酸139位的磷酸化增加，加入SAHA明显增加这种作用。H2A.X在丝氨酸139位的磷酸化指示双链DNA断裂，且这些结果表明SAHA和CNDAC导致以这种DNA破坏形式的协同增加。同源重组是对于双链DNA断裂的一种主要的修复途径，且RAD51在同源重组起重要的作用。因此，可能的情形是，该组合导致的RAD51的向下调节在解释这些药物之间的协同作用中起重要的作用，因为其导致双链DNA断裂修复的降低，这是DNA破坏最有害的方式之一。
在p388异种移植中的Sapacitabine和SAHA 使用p388小鼠白血病异种移植，通过在多种处理方案中小鼠的存活时间评估药物组合。在该模型中，与溶媒对照组相比，SAHA对于存活具有非常小的影响(参见图6)。另一方面，CYC682导致存活时间明显增加。CYC682/SAH组合导致存活至少(在最坏的情形下)为加和增加。这些数据证明CYC682/SAH组合在p388异种移植模型中至少具有加和作用。
体内研究 从Harlan获得雌性小鼠(nu/nu)。对于这些动物使用～1×107H358细胞/小鼠在它们的侧腹的一侧进行皮下注射。肿瘤生长至～127mm3，然后根据肿瘤大小配对匹配(pair-matched)到各处理组中(10只小鼠/组)。一组用sapacitabine(15mg/kg)处理，每天1次，口服灌胃，连续5天，然后停用2天；然后重复该处理总共3个循环。用伊立替康(50mg/kg)处理，每周1次，腹膜内注射，持续3周。SAHA(50mg/kg)，每天1次，口服灌胃，连续21天。所有给药方案在第1天用伊立替康处理12小时，然后用sapacitabine和SAHA处理；所有组合给药方案均基于对于单个药物处理等价的方案。作为对照，一组小鼠使用与sapacitabine(2.5％DMA 9.75％Emulphor)相同的溶媒/方案给药。每周给小鼠称重至少2次以评估处理毒性，且每周至少2次使用测径器测量肿瘤以确定肿瘤生长。使用下式将肿瘤测量转化为体积肿瘤体积(mm3)＝宽度2(mm)x长度(mm)x0.52。使用下式确定肿瘤生长抑制百分比1-(所处理的肿瘤体积的变化/对照组肿瘤体积的变化)x100％。使用双侧非配对Student’s T-检验确定统计学意义。
结果 这些异种移植实验的结果示于图2中。在第22天，溶媒对照组的平均肿瘤体积为517mm3，而给药伊立替康和sapacitabine的动物的平均体积分别为225和229mm3，证明这两种化合物具有导致～75％肿瘤生长抑制(％TGI)的活性。这两种药物的组合的平均肿瘤体积为151mm3(94％TGI)，证明该组合是有利的。
相反，由于与对照组具有相同的平均肿瘤体积(517mm3)，SAHA对肿瘤生长没有作用。sapacitabine和SAHA的组合的平均肿瘤体积为168mm3(89％TGI)，由于该值小于单独使用sapacitabine治疗的值，表明该组合对于肿瘤生长具有协同作用。
本发明的多种改变和变体将对于本领域技术人员是明显的，没有背离本发明的范围和主旨。虽然本发明使用具体的优选实施方案进行描述，但应该理解所要求保护的本发明不应不适当地限定于这些具体的实施方案中。事实上，对于进行本发明所述方式的对于相关领域技术人员明显的多种改变应包括在本发明内。
表11-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-胞嘧啶(CNDAC)和N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)的分析。数据为3个独立实验的平均值。

表2H460和H1299细胞中的CNDAC和SAHA的组合的分析。数据为3个(H460)或2个(H1299)独立实验的平均值。

表3在H460和H1299细胞中的CNDAC和丁酸钠的组合的分析。数据为3个(H460)或2个(H1299)独立实验的平均值。

表4在H460和H1299细胞中的CNDAC与拓扑异构酶抑制剂的组合的分析。数据为3个独立的实验的平均值。


表5在MV4-11、HL-60和PL-21细胞中的CNDAC与SAHA的组合的分析。数据为2个独立的实验的平均值。

表6在MV4-11、HL-60和PL-21细胞中的CNDAC与丙戊酸盐的组合的分析。数据为2个独立的实验的平均值。


权利要求
1.组合，其包含2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药。
2.权利要求1的组合，其中所述细胞毒剂为HDAC抑制剂。
3.权利要求1或2的组合，其中所述HDAC抑制剂选自丁酸钠，或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠、丙戊酸、制毛藓素A(TSA)、PXD101、LAQ824、MS-275、CI-994、SB939、MGCD0103和缩酚酸肽。
4.权利要求1-3中任一项的组合，其中所述HDAC抑制剂为丁酸钠或其前药。
5.权利要求4的组合，其中所述丁酸钠的前药为丁酸新戊酰氧基甲基酯。
6.权利要求1-3中任一项的组合，其中所述HDAC抑制剂为N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)。
7.权利要求1-3中任一项的组合，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸钠或丙戊酸。
8.权利要求1-3中任一项的组合，其中所述HDAC抑制剂为制毛藓素A(TSA)。
9.权利要求1的组合，其中所述拓扑异构酶抑制剂为SN-38或其前药。
10.权利要求9的组合，其中所述拓扑异构酶抑制剂为SN-38。
11.权利要求9的组合，其中所述SN-38的前药为伊立替康。
12.权利要求1的组合，其中所述拓扑异构酶抑制剂为依托泊苷或托泊替康。
13.根据上述权利要求中任一项的组合，其中所述2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶的代谢产物为1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-胞嘧啶(CNDAC)。
14.药物组合物，其包含上述权利要求中任一项的组合和可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
15.药物产品，其包含(i)2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，和(ii)细胞毒剂，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药，作为在治疗中同时、连续或分开使用的组合制剂。
16.权利要求15的药物产品，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂用于同时给药。
17.权利要求15的药物产品，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂用于分开或连续给药。
18.权利要求15-17中任一项的药物产品，其中所述HDAC抑制剂选自丁酸钠，或其前药、N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、丙戊酸钠、丙戊酸、制毛藓素A(TSA)、PXD101、LAQ824、MS-275、CI-994、SB939、MGCD0103和缩酚酸肽。
19.权利要求15-18中任一项的药物产品，其中所述HDAC抑制剂为丁酸钠或其前药。
20.权利要求19的药物产品，其中所述前药为丁酸新戊酰氧基甲基酯。
21.权利要求15-18中任一项的药物产品，其中所述HDAC抑制剂为N-辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)。
22.权利要求15-18中任一项的药物产品，其中所述HDAC抑制剂为丙戊酸钠或丙戊酸。
23.权利要求15-18中任一项的药物产品，其中所述HDAC抑制剂为制毛藓素A(TSA)。
24.权利要求15-17中任一项的药物产品，其中所述拓扑异构酶抑制剂为SN-38或其前药。
25.权利要求24的药物产品，其中所述SN-38的前药为伊立替康。
26.权利要求15-17中任一项的药物产品，其中所述拓扑异构酶抑制剂为依托泊苷或托泊替康。
27.权利要求15-26中任一项的药物产品，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶的代谢产物为1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-胞嘧啶。
28.权利要求15-27中任一项的药物产品，其为包含药物载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物形式。
29.权利要求15-28中任一项的药物产品，其用于治疗增殖性疾病。
30.权利要求29的药物产品，其中所述增殖性疾病为癌症或淋巴瘤。
31.权利要求30的药物产品，其中所述癌症为非何杰金氏淋巴瘤。
32.权利要求30的药物产品，其中所述癌症为皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)。
33.权利要求30的药物产品，其中所述癌症为肺癌。
34.权利要求33的药物产品，其中所述肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌(SCLC)。
35.权利要求29的药物产品，其中所述增殖性疾病为白血病。
36.权利要求35的药物产品，其中所述白血病为急性骨髓性白血病(AML)。
37.一种治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括向受试者同时、分开或连续给药2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药。
38.权利要求37的方法，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂相对于单个成分各自以治疗有效量给药。
39.权利要求37的方法，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂相对于单个成分各自以亚治疗有效量给药。
40.权利要求37-39中任一项的方法，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂同时给药。
41.权利要求37-39中任一项的方法，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂连续或分开给药。
42.权利要求41的方法，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐在细胞毒剂之前连续或分开给药。
43.权利要求41的方法，其中细胞毒剂在2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐之前连续或分开给药。
44.权利要求37-43中任一项的方法，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶的代谢产物为1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-胞嘧啶。
45.权利要求37-44中任一项的方法，其中所述增殖性疾病为癌症或淋巴瘤。
46.权利要求45的方法，其中所述癌症为非何杰金氏淋巴瘤。
47.权利要求45的方法，其中所述癌症为皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)。
48.权利要求45的方法，其中所述癌症为肺癌。
49.权利要求45的方法，其中所述肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌(SCLC)。
50.权利要求37-45中任一项的方法，其中所述增殖性疾病为白血病。
51.权利要求50的方法，其中所述白血病为急性骨髓性白血病(AML)。
52.权利要求1-13中任一项的组合在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途。
53.2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，其中所述治疗包括向受试者同时、分开或连续给药细胞毒剂，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药。
54.细胞毒剂在制备用于治疗增殖性疾病的药物中的用途，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药，其中所述治疗包括向受试者同时、分开或连续给药2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐。
55.权利要求53或54的用途，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂连续或分开给药。
56.权利要求55的用途，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐在细胞毒剂之前连续或分开给药。
57.权利要求55的用途，其中细胞毒剂在2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐之前连续或分开给药。
58.权利要求53或54的用途，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂同时给药。
59.权利要求52-58中任一项的用途，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶的代谢产物为1-(2-C-氰基-2-脱氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊糖基)-胞嘧啶。
60.权利要求52-29中任一项的用途，其中所述增殖性疾病为癌症或淋巴瘤。
61.权利要求60的用途，其中所述癌症为非何杰金氏淋巴瘤。
62.权利要求60的用途，其中所述癌症为皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)。
63.权利要求60的用途，其中所述癌症为肺癌。
64.权利要求63的用途，其中所述肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌(SCLC)。
65.权利要求52-59中任一项的用途，其中所述增殖性疾病为白血病。
66.权利要求65的用途，其中所述白血病为急性骨髓性白血病。
67.试剂盒，其包含
(i)2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，任选与可药用的稀释剂、赋形剂或载体混合；和
(ii)细胞毒剂，其选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药，任选与可药用的稀释剂、赋形剂或载体混合。
68.2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，在制备用于治疗皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)的药物中的用途。
69.一种在受试者中治疗皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)的方法，所述方法包括向受试者给药治疗有效量的2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐。
70.权利要求68的用途或权利要求69的方法，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐与可药用的载体、稀释剂或赋形剂组合给药。
71.权利要求68的用途或权利要求69的方法，其中2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐与一种或多种其它抗增生药物组合给药。
72.权利要求1-13中任一项的组合，其用于治疗增殖性疾病。
73.基本上如在此描述的组合、药物组合物、药物产品、方法或用途。
全文摘要
本发明的第一方面涉及一种组合，其包含2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药。第二方面涉及药物产品，其包含(i)2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，和(ii)细胞毒剂，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药，作为在治疗中同时、连续或分开使用的组合制剂。第三方面涉及治疗增殖性疾病的方法，所述方法包括向受试者同时、分开或连续给药2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，以及细胞毒剂，所述细胞毒剂选自(a)HDAC抑制剂；和(b)拓扑异构酶抑制剂，所述拓扑异构酶抑制剂选自依托泊苷、托泊替康，和SN-38，或其前药。本发明的第四方面涉及2′-氰基-2′-脱氧-N4-棕榈酰基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-胞嘧啶，或其代谢产物，或其可药用盐，在制备用于治疗皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)的药物中的用途。
文档编号A61K31/7068GK101610776SQ200780047070
公开日2009年12月23日 申请日期2007年12月19日 优先权日2006年12月19日
发明者西蒙·格林, 伊恩·弗莱明 申请人:西克拉塞尔有限公司