专利名称：与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种医药技术领域的配体多肽及药物输送系统，具体是一种 与Tie2 (Tyrosine kinase with Ig and EGF homology domains, 血管生成素
受体)蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统。
背景技术：
化疗技术广泛应用于肿瘤治疗中，但是，抗肿瘤药物全身分布所造成的对正 常组织的损伤，极大地限制了此类药物的应用范围，剂量和疗效。为此，提高药 物向肿瘤部位的耙向性分布，对提高化疗效果有重要意义。基因治疗作为一种新 兴的肿瘤治疗方法，得到了很大的发展。基因治疗的原理是利用基因转移技术， 使特定的基因转入靶细胞并表达，产生特定功能，从而抑制肿瘤细胞生长甚至直 接杀伤肿瘤细胞。非病毒载体介导的基因输送技术是一种安全有效的候选途径， 但基因的靶向输送及有效表达，是此项技术尚待突破的瓶颈。
Folkman博士在1995年首先发现了肿瘤血管生成的现象，并研究了其发生 机制。研究发现，血管生成对实体瘤的生成，发展以及转移起着非常关键的作用。 针对此过程，科学界研究了许多新的肿瘤治疗策略。 一方面，抗血管生成的药物 可以阻断此过程，使实体肿瘤因为缺乏氧气和营养供给，生长受到抑制而死亡； 另一方面，新生血管具有较大的通透性，易于大分子药物以及载体的停留和透过， 从而使更多的药物进入肿瘤组织发挥治疗作用。
配体或抗体介导的主动靶向输送是抗肿瘤药物输送的重要手段。不少文献报 道了针对表皮生长因子受体，血管内皮生长因子受体，整合素ave"促血管生 长因子受体等分子的药物及基因输送系统。这些受体分子在血管生成机制中起到 非常关键的作用。如罗氏公司的人重组VEGFR (血管内皮细胞生长因子受体)抗 体Avastin，商品名称阿瓦斯丁"； EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂Tarceva，商 品名称特罗凯TM以及英国AstraZeneca公司的药物Iressa，商品名称易瑞沙
TMTie2是促血管生长因子的受体。1992年由Partanen J在内皮细胞表面所发 现，为受体型酪氨酸激酶。该蛋白由1124个氨基酸残基组成的跨膜蛋白。该受 体由胞外区、跨膜区和胞内区组成，胞外区由两个免疫球蛋白样结构域，三个 EGF同源基序和三个纤连蛋白III型重复序列组成。胞内区是酪氨酸激酶催化功 能域。其中，免疫球蛋白样结构域是与配体的结合位点。
Angiopoietin-l (促血管生成素-l)和Angiopoietin-2 (促血管生成素-2) 是其两个主要的天然配体分子。Angiopoietin-l (Ang-1)与已知的血管生成因子 或其他蛋白酪氨酸激酶受体的配体不同，在体外不能直接促进血管内皮细胞生 长，而起到在血管生成过程后期起到使新生血管再组织，稳定化和成熟的作用。 Angi叩oietin-2 (Ang-2)亦可与Tie2蛋白结合，与Ang-l起到拮抗作用，参与 内皮细胞分裂和血管网重建的过程。
研究证明，Tie2是肿瘤脉管系统重要的生物标志物，在各种肿瘤新生血管 内皮细胞上均检测出高表达。同时，某些肿瘤细胞也会直接高表达Tie2蛋白。 因此，作为一个重要的恶性肿瘤标志物，Tie2可作为恶性肿瘤治疗的新靶点。 直接利用天然配体可以达到靶向结合的效果，同时，人源化抗体技术也可以达到 此项目的，但是，天然Tie2配体以及人源化抗体的人工制备，技术复杂，规模 化制备成本高昂，价格昂贵，而且储存，运输等等要求苛刻，不能满足临床使用 的要求。而特异性Tie2分子靶向的配体多肽则能够克服上述问题。因此，基于 Tie2的配体多肽的靶向型肿瘤药物输送体系有着良好的开发应用前景。
含有聚乙二醇(PEG)修饰的脂质的长循环脂质体能够通过抑制脂质体与血 浆成分之间的相互作用，降低体内清除速率，以达到缓释的目的；同时，基于肿 瘤组织血管的增强渗透作用(EPR effect),能达到药物的被动肿瘤耙向的目的。 上市药物阿霉素长循环脂质体楷莱(Caelyx)正是基于此原理。但被动靶向的肿 瘤特意性靶向效果有一定限度，而且聚乙二醇的修饰虽然提高了肿瘤部位的药物 浓度，但同时削弱了脂质体与肿瘤细胞之间的相互作用，影响了药物的细胞吸收， 无法达到有效的细胞内作用位点，影响了疗效。
经对现有技术的文献检索，中国专利CN200810134581.2 (公开号CN 101327190A,
公开日2008.12.24)，名称为 一种供注射用的抗肿瘤长循环靶 向脂质体，该技术利用整合素分子与细胞黏着分子靶向性多肽修饰脂质体，有效 的提高肿瘤部位的药物浓度，但均与本发明所述的靶点有显著不同；中国专利
5CN200310122830. 3 (公开号:CN 1634595A,
公开日2003.12.26)，名称为Tie2 受体介导的靶向性肿瘤基因治疗的基因转移系统，该技术利用了 Tie2受体靶向 性多肽GA5修饰基因输送载体，用于靶向性肿瘤基因治疗，与Tie2有不同的结 合部位，不同的多肽亦有助于克服耐受性问题，而且该技术仅限于基因转移系统。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种与Tie2蛋白特异性结合 的配体多肽。本发明的配体多肽结构清楚，不易发生多肽与多肽之间的空间位阻 效应，无Fc段的干扰；几乎没有免疫原性，副作用小，容易制备和生产，使用 方便，可作为靶向肽用于药物输送系统及基因转移系统。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明涉及一种与Tie2蛋白特异性结 合的配体多肽，包含SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
所述与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽含有大于或等于两个如SEQ ID NO. 1 所示的氨基酸序列。
所述与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽包括SEQ ID NO. 1所示序列的变异 形式1-5个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加1-20 个氨基酸。
所述与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽能被连接于以下任一纳米粒子上 聚合物粒子、金属纳米粒子、脂质体、囊泡、固体脂质微粒、胶束、碳纳米管、 量子点、树突状纳米球、微囊，细胞，脂蛋白。
所述与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽的酰胺、酯、或其盐，或配体多肽 形成的活性片段及活性衍生物。
所述与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽形成的游离型多肽、融合型多肽、 嵌合类多肽、或以配体多肽为单体的聚合物。
本发明还涉及一种药物输送系统，该系统包括与Tie2蛋白特异性结合的 配体多肽、载药系统、至少一种活性物质。
所述载药系统具体为脂质体，形成脂质体的脂质分子为磷脂酰胆碱、磷脂酰 乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、 脑苷脂，神经节苷脂、麦角固醇、胆固醇、阳离子脂质、溶血磷脂、聚乙二醇修 饰的脂质或配体多肽修饰的脂质中的一种或多种。
所述至少一种活性物质为任何需要被输送到体内特定位置的物质。所述至少一种活性物质选自抗肿瘤药物、抗代谢药物、纺锤体毒性生物碱、 细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、激酶抑制剂、抗生素、 抗真菌素、抗炎药物、免疫抑制剂、抗感染药物、抗病毒药物、驱虫药、抗寄生 虫的化合物，用于超声造影、放射造影、核医学造影剂的诊断试剂，目的基因、 反义癌基因、自杀基因、细胞凋亡基因、细胞因子基因，或上述基因的组合，或 含有上述基因的真核表达载体DNA。
本发明涉及能与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽以及基于该配体多肽的药 物输送系统，本发明的药物输送系统包含特异性结合于Tie2受体的配体多肽、 脂质体或其他载药系统、活性物质。本发明的药物输送系统可将外源DNA，治疗 性化合物和诊断试剂输送到靶细胞。本药物输送系统通过配体多肽与Tie2蛋白 的特异性结合以及受体介导的内吞作用，将相关活性物质耙向性地导入肿瘤新生 血管内皮细胞和表达Tie2受体的肿瘤细胞。 本发明具有如下的有益效果
(1) 本发明从蛋白分子相互作用的机理出发，以小分子多肽模拟人天然Tie2 配体与Tie2进行结合，与单抗比较，小分子多肽结构清楚，与Tie2结合位点局 限，不易发生多肽与多肽之间的空间位阻效应，也没有Fc段的干扰；
(2) 小分子多肽几乎没有免疫原性，副作用小，容易制备和大规模生产以 及使用方便；
(3) 本发明物中的配体多肽由于能够与细胞表面Tie2受体蛋白结合可能通 过激活或阻断Tie2信号传导通路达到调节血管新生的功能，因而可作为临床药 物研制的前提或药物组合物，它包含编码本发明有关多肽的DNA及本发明有关多 肽的抗体；本发明中的配体多肽可以作为靶向肽用于药物输送系统及基因转移系 统，进行针对Tie2受体高表达的肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞的靶向基因 治疗；本发明中的配体多肽可以作为耙向肽连接放射性核素、化学药物、生物毒 素用于恶性肿瘤及Tie2系统功能失调性疾病的耙向化学药物治疗作用；本发明 中的配体多肽可以作为靶向肽连接造影剂，用于针对Tie2受体高表达部位如肿 瘤新生血管，炎症组织，卵巢等的造影诊断；本发明中的配体多肽及其编码该多 肽的DNA序列还可作为检测或诊断试剂。
本发明涉及的大肠杆菌ER2738菌株可通过公开市售的商业渠道取得，如美 国New England Biolabs公司，公司地址240 County Road， Ipswich, MA， USA01938-2723。
本发明涉及的含有Tie2包外区cDNA序列以及6x组氨酸标签的真核表达质粒 已在文献《Xianghua Wu， Ruijiao Zhao, Zonghai Li, et aL A novel small peptide as a targeting ligand for receptor tyrosine kinase Tie2， Biochemical and Biophysical Research Communications, 315 (2004) 1004-1010》中公开。
本发明涉及的HEK293细胞，SPC-Al细胞，H1299细胞，SMMC-7721细胞以及 H460细胞可通过公开市售的商业渠道取得，如中科院上海生命科学研究院细胞 资源中心，公司地址上海市岳阳路320号。
图1为配体多肽PHI与Tie2蛋白结合表面等离子共振(SPR)分析图； 图2为配体多肽rai与Tie2蛋白特异结合解离常数曲线示意图； 图3为带有配体多肽PHI的荧光脂质体与细胞表面Tie2受体特异性结合的 荧光共聚焦显微镜结果示意图4为带有配体多肽PHI的载药脂质体细胞毒性试验示意图5为带有配体多肽PH1的荧光脂质体荷瘤小鼠体内分布示意图6为实施例4中阿霉素瘤内分布图。
具体实施例方式
结合具体实施方案，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明而非限制本 发明的范围。下列实施方案中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照试剂生产厂商所建议条件。
本发明采用生化命名委员会IUPCA-IUB推荐的命名法表示碱基和氨基酸的 縮写。其中，除特别说明外，氨基酸一般为L型。所描述的多肽，按照惯例，左 侧末端是氨基酸末端(N-末端)，右侧末端是羧基末端(C-末端)。通常当C-末 端是羧基(-C00H)或羧酸盐(-C00-)时，它可以是酰胺(-C00NH2)或酯(-C00R) 形式。酯残基R包括Cl-6垸基(如甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基等)、 C3-8环烷基(如环戊基、环己基等)、C6-12芳基(如苯基、a-萘基等)、C7-14 烷基(如节基、苯乙基等)。
实施例1配体多肽的筛选 相关试剂
氢化豆磷脂(HSPC)以及1， 2—二硬酯酰磷脂酰乙醇胺一聚乙二醇2000— 马来酸酯(DSPE-PEG2000-Mal)购自日本油脂公司(NOF Corporation);
胆固醇以及聚乙二醇化磷脂1， 2 — 二硬酯酰磷脂酰乙醇胺一聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)购自美国Avanti Polar Lipids公司;
荧光脂质LissamineiM罗丹明DHPE (罗丹明B 1， 2-双十六烷基磷脂酰乙醇 胺，1， 2 — dihexadecanoyi-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)购自美国 invitrogen公司.，
N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate (N-琥珀酰亚胺3_(2-吡使基二硫)丙酸酯，SPDP)和tris(2-carboxyethyl) phosphine (三羧甲基磷 酸，TCEP)购自美国Pierce Biotechnology公司;
Cy5. 5-NHS (Cy5. 5_N-羟基琥珀酰亚胺)酯购自美国GE Healthcare公司；
噻唑蓝(MTT)购自上海普飞生物技术公司；
重组人Tie2蛋白购自美国RnD公司；
随机十二肽噬菌体展示文库Ph. D. -12TM购自美国New England Biolabs公 司；其他化学试剂购自中国国药化学试剂公司。
Tie2特异性结合蛋白由噬菌体文库生物淘洗筛选而成。其中，多肽序列以 蛋白-间隔多肽-多肽的融合形式展示。融合多肽形式为噬菌体衣壳蛋白 pill-Gly-Gly-Gly-Ser-随机十二肽，活性片断为随机十二肽，噬菌体上含有多 个融合蛋白形式的衣壳蛋白pIII。将重组Tie2/Fc蛋白溶于10mM pH为7. 4的 TBS溶液，直至重组Tie2/Fc蛋白的浓度为50ug/ml;加100ulTie2蛋白溶液于 96孔微孔板，4'C包被过夜。用含0.5% (w/v)的牛血清白蛋白的TBS溶液(含 0. 1°/。 (v/v)吐温-20) 25摄氏度下封闭1小时。用含有O. 1% (w/v)吐温-20的 TBS溶液洗板6次，加入4X 101Q空斑形成单位的文库噬菌体，25匸孵育40分 钟。利用TBS洗板十次，以洗去结合力弱的噬菌体，然后利用100ul 0.2M的甘 氨酸-盐酸缓冲液(pH值为2.2)洗下结合紧密的噬菌体，并迅速用15ul lMTris-盐酸缓冲液(pH值为9. 1)中和。收获的噬菌体，利用大肠杆菌ER2738菌株扩 增，并进行下一筛选循环。筛选三次后，所得到的噬菌体利用LB/IPTG/Xgal平 板扩增检验，挑选12个蓝斑进行测序，测序引物为5' -CCC TCA TAG TTA GCG TAA
9CG-3'。测序得到7个不同的，能与Tie2蛋白有潜在结合能力的噬菌体衣壳蛋 白pIII-Gly-Gly-Gly-Ser-十二肽的融合多肽序列。其中，融合多肽的活性片断 为间隔多肽Gly-Gly-Gly-Ser以后的十二肽序列。最终得到7个不同的十二肽(活 性片断)序列，其中序列PH1 (如SEQ ID No. l所示)重复出现5次。此多肽融 合表达于噬菌体上，作为作用活性片断，表现出良好的Tie2蛋白结合能力，使 噬菌体有效，牢固的与Tie2蛋白结合的能力，拥有优良的Tie2靶向潜力。 实施例2
利用表面等离子共振实验测量配体多肽与Tie2蛋白包外区的结合能力 步骤一，稳定表达Tie2包外区细胞系的建立
选取含有Tie2包外区cDNA序列以及6x组氨酸标签的真核表达质粒，利用转染 试剂PEI(聚亚乙基亚胺)把Tie2表达质粒转入HEK293细胞，加入10% (v/v)胎牛 血清，700ug/ml G418的培养液筛选，阳性表达克隆利用有限稀释法筛选，并利 用西方印迹法(western blot)检测Tie2包外区蛋白表达。
步骤二，配体多肽的合成
配体多肽rai由苏州中科天马肽工程中心有限公司合成并纯化，并利用高效 液相色谱及质谱进行结构和纯度鉴定，合成方法为固相合成法。如图1所示，所 合成多肽确为配体多肽PH1，纯度为95%。
步骤三，表面等离子共振(Biacore)分析
培养并收集稳定表达Tie2包外区的HEK293细胞，利用5ml去离子水重悬， 并利用冻融法裂解细胞。裂解液以12000转/分钟速度离心10分钟，得到上清液 利用0. 22um滤膜过滤。多肽-蛋白结合试验在GE healthcare公司的Biacore X100 上进行，并利用NTA芯片。
先把NTA芯片介入Biacore X100系统，利用NTA溶液(10mM HEPES， 150raM 氯化钠，50uM EDTA， 0.005% v/v表面活性剂P_20， pH为7.4)重新管路。先 加入500uM氯化镍溶液活化芯片，然后加入含有Tie2蛋白的HEK293细胞裂解液， 经过420秒的作用，把含有6x组氨酸标签的Tie2包外区蛋白结合到芯片上。然 后利用NTA溶液洗去非特异性结合的蛋白。接着，将0.3uM、 luM、 3uM、 10uM、 30uM、 100uM梯度浓度的多肽注射入NTA芯片，与芯片表面的Tie2蛋白作用180 秒，最后，芯片表面由0.35MpH8.3的EDTA溶液进行再生，洗去表面接合蛋白。 数据由系统自带的软件Biacore X100 Evaluation Software进行分析。如图2所示，多月太PHI :TMGFTAPRFPHY (SEQ ID No. l)在与Tie2蛋白作用后，迅速与Tie2 蛋白结合，并达到饱和。信号达到峰值后，有所缓慢下降，约100秒后，信号重 新轻微上升。多肽停止与蛋白结出后，迅速解离。如图3所示，基于实验数据计 算，配体多肽稳态亲和常数拟合为1.58 x l(TM.
结果证实，配体多肽PH1能与Tie2蛋白特异性结合。
实施例3
偶联PH1多肽的脂质体与细胞表面Tie2受体特异性结合体外试验 步骤一，偶联配体多肽PH1与脂质DSPE-PEG咖。-Mal
配体多肽PH1通过连接剂SPDP与脂质偶联。多肽PH1先溶于PBS (含lmM EDTA， pH7. 5)至2mg/ml，然后以摩尔比1:1. 2加入溶于DMS0的SPDP (N-琥珀 酰亚胺-3-2-吡啶二硫代-丙酸酯)，充分混匀，24。C反应1小时，冻干，然后重 悬于事先除气并用氮气饱和的40mMpH7. 4的HEPES缓冲液。以摩尔比1: 2加入 TCEP (三(2-羰基乙基)磷)，TCEP能与连接了 SPDP的多肽作用，暴露出裸露的 巯基。24。C反应1小时后，以2:1摩尔比加入DSPE-PEG誦-Mal脂质，氮气保护 下l(TC反应24小时，得到多肽偶联的脂质PH1-PEG誦-DSPE。
反应方程式示意如下
PH1+SPDP—PH1-SPDP (24°C， 1小时)
PHI-SPDP+TCEP—PH1-SH (24°C， 1小时)
PH1-SH+DSPE-PEG誦-Ma1—PHI-PEG2。。。-DSPE (10°C， 24小时)
步骤二，荧光脂质体与顺铂脂质体的制备
荧光脂质体的制备将氢化豆磷脂(HSPC)，胆固醇，DSPE-PEG，。和荧光脂 质(罗丹明DHPE)按照摩尔比58:29:3:0.6的比例溶于氯仿。采用薄膜分散水合 法制备脂质体。然后，以摩尔比9: 100的比例加入PH1-PEG誦-DSPE胶束，60 。C孵育l小时，利用14kD截留分子量的透析膜室温透析过夜，除去游离的多肽 PH1及PH1脂质。对照组脂质体则利用raPEG扁-DSPE胶束替代PH1-PEG扁-DSPE。 顺铂脂质体的制备采用逆相蒸发法制备。HSPC，胆固醇和mPEG2。。。-DSPE以 60:35:5的摩尔比混合，并以药质比1:5(mo1)加入顺铂。PH1-PEG誦-DSPE或 mPEG2。。。-DSPE胶束与顺铂脂质体按照摩尔比4:100的比例混合，55'C孵育30分 钟。产物25'C透析4小时，除去游离的顺铂和多肽。
步骤三，激光共聚焦显微镜检验多肽荧光脂质体与细胞结合在放置于35毫米细胞培养皿内的小玻璃盖玻片上，接种表达Tie2的SPC-A1 ， H1299细胞以及不表达Tie2蛋白的S丽C-7721细胞。待生长至60%汇合度后，吸 去含血清培养液，更换无血清培养液，并以0.1mg/ml脂质浓度加入偶联或不偶 联多肽PH1的罗丹明荧光脂质体，继续37'C孵育4小时。用HANKS溶液充分清 洗5次，然后利用激光共聚焦显微镜检测。如附图4所示，表达Tie2表达阳性 的SPC-A1和H1299细胞中，孵育PH1多肽荧光脂质体的细胞罗丹明荧光强度明 显强于mPEG脂质体对照组，而不表达Tie2蛋白的smmc-7721细胞中，两组的荧 光强度相似且均非常弱。图4中，靶向多肽PH1修饰的载药脂质体对Tie2阳性 细胞H1299细胞(A)、 SPC-A1细胞(B)显示出更强的毒性，而于Tie2阴性细胞 S丽C-7721细胞(C)，靶向与非靶向脂质体毒性无差异。脂质体的毒性也通过试验 检测(D),结果显示，多肽修饰的靶向脂质体与空白脂质体毒性非常微弱，细胞 毒杀作用由顺铂所产生。
步骤四，噻唑蓝(MTT)法测量顺铂脂质体毒性试验
表达Tie2蛋白的SPC-A1， H1299， HUVEC细胞以及不表达Tie2蛋白的 smmc-7721细胞被分别接种于％孔细胞培养板，并培养24小时。然后，吸去含 血清培养液，加入无血清培养液，并以不同浓度加入偶联或不偶联PH1多肽的顺 铂脂质体，孵育4小时。接着弃去含药培养液，更换新鲜含血清培养液继续孵育 2天。两天后，弃去培养液，加入新鲜的含MTT 0.5mg/ml的含血清培养液，培 养4小时，最后，小心弃去培养液，并每孔加入200ul 二甲亚砜，混匀，利用酶 标仪测量0D490。如图5所示，Tie2表达阳性的SPC-Al， H1299及HUVEC细胞中， 偶联了 PH1多肽的顺铂脂质体均显示出较mPEG顺铂脂质体及游离药物更强大的 杀伤性，而Tie2表达阴性H1299细胞中，多肽顺铂脂质体与mPEG顺铂脂质体毒 性相近。试验证明，偶联了多肽PH1的脂质体能有效的被表达Tie2的细胞吸附 及吞噬。
实施例4
多肽荧光脂质体在荷瘤小鼠的体内分布试验 步骤一，接种肿瘤
将1 X 106 SPC-A1细胞由胰酶消化，并重悬于200ul PBS缓冲液。在5周龄 的裸鼠右腋窝下，皮下注射肿瘤细胞悬液。12天后，肿瘤长至约6mm直径，即 可使用。
12步骤二， PHI多肽荧光脂质体的制备
Cy5.5-NHS， 二硬脂酸乙醇胺(DSPE)脂质与三乙胺以3:1:3.5的摩尔比混 合，25。C孵育过夜，制备成Cy5. 5标记的脂质Cy5. 5-DSPE。将氢化豆磷脂(HSPC)， 胆固醇，DSPE-PEG2。。。和荧光脂质(Cy5. 5-DSPE)按照摩尔比58:29:3:0. 6的比例溶 于氯仿(脂质总量为3. 5mg)。采用薄膜分散水合法制备脂质体，终浓度为10mg/ml 总脂质。然后，以摩尔比9: 100的比例加入PH1-PEG誦-DSPE胶束,60'C孵育1 小时，利用14kD截留分子量的透析膜室温透析过夜，除去游离的多肽PH1及PH1 脂质。对照组脂质体则利用mPEG2。。。-DSPE胶束替代PH1-PEG誦-DSPE。
步骤三，荧光脂质体体内分布检测
荧光脂质体体内分布由美国GE healthcare公司的eXplore Optix MX小动 物体内成像系统检测。荧光脂质体由尾静脉注射入荷瘤裸鼠体内，分别在不同时 间点测量荧光。利用仪器自带软件，去除杂质荧光，仅保留在Cy5.5寿命(1.8 ns-2.2ns)内的荧光图象。如附图5所示，相较于对照组mPEG-Cy5. 5脂质体， PH1-Cy5.5脂质体显示出更强，更稳定持久以及更特异性的体内分布。肿瘤靶向 组的体内荧光分布图象显示，6个小时以内，脂质体已经集中于肿瘤组织附近， 一直到第四天荧光消失，肿瘤组织一直集中着最高浓度的靶向荧光脂质体。而非 耙向脂质体对照组中，直到约两天后荧光脂质体才在肿瘤组织达到最高浓度，并 且在大脑、脊椎以及肺部有着较高的分布。
实施例5
长循环耙向阿霉素脂质体在荷瘤小鼠的肿瘤靶向试验 步骤一，接种肿瘤
将1X106H460细胞由胰酶消化，并重悬于200ul PBS缓冲液。在5周龄的 裸鼠右腋窝下，皮下注射肿瘤细胞悬液。12天后，肿瘤长至约4-6mm直径，即 可使用。
步骤二，长循环靶向阿霉素脂质体的制备
将氢化豆磷脂(HSPC)，胆固醇，DSPE-PEG加。。按照摩尔比2:1:0. 1的比例溶 于氯仿。采用薄膜分散水合法，以125mM， pH4.0的硫酸铵溶液水合制备脂质体， 终浓度为10mg/ml总脂质。然后，以摩尔比2: 100的比例加入rai-PEG加。。-DSPE 胶束，6(TC孵育1小时。用200倍体积的10mM， pH7. 4的磷酸缓冲液作为透析液， 利用14kD截留分子量的透析膜室温透析两小时，除去游离的多肽PH1及外水相
13的硫酸铵。以药脂比h 10(w/w)加入阿霉素水溶液，60度孵育两小时。对照组 脂质体则利用mPEG誦-DSPE胶束替代PH1-PEG誦-DSPE。 步骤三，阿霉素的瘤内分布检测
阿霉素的瘤内分布由美国安捷伦公司的高效液相色谱系统检测。阿霉素脂质 体由尾静脉注射入荷瘤裸鼠体内，分别在不同时间点测量阿霉素含量。如图6所 示，相较于对照组mPEG-阿霉素脂质体，Ml-阿霉素脂质体显示出阿霉素瘤内分 布。通过统计学分析，在注射后半小时以及6小时，肿瘤组织一直集中着更高浓 度的阿霉素。序列表
〈110>上海交通大学
〈120〉与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统
<160> 1
〈210> 1
〈211> 12
<212> PRT
〈213〉人工序列
<400> 1
Thr Met Gly Phe Thr Ala Pro Arg Phe Pro His Tyr 1 5 10
1权利要求
1、一种与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽，其特征在于，包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2、 根据权利要求l所述的与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽，其特征是， 配体多肽含有大于或等于两个如SEQ ID NO. l所示的氨基酸序列。
3、 根据权利要求l所述的与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽，其特征是， 配体多肽包括SEQ ID NO. l所示序列的变异形式1-5个氨基酸的缺失、插入和 /或取代，以及在C末端和/或N末端添加1-20个氨基酸。
4、 根据权利要求l所述的与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽，其特征是， 配体多肽能被连接于以下任一纳米粒子上聚合物粒子、金属纳米粒子、脂质体、 囊泡、固体脂质微粒、胶束、碳纳米管、量子点、树突状纳米球、微囊、细胞、 脂蛋白。
5、 根据权利要求l所述的与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽，其特征是， 配体多肽的酰胺、酯、或其盐，或配体多肽形成的活性片段及活性衍生物。
6、 根据权利要求l所述的与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽，其特征是， 形成的游离型多肽、融合型多肽、嵌合类多肽、或以配体多肽为单体的聚合物。
7、 一种药物输送系统，其特征在于，该系统包括与包含SEQ ID NO. 1所 示的氨基酸序列的Tie2蛋白特异性结合的配体多肽、载药系统、至少一种活性 物质。
8、 根据权利要求7所述的药物输送系统，其特征是，所述载药系统具体为 脂质体，形成脂质体的脂质分子为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷 脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、脑苷脂，神经节苷脂、麦角固醇、胆固醇、阳离子脂质、溶血磷脂、聚乙二醇修饰的脂质或配体多肽修饰 的脂质中的一种或多种。
9、 根据权利要求7所述的药物输送系统，其特征是，所述至少一种活性物 质为任何需要被输送到体内特定位置的物质。
10、 根据权利要求7所述的药物输送系统，其特征是，所述至少一种活性物 质为抗肿瘤药物、抗代谢药物、纺锤体毒性生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、激酶抑制剂、抗生素、抗真菌素、抗炎药物、免疫 抑制剂、抗感染药物、抗病毒药物、驱虫药、抗寄生虫的化合物，用于超声造影、 放射造影、核医学造影剂的诊断试剂，目的基因、反义癌基因、自杀基因、细胞 凋亡基因、细胞因子基因，或上述基因的组合，或含有上述基因的真核表达载体 DNA。
全文摘要
一种医药技术领域的与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽及药物输送系统；其中，该配体多肽为包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽；本发明还涉及所述配体多肽的酰胺、酯、或其盐，或配体多肽形成的活性片段及活性衍生物；所述配体多肽形成的游离型多肽、融合型多肽、嵌合类多肽、或以配体多肽为单体的聚合物；本发明涉及的药物输送系统包括与Tie2蛋白特异性结合的配体多肽、载药系统、至少一种活性物质。本发明的配体多肽结构清楚，不易发生多肽与多肽之间的空间位阻效应，无Fc段的干扰；几乎没有免疫原性，副作用小，容易制备和生产，使用方便，可作为靶向肽用于药物输送系统及基因转移系统。
文档编号A61P31/10GK101555273SQ20091004873
公开日2009年10月14日 申请日期2009年4月2日 优先权日2009年4月2日
发明者徐宇虹, 麦俊华 申请人:上海交通大学