专利名称：荞麦七新黄酮化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类具有自由基清除活性的新黄酮类化合物，具体地说是从翼
蓼根块荞麦七中提取的新黄酮类化合物，涉及含有荞麦七素A的提取物，本发 明的提取物和新的化合物具有清除自由基的用途。
背景技术：
黄酮类化合物存在于多种植物之中，其具有广泛的生物活性和重要的药用
价值，其主要表现在以下几个方面①对心血管系统疾病的治疗作用，如芦丁、 槲皮素、葛根素等黄酮类化合物具有明显的扩冠作用己在临床上被应用多年。 橙皮甙、香叶木甙等能降低血管脆性及异常的通透性，可用作防治高血压及动 脉硬化的辅助治疗剂。有些黄酮类化合物还具有明显的降低血脂和抑制血栓形 成的作用。②肝保护作用，从水飞蓟种子中得到的水飞蓟素，异水飞蓟素及次 水飞蓟素等黄酮类化合物，经动物实验和临床实践均证明其有很强的保肝作用。 (+)-儿茶素对脂肪肝及因半乳糖胺或CC14引起的中毒性肝损伤均显示有一定作 用。③抗炎作用，金荞麦中的双聚原矢车菊苷元有抗炎、祛痰、解热、抑制血 小板聚集和提高机体免疫力的作用，临床用于肺脓肿及其它感染性疾病。④清 除自由基、抗氧化作用，所有需氧生物的生理过程均会产生自由基，在人体内 当自由基的积聚量过大时，将会产生多种疾病。许多重大疾病与体内自由基的 产生与积累有非常明显的正相关性。药物对自由基的清除能力一般与其抗氧化 活性成正比。多数黄酮类化合物因具有多元酚结构单元，而使其有较强的抗氧
化和清除自由基的能力；并且黄酮类化合物分子中酚羟基数目越多，其对自由 基的清除能力和抗氧化活性亦越强，如芸香苷，槲皮素及异槲皮素等清除超氧 自由基和羟基自由基的作用都强于自由基清除剂生育酚和合成抗氧化剂2， 6-二 叔丁基对甲基苯酚(BHT);因这一特点黄酮类化合物已被用作自由基对DNA损 伤所致癌变的预防药剂和辅助治疗，也有黄酮类化合物作为紫外线对皮肤损伤 的防护剂。由于黄酮类化合物具有以上这些重要的生理活性，它们的研究与开 发已受到了广泛的关注[Saraf， Swamlata. et al. Pharmacognosy Reviews, 2007， 1(1), 30-40]。
荞麦七是蓼禾斗翼蓼属植物翼蓼(^raxygo"訓g/ra她'Damm.et Diels)的块，是太白山七药的一种，其入药能凉血、止血、祛湿解毒[李安仁等.中国植
物志(二十五巻第一分册).北京科学出版社，1998， pll7-118]。该植物为我国 特有单种属，有关其化学活性成分的研究处于空白。为了发现生物活性物质， 我们对荞麦七的有效化学成分进行了研究，从中发现了具有强清除自由基活性 的新黄酮类化合物。
本发明的目的在于通过对荞麦七有效化学成分的提取与分离，提供得到荞 麦七素A提取物粗品的方法，本发明还提供了荞麦七A提取物粗品，其中荞麦 七素A的含量为50%—95%，本发明提供了一类新的黄酮化合物荞麦七素A和 荞麦七素B，及这些化合物的制备方法，另一方面本发明涉及荞麦七素A提取物 粗品和新的黄酮化合物的用途，即可以作为自由基清除剂，更进一步地可以用 于预防和治疗如心血管疾病和癌症等与自由基有关的疾病。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案
本发明的新黄酮类化合物可用下述通式(I )表示
(I)
其中，当R产H，R2-(9-cc-L-吡喃阿拉伯糖基，R3二OH时，化合物为4',5,5，，7國 四羟基-3-甲氧基-3'-0-cc-L-吡喃阿拉伯糖基黄酮，即荞麦七素A，其结构为式l;
当R产OCH3， R2=H， R产0-^"D-卩比喃葡萄糖基时，化合物为5，5，,7-三羟基-2，,3-二甲氧基-4，-O^D-卩比喃葡萄糖基黄酮，即荞麦七素B，其结构为式2。<formula>formula see original document page 5</formula>
发明内容本发明还提供了通式(I )化合物的制备方法
将翼蓼根块荞麦七的干粉先用极性溶剂，例如95%乙醇或甲醇冷浸或回流 提取，合并浸提液或回流提取液并浓縮得到总浸膏，优选减压浓縮；总浸膏经 脱脂后再次萃取，脱脂剂和萃取的溶剂选自石油醚、乙醚、氯仿或乙酸乙酯中 的一种，萃取物用硅胶柱色谱分离，以不同比例的氯仿和甲醇的混合溶剂为流
动相进行梯度洗脱逐步提高甲醇的比例，收集氯仿:甲醇=7:3 (体积比)的洗脱 液，浓縮该部分，得到含有荞麦七素A和荞麦七素B的固体物质，称之为荞麦 七素A提取物粗品，其中提取物粗品中荞麦七素A的含量为5(m—95%，优选含 量70-95%。
用甲醇洗涤荞麦七素A提取物粗品后，剩余的固体物质干燥后得到荞麦七 素A，甲醇洗涤液浓縮后再经硅胶柱色谱分离，以不同比例的丙酮和石油醚的 混合物为流动相进行梯度洗脱，收集丙酮:石油醚=4:1 (体积比)部分的洗脱液， 浓縮该洗脱液并干燥得到荞麦七素B。
具体提取和得到通式(I )化合物的方法如下
将翼蓼根块荞麦七的干粉先用95%乙醇冷浸数天，过滤，将浸液合并，减 压浓縮得到总浸膏；总浸膏用水分散后，用石油醚萃取脱脂，剩下的部分用乙 酸乙酯再次萃取。乙酸乙酯萃取物经200-300目硅胶柱色谱分离，用氯仿和甲醇 的混合溶液为流动相进行梯度洗脱，收集氯仿:甲醇=7:3 (体积比)部分的洗脱 液，对此洗脱液减压浓縮得到提取物粗品，其中含有荞麦七素A为70y。一959L
将提取物粗品用甲醇洗涤，残余物干燥后得荞麦七素A，洗涤液浓縮后再 经硅胶柱色谱分离，用丙酮和石油醚的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，收集 丙酮:石油醚=4:1 (体积比)部分的洗脱液，对此洗脱液进行浓縮干燥得到荞麦 七素B。
式(I )化合物的结构通过包括H-H COSY、 HMQC、 HMBC、 NOESY 二维
核磁共振谱在内的现代波谱手段进行确定。
此外，本发明对式(I)化合物进行了清除自由基的活性试验。结果表明，本 发明的新黄酮类化合物具有自由基清除能力，而且与已知黄酮类自由基清除剂 芦丁、葛根素、大豆甙元和合成的抗氧化剂BHT相比，具有更强的自由基清除 能力。
本发明的荞麦七素A提取物粗品、新黄酮类化合物可以作为清除自由基的 抗氧化保健品的原料，也可以作为药物的活性成分，用于预防和治疗如心血管
6疾病或癌症等与自由基有关的疾病。
可以将提取粗品和新黄酮类化合物和药物载体混合制备成各种药物制剂形
式，药学可接受载体包括药学常规的填充剂、湿润剂、粘合剂、崩解剂、赋形
剂、抗氧剂、调味剂等。药物制剂形式包括片剂、胶囊剂、滴丸剂、微丸剂、
散剂、颗粒剂等其中优选片剂、胶囊剂。
附图为不同浓度的受试样品对 OH自由基的清除率。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不局限于下述 实施例。
本发明所用的荞麦七为蓼科翼蓼属植物翼蓼(户fera;9^0"ww gz'ra/而Damm.et Diels)的根块，从陕西太白山采集。其它所用化学试剂均为化学纯。化合物结构 确定所用的核磁共振仪为Bruker AVANCE 300超导核磁共振仪，TMS作为内标； 红外光谱采用Nicolet 170SX FT-IR红外光谱仪测定；质谱用Bruker Esquire 3000plus (德国Bruker公司)质谱仪测定；紫外光谱用TU-1901紫外-可见分光光 度计(北京普析通用仪器有限责任公司)测定；熔点采用X-6型显微熔点测定 仪测定(北京泰克仪器有限公司，温度未校正)。
实施例1
荞麦七素A提取物粗品的制备
取荞麦七干粉4500克用10升95%乙醇浸泡2天后过滤，滤渣再用同样方 法处理4次，合并各次滤液，减压浓縮后得到黑色浸膏。将此浸膏分散于水中， 用石油醚(b.p. 60-90°C)进行萃取脱脂3次，每次用石油醚2升。剩余物用乙 酸乙酯萃取3次，每次用2升乙酸乙酯，将萃取液合并后减压浓縮得到乙酸乙 酯萃取物71克。对乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱色谱(1.5kg， 200-300目)分离， 用氯仿与甲醇的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱(从100%氯仿到100%甲醇)，收 集氯仿:甲醇=7:3 (体积比)部分的洗脱物。对此洗脱物减压浓縮得到固体物质 2.34克，该固体物质为本发明的荞麦七素A提取物粗品，其中荞麦七素A的含 量为91%。
实施例2荞麦七素A的制备
将实施例1所得荞麦七素A提取物粗品2.34克用甲醇反复洗涤后，所得剩 余固体物干燥得淡黄色粉末2.13克，为荞麦七素A。
荞麦七素A: 4'，5， 5'，7 -四羟基-3-甲氧基-3'-0- 丄-吡喃阿拉伯糖基黄酮， 淡黄色粉末，m.p. 258-259 。C， ESI-MS m/z ([M-H]—): 463。
IRu(KBr/max) cm": 3539, 3394, 2924, 1659 (C=0)， 1614, 1562， 1514, 1447。
UV (MeOH) W 269， 359腦。
^誦NMR (300MHz，溶剂DMSO-d6) & 6'20(1H， d, ^L53Hz， 6-H), 6.42(1H， d， 《/=1.53Hz, 8國H), 7'33(1H, d， ^1.44Hz, 2，-H), 7.42(1H， d,卢1.44Hz， 6,誦H), 4'76(1H, d, ^7.23Hz， l"國H)， 3.24(1H, m, 2"-H), 3'30(1H， m, 3"國H), 3.32(1H: m, 4"邻，3.87(1H， m， 5"-HA)， 3.28(1H， m, 5"-HB), 3.81(3H， s, 3-OCH3)， 12.67(1H， s， 5-OH), 10.88(1H， s, 7-OH)， 9.46(1H， s, 3，画OH)， 9.01(1H， s， 5,-OH), 5.13, 5.17，5.57(共3个H，糖环羟基)。13C-NMR (300MHz,溶剂DMSO-&) & 155.5(2-C)， 138.4(3-C), 178.0(4-C), 161.2(5-C), 99.1(6-C)， 164.8(7-C), 94.0(8-C), 156.7(9-C)， 104.7(10陽C)， 120.2(1，隱C)， 139.1(2,-C)， 146.4(3，-C)， 111.0(4,-C)， 146.1(5，-C)， 109.1(6，-C)， 103.7(1,，國C)， 76.2(2"-C), 73.6(3"國C)， 69.9(4"-C)， 66.3(5"-C)，60.1(3-OCH3)。波谱数据表明荞麦七素A为式1所示结构。
实施例3
荞麦七素B的制备
实施例1所得荞麦七素A提取物粗品2.34克用甲醇洗涤分离出荞麦七素A 后，将甲醇洗涤液减压浓縮后得到的固体进行硅胶柱色谱(lOOg， 200-300目) 分离，用丙酮与石油醚的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱(从100%石油醚到 100%丙酮)，收集丙酮:石油醚=4:1 (体积比)部分的洗脱液，减压浓縮得淡黄 色粉末状荞麦七素B26毫克。
荞麦七素B: 5，5，,7-三羟基-2，,3-二甲氧基-4，-0-^D-吡喃葡萄糖基黄酮，淡 黄色粉末，m,p.250-252。C， ESI-MS m/z ([M-H]—): 507。
IRu(KBr/max) cm": 3364 (OH)， 2920 (-CH2)， 1655 (C-O), 1600, 1496。UV (MeOH) W 256, 360腦。
'H-NMR (300MHz,溶剂DMSO國4) & 6.20(1H， s, 6國H)， 6.33(1H， s, 8-H)， 6.99(1H， s， 3，醫H), 6.84(1H, s， 6，-H), 4.78(1H, d，声7.62Hz, 1"國H), 3.11(1H， m, 2"-H)， 3.17(1H, m， 3"國H), 3.07(1H， m， 4"-H), 3.22(1H, m， 5"-H)， 3.38(1H， m， 6"-HA)， 3.72(1H, m, 6，，-HB), 3.70(3H， s， 3-OCH3)， 3.84(3H， s, 2，-OCH3), 12.71(1H， s, 5國OH)， 10.78(1H, s, 7-OH)， 8,96(1H, s， 5'誦OH)， 4.65， 4.98(共4个H,糖环羟 基)。
13C-NMR (300MHz，溶剂DMSO誦&) & 156.5(2-C), 139.5(3-C)， 178.6(4-C)， 161.9(5陽C), 98.9(6画C)， 164.4(7-C)， 94.3(8國C), 157.6(9-C)， 105.4(10-C)， 111.9(1，-C), 150.7(2，-C)， 102.5(3，画C), 149.4(4,-C)， 141.4(5，誦C)， 116.5(6，-C)， 102.4(1"-C), 73.7(2，，陽C), 77.2(3，，國C)， 70.7(4，，誦C), 77.8(5，，誦C), 61.5(6"誦C), 60.5(3-OCH3)， 56.1(2，-OCH3)。波谱数据表明荞麦七素B为式2所示结构。
实施例4
清除，OH自由基活性试验
1、 受试化合物荞麦七素A、芦丁、大豆甙元、葛根素、BHT
2、 试验方法
按照文献[蒋林玲等.分析科学学报，2008， 24(2)， 212-214]方法，以褪色 光度法测定Fenton反应体系所产生的'OH自由基的量和受试样品对该体系所产 生-OH自由基的清除率，以评价受试样品清除。H自由基的活性。
2.1羟基自由基的测定
在5 mL比色管中加入pH 4.0的Tris-HCl缓冲溶液0.8 mL， 3.3 X 10'2 mmol/L 的Cy5溶液0.6mL， 1.0 mmol/L的FeSO4溶液0.4 mL，然后摇匀溶液，再加入0.01% 的H2CV溶液0.4mL，加二次水稀释至刻度，摇匀，放置7min后测定647nm处的 吸光度A;同时测定不加H202体系的吸光度Ao。则自由基的产生量为AA-Ao 一A，通过测定羟基自由基形成前后的吸光度变化AA来表示Fenton反应体系所产 生-OH自由基的量。
2.2羟自由基清除率的测定
9在上述Fenton反应体系中加入一定量的受试样品后再加蒸馏水至刻度，按 同样操作测定体系的吸光度As，则受试样品对。H自由基的清除率(S)按照下 列公式计算。
<formula>formula see original document page 10</formula>
3、试验结果
通过分别对受试样品荞麦七素A、芦丁、葛根素、大豆甙元、BHT—系列不 同浓度溶液对。H自由基的清除率测定，求出了表示受试样品对，OH自由基清除 能力大小的指标IC5o值(即50Q/。的。H自由基被清除时所需样品的量)。测试结果 附图和表l所示。
实验结果表明，荞麦七素A不仅具有自由基清除的能力，而且对'OH自由基 的清除能力明显强于其它受试的芦丁等样品。
表l受试样品对'OH自由基清除能力
受试样品荞麦七素 A芦丁BHT葛根素大豆甙元
IC50 (腿olAnL)23.732.142.243.870.权利要求
1、结构如通式(I)的化合物其中，当R1＝H，R2＝O-α-L-吡喃阿拉伯糖基，R3＝OH时，化合物为4’，5，5’，7-四羟基-3-甲氧基-3’-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基黄酮，即荞麦七素A，其结构为式1，当R1＝OCH3，R2＝H，R3＝O-β-D-吡喃葡萄糖基时，化合物为5，5’，7-三羟基-2’，3-二甲氧基-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖基黄酮，即荞麦七素B，其结构为式2，
2、 一种荞麦七素A提取物粗品，其中含有荞麦七素A 50%—95%。
3、 权利要求2的荞麦七素A提取物粗品，其中含有荞麦七素A 70%—95%。
4、 权利要求2的荞麦七素A提取物粗品的制备方法，将翼蓼根块荞麦七的 干粉先用极性溶剂浸提或回流提取，合并浸提液或回流提取液浓縮得到总浸膏； 总浸膏经脱脂后再次萃取；萃取物用硅胶柱色谱分离，以不同比例的氯仿和甲 醇的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，收集氯仿:甲醇=7:3 (体积比)部分的洗 脱液，浓縮得到含有荞麦七素A和荞麦七素B的固体物质，称之为荞麦七素A 提取物粗品。
5、 权利要求1化合物的制备方法，将翼蓼根块荞麦七的干粉先用极性溶剂 浸提或回流提取，合并浸提液或回流提取液并减压浓縮得到总浸膏；总浸膏经 脱脂后再次萃取；萃取物用硅胶柱色谱分离，以不同比例的氯仿和甲醇的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，收集氯仿:甲醇=7:3 (体积比)部分的洗脱液，浓 縮干燥得到荞麦七素A提取物粗品；用甲醇洗涤荞麦七素A提取物粗品后，剩 余的固体物质为荞麦七素A;甲醇洗涤液浓縮后再经硅胶柱色谱分离，以不同 比例的丙酮和石油醚的混合物为流动相进行梯度洗脱，收集丙酮:石油醚=4:1 (体积比)部分的洗脱液，浓縮、干燥得到荞麦七素B。
6、 权利要求4或5所述的制备方法，其中极性溶剂为95%乙醇或甲醇， 脱脂和再次萃取的溶剂选自石油醚、乙醚、氯仿或乙酸乙酯中的一种。
7、 权利要求4或5所述的制备方法，其中选用200—300目的硅胶柱进行色谱分离。
8、 权利要求1所述化合物和权利要求2或3所述荞麦七素A提取物粗品用 于制备预防或治疗与自由基有关的疾病的药物用途。
9、 权利要求8的用途，其中的疾病为心血管疾病或癌症。
全文摘要
本发明提供了含有结构为式(I)的荞麦七提取物，提供了结构为式(I)的新黄酮类化合物，及含有式(I)化合物的提取物，提供了新黄酮类化合物的制备方法和它们治疗和自由基有关疾病的医药用途。
文档编号A61P9/00GK101591368SQ20081012364
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月28日 优先权日2008年5月28日
发明者张喜全, 李宝林, 杨战军, 蒋林玲, 顾红梅 申请人:陕西师范大学;江苏正大天晴药业股份有限公司