专利名称：具有二肽基肽酶iv抑制作用的黄酮类化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类具有二肽基肽酶IV(DDP-IV)抑制作用的黄酮类化合物，可用于治疗二肽基肽酶IV相关的疾病，如糖尿病，特别是II型糖尿病等。
背景技术：
糖尿病是以高血糖为特征的慢性代谢性疾病，是世界第三大疾病。中国已成为糖尿病发病的高发病率地区，2007年有糖尿病患者3000万，糖尿病的发病率约为5％，尤其是由糖尿病引起的各种并发症，是糖尿病患者致残和致死的主要原因。糖尿病发病率以II型糖尿病为主，II型糖尿病治疗药物目前包括磺酰脲类、双胍类、胰岛素增敏剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、二肽基肽酶IV抑制剂和各种剂型的胰岛素等。
二肽基肽酶IV(E.C.3.4.14.5)也称为CD26，是一种跨膜丝氨酸蛋白酶，也存在可溶形式，是脯氨酰寡肽酶家族的一员，凡N端第2位上存在脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)的多肽是该酶发挥活性的主要底物，它能从肽链N端水解两个氨基酸残基Xaa-Pro或Xaa-Ala(Xaa为任意氨基酸)，从而使活性多肽出现部分或完全失活。
二肽基肽酶IV抑制剂是一类新型的口服降血糖药，它通过抑制DDP-IV负责降解胰高血糖素样肽)的活性来维持体内胰高血糖素样肽(GLP-1)水平，GLP-1具有促进胰岛素分泌，抑制胰升糖素释放，抑制胃排空，增加β细胞数量等作用。在临床研究中，DDP-IV抑制剂对糖尿病显示出良好的治疗效果，而且，此类药不会引起患者体重增加，其导致低血糖的风险也非常小。
由于二肽基肽酶IV是近几年才发展起来的一个糖尿病治疗新靶点，国内外对二肽基肽酶IV有抑制作用的天然化合物研究较少，对该酶有抑制作用的天然黄酮类化合物更是未见报道。黄酮类化合物是天然植物中存在的一大类化合物，具有广泛的药理作用。周新等综述了黄酮类化合物的各种生物学活性，总结了黄酮类化合物可以抑制许多种酶的活性，如水解酶、氧化还原酶、DNA合成酶、RNA聚合酶、磷酸酶、蛋白磷酸激酶等[周新、李宏杰，黄酮类化合物的生物活性及临床应用进展，中国新药杂志，2007，16(5)，350]，但黄酮类化合物对二肽基肽酶IV的抑制作用还未见报道。徐智等报道了近十年发现的双黄酮类化合物在抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和抗炎等方面的应用，其中没有这类化合物在糖尿病领域的应用研究[徐智、束俭辉、谭桂山，双黄酮类化合物研究进展，中国现代医学杂志，2004，14(7)，88]。孙丰雷、焦晶晶等总结了黄酮类天然药物在糖尿病及其并发症领域的应用，但具体是哪类结构的黄酮具有二肽基肽酶IV抑制作用及糖尿病治疗作用还没有研究报道[孙丰雷，黄酮类天然药物有效成分治疗糖尿病及其并发症研讨，辽宁中医学院学报，2003，5(4)，381；焦晶晶、张英，黄酮类化合物在防治糖尿病及其并发症方面的最新研究进展，中国药学杂志，2006，41(7)，481]。
发明内容
本发明涉及一类可作为二肽基肽酶IV抑制剂的黄酮类化合物，其在预防和治疗涉及二肽基肽酶IV的疾病，特别是II型糖尿病中的用途，包括这类化合物的药用组合物在预防和治疗涉及二肽基肽酶IV的疾病，特别是糖尿病中的用途。该黄酮类化合物具有以下通式I结构
通式I 或其药学上可接受的盐及其立体异构体，其中R1、R7代表含苯环的芳基部分，R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10代表H、OH、COOH、烷氧基部分。这种化合物抑制二肽基肽酶IV活性，可用于预防和治疗二肽基肽酶IV相关的疾病，特别是糖尿病。
特别是，当R1＝4′，5，7-三羟基黄酮、R2＝OH、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，所述化合物为穗花杉双黄酮，具体结构式如下
当R1＝4′，5，7-三羟基黄酮、R2＝CH3、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，所述化合物为苏铁双黄酮，具体结构式如下
当R1＝4′，5-二羟基-7-甲氧基黄酮、R2＝CH3、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝CH3、R9＝H、R10＝H时，所述化合物为橡胶树双黄酮，具体结构式如下
当R1＝5-羟基-4′-甲氧基黄酮、R2＝OH、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，所述化合物为银杏双黄酮，具体结构式如下
当R1＝H、R2＝OH、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝5”，7”，4’”-三羟基黄酮、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，所述化合物为罗波斯塔黄酮，具体结构式如下
本发明中术语解释如下 术语“黄酮”是指以两个苯环通过中间三碳链相互连接为基本结构而形成的一系列化合物。
术语“烷氧基”是指10碳以内的直链或支链与氧原子通过单建连接的基团，特别是1-6碳直链或支链与氧原子通过单建连接的基团。
术语“芳基”是指包含苯环的6-20碳单环、双环或三环芳基，特别是含有双环的黄酮类结构。
术语“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的、非毒性碱或酸制备的盐。其中非毒性碱盐包括铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰、钾、钠、锌盐等，特别优选的是钾、钙、钠和铵盐。非毒性酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、柠檬酸、富马酸、葡萄糖酸、氢氯酸、乳酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、硝酸、磷酸、琥珀酸、硫酸和酒石酸等，特别优选的是柠檬酸、氢氯酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、琥珀酸和酒石酸。
本发明通式I结构的化合物及其药学上可接受的盐可用口服方法或非肠胃道用药。口服用药可以是片剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂；非经肠用药剂型有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备的。为制造片剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂所用的辅料是常规用的助剂，例如淀粉、乳糖、明胶、糖浆、甘油、蜂蜡、阿拉伯胶、微粉硅胶、滑石粉、聚乙二醇。液体剂型所用的溶剂例如水、乙醇、丙二醇、植物油类如玉米油、花生油、橄榄油等。含有本发明化合物的制剂中还可有其他助剂，例如表面活性剂、润滑剂、抗氧化剂、崩解剂、防腐剂、矫味剂、色素等。
后面的实施例将说明本发明通式I结构的化合物，对二肽基肽酶IV具有较强的抑制作用，因此可用于治疗二肽基肽酶IV相关的疾病，如糖尿病特别是II型糖尿病等。
具体实施例方式 以下通过具体实施例进一步阐述本发明化合物药效学研究，但是该实施例不应成为对本发明的限制。
实施例1穗花杉双黄酮对二肽基肽酶IV活性抑制实验 当R1＝4′，5，7-三羟基黄酮、R2＝OH、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，通式I化合物为穗花杉双黄酮，其对二肽基肽酶IV的酶抑制活性实验如下 实验材料穗花杉双黄酮为淡黄色粉末，购自长沙拓康生物科技有限公司，规格为20mg/瓶，HPLC检测纯度含量大于98％；阳性抑制剂Ile-Pro-Ile白色粉末，购自Sigma公司，规格为5mg/瓶，HPLC检测纯度为大于97％；Gly-Pro p-nitroanilide hydrochloride为淡黄色粉末，购自Sigma公司，规格为25mg/瓶，TLC检测纯度为99％；二肽基肽酶IV为冻干粉末，购自Sigma公司，规格为1.1unit/瓶，其它试剂均为国产分析纯。
实验方法二肽基肽酶IV酶反应实验在96孔板200μl体系中进行，各孔分别加入24μl 0.02u/ml二肽基体酶IV，分别加入0.5、1.25、2.5、5和12.5μg/ml的阳性抑制剂Ile-Pro-Ile和穗花杉双黄酮，其中阳性抑制剂Ile-Pro-Ile用水配制，穗花杉双黄酮用50％二甲基亚砜和50％50mM的Tris缓冲液配制，并设立二甲基亚砜阴性对照孔，用50mM的Tris缓冲液补至160μl，振荡混匀，于37℃孵育10分钟，加入40μl 1mM的Gly-pro-pn底物，振荡混匀，于37℃405nm测光吸收值，每5分钟检测一次，共检测60分钟。
进行Ile-Pro-Ile和穗花杉双黄酮对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性的抑制作用时，称取1g新鲜Wistar大鼠肾脏，用解剖剪剪碎，加9ml生理盐水，使用匀浆机匀浆。匀浆后的匀浆液于3000rpm离心10分钟，上清液再于5000rpm离心10分钟，吸取上清，上清液稀释10倍后用于酶活性实验。鼠肾匀浆上清中的二肽基肽酶IV酶反应实验在96孔板200μl体系中进行，各孔分别加入24μl 0.02u/ml二肽基体酶IV，分别加入不同浓度的Ile-Pro-Ile和穗花杉双黄酮，用50mM的Tris缓冲液补至160μl，振荡混匀，于37℃孵育10分钟，加入40μl 1mM的Gly-pro-pn底物，振荡混匀，于37℃405nm测光吸收值，每5分钟检测一次，共检测60分钟。
实验结果 表一、阳性抑制剂Ile-Pro-Ile对二肽基肽酶IV酶活性的抑制作用
表二、穗花杉双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性的抑制作用
由表一的结果可以得出，阳性抑制剂Ile-Pro-Ile对二肽基肽酶IV酶活性的抑制的半数抑制浓度IC50为2.86μg/ml，对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性抑制的半数抑制浓度IC50为4.66μg/ml。
由表二的结果可以得出，穗花杉双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性的抑制的半数抑制浓度IC50为1.66μg/ml，对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性抑制的半数抑制浓度IC50为3.14μg/ml。
结论穗花杉双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性具有很强的抑制作用，且在自身水溶性不好的情况下比阳性抑制剂Ile-Pro-Ile抑制效果更强，对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性的抑制效果也比阳性抑制剂Ile-Pro-Ile好。
实施例2苏铁双黄酮对二肽基肽酶IV活性抑制实验 当R1＝4′，5，7-三羟基黄酮、R2＝CH3、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，通式I所示化合物为苏铁双黄酮，其对二肽基肽酶IV的酶抑制活性实验如下 实验材料苏铁双黄酮为黄色粉末，纯度大于98％，参照文献“徐亚明、方圣鼎、何其敏，陆均松中的化学成分，植物学报，1991，33(8)，646”的实验方法从陆均松中分离提取获得，其余试剂同实施例1。
实验方法同实施例1。
实验结果 表三、苏铁双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性的抑制作用
由表三的结果可以得出，苏铁双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性的抑制的半数抑制浓度IC50为2.58μg/ml，对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性抑制的半数抑制浓度IC50为2.95μg/ml。
结论苏铁双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性具有较强的抑制作用，对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性也有显著的抑制作用，且抑制效果比阳性抑制剂Ile-Pro-Ile更好。
实施例3橡胶树双黄酮对二肽基肽酶IV活性抑制实验 当R1＝4′，5-二羟基-7-甲氧基黄酮、R2＝CH3、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝CH3、R9＝H、R10＝H时，通式I所示化合物为橡胶树双黄酮，其对二肽基肽酶IV的酶抑制活性实验如下 实验材料橡胶树双黄酮为淡黄色粉末，纯度大于95％，参照文献“Lee，Shwu Woan；Chen，Zeng Tsi；Chen，Ming Tyan；Biflavones of Selaginelladoederlenii Hieron.Zhonghua Yaoxue Zazhi，1992，44(6)，537.”的实验方法从深绿卷柏中分离提取获得，其余试剂同实施例1。
实验方法同实施例1。
实验结果 表四、橡胶树双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性的抑制作用
由表四的结果可以得出，橡胶树双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性的抑制的半数抑制浓度IC50为2.50μg/ml，对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性抑制的半数抑制浓度IC50为2.67μg/ml。
结论橡胶树双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性具有较强的抑制作用，对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性也有显著的抑制作用，且抑制效果比阳性抑制剂Ile-Pro-Ile更好。
实施例4银杏双黄酮对二肽基肽酶IV活性抑制实验 当R1＝5-羟基-4′-甲氧基黄酮、R2＝OH、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，通式I所示化合物为银杏双黄酮，其对二肽基肽酶IV的酶抑制活性实验如下 实验材料银杏双黄酮为黄色粉末，纯度大于98％，参照文献“唐于平，楼凤昌，王景华，李延芳，银杏叶中黄酮类成分的研究，中国药学杂志，2001，36(4)，231”的实验方法从银杏叶中分离提取获得，其余试剂同实施例1。
实验方法同实施例1。
实验结果 表五、银杏双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性的抑制作用
由表五的结果可以得出，银杏双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性的抑制的半数抑制浓度IC50为2.52μg/ml，对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性抑制的半数抑制浓度IC50为3.05μg/ml。
结论银杏双黄酮对二肽基肽酶IV酶活性具有较强的抑制作用，对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性也有显著的抑制作用，且抑制效果比阳性抑制剂Ile-Pro-Ile更好。
实施例5罗波斯塔黄酮对二肽基肽酶IV活性抑制实验 当R1＝H、R2＝OH、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝5”，7”，4’”-三羟基黄酮、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，通式I所示化合物为罗波斯塔黄酮，其对二肽基肽酶IV的酶抑制活性实验如下 实验材料罗波斯塔黄酮为淡黄色粉末，纯度大于98％，参照文献“David E.Zembower and Heping Zhang，Total Synthesis of Robustaflavone，aPotential Anti-Hepatitis B Agent，J.Org.Chem.，1998，63(25)，9300”的方法制备获得，其余试剂同实施例1。
实验方法同实施例1。
实验结果 表六、罗波斯塔黄酮对二肽基肽酶IV酶活性的抑制作用
由表六的结果可以得出，罗波斯塔黄酮对二肽基肽酶IV酶活性的抑制的半数抑制浓度IC50为2.34μg/ml，对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性抑制的半数抑制浓度IC50为3.12μg/ml。
结论罗波斯塔黄酮对二肽基肽酶IV酶活性具有较强的抑制作用，对鼠肾匀浆中二肽基肽酶IV酶活性也有显著的抑制作用，且抑制效果比阳性抑制剂Ile-Pro-Ile更好。
权利要求
1、具有以下通式I结构的黄酮类化合物，包含其药学上可接受的盐及其立体异构体，在抑制二肽基肽酶IV活性中的应用，通式I
其中R1、R7代表含苯环的芳基部分，R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10代表H、OH、COOH、烷氧基部分。
2、根据权利要求1所述的通式I结构的黄酮类化合物在抑制二肽基肽酶IV活性中的应用，其特征在于R1＝4′，5，7-三羟基黄酮、R2＝OH、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，所述化合物为穗花杉双黄酮，具体结构式如下
3、根据权利要求1所述的通式I结构的黄酮类化合物在抑制二肽基肽酶IV活性中的应用，其特征在于R1＝4′，5，7-三羟基黄酮、R2＝CH3、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，所述化合物为苏铁双黄酮，具体结构式如下
4、根据权利要求1所述的通式I结构的黄酮类化合物在抑制二肽基肽酶IV活性中的应用，R1＝4′，5-二羟基-7-甲氧基黄酮、R2＝CH3、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝CH3、R9＝H、R10＝H时，所述化合物为橡胶树双黄酮，具体结构式如下
5、根据权利要求1所述的通式I结构的黄酮类化合物在抑制二肽基肽酶IV活性中的应用，R1＝5-羟基-4′-甲氧基黄酮、R2＝OH、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝H、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，所述化合物为银杏双黄酮，具体结构式如下
6、根据权利要求1所述的通式I结构的黄酮类化合物在抑制二肽基肽酶IV活性中的应用，R1＝H、R2＝OH、R3＝H、R4＝OH、R5＝H、R6＝H、R7＝5”，7”，4”’-三羟基黄酮、R8＝OH、R9＝H、R10＝H时，所述化合物为罗波斯塔黄酮，具体结构式如下
7、根据权利要求1所述的通式I结构的黄酮类化合物在抑制二肽基肽酶IV活性中的应用，其特征在于制备预防和治疗II型糖尿病药物中的应用。
8、一种含有权利要求1所述的通式I结构的黄酮类化合物的药物组合物，其特征在于含有药学上可接受的药用载体或药用辅料。
全文摘要
本发明涉及一类可作为二肽基肽酶IV抑制剂的黄酮类化合物，其在预防和治疗二肽基肽酶IV相关的疾病，特别是II型糖尿病中的用途，该黄酮类化合物具有以右通式I的结构，通式I中R1、R7代表含苯环的芳基部分，R2、R3、R4、R5、R6、R8、R9、R10代表H、OH、COOH、烷氧基部分。
文档编号A61P3/10GK101554374SQ200810054750
公开日2009年10月14日 申请日期2008年4月8日 优先权日2008年4月8日
发明者王金戌, 张福军, 乔 肖, 陈欣然, 杨汉煜, 刘翠艳, 严艳欣, 刘玉峰 申请人:石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司