专利名称：全人乙肝表面蛋白单克隆抗体及其在制备预防hbv感染药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了全人乙肝表面蛋白单克隆抗体制备预防HBV感染中的用途。
背景技术：
乙肝病毒Ofepatitis B virus,HBV)是双链DNA病毒，引起慢性乙型肝炎，而导致肝硬化和肝癌的发生。全球大约有三亿五千万HBV感染者，而这也成为世界公共健康问题。 最近几十年，乙肝疫苗的研制成功，给乙肝的预防带来了很大的希望。然而，确有少部分人接种乙肝疫苗却不能激发免疫系统产生抗乙肝抗体，这一部分人群一旦接触到乙肝的高危因素，只能注射人乙肝免疫球蛋白来预防。但人免疫球蛋白成分相对复杂，使用的危险因素相对不确定性，限制了人乙肝免疫球蛋白的使用。因此迫切需要开发一种人源的，危险因素相对可控的生物制品替代人乙肝免疫球蛋白。
发明内容
本发明公开了一种全人乙肝表面蛋白(HBsAg)单克隆抗体A2E2，C9G9，其抗体序列是来源于人体单个B细胞，其中抗体A2E2重链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQID NO :1和SEQ ID NO :2，抗体A2E2轻链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO3和SEQ IDNO :4其中抗体C9G9重链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6，抗体A2E2轻链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO :7和SEQID NO :8，抗体在体外有良好的针对乙肝病毒(HBV)的中和保护活性。本发明还公开了全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，C969的制备方法及体外中和活性的鉴定。具体地，分离乙肝疫苗接种志愿者外周血PBMC，荧光标记的抗原和抗体CD19，IgG( )，HBSAg染色，利用流式细胞术分选HBSAg特异性B细胞(CD19+IgG+HBSAg+)制备成单细胞。单细胞RT-PCR技术克隆抗体K链和H链可变区序列。PCR产物测序后，抗体K链和H链可变区基因分别克隆入IgG-AbVec质粒和Ig K -AbVec质粒，并在CHO细胞系中表达得到全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，C9G9。抗体中和作用测定的步骤为HBV (2X104copy)抗体分别与clg，A2E2，C969，HBIG(Iug)预孵育lh，然后加入培养好的H印aRG细胞系(培养基中含4% PEG8000)过夜培养，次日洗三次，换新鲜的培养基。在第2，4，6天检测HBV-DNA和HBsAg。HBV-DNA检测使用 SMITEST kit (Genome Science Laboratories, Tokyo, Japan)。HBsAg 测定收集培养上清，用 ELISA kit(R&D)检测。抗体中和作用测定结果表明，本发明公开的全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，C9G9在体外能有效地阻断HBV的复制，因此具有良好的中和乙肝病毒的能力，可作为预防HBV感染药物。
图1，流式 CD19+IgG+HBsAg B cell 分析图2，单细胞RT-PCR抗体H，K链PCR扩增图3，抗体表达质粒图谱图4，全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，C9G9与HBsAg特异性结合曲线
图5，抗体保护H印aRG细胞免受HBV感染
具体实施例方式以下结合实施例、实验例进一步对本发明进行说明，这些实施例、实验例不应理解为对本发明的限制。
实施例I HBSAg特异性单个B细胞的制备具体地，分离乙肝疫苗接种志愿者外周血PBMC，荧光标记的抗原和抗体⑶19，IgG, HBSAg染色，利用流式细胞术分选HBSAg特异性B细胞(CD19+IgG+HBSAg+)制备成单细胞。(图I)实施例2单细胞RT-PCR技术克隆抗体K链和H链可变区序列。(Thomas Tller (2008)Efficient generation of monoclonal antibodies fromsingle human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.Journal of Immunological Methods 329:112-124)。PCR 产物测序后，抗体 k 链和 H 链可变区基因分别克隆入IgG-AbVec质粒和Ig K -AbVec质粒，并在CHO细胞系中表达(图2，图3)。其中抗体A2E2重链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO :1和SEQ IDNO :2，抗体A2E2轻链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4其中抗体C9G9重链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6，抗体A2E2轻链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :8.实施例3抗体中和作用测定HBV(2X104copy)抗体分别与 clg，A2E2，C9G9，HBIG(Iug)预孵育 lh，人后加入培养好的H印aRG细胞系(培养基中含4%PEG8000)过夜培养，次日洗三次，换新鲜的培养基。在第 2，4，6 天检测 HBV-DNA 和 HBsAgo HBV-DNA 检测使用 SMITEST kit (Genome ScienceLaboratories, Tokyo, Japan)。HBsAg 测定收集培养上清，用 ELISA kit(R&D)检测。(图4，图 5)
权利要求
1.一种全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，其重链、轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO 2 和 SEQID NO :4。
2.一种全人乙肝表面蛋白单克隆抗体C9G9，其重链、轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :8。
3.权利要求I或2任一所述的全人乙肝表面蛋白单克隆抗体的制备方法，包括分离乙肝疫苗接种志愿者外周血PBMC，利用流式细胞术分选HBSAg特异性B细胞制备成单细胞；单细胞RT-PCR技术克隆抗体K链和H链可变区序列，PCR产物测序后，抗体K链和H链可变区基因分别克隆入IgG-AbVec质粒和IgK-AbVec质粒，并在CHO细胞系中表达得到。
4.权利要求I或2任一所述的全人乙肝表面蛋白单克隆抗体在制备预防HBV感染药物中的用途。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，其重链、轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO2和SEQ ID NO4和全人乙肝表面蛋白单克隆抗体C9G9，其重链、轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO6和SEQ ID NO8。本发明还公开了上述两种抗体在制备预防HBV感染药物中的用途。
文档编号A61P31/20GK102757492SQ201110105709
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月26日 优先权日2011年4月26日
发明者戴建新, 李博华, 樊克兴, 郭亚军 申请人:中国人民解放军第二军医大学