专利名称：文蛤活性多肽在制备抗肺癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种文蛤活性多肽，尤其是涉及一种文蛤活性多肽在制备抗肺癌药物中的应用。
背景技术：
应用促进细胞凋亡的方法将是肿瘤治疗的主要途径之一。因此，寻找能有效诱导凋亡或 损伤癌细胞的药物成为现今研究的热点。另一方面，细胞持续分裂和不断增殖是癌细胞的重 要特征，考察对癌细胞增殖活动的抑制作用是鉴定外源性物质抗肿瘤作用的一项主要指标。 文蛤不仅肉质鲜美，营养丰富，而且具有极高的药用价值[丁源，丁伟，张吉德.我国药用海 产贝类名录及其应用[J].海洋药物，1984， 3: 34]。
近代研究表明文蛤有清热利湿、.化痰、散结功效，对肝癌、肺癌、胃癌等有明显的抑 制作用。对小鼠肉瘤S-180的抑制率仅为30Q/。[上海医药工业研究院，中国人民解放军海军后 勤卫生部编.中国药用海洋生物[M].上海人民出版社，1977， 76-77]，对肝癌腹水型和肝癌 实体型的抑制率在40%至50%[中国药用动物志协作组.中国药用动物志[M].天津科学技术 出版社，1997， 36-37]。同时，文蛤提取物对小鼠的体液免疫和细胞免疫具有明显的增强作 用，而且使用剂量较大时能够促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能[何雅军，吴谦，朱瑞斐.文蛤 多糖抗癌免疫药理作用的研究[J].中国海洋药物，1995， 3: 20-21]。 Schmeer首先报道指出， 普通可食蛤、圆蛤及其他贝类中既含有肿瘤抑制因子，通过适当提取方法，得到肿瘤抑制因 子，对小鼠S-180肉瘤有显著的抑制作用，并且对小鼠无毒性。他将这一活性物质称为"蛤素" (Mercenene) [Schmeer MR. Growth-inhibiting agents from mercenaria extracts: chemical and biological properties[J]. Science, 1964， 144: 413-414]。 Stavinski等人于1982年从蛤肝中提 取到一种分子量为76.0 kD的蛋白质，发现该蛋白肿瘤抑制作用，指出文蛤中的抗癌因子并 不全由小分子物质组成 [Stavinski SS. Isolation and characterization of the water soluble antineoplastic principles of the common quahog， Mercenaria Mercenaria[J]. UMI Proquest Digital Dissertations, 1982: 163-164]。
本申请人已经从文蛤中提取得到分子量为3144.7 dalton的文蛤活性多肽[Bo Leng， Xiao-Dan Liu, Qing-Xi Chen. Inhibitory effect of anticancer peptide from Mercenaria on the
3BGC-823 cells and several enzymes [J]. FEBS letters, 2005， 579: 1187-1190]，并对该多肽的性质 进行了研究。但是，文蛤多肽对肺癌细胞A549的作用研究至今未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种文蛤活性多肽在制备抗肺癌药物中的应用。
本发明采用MTT法和细胞计数法，实验结果显示，文蛤多肽对肺癌细胞A549具有特异
的诱导杀死效应，对肺癌细胞A549有明显的抑制作用，由此可见，文蛤活性多肽可用于制
备抗肺癌药物。
图1为文蛤活性多肽对肺癌细胞A549的抑制效应。在图1中，横坐标为文蛤活性多肽 浓度Peptide concentration (pg/mL)，纵坐标为抑制率Inhibitory late (%);文蛤活性多肽作 用肺癌细胞的时间分别为a为24h， b为48h， c为72h。
图2为文蛤活性多肽对肺癌细胞A549生长的影响。在图2中，横坐标为处理时间Time (d)，纵坐标为活细胞数Cell number (104/mL); A为对照组，B为文蛤活性多肽(mer2)。
图3为文蛤活性多肽对肺癌A549形态的影响(48 h,X 100)。在图3中，A为对照组，B 为经文蛤多肽处理组(30ng/mL)。
图4为文蛤活性多肽对肺癌细胞A549核染色质形态学变化的影响(48 h，X400)。在图4 中，A为对照组，B为经文蛤多肽处理组(30ng/mL)。
图5为文蛤活性多肽对对肺癌细胞A549细胞周期的影响。在图5中，A为对照组，B为 经文蛤多肽处理组(30pg/mL);横坐标为荧光强度P1 (道数)，纵坐标为细胞数Count (个)； 细胞周期分别为G， H， I， J。
具体实施例方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。 本发明所述的文蛤活性多肽可采用以下的分离纯化方法
1) 将新鲜文蛤冰冻2h，冰冻温度可为一20'C，取出蛤肉，加入水，按质量比，蛤肉 水为l:l，于高速组织捣碎机匀浆3次，每次30s，获得匀浆液。
2) 15000gX30min离心得上清，20%硫酸铵盐析后4。C过夜，15000gX30min离心取上 清，获得第一次提取物。
3) 加入4倍体积乙醇抽提过夜，15000gX30min离心得上清，获得第二次提取物。
4) 40'C旋转蒸发去除第二次提取物中乙醇后，冷冻干燥浓缩成干粉，制备成初提物备用。
5) 初提物按0.5%的浓度用蒸馏水溶解，用0.45^un膜过滤去除杂质和不溶物，所得溶液以蒸馏水为流动相，以280nm为检测波长，在SephadexG-25分子筛上进行柱层析，所收集 得到的各蛋白吸收峰用MTT法验证抗癌活性；收集第二峰物质，冷冻干燥浓縮成干粉即为文 蛤活性多肽，并命名为mer2。
本发明采用MTT法和细胞计数法分别研究了文蛤活性多肽对肺癌细胞A549的抑制作 用。结果显示，文蛤活性多肽对肺癌细胞A549有明显的抑制作用，处理72h， 30 Mg/mL文 蛤活性多肽可以使肺癌细胞A549的抑制50%，而浓度达50 ng/mL可使肺癌细胞死亡率达 92%，(见图1)，显示该文蛤多肽对肺癌细胞有极强的杀死作用。通过光学显微镜、Hoechst 染色和流式细胞技术等方法，可研究文蛤多肽对体外培养的肺癌A549细胞的细胞形态、细 胞周期的影响。图2给出文蛤活性多肽对肺癌细胞A549生长的影响。结果表明文蛤多肽 处理后的细胞外形变化明显，细胞体积变小，细胞群体数量显著稀疏，贴壁细胞数量减少， 出现皱縮、变圆、脱落(见图3) 。 Hoechst染色结果表明经文蛤多肽处理的细胞其细胞核呈 致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白，出现凋亡表现(见图4)。细胞周期的检测 结果也说明，经该多肽处理的肺癌A549细胞周期发生明显变化，出现明显的凋亡峰，但细 胞周期未出现明显阻滞现象(见图5)。表明文蛤多肽对癌细胞的生长抑制作用与细胞凋亡 有关。这些结果充分说明，文蛤抗癌活性多肽能有效抑制肺癌细胞A549的生长，并能改变 肺癌细胞A549形态学特征。表明该多肽具有良好的抗肺癌药物开发前景。
权利要求
1. 文蛤活性多肽的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤1)将新鲜文蛤冰冻2h，冰冻温度为—20℃，取出蛤肉，加入水，按质量比，蛤肉∶水为1∶1，于高速组织捣碎机匀浆3次，每次30s，获得匀浆液；2)15000g×30min离心得上清，20％硫酸铵盐析后4℃过夜，15000g×30min离心取上清，获得第一次提取物；3)加入4倍体积乙醇抽提过夜，15000g×30min离心得上清，获得第二次提取物；4)40℃旋转蒸发去除第二次提取物中乙醇后，冷冻干燥浓缩成干粉，制备成初提物备用；5)初提物按0. 5％的浓度用蒸馏水溶解，用0.45μm膜过滤去除杂质和不溶物，所得溶液以蒸馏水为流动相，以280nm为检测波长，在SephadexG-25分子筛上进行柱层析，所收集得到的各蛋白吸收峰用MTT法验证抗癌活性；收集第二峰物质，冷冻干燥浓缩成干粉即为文蛤活性多肽。
2. 如权利要求1所述的分离纯化方法所制备的文蛤活性多肽在制备抗肺癌药物中的应用。
全文摘要
文蛤活性多肽在制备抗肺癌药物中的应用，涉及一种文蛤活性多肽，尤其是涉及一种文蛤活性多肽在制备抗肺癌药物中的应用。提供一种文蛤活性多肽在制备抗肺癌药物中的应用。采用MTT法和细胞计数法，实验结果显示，文蛤多肽对肺癌细胞A549具有特异的诱导杀死效应，对肺癌细胞A549有明显的抑制作用，由此可见，文蛤活性多肽可用于制备抗肺癌药物。
文档编号A61K38/17GK101496817SQ200810189188
公开日2009年8月5日 申请日期2008年12月30日 优先权日2008年12月30日
发明者康劲翮, 陈清西 申请人:厦门大学