8-取代二氢苯并[c]菲啶类生物碱在制备抗耐药菌药物中的新用途的制作方法

专利名称：：8-取代二氢苯并[c]菲啶类生物碱在制备抗耐药菌药物中的新用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及8-取代二氢苯并[C]菲啶类生物碱在制备抗耐药菌药物中的新用途。
背景技术：
：细菌耐药性的出现和传播严重影响人类健康事业的发展。随着抗生素的广泛应用，越来越多的细菌对常用抗生素产生耐药性，且耐药程度日益加重。细菌耐药性常使治疗无效，感染加重，甚至死亡。同时，无效治疗也使医疗费用增加，其中包括患者的频繁入院和住院期的延长，从而加重患者和社会的负担。自1961年Jevons在英国首次发现第一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus,MRSA)以来，国内夕卜临床分离MRSA阳性率越来越高，最高达到80%。MRSA对多种抗生素耐药，致病力强且治疗效果差，是引起医源性感染的主要病菌之一，其首选抗菌药是万古霉素。产超广谱e-内酰胺酶(extended-spectrumP-Lactamases,ESBLs)耐药菌的出现，是第三代头孢菌素应用的产物。1983年，德国的Knothe等首次报道ESBLs后，其临床检出率及耐药程度也在加重，其产生菌(主要是肠杆菌属中的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，尤以前者为主)引起的感染已成为医学界关注的另一治疗难点，引起国内外的高度重视，碳青霉烯类抗生素包括亚胺培南和美洛培南等首选治疗药的耐药性也在不断出现。同时，因广谱抗生素的使用等因素也造成临床深部病原真菌耐酮康唑、氟康唑感染分离株增多。近年来，植物药单体成分对耐药菌的作用逐渐得到关注，但是迄今对耐药菌特别是产ESBLs和真菌效果较满意的有效植物成分的报告极为有限。我们针对临床上国内外耐药菌感染的现状，致力于从中草药中筛选对耐药菌有效的、具有新抗菌谱和作用机制的抗菌药，重点对其中的生物碱类的作用进行了系统筛选和深入^f究，从白屈菜中发现了含有异喹啉核类的生物碱特别是苯并[C]菲啶和原托品类生物碱对前述病原体显示较强抑制活性。白屈菜(ChelidoniummajorL.)为罂粟科(Papaveraceae)白屈菜属植物，全草入药，味苦、性凉、有毒。其主要有效成分是具有显著生理活性的多种异喹啉生物碱，包括苯并菲啶型、原小檗碱型、原托品型和阿朴菲型等。前人关于含有苯并[C]菲啶类和原托品类的生物碱及其衍生物的制备和抗菌作用研究，主要是抗标准菌作用，如白屈菜总碱在体外可抑制革兰阳性菌、结核杆菌及真菌等。原鸦片碱、血根碱及白屈菜红碱对抗炭疸杆菌、葡萄球菌特别有效，另外，白屈菜提取物还具有抗病毒作用，如对腺病毒、单纯性疱疹病毒、病毒性脑炎、病毒性心肌炎等均有作用，白屈菜中苯并菲啶季铵碱抗炎作用强，毒性低，适用于治疗口腔炎症(牛长群，何丽一，中国药学杂志，1994，29，138;ArnoldB.77w^/to/o/AC/ew/欲y"wc/Ptomaco/ogy，Vol.26.NewYork:AcademicPressInc.1985:185)。发明人检索到如下四项专利文献1，CN1061964A，苯并[C]菲啶鎿衍生物的制备方述方法制备的化合物；专利文献2，CN1238772A，新颖的菲啶鐺衍生物；专利文献3，CN1204321A(W097/16483)，菲啶衍生物和其制备方法及含有菲啶衍生物的药物；专利文献4，WO97/41890,包含苯并菲啶类生物碱的杀虫剂。以上涉及苯并[C]菲啶类衍生物的制备和应用研究的文献，限于抗肿瘤、抗血小板聚集、抗心律失常和杀虫作用；虽然也提到过抗细菌、真菌和抗病毒作用，但是没有文献提示8-取代二氢苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物对MRSA、产ESBLs耐药菌及耐药真菌的作用。纵观国内外的报道，也没有一项特指本发明所涉及的苯并[C]菲啶类生物碱的抗耐药菌作用。本发明人已经申请了含有异喹啉核类生物碱的抗耐药菌和乙肝病毒新用途三项专利，即原小檗碱(protoberberine)类生物碱在制备抗耐药菌药物中的用途(公开号CN101129364)、苯并[C]菲啶和原托品类生物碱在制备抗耐药菌药物中的新用途(公开号CN101195627)和含有苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物的医药新用途(公开号CN101084906)，其中，第三项涉及该类生物碱在制备抗乙肝病毒药物方面的应用。作为我们抗耐药菌药物研究工作的继续和公开号CN101195627的补充，本发明人在此进一歩提供8-取代二氢苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物在制备抗耐药菌药物中的新用途。
发明内容针对临床上国外和我国慢性耐药菌感染的实际，本发明重点对传统中草药中的生物碱类的作用进行了系统筛选和深入研究，提出了一种具有通式I[(DHBP)XR^]和II[(DHBP)2X]的8-取代苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物在制备抗耐药菌药物中的新用途，通式I为化合物的单体，II为二聚合物，DHBP为二氢苯并[C]菲啶基(dihydrobenzo[C]phenanthridinyl)，(DHBP)XRI2=<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中X=0或NH;R,至R,o、Ru至R,5为氢、羟基、具有112个碳原子的链或环烷基、垸氧基或酰氧基、苄氧基、氯及其他卤素原子、氨基、羟甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和一OCONH2，Ru为氢或甲基或氧原子，N为叔氮原子形式。所述的单体、二聚合物和含有这些单体、二聚合物的组合物以及药物上可接受的盐类或载体组合物作为制备抗耐药菌药物中的应用。所述的R5与或Rl5形成双键；R12与Rn及C8形成三元环结构。所述通式中的N原子呈叔氮原子形式；通式中R！至Rn)相邻碳上取代基为二噁茂结构；通式中Rl4与R15形成双键；通式中R5与&各自独立地为羟基或羰基。所述组成二聚合物的单体可以不相同。所述药物上可接受的载体选自以下的至少一种赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、包衣剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、稳定剂、吸收剂、注射用水和等渗剂。所述组合物制成口服给药形式或注射给药形式。本发明提供的生物碱类化合物对MRSA、产ESBLs和深部真菌等耐药菌显示较强抑制及杀灭活性。其中作为制备有效成分的化合物1至6的原料在植物中有广泛分布，主要存在于罂粟科和芸香科等植物的白屈菜属(Chelidonium)、紫堇属(Corydalis)、博落回属(Macleaya)飞龙掌血属(Toddalia)、崖椒属(Fagara)和花椒属(Zanthoxylum)等多属植物中，常见如白屈菜(Chelidoniummajus)，岩黄连(Corydalissaxicola)，博落回(Macleayacordata)，飞龙掌血(Toddaliaasiatica)等，已经公开发表在以下参考文献中宗永立等，时珍国医国药，2006，17，2068;SlavikJ.etal.，CollectionCzechoslov.Chem.Coi飄un.，1965，30，3697;1968，33，635;1977，42，2686;[3]PaulJ.Scheuer，etal.，J.Nat.Prod.，1962，42，1472;Tanahashi，T.etal.，J.Nat.Prod.，1990，53，579;李定祥等，中国天然药物，2004，2，285;ChoK.M"etal.,Biol.Pharm.Bull.2006,29，2317;DostalJ.,etal.,J.Nat.Prod.1995,58，723;DostalJ"etal"J.NatProd.1996,59，599。但是，没有文献提示这些基于8-取代二氢苯并苯[C]菲啶类生物碱及其衍生物的化合物具有抗耐药菌作用。图1是本发明中自白屈菜全草醇提取物中分离单体生物碱8-羟基二氢血根碱(化合物l)和8-羟基二氢白屈菜红碱(化合物2)的提取分离流程图。图2是用于本发明中8-取代二氢苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物16的化学结构说明图。这些生物碱及其衍生物可以从市场购到或/和按文献[l8]提示的方法制备。具体实施例方式现在将更详细地通过以下实施例描述本发明中制备8-取代苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物的方法及其药理作用。但是，这些实施仅以例示方式提供，而不起限定作用。实施例l:从白屈菜中提取分离单体生物碱8-羟基二氢血根碱(化合物l)和8-羟基二氢白屈菜碱(化合物2)。取白屈菜(Chelidoniummajus)全草粗粉(5kg)用80%乙醇回流提取三次，合并提取液，减压回收乙醇，得浸膏300g，反复用乙酸乙酯超声分散、抽提3次，滤取提取液、合并，回收溶剂得乙酸乙酯抽提物50g，上200-300目硅胶柱用石油醚乙酸乙酯(10:1~5:1)梯度洗脱，合并薄层谱相同的色谱段，其中石油醚乙酸乙酯(5:1)洗脱段得5.2g，继续用硅胶H进行反复真空柱层析，石油醚乙酸乙酯(25:1)分离得化合物l(0.73g)和化合物2(1.86g)。实施例2:从季钹型苯并[C]菲啶类生物碱转化为双(8-(7,8-二氢苯并[C]菲啶基》醚(化合物3和化合物4)。双[8-(7，8-二氢血根基)]醚《Bis[6-(5,6-dihydrosanguinarinyl)]Ethe^(化合物3):将氯化血根碱(Sanguinarinechloride)(160mg)溶于水，用饱和碳酸钠将此水溶液碱化使析出沉淀，然后将沉淀用乙醚萃取。醚层浓縮、室温静置6小时后有无色结晶析出，滤取结晶，真空干燥得化合物3(50mg)。在上述操作中，将氯化血根碱换为氯化白屈菜红碱(Chelerythrinechloride),同法处理得双[8-(7,8-二氢白屈菜红碱基)]醚(Bis[6-(5，6-dihydrochelerythrinyl)]Ether》(化合物4)。实施例3:从季铵型苯并[C]菲啶类生物碱转化为双(8-(7,8-二氢苯并[C]菲啶基)胺(化合物5和化合物6)。双[8-(7,8-二氢血根碱基)胺(Bis[6-(5，6-dihydrosanguinariny1)]Amine}(化合物5):将氯化血根碱(Sanguinarinechloride)(1,250mg)溶于水，用浓氨水将此水溶液碱化使析出沉淀，然后将沉淀用乙醚萃取。醚层浓縮、室温静置2天后有无色结晶析出，滤取结晶，真空干燥得化合物5(130mg)。在上述操作中，将氯化血根碱换为氯化白屈菜红碱(Chelerythrinechloride),同法处理得双[8-(7,8-二氢白屈菜红碱基)]月安{Bis[6-(5,6-dihydrochelerythrinyl)]Amine}(化合物6)。实施例4:部分单体化合物的理化和波谱数据。化合物l:C20H15NO5,白色无定形固体.[a]D-2.5。(c=0.15,MeOH),IR(KBr)v匪cm一'3434,2922，2852,1647,1462，1273，1238,1038.'H-觀R(500MHz，CDC13)《7.76(1H，(!，/=8.6,H國6),7.68(1H，s,H-l)，7.48(1H，d,J=8.6,H-5),7.42(1H,d,/=8.2，H-12),7.12(1H，s,H-4)，6.96(1H，(!，/=8.2，H-l1),6.12(1H,d,J=1.6,-OCH20—)，6.05(1H,d，J=1.6,—OCH20-)，6.07(2H，(!，/=1.5,-OCH20-),5.38(1H,s,H-8),2.79(3H，s，-NCH3)，13CNMR(125MHz，CDC13)《148.2(C-2)，147.4(C-3),147.3(C-10)，145.5(C扁9)，138.2(C-14),131.2(C-4a),126.9(C-14a)，125.8(C-12a),123.8(C-5)，122.9(C曙13),120.2(C-6),116.4(C-12),113.1(C-8a),109.6(C-ll),104.7(C-4),101.8(—OCH20-)，101.0(—OCH20—)，100,6(C-l),86.0(C-8),40.9(—NCH3)，ESI陽MS:350[M+H]+。化合物2:C21H19N05，白色无定形固体.[(x]d+8.5°(c=0.1,MeOH)，'H-NMR(500MHz，CDC13)《7.80(1H,(!，/=8.6,H-6)，7.69(1H,s,H-5),7.68(1H,8.6,H-12)，7.50(1H,d，/=8.6,H-5),7.16(1H,s,H-4),7.10(1H，d,/=8.6,H-ll),6.08(2H,1.6，—OCH20—),5.58(1H,s,H-8),3.98(3H，s,—OMe),3.96(3H,s,OMe)，2.78(3H,s，NCH3)，13CNMR(125MHz,CDC13)5:152.8(C-10),148.4(C陽2),147.7(C陽3),146.8(C-9),138.6(C-14),131.4(C陽4a),27.1(C-14a)，125.4(C-8a),125.2(C-12a),123.9(C-5),122.8(C-13)，120.1(C-6),119.4(C-12)，113.6(C-ll),104.9(C-4),101.4(-OCH20_)，100.8(C-l)，86.7(C-8),61.9(-OMe),56.2(-OMe),40.8(-NCH3),ESI-MS:m/z366[M+H]+。化合物3:mp257-259。C;IR(KBr)v,2958,2888,1648,1610，1471,1368，1307,1264,1252,1240，1193,1156，1124，1102,1059,1042,994，938,900cm-1;'H-NMR(500MHz,CDC13)5.7.94(1H,s,H-1,l'),7.13(IH,s，H隱4，4')，7.44(IH,d,/=8.5,H-5,5'),7.65(IH，d,J=8.5,H-6，6')，6.35(IH,s，8，8')，6.71(IH，8.0，H國ll,11'),7.23(IH,(!，/=8.0,H-12,12')，6.08(1H，d乂二1.2,H-OCH20),6.11(IH,(!，■/=1.2,H-OCH20)，5.16(IH,(!，/=1.2,H-OCH20),5.66(IH，d，■/=1.2，H-OCH20)，2.99(2X3H,s,H-NMe，N'Me);ESI-MS:附/z681[M+1]+。化合物5:mp264-266°C;IR(KBr)vmax3370(w，NH),2964,2894,1648,1610,1498,1467:1415,1361,1289，1247，1228,1186,1155,1124，1100,1091,1034，938,900cm—1;'H-NMR(500MHz,CDC13)《'7.96(IH，s，H-1,l')，7.14(1H，s,H-4,4'),7.43(IH,d,/=8.5,H-5，5'),7.65(IH,(!，/=8.5,H-6,6'),6.33(IH，s,8,8'),6.72(IH,(1,7=8.2，H-ll,11'),7.24(IH，br.s,H-12,12'),6.08(IH,br.s，H-OCH20)，6.12(IH,br.s,H-OCH20),5.17(IH,br.s,H-OCH20)，5.66(IH，br.s,H-OCH20)，2.98(2X3H,s，H-NMe,N'Me);ESI-MS:m/z680[M+l]+。实施例5:用作药敏试验的临床耐药菌株的筛选1.试验材料抗菌素药敏纸片(中国药品生物制品检定所)，M-H琼脂、沙保罗琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)。2.标本来源从我院临床患者感染性痰液样品中分离筛选细菌和真菌标本，冰箱-2(TC下保存备用。3.菌株鉴定依据《全国临床检验操作规程》及本领域技术人员公知的细菌和真菌鉴别方法对上述标本进行分离培养和菌种确认，并按公知的抗菌素药敏常规测试方法(K-B纸片法)，参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2007年标准进行耐药菌MRSA鉴定，以头孢西丁纸片法检测标本的抑菌圈Sl9mm视为耐药SA菌株(MRSA)。产ESBLs菌株的鉴定严格按标准采用双纸片法进行(赵建平等，中华医学检验杂志，2002，25，112)。耐氟康唑(FLC)真菌的判别标准参照文献(周汛等，重庆医科大学学报，2007，32，425)。实施例6:化合物1和2对耐药菌株的抗菌活性测定1.试验材料培养基MH和沙保罗肉汤(杭州天和微生物试剂有限公司)；受试药化合物1和2样品(由白屈菜中提取分离得到)；溶剂DMSO(分析纯)，蒸馏水；标准菌金黄色葡萄球菌(MSSA)ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、白色念珠菌ATCC10231(中国药品生物制品检定所)；耐药菌MRSA(20株)，产ESBLs大肠埃希菌(18)、肺炎克雷伯菌(12株)；氟康唑(FLC)耐药菌(FLC-R，5株)，氟康唑剂量依赖敏感菌(FLC-SDD，6株)和氟康唑敏感菌(FLC-S，2株)；对照药万古霉素、亚胺培南、氟康唑。2.药液制备用电子分析天平称取各受试药品，以无菌DMSO配成二倍梯度稀释溶液作为原药溶液。3.菌液的制备用接种环把菌株接种在相应的琼脂平板上，置于35。C恒温箱中培养24h，再用接种环把菌株转移至试管中，用无菌生理盐水配成106CFU/ml作测定MIC用。4.测定药物抑制细菌和真菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC,MFC)采用公知的二倍稀释法，取10支无菌试管编号并置于试管架上，在每支试管中加入lmlMH肉汤培养基，取原药液lml与第一支试管摇匀，继而吸取lml加入第二支试管中，依次类推稀释至第十管，弃去lml，除第十管不加菌液外，其余都加O.lml稀释为1(^CFU/ml菌液摇匀，置培养箱中于35'C培养24小时，按本领域技术人员公知方法进行受试药物活性评价，具体测定结果如表13所示。表1.化合物1和2对标准和耐药金黄色葡萄球菌的MIC和MBC()ag/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>MSSA:标准金黄色葡萄球菌；MRSA:耐药金黄色葡萄球菌。表2.化合物1和2对产ESBLs耐药菌和标准大肠埃希菌的MIC和MBCMIC(|ag/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>a￡c-MDR:耐药大肠埃希菌(五.co//);bii:;-MDR:耐药肺炎克雷伯菌(K.p股w附o"/m);^Ec:标准大肠埃希菌(ATCC25922)。表3.化合物1和2对氟康唑敏感和耐药白色念珠菌的MIC和MFC<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>aC.a:白色念珠菌(Cam//^a/Wcara);bNA:无活性(MIC〉64jag/ml);eStandardC.a:白色念珠菌ATCC90028。权利要求1、具有通式I[(DHBP)XR12]和II[(DHBP)2X]的8-取代苯并[C]菲啶类生物碱及其衍生物在制备抗耐药菌药物中的新用途，通式I为化合物的单体，II为化合物的二聚合物，DHBP为二氢苯并[C]菲啶基(dihydrobenzo[C]phenanthridinyl)，(DHBP)XR12＝其中X＝O或NH；R1至R10、R12至R15为氢、羟基、具有1～12个碳原子的链或环烷基、烷氧基或酰氧基、苄氧基、氯及其他卤素原子、氨基、羟甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和—OCONH2，R11为氢或甲基或氧原子，N原子为叔氮形式。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的单体、二聚合物和含有这些单体、二聚合物的组合物以及药物上可接受的盐类或载体组合物作为制备抗耐药菌药物中的应用。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于R5与R6或Ri5形成双键。4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于R,2与Ru及Cs形成三元环结构。5.根据权利要求l所述的用途，其特征在于通式中R,至Rm相邻碳上取代基为二噁茂结构。6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于通式中Rw与Ru形成双键。7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于通式中R5与R6各自独立地为羟基或羰基。8.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于组成二聚合物的单体可以不相同。9.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于所述药物上可接受的载体选自以下的至少一种赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、包衣剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、稳定剂、吸收剂、注射用水和等渗剂。10.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述组合物制成口服给药形式或注射给药形式。全文摘要一种具有通式I[(DHBP)XR₁₂]和II[(DHBP)₂X]的8-取代二氢苯并[C]菲啶类生物碱在制备抗耐药菌药物中的新用途，通式I为化合物的单体，II为化合物的二聚合物，DHBP为二氢苯并[C]菲啶基(dihydrobenzo[C]phenanthridinyl)，(DHBP)XR₁₂如图，其中X＝O或NH；R₁至R₁₀、R₁₂至R₁₅为氢、羟基、具有1～12个碳原子的链或环烷基、烷氧基或酰氧基、苄氧基、氯及其他卤素原子、氨基、羟甲基、醛基、羰基、丙酮基、羧基、磺酰氧基、4-甲基-苯磺酰氧基、芳基磺酰氧基、二苯基膦酰氧基和-OCONH₂，R₁₁为氢或甲基或氧原子，N原子为叔氮形式；这些生物碱类化合物对MRSA、产ESBLs和深部真菌等耐药菌显示较强抑制及杀灭活性。文档编号A61K31/4738GK101428026SQ20081023355公开日2009年5月13日申请日期2008年11月10日优先权日2008年11月10日发明者冰唐,孟凡堰,尹玉琴,左国营,青张,张云玲,帆徐,徐贵丽,王根春,赵益斌,锁高申请人:成都军区昆明总医院