专利名称：多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物领域，具体涉及用于治疗或预防类风湿性关节炎的多肽。
背景技术：
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是临床最常见的炎性关节病和主要致残因素之一。在全世界约为0.5%-1.0%，RA的发病在我国约为0.4%。RA可发生于任何年龄，随着年龄的增长，发病率也随之增高。女性高发年龄为45-55岁，性别与RA发病关系密切，男女之比约1 3。RA是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。患者常以手部或腕部疼痛及肿胀(特别是腕背部的肿胀)为首发症状，症状持续不缓解，普通的对症治疗虽可以缓解症状，但常常由于用药不规则或不足量而导致症状反复。病情进展时可以出现明显的晨僵，通常可达1小时以上，并不断加重；同时出现一定的关节功能障碍。类风湿关节炎的病因和发病机制尚未完全明了，其基本病理特点是血管炎和滑膜炎。关节内滑膜血管增生，形成血管翳，导致滑膜增厚，渗出增多，分泌多种细胞因子，侵犯软骨并引起骨质损害。对其周围的肌腔、韧带、腱鞘以及肌肉等组织也均可侵蚀，从而影响关节的稳定，容易发生关节畸形而出现功能障碍。血管炎亦可侵犯周身各脏器组织，形成系统性疾病。目前治疗RA的药物分为两大类控制症状药和控制疾病药。控制症状的抗风湿药分为四类一、非留体类抗炎药，通常称为一线药，这类药物种类繁多，国内市场已多达数十种。二、类固醇激素，激素是一个非常好的止痛抗炎药，但长期单独使用不能改善病情，反而带来许多副作用，激素作为二线慢作用药起效前的过渡性用是可以的，但用量要小，时间不宜过长。在病情较重，伴有关节外表现的患者，短期治疗冲击，并联合二线药治疗时必须的。 三、慢作用抗风湿药，通常称为二线药，所谓慢作用药包括抗疟药、金盐、青霉胺和柳氮碘胺吡啶，它们治疗RA起效慢，长期作用对RA病情有一定缓解作用，故也称病情改善药。四、免疫抑制剂常用有甲氨喋呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤、雷公藤、青风藤等。RA的病理过程中，血管新生是一种标志性的组织学改变，新生血管形成伴随滑膜增生和炎细胞浸润，是RA中血管翳形成及关节破坏的基础。原来应该没有血管存在的关节软骨因某种异常变化，而形成新的血管，使得软骨受到侵蚀，造成关节变形或疼痛。新生血管引起类风湿关节炎患者滑膜组织发生异常变化，正常人的关节滑膜内层仅1-2层细胞组成，而RA患者的滑膜内层通常有4-10层细胞(有时甚至超过20层)。这些细胞不仅在数量上异常增多，而且在功能上处于异常活跃的状态，它们可以分泌大量的细胞因子、信号分子和蛋白酶，加速关节破坏的进程。另外，RA滑膜中还有大量炎性细胞的浸润，如T细胞、B 细胞和单核细胞。新生血管生成，在正常生理条件下，受到高度调节，在生殖、胚胎发育、组织修复和创伤愈合中是必不可少的过程。血管生成在多种病理条件下也会发生，所述病理条件包括 肿瘤生长和转移；炎性障碍，例如类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、炎性肠病、克隆病、溃疡性结肠类以及其它炎性障碍。
整合素是一类广泛分布于细胞表面的受体，能介导细胞与细胞外基质及细胞与细胞之间的相互黏附，它们通过连接胞内细胞骨架蛋白和细胞外基质分子的相互作用参与血管生成。目前至少有8种的整合素(α β 、α 2β U α 3β U α6β1、α6β4、α 5β U α ν β 3、α ν β 5)参与血管生成，其中α ν β 3发挥着重要作用。α ν β 3能识别配体分子中的精-甘-天冬序列(arg-gly-aSp，RGD)。α ν β 3可以表达于多种细胞类型，并与多细胞活动过程中的多种配体结合参与肿瘤的血管生成、侵袭、转移、炎症、伤口愈合和凝血等生理和病理过程。因此，含有RGD序列的多肽具有整合素拮抗剂作用，RGD序列可以作为一种载体，靶向运输到新生血管内皮，从而对新生血管性疾病达到更高效率的治疗。因此， 血管抑制多肽通过抑制血管生成不仅可阻止向滑膜输送氧气和营养物质，且直接导致血管退化，从而可能抑制RA滑膜增生。抑制新生血管的形成是治疗这类疾病的关键，而内皮细胞的增殖和迁移是新生血管形成的关键步骤。
研究发现,序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (见 kq NO. 4) 是内皮抑素的第60-70个氨基酸，在体外具有很好的抑制新生血管生成的活性，其活性甚至高于内皮抑素本身。RGD-4C序列是整合素的一个重要配体。因此，含有RGD-4C序列的多月太 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly (见 kq NO. 5)能够特异性的识别整合素。本发明多肽是在具有抑制血管生成作用的序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro的N端连接上与整合素家族具有亲和性和结合能力的含有 RGD-4C 序列 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly,构建了一种与整合素有高亲和性和结合能力的多肽即多肽I。该整合素阻断剂多肽序列为=Ala-Cys-A sp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-CyS-Gly-Gly-Gly-Gly-IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Al a-Ala-Val-Pro，其含有25个氨基酸，分子中RGD-4C序列具有整合素亲和性和结合能力，研究表明其作用靶点为整合素α ν β 3，并且该序列中含有新生血管抑制序列，从而抑制肿瘤新生血管形成。虽然在先前的专利ZL200510040378. 5公开了该序列对黑色瘤有治疗效果， 但并未公开对其他疾病的治疗效果。发明人经过大量实验获知，多肽I对胶原型关节炎和佐剂型关节炎都有明显的疗效，且副作用小、用量少、成本低。说明本发明设计的多肽科学、 合理、可行有效，能作为制备治疗类风湿性关节炎的治疗药物，极大拓展了该整合素阻断剂的治疗谱，为将来药物开发提供了新的思路和前景，具有显著的社会价值和市场价值。
ZL200510040378. 5高效抑制血管生成多肽及其制备方法和应用，还介绍了一种多肽，其序列为 Jle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp (即多肽II)，该序列包含了整合素配体序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp (见 Seq NO. 6))和新生血管抑制序列(Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro)，其中整合素配体序列中含有RGD序列(Arg-Gly-Asp)，使该多肽序列可以有效地结合于整合素亚型，并且该序列中含有新生血管抑制序列，能够新生血管形成。先前专利中只是对黑色素瘤做了研究，本发明针对该序列做了进一步研究，发现其对类风湿性关节炎有治疗作用， 增加了其适用症，拓展了其社会价值和经济价值。
另外本发明还将多肽11进行PEG修饰得到了多肽III :mPEG-SC20k-IIe-Val-Arg-A rg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp,专利 201110128464. 7 介绍了多肽III在制备治疗新生血管性眼病中的作用，本发明针对该序列做了进一步研究，发现其对类风湿性关节炎有治疗作用，增加了其适用症，拓展了其社会价值和经济价值。
发明内容
发明目的本发明针对以下三个多肽即多肽I =Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cy s-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (序列中含有两对二硫键，配对方式为 1-4、2-3)；多肽 II Jle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro -Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp 和多肽 III :mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg -Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp 做了大量实验研究，发现其对类风湿性关节炎均具有很好预防和治疗作用。技术方案多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用，其中所述的多肽的氨基酸序列为多肽 I:Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Va I-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (命名为 AP25，见 Seq NO. 1)；多肽 II Jle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-A rg-Gly_Asp(命名为圓_3，见 kq NO. 2)；多肽 III :mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly -Gly-Gly-Arg-Gly-Asp (命名为 PEG-HM-3，见 kqNO. 3)。所述的多肽I、多肽II、多肽III是通过固相合成方法或通过重组表达体的方法制备而得。所述的多肽I、多肽II、多肽III共价连接佐剂，佐剂是牛血清白蛋白，人血清白蛋
白，或聚乙二醇。所述的治疗或预防类风湿性关节炎药物含有有效量多肽I、多肽II、多肽III可接受的盐，或必要时药学上可接受的载体/者赋形剂。所述的药物可通过多种给药方式预防或治疗类风湿性关节炎，包括皮下或肌肉注射，静脉注射或者静脉滴注，口服给药如药丸、胶囊等，鼻喷剂。有益结果1.先前研究发现多肽I、多肽II、多肽III具有较好的抗肿瘤效果，本发明针对多肽I、多肽II、多肽III又做了大量研究，发现多肽I、多肽II、多肽III对类风湿性关节炎也具有很好的疗效，多肽I、多肽II、多肽III在类风湿关节炎方面的治疗作用未有文献报道和专利申请，本发明发现的多肽I、多肽II、多肽III在类风湿关节炎方面的治疗作用是另一重大的发现和发明，增加了其适用症，拓展了其社会价值和经济价值。2.作用机制介绍研究发现，序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro 具有抑制新生血管生成的活性。RGD-4C序列是整合素的一个重要配体。因此，含有RGD-4C序列的多肽A Ia-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly 能够特异性的识别整合素。 本发明多肽是在具有抑制血管生成作用的序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-V
5al-Pro的N端连接上与整合素家族具有亲和性和结合能力的含有RGD-4C序列Ala-Cys-A sp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly，构建了一种与整合素有高亲和性和结合能力的多肽即多肽I。该整合素阻断剂多肽序列为Ala-CyS-ASp-CyS-Arg-Gly-ASp-Cys-Phe-CyS-Gly-Gly-Gly-Gly-IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro,分子中RGD-4C序列具有靶向性，具有整合素亲和性和结合能力，研究表明其作用靶点为整合素 α ν β 3，并且该序列中含有新生血管抑制序列，从而抑制新生血管形成。Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-A sp (即多肽II)，该序列包含了整合素配体序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp)和新生血管抑制序列(Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro)，其中整合素配体序列中含有RGD序列(Arg-Gly-Asp)，具有靶向性，使该多肽序列可以有效地结合于整合素亚型， 并且该序列中含有新生血管抑制序列，能够新生血管形成。另外本发明还将多肽II进行 PEG 修饰得到了多肽 III :mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-G Iy-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp，延长了半衰期，由于RGD序列的靶向性，多肽可以靶向到RA 中关节处血管翳形成过程中新生血管内皮，抑制新生血管形成，进而达到预防或治疗类风湿性关节炎的效果。发明人经过大量实验获知多肽I、多肽II和多肽III能够抑制佐剂型大鼠类风湿关节炎和DBA/1小鼠胶原型类风湿性关节炎的发展，体内实验证明具有显著的治疗类风湿型关节炎的效果，并且副作用少，用量少成本降低。说明本发明设计的多肽科学、合理、可行有效，能作为治疗或预防类风湿性关节炎药物，极大拓展了该多肽的疾病治疗范围，为将来药物开发提供了新的思路和前景，具有显著的社会价值和市场价值。
附图1多肽I对DBA/1小鼠胶原型关节炎模型足爪肿胀度的影响；附图2多肽I对DBA/1小鼠胶原型关节炎模型关节肿胀度的影响；附图3多肽I对DBA/1小鼠胶原型关节炎模型四肢关节临床评分的影响；附图4多肽I对佐剂型原发性关节炎模型大鼠左足足爪肿胀度的影响；附图5多肽I对佐剂型继发性关节炎模型大鼠右足足爪肿胀度的影响；附图6多肽I对大鼠佐剂型关节炎模型四肢关节临床评分的影响；附图7多肽II对DBA/1小鼠胶原型关节炎模型足爪肿胀度的影响；附图8多肽II对DBA/1小鼠胶原型关节炎模型关节肿胀度的影响；附图9多肽II对DBA/1小鼠胶原型关节炎模型四肢关节临床评分的影响；附图10多肽II对佐剂型原发性关节炎模型大鼠左足足爪肿胀度的影响；附图11多肽II对佐剂型继发性关节炎模型大鼠右足足爪肿胀度的影响；附图12多肽II对大鼠佐剂型关节炎模型四肢关节临床评分的影响；附图13多肽III对DBA/1小鼠胶原型关节炎模型足爪肿胀度的影响；附图14多肽III对DBA/1小鼠胶原型关节炎模型关节肿胀度的影响；附图15多肽III对DBA/1小鼠胶原型关节炎模型四肢关节临床评分的影响；附图16多肽III对佐剂型原发性关节炎模型大鼠左足足爪肿胀度的影响；附图17多肽III对佐剂型继发性关节炎模型大鼠右足足爪肿胀度的影响；
附图18多肽III对大鼠佐剂型关节炎模型四肢关节临床评分的影响；具体实施方式
实施例1
多肽I、多肽II和多肽III均采用固相合成法合成，采用高效液相色谱法纯化，并采用RP-HPLC测定多肽的纯度。合成方法参照专利201110194918. 0和201110370529. 9。
结果合成的多肽经反向液相色谱分析进行纯度鉴定结果如下多肽I、多肽II和多肽III纯度分别为96. 94%,99. 30%,96. 34%纯度均大于95%，符合设计要求。
实施例2
多肽I在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用
构建胶原型小鼠关节炎动物模型，研究多肽对小鼠胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis, CIA)的治疗作用。采用小鼠作为受试动物，SPF级DBA/1小鼠90只 (由上海西普尔-必凯实验动物有限公司(Sino-British SIPPR Lab. Animal Ltd)提供，动物生产许可证号码SCXK (沪)2008-0016)，雄性，7-8周龄，体重为18_22g，随机分成9组， 分别是正常对照组，模型对照组，多肽I低中高3个剂量组(0. 2,0. 4,0. 8mg/kg)和阳性药对照组(甲氨蝶呤lmg/kg)。除正常组外，第0天各实验组建立小鼠CIA模型，方法是鸡软骨II型胶原(cll)用0. lmol/1醋酸溶解成％ig/ml的溶液，于4°C冰箱过夜。实验当天用 II 型胶原与含4mg/ml Myeobaeterium tuberculosis strain H37Rv 的完全弗氏佐剂(CFA) 等体积充分乳化，待DBA/1小鼠麻醉后，于其尾部皮内每只注射乳化剂50 μ 1进行致敏，21d 后用％ig/ml的II型胶原(cll)与不完全弗氏佐剂(IFA)等体积充分乳化后以相同剂量的乳化剂于尾部进行再次免疫。造模第30d起皮下注射给药多肽13个剂量组(0.2，0.4， 0. 8mg/kg)每日两次，连续10天；阳性药对照组(甲氨蝶呤lmg/kg)每五天一次，连续3 次；正常对照组和模型对照组(生理盐水)连续10天。分别于造模后第21天至第70天每 3天称量体重、关节评分、分别检测左右后足足踝直径来观察药物对小鼠胶原型关节炎的影响。在第70d，脱臼处死小鼠。
关节炎评价指标如下
1)关节评分
四肢按0-4五级评分0 =无红斑或红肿；1 =轻微的红斑或肿胀，其中的一个前 /后趾关节有红斑或肿胀；2 =多于一只趾出现红斑或肿胀；3 =踝或腕关节下的足爪肿胀； 4 =包括踝关节在内的全部足爪肿胀。小鼠四只足分别评分，最高评分为16分。
分别于造模后第21天至第70天每3天进行关节评分，并记录结果。
2)测量足踝直径
分别于造模前和造模后第21天至第70天每3天用游标卡尺测量小鼠左、右足踝内侧到外侧的直径和足踝厚度，并记录结果。
试验结果的计量资料以数学平均数加减标准差(mean士SD)表示，用SPSS 11. 0软件进行各给药组与对照组之间进行t检验，表中*表示ρ < 0. 05，**表示ρ < 0. 01。
结果造模后小鼠与正常小鼠相比较，在小鼠尾部皮内注射含灭活的结核分枝杆菌完全弗氏佐剂和胶原等体积混合的乳化剂，21天后尾部皮内注射不完全弗氏佐剂和胶原等体积混合的乳化剂左后，免疫后第27天，CIA小鼠足爪红肿，关节炎指数评分增高，模型组第45-60天为肿胀高峰，模型组自第35天开始体重几乎不增加，后期还略微有下降。多肽在胶原诱导小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用见表1。由表可知，多肽I在胶原诱导小鼠关节炎动物模型都能发挥体内免疫保护作用，具体结果如下多肽I对小鼠胶原型关节炎足爪肿胀度的影响见图1，阳性对照组、多肽I高、中、 低剂量组足爪肿胀度与模型组比较，均有极显著性差异(P < 0.01)实验结果具有统计学意义。多肽I对小鼠胶原型关节炎关节肿胀度的影响见图2，阳性对照组、多肽I高、中、低剂量组关节肿胀度与模型组比较，均有极显著性差异(P <0.01)，实验结果具有统计学意义。 多肽I对胶原型关节炎小鼠临床评分的影响见图3，多肽I低、中、高剂量组四肢评分显著低于模型对照组(P < 0.01)，与模型对照组比较极显著性差异，实验结果具有统计学意义。表1多肽I对胶原型类小鼠关节炎动物模型体内免疫保护作用
权利要求
1.多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用，其中所述的多肽的氨基酸序列为多月太 I Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-CyS-Gly-Gly-Gly-Gly-IIe-Val-Ar g-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro ；多肽 II Jle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-G Iy-Asp ；多肽 III:mPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-G Iy-Gly-Arg-Gly-Asp0
2.根据权利要求1所述的多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于所述的多肽I、多肽II、多肽III是通过合成方法或通过重组表达体的方法制备而得。
3.根据权利要求1所述的多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于所述的多肽I、多肽II、多肽III可共价连接佐剂，佐剂是牛血清白蛋白，人血清白蛋白，或聚乙二醇。
4.根据权利要求1所述的多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于所述的治疗或预防类风湿性关节炎药物含有有效量多肽I、多肽II、多肽III可接受的盐，或必要时药学上可接受的载体/者赋形剂。
5.根据权利要求1所述的多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于所述的药物可通过多种给药方式预防或治疗类风湿性关节炎，包括皮下或肌肉注射，静脉注射或者静脉滴注，口服给药如药丸、胶囊等，鼻喷剂。
全文摘要
本发明涉及药物领域，具体涉及具有整合素亲和性和结合能力的多肽，其中包括三个多肽，可用于类风湿性关节炎的预防和治疗。所述的三个多肽具体是指多肽IAla-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)；多肽IIIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp；多肽IIImPEG-SC20k-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。该多肽可用于治疗类风湿性关节炎。
文档编号A61K38/16GK102499980SQ20111044306
公开日2012年6月20日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者徐寒梅, 沈鸿, 浦春艳 申请人:中国药科大学