抗TNFα的人源化Fab和人源化抗体及其用途的制作方法

专利名称：抗TNFα的人源化Fab和人源化抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗人肿瘤坏死因子α的人源化Fab和人源化抗体及其用途。
背景技术：
自身免疫性疫病的发生发展是一个由许多有活性的细胞因子调控失衡的复杂过程。在众多因子中，TNFa被证实在免疫调节中发挥重要作用，但其过量表达被证实是导致自身免疫性等疾病主要因素之一。因此，抑制TNFa活性的生物药成为治疗该类疾病中最为成功的疗法之一，已被批准治疗的适应症，主要包括类风湿性关节炎(Mieumatoid Arthritis)、克隆病(Crohn，s Disease)、斑片性银屑病(Plaque Psoriasis)、银屑病关节炎(Psoriatic Arthritis)、强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis)、溃疡性结肠炎 (Ulcerative Colitis)和幼年特发性关节炎(Juvenile Idiopathic Arthritis)，同时还有许多其他相关疾病正在开展临床试验。欧美市场上已经有针对TNF α的抗体药物和类似抗体的Fc融合蛋自药物，如 Remicade。Remicade在体内的半衰期较短，大约为9天。此外，Remicade虽有良好的结合亲和性、生物活性和临床疗效，但作为一个包含1/3鼠源序列和2/3人源序列的嵌合性抗体，约有10% -47%的患者在使用Remicade后发生了免疫反应，通常产生人抗小鼠抗体 (HAMA)，影响该抗体的疗效和长期应用。因此，十分需要寻求一种人源化程度高的抗TNF α 抗体，最大程度减少其中鼠源序列比例，以降低鼠源性并能安全用于治疗人体疾病。一种常见的抗体人源化方法是将鼠源抗体可变区(VH、VK)的互补决定区(CDR)部分移植到事先选择的人抗体框架之中，所得抗体将具有大部分人源的序列，同时又能够保留起始鼠源抗体对相同抗原的选择性，但这个过程通常导致抗体亲和力的损失。

发明内容
本发明的一个目的是提供抗人肿瘤坏死因子α人源化抗原结合片段Fab或抗人肿瘤坏死因子α人源化抗体，该Fab或抗体与人肿瘤坏死因子α的亲和力与人鼠嵌合抗体Remicade相似，甚至更高。本发明所提供的抗人肿瘤坏死因子α的人源化抗原结合片段Fab，含有重链可变区和轻链可变区；所述Fab的氨基酸序列为下述al)-U)中任一种al)所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列27的第1_120位或序列25的第1-120位，所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列31的的第1-109位或序列四的第1-109位；a2)所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1或序列3，所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15、序列9、序列11、序列7、序列13和序列5中的任一种；其中序列1的第一位氨基酸残基为Glu或Gin。所述Fab由重链片段(Fd)和轻链组成；所述重链片段(Fd)由Vh和CHl组成，所述轻链由Vk和轻链恒定区组成；所述CHl氨基酸序列与人抗体重链恒定区的CHl氨基酸序列相同，所述轻链恒定区氨基酸序列与人抗体轻链恒定区氨基酸序列相同。所述Fab的Fd片段的CHl可以是任意类型(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD)或亚类(IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4，IgMU IgM2，IgAU IgA2，)的人源恒定区的CHl ；所述Fab的轻链恒定区可为任意类型(κ型或λ型)、亚型(λ 1、λ 2、λ 3、λ 4)、或同种异性(Km(l)、Km(2), Km(3))轻链的人源恒定区。所述CHl氨基酸序列如序列表中序列33所示；所述轻链恒定区氨基酸序列如序列表中序列19所示。在本发明的具体实施例中，所述Fab为下述bl)_b3)中任一种bl)KS-7F 所述重链片段的氨基酸序列为序列表中序列27，且所述轻链的氨基酸序列为序列表中序列31 ；b2)KS-7A 所述重链片段的氨基酸序列为序列表中序列25，且所述轻链的氨基酸序列为序列表中序列31 ；b3)KS-2E 所述重链片段的氨基酸序列为序列表中序列25，且所述轻链的氨基酸序列为序列表中序列四。本发明的另一个目的是提供抗人肿瘤坏死因子α的人源化抗体，该抗体含有重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区由上述bl)所述Fab的重链可变区突变而来，所述轻链可变区由上述bl)所述Fab的轻链可变区突变而来；所述抗体的重链可变区氨基酸序列为序列表中序列1或序列3 ；所述抗体的轻链可变区氨基酸序列为序列表中序列序列15、 序列9、序列11、序列7、序列13和序列5中的任一种；其中序列1的第一位氨基酸残基为 Glu 或 Gin。所述抗体具体为下述a-Ι中的任一种a.KSlO，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH08，氨基酸序列为序列15 ；b.KS03，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH05，氨基酸序列为序列9 ；C.KS06，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH06，氨基酸序列为序列11 ；d. KS12，其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH08，氨基酸序列为为序列15 ；e.KS04，其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH05，氨基酸序列为序列9 ；f. KS07,其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH06，氨基酸序列为序列11 ；g.KS02，其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH03，氨基酸序列为序列5 ；h. KS08,其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH04，氨基酸序列为序列7 ；i.KSll，其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH07，氨基酸序列为序列13 ；
j.KSOl，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH03，氨基酸序列为序列5 ；LKS05，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH04，氨基酸序列为序列7 ；1.KS09，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH07，氨基酸序列为序列13。其中序列1的第一位氨基酸残基为Glu或Gln，优选Glu。上述序列中，序列1和序列3均共有120个氨基酸残基；序列5、序列7、序列13、 序列9、序列11和序列15均共有109个氨基酸残基。所述抗体由重链和轻链组成，所述重链的恒定区氨基酸序列与人抗体重链恒定区氨基酸序列相同，所述轻链的恒定区氨基酸序列与人抗体轻链恒定区氨基酸序列相同。所述抗体的重链恒定区可以是任意类型(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD)或亚类(IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4，IgMl、IgM2，IgAl、IgA2，)的人源恒定区；所述抗体的轻链恒定区可为任意类型(κ型或λ型)、亚型(λ 1、λ 2、λ 3、λ 4)、或同种异性(Km(l)、Km⑵、Km(3)) 轻链的人源恒定区。所述抗体的重链恒定区氨基酸序列如序列表中序列17所示；所述抗体的轻链恒定区氨基酸序列如序列表中序列19所示。所述重链的氨基酸序列为序列表中序列21 ；所述轻链的氨基酸序列为序列表中序列23。其中序列21的第1-120位氨基酸残基为所述重链的可变区，第121-450位氨基酸残基为所述重链的恒定区；序列23的第1-109位氨基酸残基为所述轻链的可变区，第 110-214位氨基酸残基为所述轻链的恒定区。序列21的第一位氨基酸为Glu或Gin。本发明的再一个目的是提供由所述Fab衍生的抗原结合片段A或抗原结合片段B。 抗原结合片段A为由所述Fab衍生的Fab’、F(ab’)2、Fv、重链可变区、轻链可变区、选自重链可变区的多肽片段或选自轻链可变区的多肽片段；抗原结合片段B为由所述抗体衍生的 Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv (抗体可变区片段)、重链可变区、轻链可变区、选自重链可变区的多肽片段或选自轻链可变区的多肽片段。上述F(ab' )2由一对轻链和一对略大于Fd的重链(称为Fd')组成，胃蛋白酶水解IgG分子产生此片段，它包含两个Fab，可结合2个抗原表位。Fd'约含有235个氨基酸残基，包括VH、CHl和绞链区。Fv由轻链可变区和重链可变区(Vh)组成，二者以非共价键结合在一起，分子量约为完整抗体分子的1/6，具有单一抗原结合位点。Fv包括 ScFv(单链抗体)、DsFv(二硫键稳定抗体)等。kFv是将％和\用一段适当的寡聚核苷酸(接头，linker)连起来，使之表达为单一的肽链。DsFv是在轻链可变区和重链可变区适当部位各引入一个半胱氨酸，形成一个二硫键固定的Fv段，经证实其结合能力及稳定性均优于&Fv。编码如下A)_C)中任一种蛋白的基因也属于本发明的保护范围A)所述Fab ；B)所述抗体；C)所述抗原结合片段A或所述抗原结合片段B。所述Fab和所述抗原结合片段A的重链可变区的编码序列均为序列表中序列观的第1-360位、序列沈的第1-360位、序列2和序列4中的任一种；所述Fab和所述抗原结合片段A的轻链可变区的编码序列均为序列表中序列32的第1-327位、序列30的第1-327位、序列16、序列10、序列12、序列8、序列14和序列6中的任一种；所述抗体和抗原结合片段B的重链可变区的编码序列均如序列表中序列2或序列4所示；所述抗体和抗原结合片段B的轻链可变区编码序列均如序列表中序列16、序列10、序列12、序列8、序列14和序列 6中的任一种所示。 其中，序列2和序列4均共有360个核苷酸；序列6、序列8、序列14、序列10、序列 12和序列16均共有327个核苷酸。 所述Fab的CHl的编码序列如序列表中序列34所示；所述Fab的轻链恒定区编码序列如序列表中序列20所示。所述抗体的重链恒定区的编码序列如序列表中序列18所示；所述抗体的轻链恒定区的编码序列如序列表中序列20所示。在本发明的实施例中，所述Fab的编码序列为下述cl)_c3)中任一种cl)KS-7F 所述Fab的重链片段的编码序列为序列表中序列28，且所述Fab的轻链编码序列为序列表中序列32 ；c2)KS-7A 所述Fab的重链片段的编码序列为序列表中序列26，且所述Fab的轻链编码序列为序列表中序列32 ；c3)KS-2E 所述Fab的重链片段的编码序列为序列表中序列26，且所述Fab的轻链编码序列为序列表中序列30 ；所述抗体的重链编码序列具体为序列表中序列22 ；所述抗体的轻链编码序列具体为序列表中序列24。其中序列22的第1-360位核苷酸为所述重链的可变区核苷酸，第360-1350位核苷酸为所述重链的恒定区核苷酸；其中序列M的第1-327位核苷酸为所述轻链的可变区核苷酸，第3观-642位核苷酸为所述轻链的恒定区核苷酸。本发明的又一个目的是提供下述遗传材料含有所述基因的重组载体、重组菌、重组细胞系、重组病毒或表达盒。所述重组载体为表达所述Fab或抗体或抗原结合片段的原核表达载体或真核表达载体。所述重组菌为携带有所述基因的大肠杆菌。所述重组细胞系可为转基因细胞系或融合细胞系，其中转基因细胞系可为转入本发明的抗人肿瘤坏死因子α人源化Fab或抗体或抗原结合片段编码基因的哺乳动物细胞系，优选CHO细胞系，或293细胞及其亚系；融合细胞系可为分泌本发明的抗人肿瘤坏死因子α人源化抗体的杂交瘤细胞。所述重组病毒为携带有所述基因的重组腺病毒或重组腺相关病毒等。所述表达盒是一个DNA分子，从上游至下游依次为如下三个片段启动子、由所述启动子启动转录的所述抗体或Fab，或所述抗原结合片段的编码基因和终止子。将含所述Fab，或所述抗体，或所述抗原结合片段编码基因的重组载体转染或转化宿主细胞，即可表达相应的蛋白，获得所述抗体或Fab，或所述抗原结合片段。所述宿主细胞可以是真核细胞，也可以是原核细胞，它们包含但不限于哺乳动物细胞、细菌、酵母、昆虫细胞等。可用于蛋白质大规模表达的哺乳动物细胞有多种，如293细胞、CHO细胞、SP20细胞、NSO细胞、COS细胞、BHK细胞或PerC6细胞等。转染细胞的方法有多种，其中包括但不限于电穿孔，脂质体介导法，钙介导法等。一种较佳的所述抗体或Fab，或所述抗原结合片段的表达方式是在已经稳定转染的宿主细胞中对重组载体进行基因扩增，以提高相应重组蛋白的表达量，例如用含有二氢叶酸还原酶(DHFR)的重组载体稳定转染缺乏DHFR的宿主细胞后，可在细胞培养液中添加氨甲喋啶(MTX)的浓度以扩增重组载体在宿主细胞中的拷贝数量。含有所述编码基因序列组合的Fab或IgG表达后，可用酶联免疫吸附法(ELISA) 或其他方法测定培养液中的蛋白浓度。对于Fab片段，可用ftOtein G亲和层析法提纯；IgG 蛋白可用ftOtein A亲和层析法提纯。所述Fab，或所述抗体，或所述抗原结合片段，或所述基因，或所述遗传材料的用途也属于本发明的保护范围dl)在制备预防和/或治疗人抗肿瘤坏死因子α相关疾病药物中的用途，或d2)在制备中和人抗肿瘤坏死因子α产品中的用途，或d3)在制备定性或定量检测人抗肿瘤坏死因子α的试剂盒中的用途。所述人肿瘤坏死因子α相关疾病为由人肿瘤坏死因子α升高引起的疾病；优选为类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、克隆病、斑片性银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎或幼年特发性关节炎。本发明的又一个目的是提供药物组合物，该药物组合物含有辅料和活性成分，所述活性成分含有下述物质中的至少一种所述Fab，所述抗体，所述抗原结合片段，所述基因，和所述遗传材料；所述辅料为药学上可接受的载体或赋形剂。上述药物组合物，可用于预防和/或治疗人肿瘤坏死因子α相关疾病，如自身免疫性葡萄膜炎或类风湿性关节炎。该药物组合物的活性成分也可只为上述任一 Fab或抗体，或上述任一所述抗原结合片段，或上述任一所述基因，或上述遗传材料中的任一种。本发明通过对CDR移植后的抗体进行突变改造，有力克服了常规抗体人源化方法 (将鼠源抗体可变区(VH、VK)的互补决定区(CDR)直接移植到人抗体框架中)导致抗体亲和力受损这一缺陷，最终得到与起始抗体相近的人源化抗体。本发明所提供的Fab及IgG 抗体的人源化程度大大提高(达95%以上)，且经实验证明具有与人鼠嵌合抗体Remicade 相近，甚至更高的亲和力及生物活性，对人TNF α具有更好的中和作用，可更有效地治疗与 TNFa相关的疾病，优选类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、克隆病、斑片性银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎或幼年特发性关节炎。


图1为Elisa检测人源化Fab抑制TNF α的生物活性。图2为细胞毒性实验检测人源化Fab中和TNF α的生物活性。图3为KSlO与不同种属抗原TNF α的结合情况。图4为KSlO对实验性类风湿性关节炎大鼠的治疗评分结果。由左至右依次为正常组、阴性组、模型组、KSlO 5mg/kg 组、KSlO 10mg/kg 组、KSlO 20mg/kg 组。图5为KSlO对实验性类风湿性关节炎大鼠关节滑液/组织IL-I β水平的影响。 由左至右依次为正常组、阴性组、模型组、KSlO 5mg/kg组、KSlO 10mg/kg组、KS1020mg/kg组。图6为KSlO对实验性类风湿性关节炎大鼠关节滑液/组织IL-6水平的影响。由左至右依次为正常组、阴性组、模型组、KSlO 5mg/kg组、KSlO 10mg/kg组、KS1020mg/kg组。
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具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明描述的人源化TNF α抗体重轻链的⑶R移植，PCR引入位点突变及突变文库的筛选是通过常规基因重组技术及基于抗原抗体相互作用的免疫学技术所完成，具体实验方法步骤如<<分子克隆>>第三版(Jos印h Sambrook，科学出版社，2002年8月1日) 及类似实验手册所记载。实施例中涉及到的EC50是将测得的OD值(0D450)输入graphpad prism5软件获得的，同时获得相关结果图。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1、人源化TNF α抗体Fab的表达及活性检测本实施例涉及三种人源化TNF α抗体Fab (Fab由抗体的重链Fd片段和抗体的轻链组成)，分别是 KS-2E、KS-7A、KS-7F。一、KS-2E、KS-7A、KS-7F 表达载体的构建(一)轻链、重链的获得以人TNF-α (R&D公司，货号210-TA_050)免疫鼠获得的杂交瘤细胞，经过单克隆筛选后，提取总RNA为模板，利用通用引物Pl 5-GCGAATTCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3, P2 :5-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3引导进行PCR扩增重链可变区序列，通用引物 P3 5-GACATTCTGMTSACMCAGMCTCC-3, P4 5-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC-3 引导进行 PCR 扩增轻链可变区序列，切胶回收目的条带，将扩增获得的抗体轻链和重链的产物分别插入到PMD18-T载体(TaKaRa公司货号D101C)中，分别挑取单菌落，经过测序鉴定获得抗体重链和轻链可变区序列。( 二)人源化Fab的构建将轻链可变区与人源化抗体的轻链可变区进行氨基酸序列相似性比对，将重链可变区与人源化抗体的重链可变区进行氨基酸序列相似性比对，通过Ig BLAST(http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/igblast/)禾口 IMGT (免疫基因数据库 IMGT :http //www. imgt. org)中分别进行序列相似性搜索，在搜索的结果中，选择与轻、重链均有较高序列相似性的抗体作为人源化抗体模板，将获得的重链可变区VH移植到序列相似度较高的人抗体 IGHV3-15*07 (Accession number :M99406)的框架之中，对获得轻链可变区VK移植到相似度较高的人抗体IGKV6-21*01 (Accession number :X63399)的框架之中。在经过对重链片段(Fd)和轻链人源序列经过多轮的突变后，将不同的轻链和重链片段(Fd)组合插入到pTLR载体(经过改造的pET22b(+)载体)中。具体操作为，制备两端分别含有酶切位点BamHI和EcoRI的各轻链DNA，以及两端分别含有酶切位点NotI和 XhoI的各重链片段尔(1)0嫩，将这两个0嫩分别克隆入？11^载体(经过改造的pET22b(+) 载体)中的相应限制性内切酶位点之间，即各轻链DNA分别插入到限制性内切酶BamHI和 EcoRI位点之间，各重链片段(Fd)DNA分别插入到限制性内切酶NotI和BioI位点之间，构建数个Fab表达载体(包括分别表达KS-2E、KS-7A和KS-7F的三个Fab表达载体)。其中，上述不同的轻链和重链片段(Fd)组合中包括KS-2E、KS-7F、KS-7A这三个
10Fab。KS-2E的重链片段氨基酸序列为序列表中序列25，核苷酸序列为序列26，轻链氨基酸序列为序列表中序列四，核苷酸序列为序列30 ；KS-7A的重链片段氨基酸序列为序列表中序列25，核苷酸序列为序列26，轻链氨基酸序列为序列表中序列31，核苷酸序列为32 ； KS-7F的重链片段氨基酸序列为序列表中序列27，核苷酸序列为序列观，轻链氨基酸序列为序列表中序列31，核苷酸序列为序列32。对pET22b(+)载体进行改造获得上述pTLR载体的具体方法如下首先通过人工合成一段含有T7启动子(T7 promoter)、乳糖操纵子(lac operator)、核糖体结合位点(RBS) 序列以及两端包含有Mil和NotI酶切位点的DNA片段(简称，T-L-R DNA序列，如序列表中序列35所示)，pET22b (+)载体(美国Novage公司产品)和T-L-R DNA序列分别用Sal I和Not I双酶切后，T4连接酶连接后转化，常规方法挑单克隆测序筛选出正确改造的载体。二、KS-2E、KS-7A、KS-7F 的原核表达将上述构建的Fab表达载体(包括分别表达KS-2E、KS_7A和KS-7F的三个Fab表达载体)分别转化大肠杆菌ToplO，涂氯霉素抗性2-YT平板(蛋白胨1.6%，酵母提取物 1%, NaCl 0. 5%，琼脂粉1. 5% )。第二天选择合适菌落密度的板挑取单克隆菌落，每个阳性克隆挑8个单克隆到96孔深孔板里IPTG诱导表达，每个单克隆菌落加入到6ml含氯霉素的2-YT液体培养基(蛋白胨1.6%，酵母提取物1%，NaCl 0.5% )中，于37°C 250rpm 摇12小时，每管中取0. 2 μ 1菌液在氯霉素抗性的2-ΥΤ平板上保菌。将5ml菌液接种到 500ml氯霉素抗性2-YT液体培养基，33 °C，300rmp培养至OD600为0. 6。在培养基中加入 IPTG至终浓度为50 μ Μ,诱导不同Fab蛋白表达，诱导时间为3h。将诱导表达结束后的培养液在5100rpm，10°C条件下，离心15min，弃上清，沉淀用40ml预冷的TES溶液充分重悬菌体沉淀；重悬后再加入66ml预冷的1/5TES溶液到重悬后的菌液中，冰上孵育40min ；冰浴结束后，13000rpm，4°C，离心IOmin ；离心后收集上清，上清即为含有Fab蛋白(KS-2E、KS-7A 或KS-7F蛋白)的细胞周质提取液。周质提取液过G-25 (GE公司，17-0034-01)柱脱盐处理后，准备ftOtein G(GE公司17-0618-04)预装柱，平衡液(20mM磷酸缓冲液pH 6.5)平衡后蛋白上样，上样结束后继续用平衡液清洗柱子，然后用洗脱液(0. IM Gly-HCl, pH2. 5) 直接洗脱，收集洗脱样品，并预先在收集样品前按照Tris缓冲液与样品体积比1 9加入 LOM Tris-HCl (pH9. 0)于样品收集管里，快速调pH7. 0，收集到的液体即为目的蛋白，蛋白经过SDS-PAGE分析纯度后，对蛋白样品进行浓度测定，最后分装后保存于-80°C，得到纯度较高的Fab蛋白(包括KS-2E、KS-7A和KS-7F这三个蛋白)。三、KS-2E、KS-7A、KS-7F的活性检测1、ELISA法检测人源化Fab与TNF α的结合能力以每孔IOOng的人源TNF α (R&D公司，商品目录号为210-ΤΑ-050)为底物包被酶标板，然后分别加入一系列2倍稀释的40ηΜ抗体Fab (步骤二制备的Fab蛋白，包括KS-2E、 KS-7A和KS-7F这三个蛋白)温育后，再加辣根过氧化酶标记的羊抗人C-Kappa二抗(Sigma 公司，产品目录号为K3502)，最后加TMB显色，加入2M硫酸终止反应，从而检测结合TNF α 的Fab蛋白，经过这样的筛选方法获得了 3个活性较高的Fab :KS_2E、KS-7F、KS_7A，共包含了 2个不同的VH (VH01和VH02，VH01的氨基酸序列如序列25 ；核苷酸序列如序列沈；VH02 的氨基酸序列如序列27 ；核苷酸序列如序列28)和2个不同的VK(VK03和VK05，VK03的氨基酸序列如序列四；核苷酸序列如序列30 ；VK05的氨基酸序列如序列31 ；核苷酸序列如序
11列 32)(表 1)。ELISA法检测人源化Fab与TNF α的结合能力的实验结果在图1中显示。结果表明上述获得的3个人源化Fab和人鼠嵌合抗体Remicade的Fab片段具有相似的抗原亲和力，其中KS-7A和KS-7F结合TNF α的EC5tl优于人鼠嵌合抗体Remicade Fab (表2)。表1人源化TNF- α抗体的Fab
权利要求
1.抗人肿瘤坏死因子α的人源化抗原结合片段Fab，含有重链可变区和轻链可变区； 所述Fab的氨基酸序列为下述al)_a2)中任一种al)所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列27的第1-120位或序列25的第 1-120位，所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列31的的第1-109位或序列四的第 1-109 位；a2)所述重链可变区的氨基酸序列为序列表中序列1或序列3，所述轻链可变区的氨基酸序列为序列表中序列15、序列9、序列11、序列7、序列13和序列5中的任一种；所述序列1的第一位氨基酸残基为Glu或Gin。
2.根据权利要求1所述的Fab，其特征在于所述Fab由重链片段和轻链组成，所述重链片段由所述重链可变区和重链恒定区的CHl组成，所述轻链由所述轻链可变区和轻链恒定区组成；所述CHl氨基酸序列与人抗体重链恒定区的CHl氨基酸序列相同，所述轻链恒定区氨基酸序列与人抗体轻链恒定区氨基酸序列相同；所述CHl氨基酸序列如序列表中序列33所示；所述轻链恒定区氨基酸序列如序列表中序列19所示。
3.根据权利要求1或2所述的Fab，其特征在于所述Fab为下述bl)-b;3)中任一种bl)KS-7F 所述重链片段的氨基酸序列为序列表中序列27，且所述轻链的氨基酸序列为序列表中序列31 ；b2)KS-7A 所述重链片段的氨基酸序列为序列表中序列25，且所述轻链的氨基酸序列为序列表中序列31 ；b3)KS-2E 所述重链片段的氨基酸序列为序列表中序列25，且所述轻链的氨基酸序列为序列表中序列四。
4.抗人肿瘤坏死因子α的人源化抗体，含有重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区由权利要求3的bl)所述Fab的重链可变区突变而来，所述轻链可变区由权利要求3的 bl)所述Fab的轻链可变区突变而来，其特征在于所述抗体的重链可变区氨基酸序列为序列表中序列1或序列3 ；所述抗体的轻链可变区氨基酸序列为序列表中序列序列15、序列 9、序列11、序列7、序列13和序列5中的任一种；所述序列1的第一位氨基酸残基为Glu或Gin。
5.根据权利要求4所述抗体，其特征在于所述抗体为下述a-Ι中任一种a、KS10，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH08，氨基酸序列为序列15 ；b、KS03，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH05，氨基酸序列为序列9 ；c、KS06，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH06，氨基酸序列为序列11 ；d、KS12，其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH08，氨基酸序列为为序列15 ；e、KS04，其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH05，氨基酸序列为序列9 ；f> KS07，其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH06，氨基酸序列为序列11 ；g、KS02，其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH03，氨基酸序列为序列5 ；h、KS08，其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH04，氨基酸序列为序列7 ；i、KS11，其重链可变区为SH02，氨基酸序列为序列3，轻链可变区为SH07，氨基酸序列为序列13 ；j、KS01，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH03，氨基酸序列为序列5 ；k、KS05，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH04，氨基酸序列为序列7 ；l、KS09，其重链可变区为SH01，氨基酸序列为序列1，轻链可变区为SH07，氨基酸序列为序列13 ；所述序列1的第一位氨基酸残基为Glu或Gin。
6.根据权利要求4或5所述抗体，其特征在于所述抗体由重链和轻链组成，所述重链的恒定区氨基酸序列与人抗体重链恒定区氨基酸序列相同，所述轻链的恒定区氨基酸序列与人抗体轻链恒定区氨基酸序列相同；所述重链的恒定区氨基酸序列如序列表中序列17所示；所述轻链的恒定区氨基酸序列如序列表中序列19所示。
7.根据权利要求4-6中任一所述的抗体，其特征在于所述重链的氨基酸序列为序列表中序列21 ；所述轻链的氨基酸序列为序列表中序列23 ；所述序列21的第一位氨基酸残基为Glu或Gin。
8.由权利要求1-3中任一所述Fab衍生的抗原结合片段A或由权利要求4-7中任一所述抗体衍生的抗原结合片段B，其特征在于所述抗原结合片段A为Fab’、F(ab’)2、Fv、重链可变区、轻链可变区、选自重链可变区的多肽片段或选自轻链可变区的多肽片段；所述抗原结合片段B为Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、重链可变区、轻链可变区、选自重链可变区的多肽片段或选自轻链可变区的多肽片段。
9.编码如下A)-C)中任一种蛋白的基因A)权利要求1-3中任一所述Fab；B)权利要求4-7中任一所述抗体；C)权利要求8所述抗原结合片段。
10.根据权利要求9所述的基因，其特征在于权利要求1-3中任一所述Fab和权利要求8所述抗原结合片段A的重链可变区的编码序列均为序列表中序列观的第1-360位、序列沈的第1-360位、序列2和序列4中的任一种；权利要求1-3中任一所述Fab和权利要求8所述抗原结合片段A的轻链可变区的编码序列均为序列表中序列32的第1-327位、序列30的第1-327位、序列16、序列10、序列12、序列8、序列14和序列6中的任一种；权利要求4-7中任一所述抗体和权利要求8所述抗原结合片段B的重链可变区的编码序列均如序列表中序列2或序列4所示；权利要求4-7中任一所述抗体和权利要求8所述抗原结合片段B的轻链可变区编码序列均如序列表中序列16、序列10、序列12、序列8、序列14和序列6中的任一种所示。
11.根据权利要求9或10所述的基因，其特征在于所述Fab的CHl的编码序列如序列表中序列；34所示；所述Fab的轻链恒定区编码序列如序列表中序列20所示；所述抗体的重链恒定区的编码序列如序列表中序列18所示；所述抗体的轻链恒定区的编码序列如序列表中序列20所示。
12.根据权利要求9-11中任一所述的基因，其特征在于所述Fab的编码序列为下述 cl)-c3)中任一种cl)KS-7F 所述Fab的重链片段的编码序列为序列表中序列观，且所述Fab的轻链编码序列为序列表中序列32 ；c2)KS-7A 所述Fab的重链片段的编码序列为序列表中序列沈，且所述Fab的轻链编码序列为序列表中序列32 ；c3)KS-2E 所述Fab的重链片段的编码序列为序列表中序列沈，且所述Fab的轻链编码序列为序列表中序列30 ；所述抗体的重链编码序列为序列表中序列22 ；所述抗体的轻链编码序列为序列表中序列24。
13.下述遗传材料含有权利要求9-12中任一所述基因的重组载体、重组菌、重组细胞系、重组病毒或表达盒。
14.根据权利要求13所述的遗传材料，其特征在于所述重组载体为表达所述Fab或抗体或抗原结合片段的原核表达载体或真核表达载体；所述重组菌为携带有所述基因的大肠杆菌；所述重组细胞系为转入所述基因的哺乳动物细胞系，优选CHO细胞系，或293细胞及其亚系；所述重组病毒为携带有所述基因的重组腺病毒或重组腺相关病毒。
15.权利要求1-3中任一所述Fab，或权利要求4-7中任一所述抗体，或权利要求8所述抗原结合片段，或权利要求9-12中任一所述的基因，或权利要求13或14所述遗传材料的用途dl)在制备预防和/或治疗人抗肿瘤坏死因子α相关疾病药物中的用途，或d2)在制备中和人抗肿瘤坏死因子α产品中的用途，或d3)在制备定性或定量检测人抗肿瘤坏死因子α的试剂盒中的用途。
16.根据权利要求15所述用途，其特征在于所述人肿瘤坏死因子α相关疾病为由人肿瘤坏死因子α升高引起的疾病，优选为类风湿性关节炎、自身免疫性葡萄膜炎、克隆病、 斑片性银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎或幼年特发性关节炎。
17.药物组合物，含有辅料和活性成分，所述活性成分含有下述物质中的至少一种权利要求1-3中任一所述Fab，权利要求4-7中任一所述抗体，权利要求8所述抗原结合片段， 权利要求9-12中任一所述的基因，和权利要求13或14所述遗传材料；所述辅料为药学上可接受的载体或赋形剂。
全文摘要
本发明公开了一种抗人肿瘤坏死因子α的人源化Fab和人源化抗体及其用途。本发明所提供的人源化Fab含有氨基酸序列如序列27的第1-120位、序列25的第1-120位、序列1或序列3所示的重链可变区，和氨基酸序列如序列31的第1-109位、序列29的第1-109位、序列15、序列9、序列11、序列7、序列13或序列5所示的轻链可变区。本发明所提供的人源化抗体含有氨基酸序列如序列1或序列3所示的重链可变区，和氨基酸序列如序列15、序列9、序列11、序列7、序列13和序列5中的任一种所示的轻链可变区。本发明所提供的人源化Fab和人源化抗体具有较高的亲和力和生物活性，能很好地中和人TNFα，有效的治疗TNFα相关疾病。
文档编号A61P29/00GK102443063SQ20111029481
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者柯潇, 高小平 申请人:成都康弘生物科技有限公司