专利名称：用于Artemin及相关配体的多肽和多核苷酸,及其使用方法
技术领域：
本发明涉及用于Artemin(ARTN)和Persephin(PSPN)的多肽、多核苷酸和抗体。本 发明也涉及生产这些多肽、多核苷酸或抗体的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及使用所 公开的多肽、多核苷酸、抗体、表达载体、宿主细胞中的一种或多种或其组合物来诊断和治 疗尤其是癌症，并且特别是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌以及其 它癌症的方法。本发明尤其涉及Artemin和/或相关配体的抑制物，以及这些抑制物的用 途。
背景技术：
不受控的无贴壁依赖性细胞生长是癌症的标志，而转移是癌症相关的死亡的原 因。目前在寻找可以用于靶向参与细胞增殖和迁移/侵袭的特异途径的新药。这提供了对 于癌症治疗的替代策略，该策略相比于传统方法如辐射、化疗和性激素疗法而言毒性较小 而耐受性高。众所周知传统化疗剂对于健康细胞以及癌细胞都有毒性。此外，长时期暴露 于化疗导致耐药细胞的选择。示例性的靶向特异信号分子的抗癌剂包括Tykerb (拉帕替尼)和 Herceptin (曲妥珠单抗)。Tykerb 是由GiaxoSmithKiine针对诸如乳腺癌和肺癌 的实体瘤的治疗而开发的用于表皮生长因子受体(EGFR)和人表皮生长因子受体2(HER-2) 的双重酪氨酸激酶抑制物。Hercept in 是设计用于靶向并阻断HER2功能的人化单克 隆抗体。有越来越多针对于EGFR和HER2受体的化合物进入了临床开发并且目前在临床试 验。神经胶质细胞系源性神经营养因子(⑶NF)是转化生长因子β超家族的远 缘成员以及⑶NF家族配体(GFL)的起始成员。这一家族由四种成员组成，即⑶NF、 Neurturin (NRTN)、Artemin (ARTN)和Pers印hin (PSPN)，它们全都是有效的神经营养因 子(参见例如 Airaksinen，Μ. S.和 Saarma，Μ. (2002) The GDNF family : signal ling， biological functions and therapeutic value. Nat. Rev. Neurosci. 3, 383-394)。GDNF家 族成员是包括信号肽的分泌蛋白。每种具有约140个氨基酸残基的成熟蛋白质序列，并且 包括7个保守的且间隔相似的半胱氨酸残基。该家族成员显示出相互之间约40%的氨基酸 同一性(Rosenblad 等人，2000 ；Takahashi，2001)。人们认为GDNF家族成员通过独特的多组分受体复合体传递信号，该复合体包括 糖基-磷脂酰肌醇(GPI)锚定的共受体(GFRa)作为配体结合组分以及RET受体酪氨酸激 酶作为共同信号组分(Takahashi，2001)。RET具有典型的细胞内激酶结构域，该结构域在 Ras/ERK-、PI3K/AKT-、p38/MAPK-和JNK-途径中与下游靶标相互作用来影响细胞生长、分 化、存活和凋亡(Baudet等人，2000 ;Coulpier等人，2002)。然而，其细胞外结构域与其它 受体酪氨酸激酶明显不同。RET包括四个对于RTK不常见的钙粘蛋白样结构域，和半胱氨酸 富集结构域(Santoro 等人，2004 ；Knowles 等人，2006)。与任何其它已知的受体酪氨酸激酶不同，RET不直接与其配体结合而需要细胞表面结合的GFRa作为共受体。共受体很重要地提供对于配体与受体复合体结合的 信号特异性。GDNF优选结合GFRa 1，NRTN结合GFRa 2，ARTN结合GFRa 3，PSPN结合 GFR a 4 (Airaksinen等人，2002)。然而，这些结合特异性并不是排他的。例如，⑶NF可以结 合GFRa 2和GFRa 3，但亲和性较低，并且可以激活RET。尚不清楚这一信号是否具有生理 重要性(Bespalov 等人，2007)。⑶NF家族成员在发育以及在成年期间在CNS的许多区域表达。已知它们有力地 促进多种类型的神经元的存活。最值得注意的是，它们能够支持多巴胺能神经元和运动神 经元的存活。这些神经元群体分别在帕金森病和肌萎缩侧索硬化症(ALS)病程中死亡。用 GDNF敲除小鼠的研究表明它们的主要作用在于肠神经系统的发育以及肾脏器官形成的调 控。人们认为⑶NF家族成员对于帕金森病(Gill等人，2003)、阿尔茨海默病(Garces 等人，2001 ；Golden等人，2003)以及ALS (Henderson等人，1994)的治疗具有临床重要性。 其它临床应用包括用作治疗酒精中毒(He等人，2005)、慢性疼痛(Gardell等人，2003)、中 风(Tomac等人，2002)、癫痫(Horger等人，1998)以及药物成瘾(Airavaara等人，2004)的 新型靶标。例如，⑶NF和Neurturin显示出对于帕金森疾病的临床试验的前景，而Artemin 目前正处于对于慢性疼痛治疗的临床试验中(Bespalov等人，2007)。近来，以证明了⑶NF 和Artemin影响具有胰腺炎和胰腺癌的患者的神经侵袭(Ito等人，2005 ；Ceyhan等人， 2006a ；Ceyhan 等人，2006b)。医学上长期需要新型疗法，包括新型抗癌剂。特别地，需要鉴定可以被靶向以抑制 癌细胞的特异基因和蛋白质。发明概述本发明基于这样的发现，即除了其它作用以外，细胞配体Artemin还作用于促进 癌细胞的无贴壁依赖性生长、集落形成、存活、迁移以及侵袭的活性。如此，Artemin以及相 关配体提供对于癌症治疗的理想的治疗靶标。抑制Artemin和/或这些相关配体的生物活 性的任何试剂将对于治疗癌症，例如癌症发作、进展、转移或复发具有潜能。本发明涉及用于Artemin或相关配体的分离的多核苷酸。该分离的多核苷酸可 以包括有义序列、互补体、反向互补体、反向序列、或其任何修饰序列。一方面，该多核苷酸 包括针对于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ ID NO 35至171)或其修饰序 列的反义多核苷酸。一方面，该多核苷酸与用于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如 SEQ ID N0:35至171)或其修饰序列杂交。在特别的方面，反义多核苷酸选自SEQ ID NO 35至171的任何反义序列。又一方面，该多核苷酸包括针对于用于Artemin或相关配体的 核苷酸序列(例如SEQ ID N0:35至42)或其修饰序列的iRNA。再一方面，该iRNA使得用 于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ ID NO 35至42)或其修饰序列沉默。具 体方面，该iRNA序列选自SEQ ID NO :46、47、50、51。这样的反义多核苷酸和iRNA，尤其是 siRNA可以抑制用于Artemin或相关配体的多核苷酸(例如SEQ ID NO :35至42)或其修 饰序列的表达。本发明也涉及包括用于Artemin或相关配体的多核苷酸的表达载体。该表达载体 可以包括有义序列、互补体、反向互补体、反向序列、或其任何修饰序列。一方面，该表达载 体包括针对于用于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ ID N0:35至171)或其修饰序列的反义多核苷酸。一方面，该多核苷酸与用于Artemin或相关配体的核苷酸序列(例 如SEQ ID N0:35至171)或其修饰序列杂交。特别的方面，反义多核苷酸选自SEQ ID NO 35至171的任何反义序列。另一方面，该表达载体包括针对于用于Artemin或相关配体的序 列(例如SEQ ID N0:35至42)或其修饰序列的iRNA。又一方面，该iRNA使得Artemin或 相关配体的核苷酸序列(例如SEQID N0:35至42)或其修饰序列沉默。具体方面，该iRNA 序列选自SEQ ID N0:46、47、50、51。此表达载体可以用于抑制用于Artemin或相关配体的 多核苷酸(例如SEQ ID NO 35至171)或其修饰序列的表达。本发明也涉及包括至少一种表达载体的宿主细胞，例如微生物或哺乳动物宿主细 胞。本发明也涉及用于Artemin或相关配体的分离的多肽。该多肽可以包括用于 Artemin或相关配体的蛋白质或肽序列，或其任何修饰序列。一方面，该多肽包括用于 Artemin或相关配体的氨基酸序列，例如SEQ ID N0:1至34。特别的方面，该多肽包括用 于Artemin或相关配体的特别的氨基酸序列，例如SEQ ID NO :1至3或其修饰序列。又一 方面，该多肽包括用于Artemin或相关配体的氨基酸序列的抗原序列，例如SEQ ID N0:1至 34。另一方面，该多肽是例如包括至少一种包括有用于Artemin或相关配体的成熟序列的 氨基酸序列(例如SEQ ID N0:1至3)的片段。其它方面，该多肽包括用于Artemin或相关 配体的氨基酸序列(例如SEQ ID N0:1至3)或其修饰序列，其包括具有在此详细描述的异 源试剂的融合物或缀合物。作为另一特征，本方面包括用于Artemin和/或相关配体的抗体。该抗体可以是， 例如，多克隆或单克隆抗体，或如在此详细描述的任何修饰抗体。一方面，该抗体针对于用 于Artemin或相关配体的氨基酸序列(例如SEQ ID N0:1至34)或其修饰序列。一方面， 该抗体与用于Artemin或相关配体的氨基酸序列(例如SEQ ID N0:1至34)或其修饰序列 相结合。特别的方面，该抗体与用于Artemin或相关配体的氨基酸序列(例如SEQ ID NO 1至34)的抗原方面相结合。又一方面，该抗体针对于用于Artemin或相关配体的核苷酸序 列(例如SEQ ID N0:35至171)或其修饰序列。再一方面，该抗体与用于Artemin或相关 配体的核苷酸序列(例如SEQ ID N0:35至171)或其修饰序列相结合。具体方面，该抗体 与Artemin或相关配体的核苷酸序列(例如SEQ ID NO 35至42)相结合。本发明涉及包括用于Artemin或相关配体的分离的多核苷酸、多肽或抗体的组合 物。可选方面，该组合物可以包括根据本发明的表达载体，或包括该表达载体的宿主细胞。 该组合物可以包括在此所述任何一种生物活性修饰体。该组合物可以包括至少一种融合体 或缀合物。该组合物可以配制为，例如药学组合物，如在此详细描述。本发明也涉及作为用于根据所公开的方法来诊断或治疗，尤其是癌症，并且特别 是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或其它癌症的试剂盒的一部分 的本发明组合物。该试剂盒可以包括a)如在此提出的用于Artemin或相关配体的至少一 种组分(例如多肽、多核苷酸或抗体)；和b)可选的，说明书，例如，用于诊断或治疗癌症。本发明还涉及检测和/或测量用于Artemin或相关配体的多肽水平的方法，包括 1)将来自受试者的样品与抗该多肽(例如SEQ IDNO :1至34的至少之一，或其修饰序列) 或对应肽的抗体相接触；和2)测定由样品中的对应肽或多肽形成的抗体复合物的存在或 水平。此方法也可以用于在受试者中诊断癌症，如在此详细描述。
本发明也涉及检测和/或测量用于Artemin或相关配体的多核苷酸水平的方法， 包括1)将来自受试者的样品与互补多核苷酸(例如与SEQ ID NO 35至171任一互补的 序列，或其修饰序列)相接触；和2)测定由样品中的多核苷酸形成的杂交复合物的存在或 水平。此方法也可以用于在受试者中诊断癌症，如在此详细描述。此外，本发明涉及通过使用如在此所述的用于Artemin和/或相关配体的至少一 种抑制物(例如多核苷酸或抗体)来抑制癌细胞，尤其是来自乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子 宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另一癌症的癌细胞(例如抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动 性和/或致癌性)的方法，该方法包括将该细胞与该抑制物接触。特别的方面，该抑制物选 自化学化合物(例如小分子)拮抗剂、抗体、反义多核苷酸，和iRNA。作为增加的特征，本发明包含在受试者中治疗癌症，尤其是乳腺癌、结肠癌、前列 腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另一癌症的方法，包括向受试者给予用于Artemin和 /或相关配体的至少一种抑制物(例如多核苷酸或抗体)，或其组合物，例如药学组合物。特 别的方面，该抑制物选自化学化合物(例如小分子)，拮抗剂、抗体、反义多核苷酸，和iRNA。作为另一特征，本发明包含在受试者中诊断或监控癌症，尤其是乳腺癌、结肠癌、 前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另一癌症的方法，方法包括将在此所述的至少一 种抗体与来自受试者的样品相接触；和测定样品中用于Artemin和/或相关配体的多肽 (例如SEQ ID NO :1至3)的水平。作为又一特征，本发明包含在受试者中诊断或监控癌症，尤其是乳腺癌、结肠癌、 前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另一癌症的方法，方法包括将在此所述的至少一 种多核苷酸(例如探针或引物)与来自受试者的样品相接触；和测定样品中用于Artemin 和/或相关配体的多核苷酸(例如RNA)(例如SEQ ID NO 35至42)的水平。许多方面，本发明的方法利用体内或体外表达体系。其它方面，该方法使用通过重 组、合成或半合成手段生产的多核苷酸或多肽，或通过内源手段(例如天然存在的组分)生 产的多核苷酸或多肽。广义上也可说本发明存在于本申请说明书中指出的或表示的部分、要素和特征， 单独地或总体地，或者两种或更多种所述部分、要素或特征的任何或全部组合，而在此提及 的具体整体具有本发明相关领域已知的等效物，此种已知等效物被认为包含于此如同单独
提出ο下文描述本发明的其它方面和实施方式。附图简要说明应以其所有方面而理解的本发明的这些以及其它方面将从下面的说明中显见，该 说明参考附图而仅以示例的方式给出图IA-C 人Artemin在人正常组织和癌细胞系中的mRNA表达模式。(A)Artemin 和Pers印hin在乳腺癌MCF-7细胞中的表达。从MCF-7细胞分离总RNA。使用One-St印 RT-PCR试剂盒(QIAGEN)通过用特异引物的RT-PCR来检测Artemin和Pers印hin的表达。 箭头(一)表示扩增的特异条带。M，lkb plus DNA梯度(Invitrogen)。(B)通过使用特异 引物的PCR在一组由不同的人组织制成的cDNA(Primgen)中扩增Artemin。在每一泳道上 方标记了组织来源。β 2-微球蛋白(β 2Μ)基因用作cDNA输入对照。(C)使用One-st印 RT-PCR试剂盒(Qiagen)通过具有相同的Artemin特异弓|物对的RT-PCR检查Artemin在人癌细胞系中的表达。包括了 β-肌动蛋白作为RNA输入对照。(D)按(B)的RT-PCR检验 GFRa 1-4和RET在三种乳腺癌细胞系中的表达。图左侧表示了 PCR循环数量。图2A-G =Artemin在乳腺癌MCF-7细胞中的强制表达的影响的特征。如所示，用 表达Artemin的质粒(MCF7-ARTN)或者空载体质粒(MCF7_Vec)作为对照稳定转染细胞。 (A)分离总RNA并使用One-st印RT-PCR试剂盒(Qiagen)检测Artemin和β -肌动蛋白 的mRNA水平。(B)对Artemin在MCF-7细胞中的强制表达和分泌的Western印迹分析。用 可溶的全细胞提取物或浓缩的条件培养基在12. 5% SDS-PAGE上跑胶，转移到硝酸纤维素 膜，并使用山羊抗-Artemin多克隆抗体(R&D Systems)进行免疫印迹。β-肌动蛋白用作 细胞裂解物的上样对照。(C，D)总细胞数检测。在具有(C) 10% FBS(血清)或(D)低血 it (0. 2% )(无血清)的 3ml 的 RPMI1640 中，将 MCF7-ARTN(ARTN)和 MCF7_Vec (载体)细 胞以每孔50，000个细胞的密度接种到6孔板中，一式三份。培养细胞达8天，其间每两天 换培养基。每2天在胰蛋白酶化后测定细胞数。(E)BrdU掺入检测。在完全培养基(full media)的6孔板中，将MCF7_ARTN(ARTN)和MCF7_Vec (载体)细胞接种到玻璃盖玻片上，过 夜孵育，随后在无血清培养基中进行血清饥饿18h。然后用BrdU脉冲标记细胞。使用试剂 盒(Zymed)用抗BrdU鼠单克隆抗体的BrdU染色来检测增殖细胞。细胞核用苏木精复染色。 将具有深棕色核染色的细胞计数为BrdU-标记的细胞。从每个盖玻片10个随机视野来计算 BrdU-阳性细胞核相对于细胞核总数的百分数。(F，G)细胞凋亡检测。将MCF7-ARTN(ARTN) 和MCF7-Vec (载体)细胞接种到含有10%血清的完全RPMI培养基的6孔板中。一天后，对 细胞进行血清饥饿24h。然后固定细胞并用Hoechst 33258染料(F)或用异硫氰酸荧光素 缀合的膜联蛋白V(AV)以及碘化丙啶(PI) (G)染色以评估凋亡。在UV可见荧光显微镜下检 查Hoechst 33258染色的细胞的核形态。将具有凋亡核特征(例如核浓缩和断裂)的细胞 记作凋亡的。用百分数来表示早期(AV-阳性和PI-阴性；阴影框)和晚期(AV-和PI-阳 性；空框)凋亡。*，ρ < 0. 05 ；**，ρ < 0. 01。图3A-F =Artemin的强制性过表达显著促进无贴壁依赖性生长并增强细胞迁移和 侵袭。(A)悬浮培养。将MCF7-ARTN(ARTN)和MCF7_Vec (载体)细胞放入预涂覆有多HEMA以 防止细胞附着的6孔板的每孔中。在指示的时间，使用血细胞计数器来计数活细胞。(B)软 琼脂检测。在6孔板中，将细胞接种到含有10%血清的完全RPMI 1640培养基中的0. 35% 琼脂中，三个重复。在孵育14天后计数形成的集落。(C)通过细胞在Matrigel中生长而形 成的集落的代表性的显微照相图片。(D)MCF7-ARTN和MCF7-Vec细胞的鬼笔环肽染色。(E) 迁移/侵袭检测。将无血清培养基中的细胞上样到未涂覆的(迁移)或Matrigel-涂覆的 (侵袭)8 μ m孔径的Transwel 1小室的上室中，其放入含有10% FBS的完全培养基的下室 中。孵育上样室24h或48h。用棉签除去上室中的细胞并且在用结晶紫染色后，显微鉴定 迁移到内室下表面的那些细胞。(F)伤口愈合检测。细胞在生长培养基中在组织培养平皿 上生长至汇合。通过用灭菌枪头刮擦细胞单层而体外产生“划”伤。在所指示的时间照相。
氺氺，ρ < 0. 01 ;氺氺氺，ρ < 0. 001。图4A-D =Artemin的强制表达对于MCF-7移植裸鼠的体内生长的影响。将在 Matrigel中的过表达Artemin的MCF7-ARTN细胞系或的MCF7_Vec对照细胞系的细胞 (5X IO6)皮下移植免疫缺陷裸鼠的侧腹。一周两次测量肿瘤长度和宽度并且计算体积。㈧ 显示出相对手术天数的肿瘤体积。⑶用苏木精和曙红(H&E)对代表性肿瘤的组织学染色。(C，D)在实验最后，通过BrdU掺入来评估细胞增殖，并且通过TUNEL标记来测量细胞凋亡。 氺，ρ < 0. 05 ;氺氺，ρ < 0. 01 ;氺氺氺，ρ < 0. 001。图5A-E 在T47D和BT549细胞中，Artemin的强制过表达显著增强无贴壁依赖 性生长，细胞迁移和侵袭。用表达Artemin的质粒(T47D-ARTN和BT549-ARTN)或空载体 质粒(T47D-Vec和BT549_Vec)作为对照稳定转染T47D和BT549细胞。通过RT-PCR和 Western印迹来确认Artemin在这些细胞中的表达(A)。按图3所示，用稳定过表达Artemin 的T47D-ARTN及其对照T47D_Vec，以及BT549-ARTN及其对照BT549_Vec细胞，进行软琼脂
(B)，迁移和侵袭(C，D)检测。也示出了BT549-ARTN和BT549_Vec细胞的形态(E)。*，ρ < 0. 05 ；**，ρ < 0. 01 ；_，ρ < 0. 001。图6A-F 在MCF-7细胞中由siRNA消除内源Artemin mRNA减少血清饥饿下 的乳腺癌细胞增殖的存活，并且显著增加凋亡性细胞死亡。㈧将编码靶向Artemin 转录本的siRNA的pSiIencer-ARTN质粒(ARTN-siRNA)或阴性对照siRNA质粒 pSilencer-CK (CK-siRNA)与 pEGFP-Cl 载体(EGFP)或pEGFP-ARTN质粒(EGFP-ARTN) —起瞬 时转染至MCF-7细胞中，其中Artemin cDNA插入EGFP编码序列的3，UTR。转染24h后，用 UV可见荧光显微镜显现EGFP的表达。(B) RT-PCR和Western印迹。用pSiIencer-ARTN质粒 (MCF7-siRNA)或用阴性对照pSilencer_CK质粒(MCF7-CK)稳定转染MCF-7细胞。分离总 RNA，使用One-st印RT-PCR试剂盒(Qiagen)通过RT-PCR检测Artemin和β-肌动蛋白的 mRNA水平。对可溶的全细胞提取物跑12. 5% SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素膜，并使用山羊 抗-Artemin多克隆抗体(R&D Systems)进行免疫印迹。β _肌动蛋白用作细胞裂解物的上 样对照。(C，D)总细胞数检测。在具有(C) 10% FBS(血清)或⑶低血清(0. 2% )(无血 清)的 3ml 的 RPMI 1640 中，将 MCF7_siRNA (siRNA)和 MCF7-CK (CK)细胞以每孔 50，000 个 细胞的密度接种到6孔板中，三个重复。细胞培养达8天，其间每两天换培养基。每2天在 胰蛋白酶化后测定细胞数。(E，F)细胞凋亡检测。将细胞接种到含有10%血清的完全RPMI 培养基的6孔板中。一天后，对细胞进行血清饥饿24h。然后固定细胞并用Hoechst33258 染料(E)或用异硫氰酸荧光素缀合的膜联蛋白V(AV)以及碘化丙啶(PI) (F)染色以评估凋 亡。在UV可见荧光显微镜下检查Hoechst 33258染色的细胞的核形态。将具有凋亡核特 征(例如核浓缩和断裂)的细胞记作凋亡的。用百分数来表示早期(AV-阳性和PI-阴性； 阴影框)和晚期(AV-和PI-阳性；空框)凋亡。*，ρ < 0. 05 ；**，ρ < O-Ol0图7A-D 通过siRNA的内源Artemin消除显著减少无贴壁依赖性生长并减少细胞 迁移和侵袭。㈧软琼脂检测。在6孔板中，将MCF7-siRNA(siRNA)和MCF7_CK(CK)细胞接 种到含有10%血清的完全RPMI 1640培养基中的0. 35%琼脂中，三个重复。在孵育14天后 计数形成的集落。(B)由在Matrigel中生长的细胞形成的集落的代表性的显微照相图片。
(C)迁移/侵袭检测。将无血清培养基中的细胞上样到未涂覆的(迁移)或Matrigel-涂 覆的(侵袭)8μπι孔径的Transwell小室的上室中。将这些放入含有10% FBS的完全培养 基的下室中。孵育上样室24h。用棉签除去上室中的细胞并且在用结晶紫染色后，显微鉴定 迁移到内室下表面的那些细胞。(D)伤口愈合检测。细胞在生长培养基中在组织培养平皿 上生长至汇合。通过用灭菌枪头刮擦细胞单层而体外产生“划”伤。在所指示的时间照相。 氺，ρ < 0. 05 ;氺氺，ρ < 0. 01。图8A-C 重组人Artemin蛋白质在细菌中的生产。(A)将pQE30_ARTN质粒转化到细菌中并通过加入IPTG来诱导His-Artemin的表达。通过SDS-PAGE来分析诱导前后 的全细胞裂解物并通过考马斯亮蓝染色来显现。(B)通过用山羊抗Artemin多克隆抗体 (R&DSystems)的Western印迹来检测诱导前后的全细胞裂解物中的His-Artemin。(C)使 用Ni-NTA(Qiagen)从裂解物中纯化His-Artemin蛋白并通过SDS-PAGE分析以及通过考马 斯亮蓝染色来显现。箭头表示13. 5kDa的His-Artemin条带。分子量标记也以kDa用横杠 在图的左侧表示。图9A-D 抗Artemin的兔多克隆抗体降低MCF-7细胞的存活力并抑制侵袭。㈧ 抗血清表征。使用兔多克隆抗体对表达Artemin的MCF7-ARTN和对照MCF7_Vec稳定细胞 进行Western印迹分析。(B，C)使用在此下述的方法，用500 μ g/ml兔多克隆抗体(抗体) 或兔对照IgG (对照IgG)通过比色MTT检测法来评估细胞存活力。以相对于没有抗体的处 理(PBS)来表示存活力。(D)通过兔多克隆抗血清抑制MCF-7细胞的侵袭。*，ρ < 0. 05 ； **，ρ < 0. 01。
图10 抗Artemin的鸡多克隆抗体的表征。使用抗Artemin的鸡多克隆抗体对过 表达Artemin的BT549-ARTN和对照BT549_Vec稳定细胞进行Western印迹分析。图IlA-C 抗Artemin的鸡多克隆抗体降低MCF-7细胞的存活力以及无贴壁依赖 性生长并抑制MCF-7细胞的侵袭。㈧使用在此下述的方法，按所指示浓度用抗Artemin的 鸡多克隆抗体(Anti-ARTN)或免疫前鸡对照IgY通过比色MTT检测法，来评估在含有低血 清(0.2%)的培养基中生长了 3天的细胞的细胞存活力。(B)在96孔板中，在按所指示浓 度抗Artemin的鸡多克隆抗体(抗ARTN)或免疫前对照IgY的存在下，对MCF-7细胞进行 软琼脂集落形成检测。然后使用在此下述的方法，通过比色MTT检测法来评估细胞存活力， 并且以相对于没有任何处理的PBS对照的百分数来表示细胞存活力。(C)通过抗Artemin 的鸡多克隆抗体抑制MCF-7细胞的侵袭。*，ρ < 0. 05 ；**，ρ < 0. 01 ；***，ρ < 0. 001。图12 =Artemin表达在它莫西芬(Tamoxifen)抗性的MCE-7细胞中的上调。MCF7 细胞通常是它莫西芬敏感的(TAMS)。在连续暴露于浓度渐增的药物后，建立了它莫西芬抗 性的(TAMk)MCE-7细胞。通过RT-PCR测定Artemin的表达，以β -肌动蛋白作为总RNA输 入的对照。图13A-C =Artemin的强制性过表达显著消除化学治疗药物诱导的死亡。在以所指 示的浓度存在它莫西芬(A)、阿霉素(B)或紫杉醇(C)或它们不存在下，于含有10%血清的 RPMI 1640培养基中，以每孔10，000细胞密度将MCF7-ARTN (ARTN)和MCF7_Vec (载体)细 胞接种到96孔板，三个重复。使用在此下述方法，通过比色MTT检测法，相对于无药物治疗 来评估细胞存活力。*，ρ < 0. 05 ；**，ρ < 0. 01 ；***，ρ < 0. 001。图14A-C =Artemin的强制性过表达显著增加它莫西芬存在下的无贴壁依赖性生 长。用MCF7-ARTN(ARTN)和MCF7_Vec (载体)细胞，在以指示浓度的它莫西芬存在下，将细 胞接种到10%血清的完全RPMI 1640培养基中的0. 35% %琼脂中而进行软琼脂检测，三个 重复。在孵育14天后计数形成的集落并在(A)中表示。相对集落形成表示于(B)，将不存 在它莫西芬时形成的集落数设定为100%。(C)在存在或不存在指示浓度的它莫西芬下，在 Matrigel 中形成的集落的 3D-结构。*，ρ < 0. 05 ；**，ρ < 0.01ο图15Α-Β 通过抗Artemin的鸡多克隆抗体结合抗雌激素对MCF-7细胞的无贴壁 依赖性生长的协同抑制。在存在浓度为1 μ M抗雌激素的它莫西芬(TAM) (A)或浓度为IOOnM氟维司群(Faslodex) (ICI 182,780) (ICI) (B)下或者它们不存在下，将其单独或者与浓度 为400 μ g/ml的抗Artemin的鸡多克隆抗体(抗ARTN)或浓度为400 μ g/ml的免疫前对照 IgY 一起，在96孔板中对MCF-7细胞进行软琼脂集落形成检测。使用在此下述方法，通过比 色MTT检测法，评估细胞存活力，并以相对于对照IgY处理的百分数表示。图16 具有增加或减少的Artemin表达的子宫内膜癌细胞的表征。为了强制 Artemin的表达，用表达Artemin的质粒pIRESneo3_ARTN(细胞分别命名为RL95-2-ARTN 和AN3-ARTN)或空pIRESneo3载体作为对照(细胞命名为RL95-2-CK和AN3-CK)稳定 转染RL95-2和AN3。为了消除内源性Artemin表达，用pSiIencer-ARTN质粒(细胞命 名为RL95-2-siARTN和AN3_siARTN)或用阴性对照pSiIencer-CK质粒(细胞命名为 RL95-2-siCK和AN3-siCK)来稳定转染细胞。按所指示，通过RT-PCR在mRNA水平测定 Artemin(ARTN)的表达而用Western印迹在蛋白质水平测定。β -肌动蛋白用作对照。图17Α-Ε =Artemin的强制表达增加人子宫内膜癌RL95-2细胞的细胞增殖并减少 细胞凋亡。(A)总细胞数检测。在3ml的10% FBS的完全培养基中，将过表达Artemin的 RL95-2-ARTN细胞以及RL95-2-CK对照细胞以每孔50，000个细胞的密度接种到6孔板中， 三个重复。培养细胞达14天，其间每两天换培养基。每2天在胰蛋白酶化后测定细胞数。 (B)BrdU掺入检测。在无血清培养基或在含10%血清(FBS)的完全培养基的6孔板中，将细 胞接种到玻璃盖玻片上，过夜孵育，随后在无血清培养基中进行血清饥饿18h。然后用BrdU 脉冲标记细胞。用抗BrdU小鼠单克隆抗体的BrdU染色来检测增殖细胞。(C)细胞凋亡检 测。将细胞接种到含有10%血清的完全生长培养基的6孔板中。一天后，对细胞进行血清 饥饿48h。然后固定细胞并用异硫氰酸荧光素缀合的膜联蛋白V(AV)以及碘化丙啶(PI) 染色。表示早期(AV-阳性和PI-阴性；阴影条)和晚期(AV-和PI-阳性；实心条)凋亡。 (D，E)实时PCR。通过实时PCR来测定参与细胞周期控制和DNA损伤修复⑶，以及凋亡和 细胞衰老(E)的若干关键标记的相对表达水平。以成倍表达表示RL95-2-ARTN细胞相对对 照RL95-2-CK细胞中的相对表达水平。*，ρ < 0. 05 ;**，ρ < 0. 001。图18A-E =Artemin的强制表达增强人子宫内膜癌RL95-2细胞的无贴壁依赖性增 长(A)软琼脂检测。在6孔板中，将过表达Artemin的RL95-2-ARTN细胞以及RL95-2-CK对 照细胞接种到含有10%血清的完全培养基中的0. 35%琼脂，三个重复。在孵育14天后计 数形成的集落。右侧示出了由细胞生长所形成的集落的代表性的显微照相图片。(B)悬浮 培养。将细胞置入预涂覆有多-HEMA以防止细胞附着的6孔板的每孔中。在指示的时间， 使用血细胞计数器来计数活细胞。(C，D)集落形态学。在生长因子减少的Matrigel中(C) 或在涂有Matrigel的板上(D)生长细胞。在铺板后的指定时间获取相差显微镜照片。(E) 转化灶形成检测。在含有10%血清的完全培养基中生长细胞并用70%乙醇中的0. 2%结晶 紫染色以及照相。*，ρ < 0. 05 ；**，ρ < 0. 001。图19A-E. Artemin的强制表达增强人子宫内膜癌RL95-2细胞的迁移和侵袭。(A) 在具有10% FBS的完全培养基中，将过表达Artemin的RL95-2-ARTN细胞以及RL95-2-CK 对照细胞在经组织培养物处理过的塑料平皿中培养。监控细胞生长并在指示的时间照相。 (B)迁移/侵袭检测。将无血清培养基中的细胞上样到未涂覆的(迁移)或Matrigel-涂 覆的(侵袭)8μπι孔径的Transwell小室的上室中。这些放入含有10% FBS的完全培养基 的下室中。孵育上样室24h。用棉签除去上室中的细胞并且在用结晶紫染色后，显微鉴定迁移到内室下表面的那些。(C，D)实时PCR。通过实时PCR来测定参与侵袭和转移(C)，以及 细胞重塑(D)的若干关键标记的相对表达水平。表示RL95-2-ARTN细胞相对RL95-2-CK对 照细胞中的表达水平。(E)细胞用四甲基异硫氰酸罗丹明B(TRITC)-缀合的鬼笔环肽(绿) 染色而核用DAPI (蓝)复染色。指示片状伪足(红色箭头)和丝状伪足(白色箭头)的形 氺，ρ < 0. 05 ;氺氺，ρ < 0. OOl0图20A-E.通过siRNA的内源Artemin的消除减少人子宫内膜癌RL95-2细胞的细 胞致癌潜能。(A)总细胞数检测。在3ml的10% FBS的完全生长培养基中，将Artemin消 除的RL95-2-siARTN细胞以及对照RL95_2_siCK细胞以每孔50，000个细胞的密度接种到6 孔板中，三个重复。培养细胞14天，其间每两天换培养基。每2天在胰蛋白酶化后测定细 胞数。(B)BrdU掺入检测。在无血清培养基或在含10%血清(TOS)的完全培养基的6孔板 中，将细胞接种到玻璃盖玻片上，并过夜孵育，随后在无血清培养基中进行血清饥饿18h。然 后用BrdU脉冲标记细胞。用抗BrdU小鼠单克隆抗体的BrdU染色来检测增殖细胞。(C)细 胞凋亡检测。将细胞接种到含有10%血清的完全生长培养基的6孔板中。一天后，对细胞 进行血清饥饿48h。然后固定细胞并用异硫氰酸荧光素缀合的膜联蛋白V(AV)以及碘化丙 啶(PI)染色以评估凋亡。表示早期(AV-阳性和PI-阴性；阴影条)和晚期(AV-和PI-阳 性；实心条)凋亡。⑶软琼脂检测。在6孔板中，将细胞接种到含有10%血清的完全培养 基的0.35%琼脂中，三个重复。在孵育14天后计数形成的集落。(E)迁移/侵袭检测。将 无血清培养基中的细胞上样到未涂覆的(迁移)或Matrigel-涂覆的(侵袭)8μπι孔径的 Transwell小室的上室中。这些这放入含有10% FBS的完全培养基的下室中。孵育上样室 24h。用棉签除去上室中的细胞并且在用结晶紫染色后，显微鉴定迁移到内室下表面的那 些。图21A-D =Artemin表达与人子宫内膜癌AN3细胞中的无贴壁依赖性生长以及迁 移和侵袭显著相关。(A，B)软琼脂检测。在6孔板中，将过表达Artemin的AN3-ARTN细胞 以及AN3-siCK对照细胞㈧接种到含有10%血清的完全培养基的0. 35%琼脂中，三个重 复。在孵育14天后计数形成的集落。右侧示出了由细胞生长所形成的集落的代表性的显 微照相图片。(C，D)迁移/侵袭检测。将无血清培养基中的细胞上样到未涂覆的(迁移) 或Matrigel-涂覆的(侵袭)8 μ m孔径的Transwell小室的上室中。这些这放入含有10% FBS的完全培养基的下室中。孵育上样室24h。用棉签除去上室中的细胞并且在用结晶紫 染色后，显微鉴定迁移到内室下表面的那些。*，P < 0. 05 ；**，p < 0.001。图22A-C:抗Artemin的鸡多克隆抗体降低子宫内膜癌细胞的存活力以及无贴 壁依赖性生长并抑制子宫内膜癌细胞侵袭。(A)使用在此下述的方法，按所指示浓度用抗 Artemin的鸡多克隆抗体(抗ARTN)或免疫前鸡对照IgY通过比色MTT检测法来评估在含 有低血清(0.2%)的培养基中生长了 3天的RL95-2细胞的细胞存活力。(B)在96孔板 中，在400 μ g/ml的抗Artemin的鸡多克隆抗体(抗ARTN)或免疫前对照IgY存在下，对 RL95-2和AN3细胞进行软琼脂集落形成检测。然后使用在此下述的方法，通过比色MTT检 测法来评估细胞存活力，并且以相对于没有任何处理的对照(PBS)的百分数来表示细胞存 活力。(C)由抗Artemin的鸡多克隆抗体抑制MCF-7细胞的侵袭。#，ρ < 0. 01。图23A-G。Artemin的多核苷酸和多肽序列信息。(A)人Artemin (ARTN)转录本 变体IcDNA(GenBank登录号ΝΜ_003976)的核苷酸序列。(B)人Artemin(ARTN)转录本变体2cDNA(GenBank登录号NM_057091)的核苷酸序列。(C)人Artemin(ARTN)转录本 变体3cDNA(GenBank登录号NM_057160)的核苷酸序列。(D)人Artemin(ARTN)转录本 变体3cDNA(GenBank登录号NM_057090)的核苷酸序列。(E)由转录本1和2编码的人 Artemin (ARTN)同工型1前体的氨基酸序列(Entrez蛋白质ID :NP_003967和NP_476432)， 小写为信号导肽。(F)由转录本3编码的人Artemin(ARTN)同工型2前体的氨基酸序列 (Entrez蛋白质ID :NP_476501)，小写为信号导肽。(G)由转录本4编码的人Artemin (ARTN) 同工型3前体的氨基酸序列(Entrez蛋白质ID :NP_476431)，小写为信号导肽。图24A-D 人Artemin mRNA转录本的核苷酸序列。该序列从克隆的cDNA(例如 GenBank登录号BC062375)以及基因组序列推导。(A)转录本变体IcDNA(GenBank登录 号NM_003976)。(B)转录本变体 2cDNA(GenBank 登录号NM_057091)。(C)转录本变体 3cDNA (GenBank 登录号NM_057160)。(D)转录本变体 3cDNA (GenBank 登录号NM_057090)。 起始密码AUG和终止密码UGA有下划线且为黑体。潜在的聚腺苷酸化信号UUUAUU (AAUAAA 的互补序列)也有下划线并为斜体。*表示poly(A)尾巴的可能位置。图25A-B =Persephin的多核苷酸和多肽序列信息。(A)人Pers印hin (PSPN) mRNA (GenBank 登录号NM_004158)的核苷酸序列。(B)人 Pers印hin (PSPN)前体(Entrez 蛋白质ID :NP_004149)的氨基酸序列。图26 人Persiphin mRNA转录本的核苷酸序列。该序列由克隆的cDNA (GenBank 登录号ΝΜ_004558)所推导。起始密码AUG和终止密码UGA有下划线且为黑体。发明详述下面是本发明的描述，包括其优选实施方式，以通用术语给出。还从提供支持本发 明及其具体实施例的实验数据的“实施例”部分给出的公开内容来阐明本发明。定义术语“抗体”应尽可能以最宽泛的含义而理解并旨在包括完整的单克隆抗体和多 克隆抗体。也旨在涵盖修饰抗体，只要它们展示出想要的生物活性。抗体包括免疫球蛋白 分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异结合(免疫反应)的抗原 结合位点的分子。这些包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链4(4油4油’、和？油2片 段，以及Fab表达文库。抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE以及IgD的任何类别，它们由于 分子中存在的重链性质而彼此不同。这些也包括亚型，例如IgGl、IgG2以及其它。轻链可 以是κ链或λ链。在此对抗体的引述包括对于所有分型、亚型以及种类的引述。也包括 嵌合抗体，例如单克隆抗体或其对于一种以上来源(例如鼠或人序列)具有特异性的修饰。 还包括骆驼抗体(camelid antibody)或纳米抗体(nanobody)。应理解对于“抗体”或任何 类似术语的每种引述，在此包括完整抗体，以及其任何修饰。术语“反义”应被广义理解。旨在意指任何能够结合用于Artemin和/或相关配 体的转录本的核酸(优选RNA，但包括单链DNA)。其包括能与DNA或RNA (优选mRNA)特异 性杂交的寡核苷酸及其衍生物(以及其在有形成盐的基团存在时的盐)。此种寡核苷酸或 寡核苷酸衍生物可以包括数量和同一性足够以允许此种杂交的核苷酸单元或者其核苷酸 类似物/衍生物。多数情况下，反义寡核苷酸及其衍生物与DNA互补序列、前体-mRNA或成 熟mRNA特异性结合(杂交)，如由Watson-Crick碱基配对所限定。如在此所使用，“改变的”多核苷酸包括具有缺失、插入或置换不同核苷酸而导致编码相同或功能等效的多核苷酸的那些。多肽和抗体也可为“改变的”并且含有氨基酸残 基的缺失、插入或置换，其产生沉默改变并导致功能等效序列。可根据残基的极性、电荷、可 溶性、疏水性、亲水性和/或两性性质进行有意的氨基酸置换，只要保留序列的至少一种生 物活性(例如对细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的作用)或免疫原性/免疫 活性。例如，负电荷氨氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷氨基酸可包括赖氨酸和精氨 酸；而具有相似亲水性值的不带电极性头部基团的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨 酸、甘氨酸和丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺，丝氨酸和苏氨酸以及苯丙氨酸和酪氨酸。产生 置换和/或缺失或添加的指南可以获自，例如通过与同源物、直系同源物(orthologue)或 旁系同源物(paralogue)的序列比较，如在此的附图中所示。术语“抗原结合位点”或“抗原结合部分”指参与抗原相互作用的免疫球蛋白分子 的部分，或片段或其修饰。抗原结合位点通常由重(“H”)和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”) 区的氨基酸残基所形成。在重和轻链V区内的三条高度趋异序列(divergentstretch)(称 作“高度可变区”)插入更保守的侧翼序列(flankingstretch)(称作“框架区”)之间。因 此，术语“框架区”或“FR”指在免疫球蛋白的高度可变区之间以及邻近高度可变区天然发现 的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高度可变区和重链的三个高度可变区在三维空 间彼此相关排列以形成抗原结合表面。该抗原结合表面通常与结合抗原的三维表面互补， 并且重和轻链每种的三个高度可变区称作“互补决定区”或“CDR”。氨基酸向每个结构域 的分配是按照已接受的定义(参见例如Kabat Sequences ofPToteins of Immunological Interest,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD, 1987禾口 1991 ；以及Chothia&Lesk J. Mol. Biol. 196 :901_917，1987，Chothia 等人，Nature 342 :878_883，1989)。在此使用的“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽、蛋白质、或抗体，以及其任何片段的序 列，以及任何天然发生的、重组的、合成的或半合成的分子。本发明的序列包括至少5、6、7、 8、9、10、11、或12个氨基酸，优选至少5至10、5至15、10至15、或12至15个氨基酸。优 选地，该序列保留原始氨基酸序列的生物活性(例如对细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和 /或致癌性的作用)或免疫原性/免疫活性。应理解“氨基酸序列”和类似术语并不限于与 全长分子相关的完整的、原始序列，也包括其任何修饰。在此使用的“Artemin和相关配体”指包括Artemin (ARTN)和Pers印hin (PSPN)的 ⑶NF家族配体(GFL)，其可以包括相似序列和/或活性，包括但不限于Artemin (ARTN)转录 本变体l、Artemin (ARTN)转录本变体2、Artemin (ARTN)转录本变体3、Artemin (ARTN)转录 本变体3、Artemin (ARTN)同工型1前体、Artemin (ARTN)同工型2前体、Artemin (ARTN)同工 型3前体、Pers印hin (PSPN)、以及Pers印hin (PSPN)前体。对于在本发明使用，优选人序列， 但也可以使用其它同源物和直系同源物。应理解在此对于这些因素(例如Artemin(ARTN) 和相关配体，如Persephin(PSPN)或相似术语)的每种引述将包括全长序列以及其任何片 段或修饰(包括变体)。术语“癌症”和“癌性的”指哺乳动物中通常具有异常或未调控的细胞增殖、细胞 存活、细胞运动性和/或致癌性特征的生理状况。癌症以及癌症病理学可以与下述相关，例 如转移、对邻近细胞的正常功能的干扰、异常水平的细胞因子或其它分泌产物的释放、炎性 或免疫应答的抑制或恶化、瘤形成、癌前病变(premalignancy)、恶性肿瘤、周围或远距离组 织或器官例如淋巴结等的侵袭。具体包括癌症和癌症前期症状，例如乳腺癌，其可以包括上皮肿瘤、非上皮肿瘤，癌(carcinoma)(例如原位癌)，以及侵袭性乳腺癌。也包括结肠癌、前 列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、和肝癌等。在此使用的术语“互补的”或“互补”指在允许的盐和温度条件下多核苷酸通过 碱基配对的天然结合。对于序列A-G-T，互补序列是T-C-A，反向互补是A-C-T，反向序列是 T-G-A。两单链分子之间的互补可能是部分的，其中只有一些核酸结合，或者当在单链分子 之间存在完全互补时，其可以是全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交效 率和强度具有显著作用。这对于扩增反应以及iRNA和PNA的设计和应用尤其重要，该扩增 反应取决于核酸链之间的结合。在此使用的术语“衍生的”指多核苷酸，或其互补的多核苷酸的化学修饰。此种修 饰包括例如，由烷基、酰基或氨基对氢的取代。优选的方面，多核苷酸衍生物编码保留天然 分子的生物或免疫功能的多肽。衍生多肽或抗体是这样的，它们经糖基化、聚乙二醇化或保 留它们所来源的序列的一种或多种生物功能(例如对细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/ 或致癌性的作用)或免疫原性/免疫功能的任何类似方法所修饰。对于抗体，术语“衍生 物”包括例如，杂交和重组抗体。抗体的“杂交”和“重组”形式包括，例如人化抗体、双链抗 体、三链抗体以及单链抗体。如在此所使用，术语“表位，，包括能够特异地结合免疫球蛋白，或相关分子(例如 scFv)，或T细胞受体的任何多肽或肽决定簇。表位决定簇通常包括分子的化学活性表面基 团，例如氨基酸和/或糖侧链，并且通常具有特异的三维结构特征，以及特异的电荷特征。 表位包括两种主要类型，即，顺序表位(SE)和构象表位(CE)，抗体在顺序表位处结合由肽 键连接的氨基酸残基的连续序列，而抗体在构象表位处与通过多肽链折叠到一起的非连续 的残基结合。构象表位在此也称作原生表位。通过抗原-抗体复合物结晶结构的分析可知， 为了被抗体识别，残基必须大体是可进行相互作用的，并且因此临近抗原表面存在。使用商 业可获得的算法预测SE和CE。当解离常数彡1 μ M时，优选彡IOOnM,且最优选彡IOnM,称 抗体特异地结合抗原。某些方面，抑制物可以与在此所述的配体特异结合或反应。对于抗 体，“特异结合”或“特异免疫反应”意指抗体与期望的抗原的一个或多个抗原决定簇反应而 不与其它多肽反应(即结合)或者以较低的亲和性(例如Kd > 10_6)与其它多肽结合。术语“表达”包括从基因或者基因的一部分生产多核苷酸和多肽，尤其是RNA(例 如mRNA)的生产，并且包括由RNA或基因或基因的一部分所编码的多肽的生产，以及与表达 相关的可检测物质的出现。例如，术语“表达”的范围内包括例如由多肽-多肽相互作用、多 肽-核苷酸相互作用等形成复合物。另一实例是结合配体，例如杂交探针或抗体与基因或 其它多核苷酸或寡核苷酸、多肽或蛋白质片段的结合，以及该结合配体的可视化。因此，在 微阵列上、在诸如Northern印迹的杂交印迹上、或者在诸如Western印迹的免疫印迹上、或 在珠阵列上、或通过PCR分析的点强度的增加包括在下面的生物分子的术语“表达”之内。如在此使用，术语“同源性”指互补程度。可为部分同源性(即一定的％同一性) 或完全同源性(即100%同一性)。使用功能术语“基本上同源的”指至少部分抑制相同序 列与靶核酸杂交的部分互补序列。可使用低严谨性条件下的杂交检测(例如Southern或 northern印迹、溶液杂交等)来检验完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本上同源的序 列或杂交探针将与在低严谨性条件下完全同源序列与靶序列的结合相竞争并抑制它。这并 不是说地严谨性条件是允许非特异性结合的；低严谨性条件需要两条序列的相互结合是特异性(即选择性)相互作用。如在此使用，术语“杂交”指核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何方法。如在此使用，“插入”或“添加”指相比于天然发生的分子，导致分别加入一个或多 个氨基酸残基或核苷酸的氨基酸或核苷酸序列的变化。对Artemin和/或相关配体的“抑制”或“进行抑制”旨在指阻断或降低这些配体 的生物活性和/或水平。尽管可能想要完全抑制活性，但这一需要并非必需的。例如，“抑 制”可在表达和产生水平(例如转录或翻译水平)或例如通过靶向功能而发生。如在此使 用，用于Artemin和/或相关配体的术语“抑制”或“抑制”指减少的例如DNA水平(例如， 减少的DNA合成，增加的转换(turnover)和/或减少的稳定性)、RNA水平(例如，减少的 转录，增加的转换和/或减少的稳定性)、或多肽水平(例如减少的翻译，增加的转换和/ 或减少的稳定性)或活性，或翻译后修饰。抑制物也可以减少或阻断相关途径中下游或上 游试剂的活性或表达水平。具体方面，本发明的抑制试剂可用于抑制细胞增殖、细胞存活、 细胞运动性和/或致癌性，尤其是癌症细胞，如在此所述。特别地，该试剂可用于下述一种 或多种减少细胞增殖(例如通过减少细胞分裂)，增加细胞死亡(例如通过增加凋亡或坏 死)或减少细胞侵袭和/或转移(例如通过减少细胞骨架活动，细胞运动性)。术语“修饰的”或“修饰”指改变的序列和序列片段、变体以及衍生物，如在此所述。 该术语包括多肽、多核苷酸、抗体和在此描述的类似试剂。如在此使用，术语“单克隆抗体”、“MAb”或“单克隆抗体组合物”指一群抗体分子， 其含有包括独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物的抗体分子的分子种类。特别地， 单克隆抗体的互补决定区(CDR)是独特的。MAb包括能够与抗原的特定表位免疫反应的抗 原结合位点，该反应特征在于与该表位的独特结合亲和性。如在此使用，术语“核酸序列”或“核苷酸序列”指多核苷酸、寡核苷酸的序列或其 片段，以及天然的、重组的、合成的或半合成的DNA或RNA，其起源可为单链或双链并且可以 表示有义或反义链，或者编码或非编码区。本发明的序列优选包括至少15、21、27、33、36、 39、45、51、57、或66个核苷酸，优选至少15至36、15至66、36至66、或45至66个核苷酸、 或者至少100个核苷酸、或者至少1000个核苷酸。应理解在此对于“核酸序列”或“核苷酸 序列”的每种引述将包括原始的全长序列以及其任何互补体或修饰。还应理解对于具有特 定SEQ ID NO.的“多核苷酸”(或“寡核苷酸”或“探针”或“引物”等)的任何引述将包括 DNA和相应RNA序列。术语“寡核苷酸”指多核苷酸，典型地为探针或引物，包括但不限于单链DNA、单链 或双链RNA、RNA =DNA杂交体以及双链DNA。通常通过化学方法，例如使用商购可得的自动 寡核苷酸合成仪，或者多种其它方法包括体外表达系统、重组技术以及细胞和生物体中表 达来合成诸如单链DNA探针寡核苷酸的寡核苷酸。术语“患者”或“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括但不限于鸟和 哺乳动物，尤其是小鼠、兔、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛和马。如在此使用，“肽核酸”或“PNA”指包括通过肽骨架连接的碱基的反义分子或反基 因试剂。如在此使用，短语“可药用的稀释剂、运载体、和/或赋形剂”旨在包括用于制备药 物组合物，并且可与根据本发明的试剂共同给予而允许该试剂表现其想要的功能的物质。这些通常是安全、无毒的，并且不是生物学上或其它方面不期望的。可药用的稀释剂、运载 体、和/或赋形剂的实例包括溶液、溶剂、分散介质、缓释剂、乳剂等。稀释剂、运载体、和/ 或赋形剂可含有少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。术语“多核苷酸”(例如，“Artemin或相关配体”，其可以用于讨论多核苷酸的)当 以单数或复数使用时，通常指任何核酸序列，例如任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸，其可 为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。这包括但不限于单链和双链DNA、包括单 链和双链区的DNA、单链和双链RNA，和包括单链和双链区的RNA、包括DNA和RNA的杂交分 子，该DNA和RNA可为单链，或者更典型地为双链或者包括单链和双链区。包括RNA或DNA 或RNA和DNA两者的三链区也包括在内。具体包括mRNA、cDNA以及基因组DNA，及其任何 片段。该术语包括含有一个或多个修饰碱基(例如氚化碱基)或不常见碱基(例如肌苷) 的DNA和RNA。本发明的多核苷酸可以包括编码或非编码序列，或者有义或反义序列，或者 iRNA如siRNA。应理解在此对于“多核苷酸”或相似术语的每种引述将包括全长序列以及 其任何互补体或修饰。如在此使用，术语“多肽”(例如，可以用于讨论多肽的“Artemin或相关配体”)指 寡肽、肽、或蛋白质或其片段，以及天然发生的、重组的、合成的或半合成的分子。当在此叙 述这些术语来意指天然发生的蛋白质分子的氨基酸序列时，该术语并不旨在将氨基酸序列 限制于该全长分子的完整的、原始序列。应理解在此对于“多肽”或相似术语的每种引述将 包括全长序列以及其任何修饰。如在此使用，术语“严谨条件”或“严谨性”指由核酸、盐和温度限定的杂交条件。这 些条件是本领域公知的并且可被改变以鉴定或检测相同或相关的多核苷酸序列。参见例如 Sambrook, J.等人，(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Press, Plainview, NY, UR Ausubel, F. M.等人，(1989) Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, NewYork, NY。包括低或高严谨性的众多等效条件取决于下面 的因素，例如序列(例如DNA、RNA、碱基组合物)长度和性质、靶标(例如DNA、RNA、碱基组 合物)性质、环境(例如在溶液中或在固体底物上固定化)、盐和其它组分(例如甲酰胺、硫 酸葡聚糖和/或聚乙二醇)的浓度以及反应温度(例如在低于探针溶解温度约5°C到低于 该溶解温度约20°C至25°C的范围内)。可改变一种或多种因素以产生与上面列举的条件不 同但等效的低或高严谨性条件。如在此所指，“SEQ ID NO ”可以单独表示每条序列标识符，或者它们的任何组合， 或者所有此种序列的标识符。如在此使用，术语“基本上纯化的”或“分离的”指这样的核酸或氨基酸序列，它们 从其细胞的、重组的或合成环境取出并且有至少60%，优选75%和最优选至少90%或至少 99%不含在它们的环境中与它们相伴的其它组分。已经从在多核苷酸和多肽的天然状态中 与其相伴的至少一种污染核酸分子中鉴定并分离出“分离的”多核苷酸和多肽。因此，应理 解分离的多核苷酸和多肽是与自然下发现它们的形式或装配不同的形式。还应理解“分离 的”并不需要反映该序列被纯化的确切程度(例如具体百分数)。“治疗”以及相似术语指预防、治愈、或改善医学病症(例如医学疾病、状况或症 状)或者减轻此种病症的至少一种症状的方法和组合物。特别地，这包括预防或延缓医学 病症发作；治愈、纠正、降低、减缓或改善病症的身体或发展作用；和/或预防、终止、降低、或改善该病症造成的疼痛或苦楚的方法和组合物。术语“治疗”以其最广义来理解。该术语 并不需要意味着治疗受试者直到完全康复。因此，如在此使用的“治疗”广义地包括抑制、 降低、或预防细胞增殖、细胞存活、细胞运动性、和/或致癌性；改善细胞增殖、细胞存活、细 胞运动性、和/或致癌性的症状或严重性；或者预防或降低产生细胞增殖、细胞存活、细胞 运动性、和/或致癌性的风险，例如产生癌症的风险，特别是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子 宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另外的癌症。如在此使用，多肽“变体”指一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列。类似地，变体 抗体的一个或多个氨基酸改变。变体多核苷酸的一个或多个核苷酸改变。变体可导致“保 守”改变，其中取代的氨基酸具有相似结构或化学性质，例如用异亮氨酸代替亮氨酸。更罕 见地，变体可导致“非保守”改变，例如用色氨酸代替甘氨酸。类似的小改变也可包括氨基 酸缺失或插入或者两者。可使用本领域公知的计算机程序，例如LASERGENE软件(DNASTAR) 来找到确定哪个氨基酸残基可被取代、插入或缺失而不废除生物或免疫原活性的指南。本发明也包括保持至少一种生物活性(例如对于细胞增殖、细胞存活、细胞运动 性、和/或致癌性的作用)或者免疫原/免疫功能的变体。优选的变体是与已公开的序列 具有至少80%，且更优选至少90%序列同一性的变体。最优选的变体是与在此公开的序列 具有至少95%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的变体。通过按照下面描述来 比对待比较的两条序列测定比对部分的相同残基数，用该数除以发明(检索)序列中的总 残基数，并且将结果乘以100而确定同一性百分数。有用的比对程序是AlignX(载体NTI)。除非另有指明，否则本发明的实践将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物 学、细胞生物学、和生物化学的常规技术，这在本领域技术人员的范围内。文献中全面地 解释了此种技术，例如 Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第二版，Sambrook 等 人，1989 ；还有 Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第三版，Sambrook 等人，2000 ； Oligonucleotide Synthesis, MY Gait 编，1984 ;Animal Cell Culture, R. I. Freshney 编，1987 ；Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. ；Handbook ofExperimental Immunology,第四版，D. M. Weir&CC. Blackwell 编，Blackwell Science Inc.，1987 ; Gene Transfer vectors forMammalian Cells, JAM. Miller&MAP.Calos 编，1987 ; CurrentProtocols in Molecular Biology, FEM. Ausubel 等人编，1987 ；以 & PCR :The Polymerase Chain Reaction, Mullis 等人编，1994。Artemin神经胶质细胞系源性神经营养因子(⑶NF)家族由四种成员组成，即Artemin、 Neurturin、Pers印hin和⑶NF。在本领域目前的理解中，成员通过结合共受体GFR a来起 作用，这激活共同的酪氨酸激酶受体RET以引发下游靶标，这依次影响细胞生长、分化、存 活和凋亡(Baudet等人，2000 ；Coulpier等人，2002)。乳腺癌MCF-7细胞表达所有该家族成 员。本公开内容阐明了特别地，Artemin增强无贴壁依赖性生长和集落形成(即致癌性)， 减少凋亡并增加细胞迁移/侵袭。由siRNA在MCF-7细胞中消耗内源性Artemin导致对强 制表达的相反作用。因此，本发明研究表明Artemin除了其对神经细胞的正常作用外，还 影响癌细胞凋亡、迁移和侵袭，以及无贴壁依赖性生长和集落形成(即致癌性)。这些生物 功能的抑制可以用来显著限制癌的发作、进展、转移和复发，尤其是乳腺癌、结肠癌、前列腺 癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另外的癌症。
因此，在此公开的数据阐明了 Artemin表达除了促进无贴壁依赖性生长和集落 形成(即致癌性)以外，还促进乳腺癌MCF-7细胞的存活、迁移、和侵袭，并且可以通过由 siRNA降低Artemin的表达水平或由抗体降低活性来有效抑制这些活动。如此，Artemin和 相关配体代表了用于癌症，尤其用于乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝 癌或另外的癌症的治疗和诊断的理想的新靶标。抑制Artemin和/或相关配体的生物活性 和/或水平的试剂可以用于抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性，例如用于 癌细胞。这些试剂可以包括，例如，化学化合物(例如小分子)、拮抗剂、抗体和iRNA。类似 地，诊断剂(例如多核苷酸和抗体)可以用于确定Artemin和/或相关配体的水平，以及检 测癌的状况，例如癌症发作、进展、转移或复发。Artemin多核苷酸和多肽本发明包括用于Artemin或相关配体的多肽，包括包括SEQID N0:1至36、172、 173中至少一种的那些，及其修饰。本发明也包括这些多肽在诊断癌症，尤其是乳腺癌、结肠 癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另外的癌症的应用。本发明还包括该多肽在 制备抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性例如癌细胞的抗体的应用。本发明 的多肽可在多种检测中表达和使用以确定它们的生物活性。该多肽可用于大规模合成和分 离方法，例如，用于商业生产。此种多肽可用于产生抗体、分离相应的氨基酸序列，以及定量 地确定氨基酸序列的水平。本发明的多肽也可以用作组合物，例如，药物组合物或试剂盒组 合物。本发明的多肽也可以用于提供健康益处。对于此种益处，该多肽可以用于制备抗体 以及其组合物。本发明的多肽包括选自下组的至少一种序列(a)包括选自SEQID NO :1至36、 172、173或其修饰中至少一种氨基酸序列的多肽；(b)包括选自SEQ ID NO :1至36、172、173 或其修饰中至少一种氨基酸序列的功能结构域的多肽；以及(c)包括选自SEQ ID NO 1至 36、172、173或其修饰中至少一种氨基酸序列的至少特定数量的连续残基的多肽。一个特别 实施方式中，本发明包括分离的多肽，该多肽包括SEQ ID而1至36、172、173中至少一种 的氨基酸序列。在此将所有这些序列都总体上称作本发明的多肽。本发明包括用于Artemin或相关配体的多核苷酸，该多核苷酸包括SEQ ID NO 37 至171、174，以及互补体，以及其修饰序列的那些。本发明也包括这些多核苷酸在诊断癌症， 尤其是乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肺癌、胃癌、肝癌或另外的癌症的应用。本发 明还包括这些多核苷酸在抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的应用，例如 用于癌细胞。因此，本发明包括该多核苷酸在制备表达载体和宿主细胞、以及在制备反义多 核苷酸和iRNA的应用。本发明的分离的多核苷酸在对或多或少相关的物种的基因组作图、 物理作图以及基因克隆上也具有实用性。可使用本领域公知的技术，例如狭线印迹技术或 微阵列分析，将用本发明多核苷酸所设计的探针用于检测在细胞中的具有充分同源性DNA 和RNA序列的任何生物体中基因的存在并检查基因表达模式。用本发明多核苷酸设计的引 物可用于测序和PCR扩增。本发明的多核苷酸也可用作组合物，例如药物组合物。本发明 的多核苷酸也可以用于提供健康益处。对于此种益处，该多肽可以以表达载体或包括表达 载体的宿主细胞存在。本发明的多核苷酸包括至少一种选自下组的序列(a)包括选自SEQ ID NO 1至 36、172、173或其修饰中至少一种的氨基酸序列的编码序列的序列；(b)选自SEQ ID NO 1至36、172、173或其修饰中的至少一种的氨基酸序列的编码序列的互补体、反向序列以及 反向互补体；(c)选自SEQ ID N0:1至36、172、173或其修饰中的至少一种的氨基酸序列的 编码序列中含有的开放读码框；(d)选自SEQ ID NO :1至36、172、173或其修饰中的至少一 种的氨基酸序列的编码序列的功能结构域；(e)包括选自SEQ ID而1至36、172、173或 其修饰的氨基酸序列中至少一种的编码序列至少特定数量的连续残基的序列；和(f)包括 SEQ ID NO :37至171、174，或其互补体，或其修饰序列的至少特定数量的连续核苷酸的序 列。一个特别实施方式中，本发明包括分离的多核苷酸，该多核苷酸包括选自SEQ ID N0:1 至36、172、173的氨基酸序列中至少一种的编码序列。另一特别实施方式中，本发明包括分 离的多核苷酸，该多核苷酸包括选自SEQ ID而1至36、172、173的序列。本发明也提供寡 核苷酸探针和引物以及它们的修饰。在此将所有这些多核苷酸和寡核苷酸探针和引物总体 上称作本发明的多核苷酸。本领域技术人员将理解作为遗传密码简并性的结果，可产生大量编码本发明多肽 的核苷酸序列，其中一些与任何已知的及天然发生的基因的核苷酸序列具有最小同源性。 因此，本发明考虑到可以基于可能的密码子选择通过选择组合而得到的核苷酸序列的所有 可能的变化。根据适用于天然发生的氨基酸序列的标准三联体遗传密码进行这些组合，并 且认为具体地公开了所有此种改变。用于Artemin或相关配体的核苷酸序列，或其修饰优选地能够与天然发生序列的 核苷酸序列在适当选择的严谨性条件下杂交。然而，产生具有基本上不同密码子使用的核 苷酸序列或其修饰可能是有益的。可根据特殊密码子被特殊原核细胞或真核细胞宿主所利 用的频率来选择密码子以增加在该特殊原核细胞或真核细胞宿主中发生多肽表达的比率。 其它实质上改变核苷酸序列及其衍生物而不改变所编码的氨基酸序列的原因包括与天然 发生序列所产生的转录体相比，具有更多期望特性(例如更大的半衰期)的RNA转录体的 产生。本发明也包括完全通过合成化学来生产用于Artemin或相关配体的多核苷酸，或 其修饰。生产以后，可使用本领域公知的试剂将合成序列插入到许多可用的表达载体和细 胞体系的任何一种中。此外，可使用合成化学将突变引入核苷酸序列，或其任何衍生物。本 发明也包括能够在如 Wahl, G. M.和 S. L. Berger (1987 ；MethodsEnzymol. 152 399-407)以 及Kimmel，A. R. (1987 ；Methods Enzymol. 152 507-511)所教导的多种严谨性条件下，与所 主张的核苷酸序列，尤其是SEQ ID NO :35-171所示的那些，或其互补体，或修饰序列杂交的 多核苷酸序列。可将本领域公知的和通常可用的DNA测序方法用于实践本发明的任何实施 方式。该方法可使用酶如DNA聚合酶I的Klenow片段、SEQUENASE(U. S. Biochemical Corp, Cleveland, OH)、Taq 聚合酶(Perkin Elmer)、热稳定 T7 聚合酶(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway，NJ)，或聚合酶的组合，以及校对外切酶，如在EL0NGASE Amplification System (Life Technologies, Gaithersburg,MD)中所见的那些。优选地，该 方法是用诸如Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton，Reno，NV)、Peltier 热循环仪(PTC200 ； MJ Research, ffatertown, MA)、ABI 催化剂以及 373 和 377DNA 测序仪(Perkin Elmer)，或 是Genome测序仪20TM(Roche Diagnostics)的仪器自动完成的。可利用部分核苷酸序列并使用本领域已知的多种方法来延伸核酸序列以检测上游序列如启动子和调控元件。例如，一种可使用的方法“限制位点，，PCR使用通用引物来回 收与已知座位相邻的未知序列(Sarkar，G. (1993)PCR Methods Applic. 2 :318_322)。特别 地，在接头序列的引物和对已知区域特异的引物存在下，首先扩增基因组DNA。然后使用相 同的接头引物和在第一特异引物内的另一特异引物对扩增的序列进行第二轮PCR。用适当 的RNA聚合酶转录每轮PCR的产物并用反转录酶来测序。可使用市售可得的毛细管电泳系统来分析测序或PCR产物的大小或者确认其核 苷酸序列。特别地，毛细管测序可使用用于电泳分离的可流动聚合物，由激光活化的四种不 同荧光染料(每种用于一种核苷酸)，以及用电荷偶联设备照相机来检测发出的波长。可使 用适当的软件(例如GEN0TYPER和Sequence NAVIGATOR, PerkinElmer)将输出/光强度转 变成电信号，并且可由计算机控制从上样到计算机分析以及电子数据显示的整个过程。对 于可能在特殊样品中以有限量存在的小片DNA的测序尤其优选毛细管电泳。本发明的另一实施方式中，多核苷酸或其修饰可用于重组DNA分子以在合适的宿 主细胞中指导用于Artemin或相关配体的多肽，或其修饰的表达。由于遗传密码的固有简 并性，可产生编码基本上相同或功能上等效的氨基酸序列的其它DNA序列，而这些序列可 用于克隆和表达多肽。出于多种原因，包括但不限于修饰基因产物的克隆、加工和/或表达 的改变，可以使用本领域通常已知的方法改造本发明的核苷酸序列以便改变氨基酸编码序 列。通过随机片段化以及基因片段和合成寡核苷酸的PCR重新组装的DNA改组可用于改造 核苷酸序列。例如，定点诱变可用于插入新的限制位点，改变糖基化模式、改变密码子偏好、 引入突变等等。本发明的另一实施方式中，可将编码多肽的天然的、修饰的或重组的核酸序列与 异源序列连接以编码融合蛋白。例如，编码可被市售可得的抗体所识别的嵌合序列可能是 有用的。也可改造融合蛋白以含有位于本发明的多肽和异源蛋白质序列之间的切割位点， 以便可切割该多肽并从外源的分子部分中纯化。另一实施方式中，可使用本领域公知的化学方法(参见Caruthers，M. H.等人， (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T.等人，(1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232)整体或者部分合成核苷酸序列。或者，可使用化学方法生产多肽本身以合成 氨基酸序列，或其修饰。例如，可以使用多种固相技术进行多肽合成(Roberge，J. Y.等人， (1995)Science269 202~204 ；Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85 :2149_2154)，并且 可使用例如ABI 431A多肽合成仪(PerkinElmer)实现自动合成。可使用化学方法来单独 地以及组合地化学合成多种多肽片段以生产全长分子。可通过制备型高效液相色谱(例如Creighton，T. (1983)Proteins Structures and Molecular Principles,WH Freeman andCo. ，New York,NY)月太。"SJil 过氨基酸分析或测序(例如Edman降解法；Creighton，上文)来确认合成多肽的组成。此 外，可使用化学方法在直接合成和/或组合时用来自其它蛋白质的序列，或其任何部分改 变该多肽的氨基酸序列或其任何部分以生产修饰的分子。为了表达有生物活性的多肽，可将编码该多肽或功能等效物的核苷酸序列插入 适当的表达载体，例如，含有所插入编码序列的转录和翻译所需元件的载体。可使用本领 域技术人员公知的方法来构建含有编码该多肽的序列和适当的转录及翻译控制元件的表 达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。此种技术描述于 Sambrook, J.等人，(1989)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY ；还有 Sambrook, J.等人’ (2000)Molecular Cloning, A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY,以及Ausubel, F. M.等人，(1989) Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley&Sons, New York,NY。可利用多种表达载体/宿主系统以含有并表达编码本发明多肽的序列。这些包 括但不限于，微生物如转化有重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体的细菌；转化有酵母 表达载体的酵母；由病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；转化有病毒表 达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV ；烟草花叶病病毒，TMV)或者细菌表达载体(例如Ti 或PBR322质粒)的植物细胞系统；或者动物细胞系统。对于细菌，有用的质粒包括来自 Invitrogen 的 pET、pRSET、pTrcHis2 和 pBAD 质粒，来自 Novagen 的 pET 和 pCDF 质粒，以及 来自Sigma-Aldrich的Director 质粒。特别地，大肠杆菌可以与表达载体pET—起使用。 本发明并不受所用表达载体或宿主细胞限制。“控制元件”或“调控序列，，是那些与宿主细胞蛋白质相互作用以进行转录和翻译 的非翻译区(例如，增强子、启动子、5'和3'非翻译区)。此种元件的强度和特异性可不 同。根据所用载体系统和宿主，可使用任何数量的适合的转录和翻译元件，包括组成型和 诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用诱导型启动子例如BLUESCRIPT噬粒 (Stratagene, Lajolla, CA)或 pSPORTl 质粒(Life Technologies)的杂交 lacZ 启动子等。 杆状病毒多角体蛋白启动子可用于昆虫细胞。可将源自植物细胞基因组的启动子或增强子 (例如，热激、RUBISC0、和贮藏蛋白基因)或源自植物病毒的启动子或增强子(例如，病毒 启动子或前导序列)克隆到载体中。在细菌系统中，可根据多肽想要的应用来选择许多表达载体。例如，当需要大 量多肽时，可使用指导易于纯化的融合蛋白高水平表达的载体。此种载体包括但不限 于，多功能大肠杆菌克隆和表达载体；pIN载体(Van Heeke, G.和S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264 =5503-5509)等，该多功能大肠杆菌克隆和表达载体例如 BLUESCRIPT (Stratagene)，其中可将编码多肽的序列与氨基末端Met和随后的0 -半乳糖 苷酶的7个残基符合读框地连接到载体中，以便生产杂合蛋白。pGEX载体(Promega，Madison，WI)也可用于作为与谷胱甘肽S_转移酶(GST)的融 合蛋白表达多肽。总体上，此种融合蛋白是可溶的并且可以易于通过吸附到谷胱甘肽琼脂 糖珠随后在游离谷胱甘肽存在下洗脱而从裂解细胞中纯化。此系统制造的蛋白质可设计为 包括肝素、凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点以便可以随意从GST部分释放目的克隆多肽。 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中可使用多种含有组成型或诱导型启动子(例如 a因子、醇氧化酶和PGH)的载体。综述参见Ausubel等人，(上文)和Grant等人，(1987) Methods Enzymol. 153 :516-544。特异的起始信号也可用于实现编码本发明多肽的序列的更有效翻译。此种信号包 括ATG起始密码子和相邻序列。在编码多肽的序列、其起始密码子以及上游序列都插入到 适当的表达载体的情形下，可不需要其它转录或翻译控制信号。然而，在只插入了编码序列 或其修饰的情形下，应提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应 在正确的读码框中以保证全部插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可为多种来源(天然的和合成的)。可通过包括适于所用特殊细胞系统的增强子(例如文献中描述的那 些(Scharf，D.等人，(1994)Results Probl. Cell Differ. 20 :125_162))来增强表达效率。此外，可依调节插入序列的表达或以想要的形式加工所表达多肽的能力选择宿 主细胞。此种序列修饰包括但不限于，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、脂化以及酰基化。 也可使用切割“前体原(pr印ro) ”形式多肽的翻译后加工来促进正确插入、折叠和/或功 能。对翻译后活性具有特异的细胞结构(machinery)和特征机制的不同宿主细胞可获自 美国典型菌种保藏中心(ATCC Jethesda，MD)并且可进行选择以保证序列的正确修饰和加 工。特异宿主细胞包括但不限于红酵母菌(Rhodotorula)、短梗霉(aureobasidium)、酵母 菌属(Saccharomyces)、掷孢酵母(Sporobolomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)、欧文氏菌 (Erwinia)和黄杆菌(Flavobacterium)；或这样的其它生物体如埃希氏菌(Escherichia)、 乳杆菌(Lactobacillus)、杆菌(Bacillus)、放线菌(Str印tomyces)等。特别的宿主细 胞包括大肠杆菌(Escherichia coli，其尤其适于本发明)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、苏云金芽抱杆菌(Bacillusthuringiensis)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)等。存在若干用于将核酸导入体外培养的真核细胞的技术。这些包括化学方法 (Feigner 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 84 74137417 (1987) ；Bothwell 等人，Methods for Cloning and Analysisof Eukaryotic Genes,Eds. ,Jones and Bartlett Publishers Inc. , Boston, Mass. (1990), Ausubel 等 人’ Short Protocols inMolecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY (1992)；和 Farhood，Annal. NY Acad. Sci.，716 :23 34(1994))，原生质体(Bothwell，上文)或电脉冲的使用(Vatteroni等人，Mutn. Res.， 291 163169(1993) ；Sabelnikov, Prog. Biophys. Mol. Biol. ,62 119 152(1994) ；Bothwell 等人，上文；和Ausubel等人，上文)，减毒病毒的使用(Davis等人，J. Virol. 1996，70 (6)， 3781 3787 ；Brinster 等人，J. Gen. Virol. 2002,83 (Pt2)，369 381 ；Moss, Dev. Biol. Stan.， 82 55 63 (1994)；以及Bothwell等人，上文)，以及物理方法(Fynan等人，上文Johnston 等人，Meth. Cell Biol.，43(Pt A) 353 365(1994) ；Bothwell 等人，上文；以及 Ausubel 等 人，上文)。可以通过下述方法实现核酸向动物组织的成功递送阳离子脂质体(Watanabe等 人，Mol. R印rod. Dev. ,38 268 274 (1994))，裸露DNA或RNA向动物肌肉组织的直接注射 (Robinson 等人，Vacc.，11 957 960(1993) ；Hoffman 等人，Vacc. 12 1529 1533 ； (1994)； Xiang 等人，Virol.，199 132 140(1994) ；Webster 等人，Vacc.，12 14951498 (1994)； Davis 等人，Vacc.，12 15031509 (1994) ；Davis 等人，Hum. Molec. Gen.，2 18471851 (1993)； Dalemans 等人，Ann NY Acad. Sci. 1995，772，255256. Conry 等人，CancerRes. 1995，55 (7)， 1397-1400)，和胚胎(Naito 等人，Mol. Reprod. Dev. ,39 153161 (1994)；和 Burdon 等人， Mol. Reprod. Dev. , 33 =436442 (1992)),自复制 RNA 疫苗的肌内注射(Davis 等人，J Virol 1996，70 (6) ,37813787 ;Balasuriya 等人，Vaccine 2002，20 (1112)，16091617)或使用“基 因枪”技术的DNA皮内注射(Johnston等人，上文)。使用蛋白特异的多克隆或单克隆抗体，检测和测量本发明多肽的表达的多种方法 是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附检测法(ELISA)、放射性免疫检测法(RIA)以及荧 光活化细胞分选法(FACS)。两位点单克隆类免疫检测法可以用对多肽上两个不相干涉表位
23有反应性的单克隆抗体进行，但也可以使用竞争性结合检测法。这些以及其它检测法描述 于 Hampton, R.等人，(1990 ；Serological Methods, a laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN)和 Maddox, D. E.等人，(1983 ;J. Exp. Med. 158 :1211_1216)等。许多标记和缀合技术是本领域技术人员已知的并且可用于多种核酸和氨基酸检 测法。生产用于检测多核苷酸相关序列的标记杂交或PCR探针的手段包括随机引物DNA 标记(oligolabeling)、缺口翻译、末端标记或使用标记核苷酸的PCR扩增。或者，可将该 序列或其任何修饰克隆到用于mRNA探针生产的载体中。此种载体是本领域已知的，市售 可得的并且可通过添加适当的RNA聚合酶例如T7、T3或SP6和标记核苷酸而用于体外合 成RNA探针。可使用多种市售可得的试剂盒Amersham Pharmacia Biotech，Promega和 USBiochemical来进行这些程序。可用于便捷检测的适合的报告分子或标记包括放射性核 素、酶、荧光素、化学发光素或显色剂，以及底物、辅因子、抑制物、磁微粒等。可在适于多肽表达和从培养物回收的条件下培养表达载体或转换有表达载体的 宿主细胞。培养物可以包括用于体外或体内表达的组分。体外表达组分包括用于兔网 织红细胞裂解物、大肠杆菌裂解物、和小麦胚芽提取物的那些，例如来自Invitrogen的 Expressway 或 RiPs 系统，来自 iNtRON Biotechnology 的 Genelator 系统，来自 Novagen 的 EcoPro 或 STP3 系统，来自 Promega 的TNT Quick Coupled 系统，和来自 QIAGEN 的 EasyXpress系统。根据序列和/或所用载体，培养物生产的多肽可分泌或包含在细胞内。 特殊的方面，编码噬菌体多肽的表达载体可以设计为含有信号序列，该序列引导多肽通过 原核细胞或真核细胞膜的分泌。其它构建体可包括将促进多肽纯化的氨基酸结构域。此结构域包括但不限于金 属螯合肽，例如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸(例如6X-HIS)模块，允许在 固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域，以及FLAG 延伸/亲和纯化系统(Immimex Corp. , Seattle, WA)所用的结构域。有用的表位标签包括3X-FLAG 、HA、VSV_G、V5、HSV、 GST、GFP、MBP、GAL4和0 -半乳糖苷酶。有用的质粒包括那些包括有生物素标签(例如来 自Promega的PinPoint质粒)、钙调蛋白结合蛋白(例如来自Stratagene的pCAL质粒)、 链霉亲和素结合肽(例如来自Stratagene的InterPlay质粒)、c-myc或FLAG 标签(例 如来自Sigma-Aldrich的Immunoprecipitation质粒)，或组氨酸标签(例如来自QIAGEN 的 QIAExpress 质粒)。为了促进纯化，表达载体可以包括可切割的接头序列，例如对于因子Xa或肠激酶 (Invitrogen, San Diego, CA)特异的那些。例如，载体可以包括在纯化结构域和多肽之间 的一种或多种接头。一种此表达载体提供包括本发明多肽和编码6个组氨酸残基的核酸， 此二者在硫氧还蛋白或肠激酶切割位点之前，以用于融合蛋白的表达。该组氨酸残基促进 在 IMAC (固定化金属离子亲和色谱，如 Porath，J.等人，(1992) Prot. Exp. Purif. 3 263-281 所述)上的纯化，而肠激酶切割位点提供从融合蛋白纯化该多肽的手段。Kroll，D. J.等人， (1993 ；DNA Cell Biol. 12 :441_453)提供了含有融合蛋白的载体的讨论。抑制Artemin和/或相关配体的多核苷酸如此前所述，一个实施方式中，可利用多核苷酸来抑制根据本发明的Artemin 和/或相关配体。此多核苷酸可为DNA、RNA、单链或双链。用于本发明的多核苷酸在此 可称作“分离的”多核苷酸。可使用本领域已知的许多技术获得分离的多核苷酸。例如，可使用例如 Sambrook.，J.等人，(1989)Molecular Cloning :A LaboratoryManual ( % 二三版)，cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY 以及 Sambrook 禾口 Russell (2000)Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第三版)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview, NY中描述的重组DNA技术。类似地，可使用化学合成，例如 使用亚磷酰胺和固相化学。可在所公开的核酸序列数据、核苷酸碱基间的已知相对相互作 用、已知的序列同一性、以及待使用的特别核酸技术的基础上设计多核苷酸，如下文将举例 证明。一个实施方式中，可利用干涉RNA(iRNA或siRNA)来抑制Artemin和/或相关配 体。用于iRNA技术的多核苷酸将通常与它们的靶标具有100%的互补性。然而，应理解在 iRNA保留对于其靶标的特异性以及阻断翻译的能力的情形下，不需如此。示例性的iRNA分 子可为具有3’二核苷酸突出端的 18至21bp双链RNA的形式，尽管更短或更长分子也是 适合的。在由适当的核酸载体体内生产iRNA的情形下，通常将采取具有茎环结构的RNA分 子的形式，例如3’末端有2-3个U的约19个核苷酸的茎和9个核苷酸环。用来设计siRNA 的算法可获自 Cenix (Dresden，Germany，通过 Ambion，TX)。Artemin siRNA的示例性靶序列包括AACTGGCCTGTACTCACTCAT(SEQ ID NO 46)Artemin siRNA表达载体的示例性插入序列包括CTGGCCTGTACTCACTCAT T TCAAGAGAATGAGTGAGTACAGGCCAGTTTTTTGGAA(SEQ ID NO: 47)对于这些插入物，黑体示出有义链，下划线示出反义链，而斜体字示出环序列。任 何序列可以连接到这些插入物的任一端或两端，例如，可以连接限制位点以便于克隆。例 如，可以为Pers印hin设计类似的siRNA序列。可以根据在此名为“实施例”的部分中所述的技术生产iRNA分子。关于如何 生产和设计此种分子的进一步的信息可以获自，例如:McManus MT和Sharp PA (2002) Gene silencing in mammals bysmal1 interfering RNAs.Nature Rev. Genet. 3 737747 ；DillinA(2003)The specifics of small interfering RNA specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (11) :6289_6291 ；和 Tuschl T(2002)Expanding small RNA interference. Nature Biotechnol. 20 :446_4480本领域技术人员将理解siRNA指短/小干涉RNA，其包括双链RNA，通常包括21_23 个碱基对，可以通过化学合成。相比之下，shRNA指短发夹RNA，也称作基于载体的siRNA， 其包括单链RNA，例如体外或体内转录的。通常shRNA包括与靶mRNA(有义序列)同源的序 列，“环”区和与靶序列互补的序列(反义序列)。shRNA形成发夹二级结构，而dicer酶切 割该结构，移除发夹，并将其转变成siRNA。因此，根据需要，在此公开的序列可以用于生产 shRNA，然后转变成siRNA。本发明的另一实施方式中，使用反义分子。如在此所使用，术语“反义”应广义理 解。旨在意指任何能够与用于Artemin和/或相关配体的转录体结合的任何核酸(优选 RNA，但包括单链DNA)。通常，反义分子或寡核苷酸包括约15至25个与它们的靶标mRNA完 全互补的核苷酸。然而，应理解可以使用更大的反义寡核苷酸，包括全长序列。此外，应理 解只要反义分子保留对于它们的靶标的特异性和抑制表达的能力，那么可使用与它们的靶标不完全互补的反义分子。鉴于在此提供的说明以及对于Artemin和相关配体可得的序列数据，本发明 所涉及领域的熟练技术人员应理解在本发明中使用的反义分子。关于反义技术的进 一步信息可以获自，例如Kandimalla ER, Manning A, Lathan C, Byrn RA, Agrawal S. Design, biochemical, biophysical and biological properties ofcooperative antisense oligonucleotides ；Nucleic Acids Res. 1995 Sep 11 ；23(17) :3578_84 ; Tseng BY, Brown KD. Antisenseoligonucleotide technology in the development of cancertherapeutics ；Cancer Gene Ther. 1994 Mar ； 1 (1) 65~71 ；Bryschff, Schlingensiepen KH. Design and application of antisensedigonucleotides in cell culture, in vivo, and as therapeuticagents ；Cell Mol Neurobiol. 1994 Oct ； 14(5) 557-68 ；Han J, Zhu Z, Hsu C, Finley WH. Selection of antisenseoligonucleotides on the basis of genomic frequency of thetarget sequence ；Antisense Res Dev. 1994 Spring ；4(1) :53_65。应理解根据本发明，脱氧核酶(DNAzyme)、单链DNA、核酶、和三链螺旋DNA也可用 于抑制Artemin和/或相关配体。鉴于在此提供的说明、可用的序列数据以及目前的方法 学，本发明所涉及领域的普通技术人员可容易地理解核酶、脱氧核酶、三链螺旋DNA、和单链 DNA。然而，作为示例，与这些技术相关的方法描述于Jos印hSambrook和David ff. Russell. Molecular Cloning :A LaboratoryManual (第三版),Cold Spring Harbor Laboratory Press, NYo可化学修饰用于本发明的多核苷酸，包括反义的、iRNA、核酶和脱氧核酶以增加稳 定性或防止降解或其它。例如，核酸分子可包括具有非天然碱基的类似物、修饰的糖(尤其 是在核糖的2’位置)、或者改变的磷酸骨架。用于本发明的多核苷酸也可包括允许其所结 合的任何转录本的靶向降解的序列。例如，可包括对Rnase H特异的序列。另一实例是外 部指导序列(EGS)的使用，其可募集核酶(RNase P)以消化反义分子所结合的转录本。通过用转录物组中其它序列、活化基因的全部互补体、mRNA或具体细胞中的转录 体筛选具同一性的候选序列，可以帮助确保如反义寡核苷酸、iRNA、核酶、脱氧核酶和cDNA 的特异性。此外，熟练技术人员可理解可使用适当算法来设计并确保此多核苷酸的特异性。用于本发明的多核苷酸可以体外生产的核酸分子，例如单链DNA、iRNA、反义RNA、 或脱氧核酶的形式使用。或者，适当的时候，它们可以适于生产合适的核酸，例如反义分子、 iRNA或核酶的形式使用。本发明人考虑使用本领域可知的任何载体。例如，可使用利用CMV 启动子的裸露质粒。病毒载体也可能是适合的，例如腺伴随病毒(AAV)和慢病毒。下文提 供了适合的启动子和病毒载体的其它实例。使用此病毒载体的一个优势在于与向组织或肿 瘤的局部给药不同，它们可允许全身给药。用于本发明的载体或构建体可包括适当的遗传元件，例如本领域已知的启动子、 增强子、复制起点，包括诱导型、组成型或组织特异型启动子。
具体实施方式
中，载体包括有 效连接编码本发明核酸(例如反义或适当的siRNA)的区域的诱导型启动子，以便可通过控 制转录的适当诱导物的存在与否来控制核酸的表达。另一实施方式中，本发明的核酸分子 的侧翼为在基因组期望的位点处促进同源重组的区域，从而提供期望的核酸的染色体内整 合(Roller 和 Smithies, 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :8932_8935 ；Zijlstra 等人，1989，Nature 342:435-438)。当然，载体可保持染色体外的。本发明的另一实施方式中，使用PNA。PNA是磷酸骨架被由N- (2-氨基乙基)-甘 氨酸单元形成的非手性的和中性的骨架所代替的肽-核酸杂交体(参见例如Eurekah Bioscience Collection. PNA andOligonucleotide Inhibitors of Human Telomerase. G. Gavory 禾口 S. Ba 1 asubramanian, Landes Bioscience, 2003)。喊基 A、G、T、C 通过亚甲 基羰基键接而连接到骨架的氨基氮(P. E. Nielsen等人，Science 1991. 254 =1497-1500 ； M. Egholm等人，Nature 1993. 365 :566_568)。PNA高特异性地结合互补序列，且相对于类 似的DNA或RNA，以更高亲和性结合互补序列(M. Egholm等人，上文)。相比于相应的DNA/ DNA或DNA/RNA双链，PNA/DNA或PNA/RNA杂交体也展现出更高的热稳定性(M. Egholm等 人，上文)。由于不被核酶或蛋白酶所识别的非天然酰胺骨架，PNA也拥有高化学和生物 稳定性(V. Demidov 等人，Biochem Pharmacol 1994.48:1310-1313)。通常，PNA 长度为 至少5个碱基，并且包括末端赖氨酸。PNA也可聚乙二醇化以进一步延长它们的生命期 (Nielsen, P. E.等人，(1993) Anticancer Drug Des. 8 :53_63)。作为非限制性实例，下面 的反基因PNA与Artemin基因的编码DNA链的独特序列互补，并且设计为抑制mRNA合成。 H-GCTGAGCAGCGTCGCAG-NH2 (SEQID N0 48)。例如，可以为GDNF、Neurturin和/或Pers印hin 设计类似的PNA序列。除了多核苷酸抑制物，可以为Artemin和/或相关配体鉴定小分子抑制物。特 别地，可以将Artemin的3D晶体结构以及Artemin-GFR a 3复合体的3D晶体结构用于 指导能够抑制Artemin和/或相关配体(包括⑶NF、Neurturin,和/或Pers印hin) 的高特异性小分子(参见例如，Silvian L, Jin P, Carmillo P, Boriack-Sjodin PA, Pelletier C, Rushe M, Gong B, Sah D, Pepinsky B, Rossomando A.Artemin crystal structure revealsinsights into heparin sulfate binding. Biochemistry. 2006 Jun6 ； 45(22) 6801-12 ；Wang X, Baloh RH, Milbrandt J, Garcia KC. Structure of artemin complexed with its receptor GFRalpha3 :convergent recognition of glial cell line-derivedneurotrophic factors. Structure. 2006 Jun ； 14 (6) :1083_92)o用于抑制Artemin和/或相关配体的抗体本发明包括用于Artemin和/或相关配体的抗体，例如与其至少一部分或其修饰 序列结合的抗体。本发明的某些方面，抗体可用于抑制这些配体。应理解的是，出于本发明 的目的，抗体的其它修饰或片段不需要完全像抗体一样作用。也就是说，该片段或其它修饰 不需要能够将免疫系统细胞体内募集到结合Artemin的位点。不需要生产中和抗体。本发 明所涉及领域的普通技术人员将认识到产生抗体片段的方法。本发明的抗体片段可以包括 完整抗体之一的一部分，通常是抗体的抗原结合区或可变区。然而，作为普通实例，可使用 完整抗体的蛋白水解消化，或者可通过重组核酸技术直接生产该片段。应理解已知基本抗体结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构 成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基末端 部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基末端 部分限定主要负责效应子功能的恒定区。人类轻链分为K和\轻链。重链分为ii、5、 Y、a或￡，并且将抗体的同种型分别限定为IgM、IgD、IgA和IgE。在轻和重链中，可变 和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“ J”区相连，而重链也包括约10或更多个氨基酸的"D，，区。总体参见 Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, ff. , ea.,第二版，Raven Press, N. Y. (1989))。每对轻/重链的可变区形成抗体结合位点。本发明抗体可以根据同种型和表位作图以及在一些情形下，它们阻断Artemin和 /或相关配体与一种或多种受体结合的能力来表征。阻断配体结合或活化的试剂可用于在 此公开的多种病症治疗的方法中。也考虑识别Artemin和/或相关配体，但不能阻断受体 结合的抗体。此抗体可用于检测和纯化此配体，以及如下文所详述用于诊断和监控病症在 受试者中进展的方法。此抗体也可用于分析配体或其其它修饰序列的翻译后修饰。抗体的人源化可用于降低在其它动物中产生的抗体免疫原性。可使用本领域已知 的技术实现人化抗体的生产或抗体的人源化，例如在鼠抗体的人源化的情形下，使用表位 定向选择。啮齿动物单克隆抗体人源化的最常用策略是⑶R移植(Reichmarm，L.，M. Clark, H. ffaldman, 和 G. Winter. 1998. Reshaping human antibodies fortherapy. Nature 332L323-327 Jones PT,Dear PH,Foote J,Neuberger MS,Winter G. 1986.Replacing the complementaritydetermining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature 321:522 25)以及表面重塑(Pedersen, J. T. , A. H. Henry, S. J. Searle,B. C. Guild, M. Roguska 和 A. R. Rees. 1994. Comparison of surface accessible residues in human and murineimmunoglobulin Fv domains. Implication for humanization ofmurine antibodies. J. Mol. Biol. 235 =959-973)。也可以使用表位定向选择来实现抗体的人源化 (Wang 等人，J. ImmunologicalMethods 241 :171_184，2000)。 Maynard，J.和 Georgiou， G. 2000. antibody engineering. Annu Rev Biomed Eng 2 :339_376 的方法提供了进一步的 实例。可以根据合理的设计方法以及反复优化，即由计算机模型化所辅助的框架 残基的定点突变来生产人化抗体。可使用利用噬菌体展示的其它选择性人源化策略 (Baca, M.，L. G. Presta，S. J. 0’ Connor 和J. A. Wells. 1997. antibody humanization usingmonovalent phage display. J. Biol. Chem. 272 :10678—10684 ；Hoogenboom，H. R.， A. P. de Bruine, S. E. Hufton, R. M. Hoet, J. W. Arends和 R. C. Roovers. 1998. antibody phage di splay techno logy and its applications. I mmuno techno logy. 4 1~20 ； Jespers, L. S.， A. Roberts, S. M. Mahler, G. Winter 和H. R. Hoogenboom. 1994. Guiding the selection of human antibodiesfrom phage display repertoires to a single epitope of anantigen. Biotechnology (NY) 12 899-903 ；Rader, C.和 C.F.Barbas， III. 1997. Phage display of combinatorial antibodylibraries. Curr. Opin. Biotechnol. 8 :503_508 ； Rader，C.，D. A. Cheresh 和 C. F. Barbas，III. 1998. A phage display approachfor rapid antibody humanization :designed combinatorial Vgene libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95 8910-8915 ；Rosok, M. J. ， D. E. Yelton, L. J. Harris, J. Bajorath, K. E. Hellstrom，I. Hellstrom，G.A.Cruz, K.Kristensson，H.Lin, W. D.Huse和 S. M. Glaser. 1996. A combinatorial 1ibrarystrategy for the rapid humanization of anticarcinoma BR96 Fab. J. Biol. Chem. 271 :22611_22618)。其它方面，可以使用重建有人免疫球蛋白座位的转基因动物株系(例如 XenoMouse株系)生产人抗体。此株系使得能够在动物宿主中产生全人抗体(Mendez， M. J.，L L 等 人，1997.Functionaltransplant of megabase human immunoglobulinlocirecapitulates human antibody response in mice. Nat. Gen. 15 :146-156)。特别 地，XenoMouse动物在它们的基因组中包括含有66个人重链和32个k轻链免疫球蛋 白基因的酵母人工染色体(YAC)，其中的内源重链和k座位通过靶向缺失而功能性失活 (Mendez等人，上文)。小鼠表达人y、S、Y 2和k链和鼠人链，人k与鼠人的比率 为75 1 (Mendez等人，上文)。XenoMouse动物早前已显示为生产针对蛋白质抗原的人 抗体(Green, L. L.,等人，1994. Antigen-specific human monoclonal antibodies from miceengineered with human Ig heavy and light chain YACs. Nat. Gen. 7 13-21 ；Mendez 等人，上文)，并且也可应答T不依赖性抗原如多糖。作为一个实例，可以使用两组或更多 组遗传上不同的XenoMouse动物生产抗体，例如Xm2a-3株系，其由一种含有重链和轻链基 因的双YAC重建；以及Xm2a-5株系，其由两种YAC重建，一种具有重链而另一种具有轻链基 因(Jakobovits,A. 1995. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Curr. Opin. Biotechnol. 6 :561_566 ；也参见 Russell ND 等人，Production of protective human antipneumococcal antibodies bytransgenic mice with human immunoglobulin loci.Infect Immun. 2000Apr ；68 (4) : 1820-6)。本发明涉及领域的技术人员将理解术语“双链抗体”和“三链抗体”。这些是包括 通过短肽接头连接到轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)的分子，该短肽接头太 短而不能允许同一链上的两个结构域之间配对。这促进与一条或多条其它链的互补结构 域配对，并促进与两个或更多个功能抗原结合位点的二聚或三聚分子的形成。生成的抗体 分子可为单特异性或多特异性的(例如，在双链抗体的情形下为双特异性的)。可使用本 发明涉及领域标准的方法学从两种或更多种抗体产生此抗体分子(参见例如Todorovska 入，Design and application of diabodies, triabodies, andtetrabodies for cancer targeting. J. Immunol. Methods. 2001Feb 1 ；248 (1-2) 47-66 ；Holliger P, Prospero T 禾口 Winter G, Diabodies :small bivalent and bispecific antibody fragments, Proc Natl Acad Sci USA，90，6444-6448，1993 ；以及 TomlinsonI 和 Holliger P, Methods for generating multivalent andbispecific antibody fragments, Methods Enzymol,326, 461-479，2000)。可根据本领域标准方法学进行抗体的生产。例如，在生产多克隆抗体的情形下， nT^ffl Bean(Eric S. Bean (2001) Polyclonal Antibodies. In :Basic Methods in AntibodyProduction and Characterization antibodies. Howard, G, andBethel D.(编)，CRC Press，5 :21-50，2000)。例如，可根据Stewart的方法学制备单克隆抗 体(Sandy J. Stewart (2001)Monoclonal Antibody Production. In :Basic Methods in AntibodyProduction and Characterization antibodies. Howard,G.禾口 Bethel D.(编)， CRC Press,6 :51_68,2000)或"MonocolonalAntibody Production Techniques and Applications,，，LawrenceB Schook 编，Marcel Dekker Inc. , New York, 1987)。可使用本 领域标准技术亚克隆、生长和维持杂交瘤。例如，它们可在诸如DMEM或RPMI-1640的培养 基中体外生长和维持。或者，这在所选择的动物中可体内作为腹水瘤进行。也可通过标准重组技术生产用于本发明的抗体(参见例如Siegel(2002) Siege1 DL, Recombinant monoclonal antibodytechnology, Transfus Clin Biol,9 (1) 15-222002 ；ffelschof,M.，C. Christ,I. Hermes,A. Keller,C. Kleist 和 M. Braunagel. 2003.Generation and screening of a modular human scFvexpression library from multiple donors. Methods Mol. Biol. 207 :103-121)。本发明人认为重组技术是商业规模 上优选的生产抗体的手段。可在抗体的氨基酸序列、遗传密码和其中所理解的简并性的基 础上容易地鉴定编码抗体的多核苷酸。例如，可使用本领域的标准方法从杂交瘤细胞分离 编码抗体的多核苷酸并随后表征。例如，可根据抗体的一部分的氨基酸序列设计多核苷酸 探针并随后用该探针分离编码抗体重和/或轻链的基因。或者，可通过标准化学合成方法 学，例如使用亚磷酰胺和固相化学来产生多核苷酸。可使用标准方法学确定本发明的抗体 的氨基酸序列；例如可使用Edman降解和HPLC或质谱分析。应理解因为本发明也延及在此具体所指的抗体的片段，以及修饰，也可适当地修 饰编码该抗体的核酸。例如，重链和轻链恒定结构域的编码序列可被同源人结构域所代替。 或者，可将CDR(互补决定区或抗原结合位点)区移植到同源人β片层框架。以此方式，可 通过重组技术产生抗体修饰，例如人化抗体。如在此所提及，可通过标准重组方法生产本发 明抗体。因此，本发明也延及编码抗体、抗体片段、或其修饰的多核苷酸、包括该多核苷酸的 构建体、以及包括所述构建体的宿主细胞。根据本发明的多核苷酸可为DNA、RNA或cDNA， 例如双链或单链、有义或反义序列，如在此所述。例如，可使用本发明涉及领域已知的标准方法从培养物上清、腹水或血清分离 本发明抗体。下文提供此技术的实例。然而，作为其它实例，可通过一种或多种方法例 如亲和色谱、离子交换色谱、相互作用色谱、凝胶过滤色谱、嗜硫凝胶色谱、色谱聚焦、蛋 白A或G琼脂糖柱、羟基磷灰石柱、去垢剂提取、电泳、渗透压冲击处理、包涵体纯化、硫酸 铵沉淀、用液态聚合物离心、过滤和透析来发生分离或纯化。可使用本领域标准的多种技 术从转化的宿主细胞或培养基或转基因生物体回收本发明的重组抗体。应理解可使用 标准方法学，例如使用Edman降解和HPLC或质谱分析来确定本发明抗体的氨基酸序列 (M. W. HunkapilIer，R. M. Hewick, W. J. Dreyer 禾口 L. E. Hood. 1983. High-Sequencing with a Gas-PhaseSequenator. Methods Enzymo1. 91 :399)。可以使用标准方法来鉴定用于抗体生产的氨基酸序列。例如，可以通过Abie Pro 3. 0 肽抗体设计(超文本传输协议://www. changbioscience. com/abie/abie. html) 来预测多肽的抗原节段。更具体地，可以根据Hopp-Woods scale (Hopp TP, WoodsKR. Prediction of protein antigenic determinants from aminoacid sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981Jun ；78 (6) :3824_8.)和 / 或 Kyte 和 Doolittle scale (Kyte J, DoolittleRF. A simple method for displaying the hydropathic characterof a protein. J Mol Biol. 1982 May 5 ；157(1) :105_32.)来预测抗原节段。特殊的计算机程
MAPAG (Agui Iar RC, ReteguiLA, Roguin LP Int J Biomed Comput. 1994Nov-Dec ； 37(3) 225-35) ；PEOPLE (Alix AJ. :Vaccine. 1999S印；18 (3—4) :311_4)；和 HYDRPHIL(E A Mesri 等人，J Clin Microbiol. 1990June ；28 (6) :1219_1224)。此表位可为构象特异的，因 为它们可包括非连续残基，并且可构成所预测抗原序列的多个部分(例如SEQ ID N0:9至 36中任何一条的部分，参见下面)，或者所预测抗原序列的一个或多个部分的组合(例如 SEQ ID NO :9至36中一种或多种的组合)，或者一种或多种全长序列(例如SEQ ID NO 9 至36中一种或多种)。抗原序列可以包括能形成能在天然多肽所遇到的类似3-D结构(例 如表面残基)的氨基酸或其衍生物的任何组合。
对于Artemin和/或相关配体，可以使用序列分析来预测用于抗体生产的抗 原序列。这些配体的序列信息是可广泛获得的(参见例如Rosenblad C, Gronborg M， Hansen C, Blom N, Meyer Μ, JohansenJ, Dago L, Kirik D, Patel UA, Lundberg C, Trono D, BjorklundA, Johansen TE. In vivo protection of nigral dopamine neuronsby lentiviral gene transfer of the novel GDNF-family memberneublastin/artemin. Mol Cell Neurosci. 2000Feb ； 15 (2) 199-214. Erratum in :Mol Cell Neurosci 2001S印； 18(3) :332-3)。在示例性序列分析中，Abie Pro 3. O 肽抗体设计(超文本传输协议 //www.changbioscience.com/abie/abie.html)根据 Hopp-Woods scale 以及 Kyte 禾口 Doolittle scale(Hopp TP, Woods KR. Prediction of protein antigenic determinants fromamino acid sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981Jun ；78 (6) 3824~8 ；Kyte J, Doolittle RF. A simple method fordisplaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 1982 May5 ； 157(1) :105_32)显示出为两个高度抗原性的节段。这些用于Artemin 的抗原序列包括 PPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARA AGARG (残基1-43，相对于140个氨基酸的经加工的最大的成熟蛋白质；SEQ ID NO 5)和 GALRPPPGSRPVSQP(残基92-106 ；SEQ ID NO 6)。此外，14个氨基酸的27种抗原性的肽预 测如下PPPQPSRPAPPPPA (残基 1-14 ；SEQ ID NO 7) ；PPQPSRPAPPPPAP (残基 2-15 ；SEQ ID NO 8) ；PQPSRPAPPPPAPP (残基 3-16 ；SEQ ID NO 9) ；QPSRPAPPPPAPPS (残基 4-17 ；SEQ ID NO 10) ；PSRPAPPPPAPPSA (残基 5-18 ;SEQ ID NO 11) ；SRPAPPPPAPPSAL (残基 6-19 ;SEQ ID NO 12) ；RPAPPPPAPPSALP (残基 7-20 ;SEQ ID NO 13) ；PAPPPPAPPSALPR(残基 8-21 ;SEQID NO: 14) ；APPPPAPPSALPRG (残基 9-22 ;SEQ ID NO 15) ；PPPPAPPSALPRGG (残基 10-23 ;SEQ ID NO 16) ；PPPAPPSALPRGGR(残基 11-24 ； SEQ ID NO 17) ；PPAPPSALPRGGRA (残基 12-25 ； SEQ ID NO: 18) ；APPSALPRGGRAAR(残基 14-27 ;SEQ ID NO: 19) ；PPSALPRGGRAARA(残基 15-28 ；SEQ ID NO 20) ；PSALPRGGRAARAG(残基 16-29 ;SEQ ID NO 21) ；LPRGGRAARAGGPG(残 基 19-32 ；SEQ ID NO 21) ；PRGGRAARAGGPGS (残基 20-33 ；SEQ ID NO 23)； RGGRAARAGGPGSR(残基 21-34 ；SEQ ID NO 24) ；GGRAARAGGPGSRA (残基 22-35 ；SEQ ID NO 25) ；GRAARAGGPGSRAR(残基 23-36 ;SEQ ID NO 26) ；RAARAGGPGSRARA (残基 24-37 ;SEQ ID NO 27) ；ARAGGPGSRARAAG(残基 26-39 ；SEQ ID NO 28) ；AGGPGSRARAAGAR(残基 28-41 ；SEQ ID NO 29) ；GGPGSRARAAGARG (残基 29-43 ;SEQ ID NO 30) ；GALRPPPGSRPVSQ (残基 92-105 ； SEQ ID NO 31) ；ALRPPPGSRPVSQP (残基 93-106 ;SEQ ID NO :32)。除了治疗应用，针对Artemin和/或相关配体的抗体可用于纯化或用于诊断应用。 例如，抗体可固定化到固相上。这将帮助纯化和/或量化样品中的多肽或肽水平。在诊断 程序和纯化的情形下，不需要抗体具有抑制物活性或减少配体的表达水平。尽管如可用于 某些应用，可通过用提供可检测的信号的化合物进行标记来修饰抗体；例如，可以使用酶、 荧光试剂、和放射性同位素。本发明所涉及领域的普通技术人员将容易地鉴定此适合的标 记体系。此外，抗体可用作载体，例如携带毒素、放射性核素、同位素、基因或其它治疗分子 到细胞或组织以辅助治疗。本领域普通技术人员将容易地理解确定抗体预防、减少或抑制 细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性的效力的方法。然而，作为实例，可使用本文 他处所述的方法，包括在实施例部分所涉及的一种或多种检测法。应理解，抗体或抗体片段或其修饰可用于Artemin和/或相关配体的一般目的的检测和纯化。配体可来自天然或人工源，例如细胞培养物。优选地，配体是人源。此外，如 可用于某些应用，可通过由提供可检测信号的化合物所标记来修饰抗体。例如可以使用酶、 荧光试剂和放射性同位素。本发明所涉及领域的普通技术人员将容易地鉴定此适合的标记 体系。因此，除了针对于配体的抗体的治疗应用，抗体可用于纯化配体或用于诊断应用。例 如，固定化到固相上的抗体可帮助纯化和/或量化样品中的配体水平。本发明所涉及领域 的熟练技术人员将理解可进行这些步骤的适当的技术。然而，作为实例，可使用利用固定化 到色谱支撑物上的抗体、抗体片段或修饰的亲和色谱。在诊断和纯化程序的情形下，不需要 抗体具有抑制活性。应理解ELISA或类似检测法可加入直接和间接检测手段，并且本发明的抗体、或 抗体片段或其修饰可用于捕获或检测抗体。如应理解，可在一种检测中使用一种或多种本 发明的抗体。例如，当本发明的两种抗体不识别Artemin和/或相关配体上的相同抗原决 定簇时，可将一种抗体用作捕获抗体而可将另一种抗体用作检测抗体。或者，本发明抗体可 以与以前鉴定的配体抗体组合使用。如本领域普通技术人员应理解，用于ELISA的检测抗 体可与在此所述的可检测标记缀合。除了 ELISA，其它有用的检测法包括western印迹、放 射免疫检测法、免疫沉淀检测法、免疫细胞化学、免疫组织化学、流式细胞仪、Luminex 检测法和流式微殊阵列检测法。可通过进行检验样品中Artemin和/或相关配体的水平与确定的基础水平或标准 的直接比较来获得用于诊断或大体监控受试者状态的信息。例如，可以测定正常受试者的 配体的平均血清水平(即已知不存在在此所述的医学病症的受试者)。这些浓度可用作基 础水平，高于这一范围的结果指示医学病症。优选地，指示为病症的所必须的水平是鉴定为 正常的那些范围的统计学上显著的增加。然而，即使没有统计学上显著的增加，所获得的结 果可提供对于受试者状态的有价值的信息。应理解配体的正常范围在不同体液和组织中可 不同。类似地，局部配体的正常水平可在血清中正常水平的范围之外。应理解可通过比较检验样品中存在的Artemin和/或相关配体的水平与获自一系 列其它受试者的结果的数据库来进行受试者状态的诊断或大体确定。代替利用获自许多正 常受试者的配体的标准或基础水平浓度，可在知晓他们不存在医学病症期间，或在有活跃 的医学病症期间，从单个受试者确定基础水平浓度。这可尤其用于需要持久的监控受试者 状态的疾病事件或病症进行和/或间歇的情形下。例如，可在病症缓解期间确定基础水平， 此后多个时间进行的诊断程序以评估状态。这可提供关于病症进展的有价值信息，或者帮 助评估该病症的治疗是否证明为成功的。本发明一方面，本发明抗体可以用于基于免疫组织化学的应用。例如，抗体染色 可以用于异常细胞(例如在肿瘤中发现的那些)的诊断，或者用于特殊细胞事件(如细胞 增殖或细胞死亡)的表征，或用于评估蛋白质(例如Artemin和相关配体)在生物组织中 的定位和差异表达。对于免疫组织化学，可通过多种手段显现抗体-配体相互作用。特别 地，抗体可以和能够催化生色反应的酶(例如过氧化物酶)缀合。或者，抗体可以用免疫 荧光显微镜可观察到的荧光团作标签，例如FITC、罗丹明、Texas Red、Alexa Fluor 或 DyLightFluor。荧光团标签尤其可用于共聚焦激光扫描显微镜，这是高度灵敏的并且可以 用于显现多种蛋白质之间的相互作用。作为另一方法，可以使用二级抗体来放大抗体信号。 例如，二级抗体可以缀合生物素或报告酶如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，或者缀合如在此所详述的荧光试剂。对于免疫组织化学，可以使用来自活组织检查的任何细胞或组织，或 者任何如在此所述的生物样品。如在此所述，根据本发明生产的抗体可尤其用作治疗剂，例如，用于预防、减少、或 抑制细胞增殖、细胞存活、细胞运动性和/或致癌性。一个广义实施方式，本发明提供阻断 至少一种配体与一种或多种受体相互作用，或者更广义地，阻断配体与结合因子相互作用 的方法，该方法包括接触根据本发明的抗体、抗体片段或其修饰。该方法可在体内或体外进 行。抑制Artemin和/或相关配体的组合物用于抑制Artemin和/或相关配体的试剂(例如，化学化合物如小分子、以及拮抗 剂、抗体、反义多核苷酸和iRNA)可以其自身使用，或者以组合可药用稀释剂、运载体、和/ 或赋形剂中一种或多种的组合物的形式使用。本发明所涉及领域的技术人员将容易地理解 可用于本发明组合物的多种可药用稀释剂、运载体、和/或赋形剂。如应理解，对于此种稀 释剂、运载体和/或赋形剂的选择将在一定程度上由所用试剂的性质、想要的组合物剂型 以及给药模式所指示。作为实例，在给予多核苷酸的情形下，例如适于表达反义或iRNA的 载体，适合的运载体包括等渗溶液、水、水性盐溶液、水性葡萄糖溶液等。除了标准稀释剂、运载体和/或赋形剂，本发明药学组合物可与其它组分一起，或 以某种方式来配制，使得增强试剂活性或帮助保护试剂的完整性。例如，组合物可进一步包 括佐剂或者在给予受试者时，提供针对降解的保护或减少试剂抗原性的组分。或者，可改良 该试剂以便允许靶向特定的细胞、组织或肿瘤。可配制试剂以结合缓释体系。因为这一情形，组合物可包括成型制品形式的半渗 透聚合物基质，例如膜，或微胶囊。缓释基质包括多乳酸化合物(美国专利No. 3，773，919 ； EP 58，481)、L-谷氨酸和Y -乙基-L-谷氨酸盐(酯)的共聚物(Sidman等人，1983， Biopolymers 22 :547_56)、聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)(Langer 等人，1981，J. Biomed. Mater. Res. :15 :267)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer 等人，1981，J. Biomed. Mater. Res. 15 267)、或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。本发明试剂也可配制成脂质体。可使用本发明所涉及领域已知的技术配制包括所 述组合物的脂质体。作为实例，参见 DE3，218，121、EP 52，322、EP 36，676、EP 88，046、EP 143，949、EP142, 641、日本专利申请 83-118008、美国专利 No. 4，485，045 和 4，544，545、以及 EP 102，324。通常，脂质体为小(从或约200至800埃)单层(unilamellar)型，其中脂含 量大于约30mol胆固醇百分数，针对最有效的治疗来调整所选比例。也可对用于本发明的 试剂聚乙二醇化以增加它们的寿命。此外，考虑根据本发明的组合物可与能在特殊情况下有益于受试者的其它成分一 起配制，例如，适当的时候，可有益于掺入一种或多种抗肿瘤试剂。此种试剂的实例包括烷 基化试剂，例如苯丁酸氮芥(例如Leukeran )、环磷酰胺(例如End0XanTM、CyCl0blaStinTM、 Neosar 、Cyclophosphamide )、异环磷酰胺(例如 Holoxan 、If ex , Mesnex )、塞替派 (例如ThiopleXTM、Thiot印a )；和抗代谢物/S-相抑制物，例如甲氨蝶呤钠(例如Folex 、 Abitrexate 、Edertrexate )、5-氟尿嘧啶(例如 Efudix 、Efudex )、羟基脲(例如 Droxia , Hydroxyurea、Hydrea )、安吖啶、吉西他滨(例如Gemzar )、达卡巴嗪、硫鸟嘌呤 (例如 Lanvis )。
还包括抗代谢物/有丝分裂毒，例如依托泊苷(etoposide) (Etopophos , Etoposide、Toposar )、长春碱(例如 Velbe 、Velban )、去乙酰长春酰胺(vindestine) (例如 Eldesine )、长春瑞滨(vinorelbine)(例如 Navelbine )、紫杉酚(paclitaxel) (例如Taxol )；抗生素型试剂，例如阿霉素(例如Rubex )、博来霉素(例如Blenoxane )、 放线菌素D (例如Cosmegen )、道诺霉素(例如Cerubidin )、丝裂霉素(例如 Mutamyci )；激素类试剂，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)(例如Cytadren )、阿那 曲唾(anastrozole)(例如 Arimidex )、雌莫司汀(estramustine)(例如 Estracyt 、 Emcyt )、戈舍瑞林(goserelin)(例如Zoladex )、六甲基三聚氰胺(例如Hexamet )、来曲 唑(Ietrozole)(例如 Femara )、阿那曲唑(anastrozole)(例如 Arimidex )和它莫西芬 (tamoxifen)(例如 Estroxyn 、Genox 、Noval dex > Soltamox 、Tamo fen )。还包括任何两种或更多种抗新生瘤试剂的组合，例如阿霉素/5-氟尿嘧啶/环 磷酰胺(FAC)；和环磷酰胺/甲氨喋呤/5-氟尿嘧啶(CMF)。尤其有用的是包括，例如至 少两种或更多种下述试剂的组合，该试剂例如环磷酰胺(例如CYTOXAN)，甲氨喋呤(例如 RHEUMATREX)，5-氟尿嘧啶(例如 ADRUCIL)，阿霉素(doxorubicin)(例如 ADRIAMYCIN)，和 环磷酰胺(例如CYTOXAN)。用于转移性疾病的试剂例如卡培他滨(capecitabine)(例如 XEL0DA)，多柔比星(例如ADRIAMYCIN)，包括其脂质体制剂，吉西他滨(gemcitabine)(例 如GEMZAR)，紫杉烷类包括紫杉醇(例如TAX0L)和多西紫杉醇(例如TAX0TERE)，长春瑞滨 (例如NAVELBINE)，和曲妥珠单抗(trastuzumab)(例如HERCEPTIN)。本发明所涉及领域的 普通技术人员将容易地理解其它可有益处的试剂的实例。根据已接受的药学实践，本发明 的试剂也可与除了在此所具体提及的化合物和试剂以外的那些一起配制。如应理解，在给予多核苷酸的情形下，可将它们包装进病毒递送体系，该病毒体系 可自身配制成在此所述的组合物。本发明所涉及领域的技术人员可理解具有在此所述的本 发明性质的多种适合的病毒载体。然而，作为实例，可以使用逆转录病毒载体、腺病毒载体 和腺伴随病毒(AAV)。本发明所涉及领域的技术人员将容易地理解可用于实施本发明的此 种载体的方法。然而，仅作为实例，逆转录病毒载体的使用报道于Miller等人，1993，Meth. Enzymo 1. 217 :581_599，和 Boesen 等人，1994，Biotherapy 6 291-302 ；腺病毒载体的使用 报道于例如 Kozarsky 禾口 Wilson, 1993, CurrentOpinion in Genetics and Development 3 499-503 ；Rosenfeld 等人，1991，Science 252 :431_434 ；Rosenfeld 等人，1992，Cell68 143-155 ；Mastrangeli 等人，1993，J. Clin. Invest. 91 :225_234 ；PCT
发明者D·刘, P·E·罗比埃 申请人:奥克兰联合服务有限公司