用于因子xa抑制剂的解毒剂和其使用方法

专利名称：用于因子xa抑制剂的解毒剂和其使用方法
技术领域：
本发明涉及因子叙^乂幻衍生物的用途，所述因子fe(fXa)衍生物具有降低的固有促凝血活性或没有固有促凝血活性，但能够结合和/或中和fXa抑制剂，由此作为靶向 fXa的抗凝血剂的解毒剂。
背景技术：
市场上在治疗或预防在不活动时或正接受医疗手术时易于形成血凝块的患者 (例如，那些患有凝血病症的患者)的不期望血栓形成时需要抗凝血剂。然而，抗凝血疗法的一个重要限制是与治疗有关的出血风险，且在服用过量或如果需要紧急手术的情况下限制了迅速逆转抗凝血活性的能力。因此，业内极为期望针对所有形式的抗凝血疗法的特定且有效解毒剂。出于安全考虑，同样有利的是在研发新的抗凝血剂药物中获得抗凝血剂-解毒剂对。目前对于过度抗凝血可用的抗凝血剂-解毒剂对是肝素-鱼精蛋白和华法林 (warfarin)-维生素K。新鲜的冷冻血浆和重组因子VIIa(rfVIIa)也已用作在低分子量肝素治疗中正经受严重创伤或严重失血的患者的非特异性解毒剂。(劳里岑(LaUritzen，B.) 等人，血液(Blood), 2005，607A-608A。)还报导了鱼精蛋白片段(美国专利第6，624，141 号)和小的合成肽(美国专利第6，200，955号)作为肝素或低分子量肝素解毒剂；和凝血酶突变蛋白质(美国专利第6，060, 300号)作为凝血酶抑制剂的解毒剂。已报导将凝血酶原中间产物和衍生物作为水蛭素和合成凝血酶抑制剂的解毒剂(美国专利第5，817，309号和第 6，086，871 号)。抗凝血疗法的一种有希望的形式靶向因子fe(fXa)，且实际上，目前在临床研发的不同阶段中有多种直接《a抑制剂用于抗凝血疗法中。这些中的大多数是小分子。尽管这些新的《a抑制剂展示有希望用于治疗，但仍需要特定且有效的解毒剂。在过度抗凝血或利用这些《a抑制剂治疗的患者需要手术的情况下，可能需要一种试剂来实质上中和所投与的一种或多种fXa抑制剂并恢复正常止血。目前可用试剂(例如重组因子Vila(rfVIIa))是以机械方式进行限制且并非特定用于ffe抑制剂的逆转且因此临床医生极为期望经改良的方案。在人类研究中，已经使用 rfVIIa来逆转间接抗凝血酶III依赖性《Ca抑制剂(例如磺达肝素(fondaparinux)和伊达肝素(idraparinux))的作用(比斯特沃特(Bijsterveld，NR)等人，循环(Circulation)， 2002,106 :2550-2554 ；比斯特沃特(Bijsterveld, NR)等人，英国血液病学杂志(British J. of Haematology), 2004 (124) :653-658)。因子 Vlla(fVIIa)的作用机制是与组织因子一起作用将血液循环中存在的因子X(fX)转化成《a来恢复患者的正常止血。必须说明的是， 这种作用模式可能达到以中和活性位点定向《a抑制剂的fXa的最高可能浓度受fX的循环血浆浓度限制。因此，使用rfVIIa来逆转直接《Ca抑制剂的作用的潜力机械上受限。由于fX的循环血浆浓度为150毫微摩尔(“nM”)，所以通过这种模式所产生的fXa的最大量将为150nM。因此，使用rfVIIa来逆转直接ffe抑制剂的作用的潜力机械上受限。小分子 fi(a抑制剂(例如利伐沙班(rivaroxaban))的报告治疗浓度(大约600nM，库比察(Kubitza D)等人，欧洲临床药理学杂志(Eur. J. Clin. Pharmacol)，2005，61 :873-880)高于由 rfVIIa 所生成的fXa的可能量。因此，使用rfVIIa来逆转由《a抑制剂所产生的治疗或超治疗水平的抗凝作用将提供不充分的效能水平。如图4中所示，在中和因子叙抑制剂贝特沙班 (betrixaban)的抗凝血活性中使用rfVIIa具有有限的作用(如下文所阐述)。重组fVIIa 展示50nM至IOOnM的剂量反应解毒活性，但所述作用在IOOnM至200nM之间趋于稳定，此表明其解毒作用受除其浓度以外的因素的限制。在所有所测试的rfVIIa浓度中，贝特沙班在250nM的浓度下仍展示fXa的剂量反应抑制(高达约75%抑制)。此观察结果与fVIIa 的建议作用机制一致。此结果还被展示rfVIIa不能完全逆转磺达肝素对凝血酶生成和凝血酶原活化的参数的抑制作用的研究所支持。(吉偌提法斯(Gerotiafas，GT)等人，血栓形成和止血(Thrombosis &Haemostasis) 2204 (91) :531-537)。外源活性fXa不能以类似于rfVIIa的方式直接投与个体。不像rfVIIa在缺少其辅因子组织因子的情况下具有极低促凝血活性那样，天然fXa是强效酶且具有造成血栓形成的潜在风险。因此，使用rfVIIa或活性《Ca作为《Ca抗凝血疗法的解毒剂具有许多缺点。因此，需要经改良的解毒剂，其不会造成不期望的血栓形成且在《Ca抑制剂服用过量的情况下或在需要恢复正常止血以阻止或停止出血的情况下有效地实质上中和fXa 抑制剂的抗凝血活性。本文所提及的任何及所有出版物、专利和专利申请案均以整体引用的方式并入本文中。

发明内容
现在已发现，投与fXa蛋白质的经修饰衍生物可用作靶向fXa的抗凝血剂的解毒剂。所述《a蛋白质的经修饰衍生物并不与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物，而是结合和/或实质上中和抗凝血剂(例如fXa抑制剂)。可用作解毒剂的衍生物经修饰以降低或去除固有的促凝血和抗凝血活性，同时保留结合至抑制剂的能力。预计本发明的衍生物可包括修饰活性位点、或改变Gla结构域或自《a去除整个Gla结构域、或其各种组合。由于已知活性位点经修饰的全长fXa是抗凝血剂，因此进一步预计修饰Gla结构域将降低或消除fXa衍生物对正常止血的抗凝血作用。进一步预计，修饰fXa的EGF结构域(通过EGF1、EGF2、或EGFl和EGF2两个结构域的缺失或取代)提供用于本发明方法的衍生物。EGF结构域修饰可单独实施或连同Gla 结构域修饰一起实施。
在一个实施例中，衍生物保留结合靶向fXa的抗凝血剂(或《a抑制剂)所需的结构特性。通过衍生物直接或间接结合抑制剂，抑制剂实质上被中和。在一个方面中，本发明提供阻止或降低正利用因子叙抑制剂进行抗凝血疗法的个体出血的方法，其包含向所述个体投与有效量的因子fe蛋白质衍生物，所述衍生物结合至因子叙抑制剂但不会组装成凝血酶原酶复合物。在一个实施例中，衍生物具有一个或一个以上的以下性质降低的促凝血活性或没有促凝血活性；经修饰或去除的Gla结构域；和经修饰的活性位点。本发明的衍生物选择性地结合并抑制以外源方式投与的因子fe抑制剂，由此实质上中和《a抑制剂的抗凝血活性。此方法涵盖活体外和活体内方法二者。本发明所涵盖的对因子)(a蛋白质的各种修饰可在整个具体实施方式
中找到。应了解，本发明所涵盖的衍生物不是血浆源性因子Vila、重组因子Vila、新鲜冷冻血浆、凝血酶原复合物浓缩物、或全血。本发明的一个方面是使用因子)(a衍生物和含有其的组合物来治疗已接受或正利用因子fe抑制剂接受过度抗凝血疗法的患者或之前已投与因子fe抑制剂且然后需要止血的患者(例如非急需或急诊手术可能需要)。在一个方面中，经修饰《a蛋白质不同于天然存在的fXa，这是因为其具有降低的固有促凝血活性或消除固有促凝血活性且将不会妨碍在止血方面的生理fXa功能，同时仍能够结合并实质上中和fXa抑制剂。在另一方面中，经修饰的因子叙蛋白质是与能够延长所述因子叙衍生物的血浆半寿期(或循环半寿期)的试剂共同投与。在又一方面中，解毒剂与一个部分偶联以延长其血浆半寿期。还提供含有因子衍生物的医药组合物，所述因子fe衍生物结合(和/或实质上中和)因子)(a抑制剂，但不会组装成凝血酶原酶复合物。所述医药组合物任选地包含医药上可接受的载剂。在另一方面中，本发明提供试剂盒，其包含用于抗凝血用途的《Ca抑制剂和当需要实质上中和fXa抑制剂的抗凝血活性时使用的fXa抑制剂解毒剂(或因子fe衍生物)。本发明的一个实施例涉及分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO. 12或与SEQ ID NO. 12具有至少80%同源性的多肽。另一实施例涉及分离的双链多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或与SEQ ID NO. 13具有至少80%同源性的多肽。再一实施例涉及分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO. 15或与SEQ ID N0. 15具有至少80%同源性的多肽。还提供包含载剂和刚刚所阐述多肽的医药组合物。还提供编码刚刚所阐述多肽的多核苷酸。本发明进一步提供肽偶联物，其包含以共价或非共价方式连接至刚刚所阐述多肽的载剂。载剂可为脂质体、胶束、医药上可接受的聚合物、或医药上可接受的载剂。本发明还涉及结合刚刚所阐述多肽的抗体。所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、 嵌合抗体或人源化抗体。还提供抗体的生物活性片段。所述抗体可以可检测方式标记。所述抗体(或抗体片段)还作为组合物的一部分提供，所述组合物进一步包含载剂。在一个实施例中提供抗体-肽复合物，其包含本发明的抗体和特异性结合至所述抗体的多肽。所述多肽是受到对抗可产生所述抗体的多肽。所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在另一实施例中提供制备本发明多肽的方法，其包含在原核或真核宿主细胞中表达编码所述多肽的多核苷酸。在一个实施例中，所述宿主细胞是真核细胞且尤其是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell)。在一个实施例中，重链(SEQ ID NO. 15)表达于原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))中。在另一实施例中，多肽经分离。在再一实施例中提供分离的原核或真核宿主细胞，其包含编码本发明多肽的多核苷酸。在一个实施例中，所述宿主细胞在组合物中，所述组合物进一步包含载剂。在又一实施例中提供阻止或降低正利用因子叙抑制剂进行抗凝血疗法的个体出血的方法，其包含向所述个体投与有效量的组合物，所述组合物包含本发明的多肽和载剂。 进一步提供选择性结合并抑制正进行抗凝血疗法的个体中以外源方式投与的因子)(a抑制剂，其包含向所述个体投与有效量的刚刚所阐述的组合物。


图1示意性地展示表1中所示的人类因子X (SEQ ID NO. 1)的结构域结构，如在李塔斯(Leytus)等人，生物化学(Biochem.)，1986，25，5098-5102 中所报告。SEQ ID NO. 1 是由表2中所示的人类fX的核苷酸序列(SEQ ID N0. 2)编码的人类fX的氨基酸序列， 如此项技术中所习知。例如，经翻译的氨基酸序列报告于李塔斯等人(Leytus)，生物化学(Biochem.)，1986，25, 5098-5102 中且可在 <http //www, ncbi. nlm. nih. gov/entrez/ viewer, fcgi ？ db = nuccore&id = 89142731〉的基因库(GenBank)，“NM_000504”中找至Ij。 此序列中的氨基酸编号是基于fX序列。人类fX前体(SEQ ID NO. 1)含有前导序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸1至40)，随后是对应于fX轻链(LC)的序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸41至 179)、在fX分泌期间去除的RKR三联体的序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸180至182)、和fX 重链的序列(SEQ ID NO. 1的氨基酸183至488)，所述重链含有激活肽(AP) (SEQ ID NO. 1 的氨基酸183至234)和催化结构域(SEQ ID NO. 1的氨基酸235至488)。图2(SEQ ID NO. 3)展示成熟人类因子X的氨基酸序列。此图中氨基酸编号是基于成熟fx序列自fx轻链的N-末端开始。因子X在血浆中作为通过二硫键连接的双链分子循环。轻链(LC)具有139个氨基酸(SEQ ID NO. 1的氨基酸41至179)残基且含有富 Y-羧基谷氨酸(Gla)的结构域(SEQ ID N0. 3的1_45)(包括短芳香族堆栈(AS) (SEQ ID NO. 3的氨基酸40-45))，之后是两个表皮生长因子(EGF)样结构域(EGF1 =SEQ ID N0. 3的氨基酸46-84，EGF2 =SEQ ID N0. 3氨基酸85-1 )。重链(HC)具有306个氨基酸且含有52 个氨基酸激活肽(AP =SEQ ID N0. 3的氨基酸143-194)，然后是催化结构域(SEQ ID N0. 3的氨基酸195-448)。糜蛋白酶编号中的H57-D102-S195的催化三元体等效物位于fX序列中的 His236、Asp282、和 Ser379 处并加下划线(SEQ ID N0. 3 的氨基酸 236,282 和 379)。图3示意性地展示图2中所示的成熟人类因子X的结构域结构。此图中的氨基酸编号是基于成熟fx序列。突出显示用于糜蛋白酶消化以去除含Gla-结构域的片段(SEQ ID N0. 3的氨基酸1-44)和用于fX激活以去除激活肽的切割位点。糜蛋白酶消化《3产生缺少1-44氨基酸残基的无Gla结构域fXa(SEQ ID NO. 4)。图4展示在凝血酶生成(表示为相对荧光单位(RFU))分析中在组织因子的存在下各种浓度的rfVIIa对《Ca抑制剂贝特沙班(如下文所述)的抗凝血活性的影响(如实例2中所述))。数据显示，rfVIIa和组织因子的组合在高达200nM的浓度下不能完全中和 fXa抑制剂贝特沙班的抗凝血活性。
图5展示在含活性fXa和贝特沙班(空心圆)的纯化系统中Gla-结构域完整的酐_fXa逆转贝特沙班的fXa抑制作用，而与活性fXa相比，仅酐-fXa的促凝血活性(空心三角)可忽略。将fXa发色活性标准化成在无任何抑制剂的情况下的活性fXa(空心正方形)。此更充分地阐述于实例2中。数据表明，酐对于fla底物无活性，但仍保留fXa 抑制剂结合能力。图6展示在血浆凝血酶生成(表示为相对荧光单位(RFU))分析(如实例2中所述)中，图5中具有完整Gla结构域的酐-ffe是有效抑制剂。其在115nM约时几乎完全抑制凝血酶生成。数据表明，Gla-结构域未修饰的酐-fXa并不适于用作fXa抑制剂解毒剂。图7展示在96孔板格式中活性fXa的凝血活性在糜蛋白酶消化之前和在糜蛋白酶消化15分钟和30分钟之后的比较。如此图中所示，凝血时间(0D405的变化)在《Ca被糜蛋白酶消化15分钟之后明显延迟，且当fXa被消化30分钟时有长达20分钟的时间未观察到凝血。此结果还用于建立糜蛋白酶消化酐_fXa的条件，这是因为在消化期间可监测到酐_fXa没有活性。此更充分地阐述于实例3中。图8展示去Gla的酐-fXa对因子)(a抑制剂贝特沙班的结合亲和力，如实例4中所阐述。数据表明，通过糜蛋白酶消化酐所制备以去除含Gla-结构域的片段(残基1-44)的去Gla的酐- a能够以与天然fla类似的亲和力结合贝特沙班(fXa :Ki = 0. 12nM,去 Gla 的酐-fXa :Kd = 0. 32nM)。图9展示，在实例2的凝血酶生成分析中，通过添加浓度为680nM的解毒剂(去Gla 的酐_fXa)逆转不同浓度贝特沙班的抗凝血活性。在浓度为680nM时，去Gla的酐-fXa能够产生实质上完全的fXa活性恢复。图10展示，在凝血延长分析中使用aPTT试剂在96孔板格式(如实例3中所述)， 通过不同浓度的解毒剂(去Gla的酐-fXa)逆转250nM贝特沙班的抗凝血活性。数据表明， 当使用约608nM的解毒剂来中和250nM的fXa抑制剂贝特沙班时，凝血时间与对照贫血小板血浆的凝血时间相当。图11展示，在凝血延长分析中使用aPTT试剂在96孔板格式中，563nM的解毒剂 (去Gla的酐-fXa)对依诺肝素(enoxaparin) (0. 3125-1. 25U/mL)的抗凝血活性的影响，其表示为标准化之后的倍数变化。分析方案阐述于实例3中。数据表明，添加563nM的解毒剂明显中和低分子量肝素依诺肝素的活性。图12展示在发色分析中解毒剂(去Gla的酐-fXa)对凝血酶(5nM)活性的作用和50nM阿加曲班(argatroban)( 一种特异性凝血酶抑制剂)对其的抑制作用。正如所预期，fXa抑制剂的解毒剂在高达538nM浓度下不会以可检测方式影响凝血酶活性或所述特异性抑制剂阿加曲班对其的抑制作用。此更充分地阐述于实例14中。图13展示，在aPTT分析中使用标准凝血计时器通过改变解毒剂去Gla的酐-fXa 的浓度对400nM贝特沙班抗凝血活性的影响。分析方案阐述于实例3中。数据展示，《3抑制剂的解毒剂实质上400nM贝特沙班对fXa的抑制作用。据估计，在400nM贝特沙班的情况下，解毒剂的EC5tl为约656nM。图14展示CHO细胞中用于表达fXa三重突变体(SEQ ID NO. 12)的DNA构建体的图。将质粒DNA线性化并转染至CHO dhfr(-)细胞中。使用四氢叶酸酯(HT)缺乏的培养基加甲氨蝶呤(MTX)米选择细胞。通过ELISA来针对高蛋白质表达筛选稳定克隆。在无血清培养基中产生《a三重突变体并通过离子交换与亲和柱的组合来纯化。图中的编号是基于编码人类fX SEQ ID NO. 1的多核苷酸序列进行。例如，活性位点S419(SEQ ID NO. 1)处的丙氨酸突变等效于成熟人类fX的S379(SEQ ID NO. 3)处的突变，如整个申请案且更具体地实例7所讨论。图15展示分别使用识别fX重链和轻链的单克隆抗体纯化的r-解毒剂的西方印迹(Western blot)。当将连接轻链和重链的二硫键还原后，r_解毒剂重链以类似于血浆源性fXa的预计分子量迁移。与正常FXa相比，fXa突变体的Gla-结构域中缺失6_39aa使得r-解毒剂轻链的分子量带较低。图16展示经口单独投与贝特沙班(15mg/kg)、或经口投与贝特沙班(15mg/kg)然后静脉注射(300 μ g，IV)根据实例1制得的血浆源性解毒剂(Pd-解毒剂)之后小鼠(η =7-10/组)中的贝特沙班血浆水平。pd-解毒剂是在1. 5小时的时间点之前5分钟时投与，并在经口投与贝特沙班之后1. 5,2. 0和4. 0小时时取小鼠血液样品(0. 5mL)。分析全血 INR、贝特沙班和解毒剂血浆水平。将小鼠血浆中的贝特沙班水平(平均值士SEM)绘示为小鼠投与15mg/kg(空心正方形)和15mg/kg然后解毒剂注射(空心圆)之后随时间变化的曲线。在1.5小时时间点(解毒剂注射后5分钟)解毒剂治疗组的H(-PD相关性汇总于表13中。根据INR测量值，单次注射解毒剂使功能性贝特沙班减少> 50%。此更充分地阐述于实例8中。图17展示利用经纯化r-解毒剂进行小鼠实验(n = 4-10/组)的结果。比较经口单独投与贝特沙班(15mg/kg)或经口投与贝特沙班(15mg/kg)然后静脉注射(300 μ g) r-解毒剂之后小鼠血浆中的贝特沙班水平(图17A)和全血INR(图17B)。标明各治疗组的平均值。如表14中所汇总，单次静脉注射r-解毒剂使得离体全血1冊有> 50%校正，此证明经由多次注射或其它方案解毒剂有效中和《a抑制剂。这些结果表明，本发明的fXa 变体具有用作普遍解毒剂来逆转在出血或其它医疗急诊的患者中《a抑制剂的抗凝血作用的潜力。此更充分地阐述于实例8中。图18展示在96孔浊度变化凝血分析中r-解毒剂逆转依诺肝素的抑制作用。这些结果基本上类似于Pd-解毒剂(图11)，此表明两种《a衍生物具有相当的功能性解毒剂活性。50nM r-解毒剂实质上校正(>75%)1.25U/mL依诺肝素的抑制作用。分析方案呈现于实例11中。图19展示r-解毒剂逆转低分子量肝素(LMWH)的抑制作用，如在人类血浆凝血分析中所测试。图18和19 二者均于实例11中讨论。图20展示r-解毒剂逆转利伐沙班的抗凝血作用。此更充分地讨论于实例12中。图21展示r-解毒剂的多核苷酸序列和经翻译多肽序列的排列。图22展示在单次静脉注射(1次注射)或两次注射O次注射)r_解毒剂的情况下小鼠实验(n = 5/组，312ug/200ul r_解毒剂)的结果。对经口投与贝特沙班(15mg/ kg)之后静脉注射媒剂或r-解毒剂之后的血浆中的贝特沙班水平进行比较(图22A)(参见实例8的详细阐述)。如图22A中所示，与媒剂对照(对照1)相比，单次静脉注射r-解毒剂使血浆中的贝特沙班水平增加8倍以上，此表明解毒剂在活体内有效捕获贝特沙班的能力。与单次注射相比，第二次注射解毒剂又使贝特沙班水平增加不到2倍，此表明在小鼠血浆中贝特沙班的数量有限且其抗凝血作用可能被解毒剂逆转。图22B表明，单次和双次注射解毒剂之后，所测量的INR随小鼠血浆中解毒剂/贝特沙班的比例的增加而降低。
具体实施例方式I.定义除非另有说明，否则本发明的实践将使用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，此在所属领域的技术人员的范围内。参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)和罗塞尔(Russell)编辑Q001)分子克隆实验室手册(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，第 3 版；奥苏贝尔(Ausubel)等人编辑 Q007)最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)系列；酶学方法 (Methods in Enzymology)系列(学术出版社公司(Academic Press，he.)，纽约(N. Y.))； 麦克弗森(MacPherson)等人(1991)PCR 1 实用方法(PCR 1 :A Practical Approach) (牛津大学出版社(Oxford University Press)的 ^L Press)；麦克弗森(MacPherson) 等人(1995)PCR 2:实用方法(PCR 2 :A Practical Approach)；哈洛(Harlow)和莱恩 (Lane)编辑(1999)抗体，实验室手册(Antibodies, A Laboratory Manual)；富润氏尼 (Freshney) (2005)动物细胞的培养基本技术手册(Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique)，第5版；盖特(Gait)编辑(1984)寡核苷酸的合成(Oligonucleotide Synthesis)；美国专利第4，683，195号；黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)编辑(1984) 核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)；安德森(Anderson) (1999)核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)；黑姆斯(Hames)和希金斯(Higgins)编辑(1984)转录和翻译； 固定化细胞禾BBS (Transcription and Translation ；Immobilized Cells and Enzymes) (IRL Press (1986))；佩巴尔(Perbal) (1984)分子克隆实验指南(A Practical Guide 至 Molecular Cloning)；米勒(Miller)和考斯(Calos)编辑(1987)哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory))；马克瑞德斯(Makrides)编辑^)0 哺乳动物细胞的基因转移禾口表达(Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells)；迈耳口 (Mayer)禾口沃克 (Walker)编辑(1987)细胞核分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology) ((Academic Press) ,^ (London)) -M 岑贝格(Herzenberg)等人编辑(1996)韦尔的实验免疫学手册(Weir' s Handbook of Experimental Immunology)；小鼠胚胎操作实验指南(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual)，第 3 版(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press) (2002))ο所有包括范围在内的数值指定(例如，pH、温度、时间、浓度、和分子量)都是近似值，其以⑴或(-)0. 1的增量变化。应了解，但不一定明确陈述所有数值指定前面皆有术语“约”。还应该了解，但未必明确陈述本文所述的试剂仅是例示性的且这些试剂的等效物已为此项技术习知。除非上下文另有明确说明，否则说明书和权利要求书中使用的单数形式“一(a， an)”和“所述的(the)”包括复数意义。例如，术语“医药上可接受的载剂”包括多种医药上可接受的载剂(包括其混合物)。本文所用术语“包含”意欲指组合物和方法包括所列举要素，但并不排除其它要素。当使用“基本上由...组成”定义组合物和方法时，将意味着出于所想要的用途不包括对所述组合有任何本质意义的其它要素。因此，基本上由本文所定义的要素组成的组合物不会将来自分离和纯化方法的痕量污染物和医药上可接受的载剂(例如磷酸盐缓冲的盐水、防腐剂、和诸如此类)排除在外。“由...组成”将意味着排除超过其它成分的痕量元素和用于投与本发明组合物的大量方法步骤。通过这些过渡术语中的每一者定义的实施例均在本发明的范围内。诊断或治疗的“个体”是细胞或哺乳动物(包括人类)。诊断或治疗的非人类动物个体包括(例如)鼠科动物(例如大鼠、小鼠)、犬科动物(例如狗)、兔科动物(例如兔子)、家畜、运动动物和宠物。术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用且在其最广泛意义上是指两个或两个以上的亚单位氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的化合物。所述亚单位可通过肽键连接。在另一实施例中，所述亚单位可通过其它键(例如，酯、醚等)连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸且对蛋白质或肽序列中可包含的氨基酸的最大数量并无限制。本文所用术语“氨基酸” 涉及天然的和/或非天然的或合成的氨基酸，其包括甘氨酸和D与L光学异构体二者、氨基酸类似物和拟肽物质。天然存在的氨基酸的单个字母和三个字母缩写列示于下文中。如果肽链短，通常将三个或三个以上氨基酸的肽称为寡肽。如果肽链较长，则通常将所述肽称为多肽或蛋白质。
权利要求
1.一种分离的因子叙衍生物多肽，所述分离的因子叙衍生物多肽(a)包含因子叙重链和(b) Gla缺乏的或去Gla的因子fe轻链或者不包括轻链，所述因子fe重链包含在所述重链的活性位点处的修饰。
2.如权利要求1所述的分离的因子叙衍生物多肽，其中，所述修饰是脱氢丙氨酸或丙氨酸取代^^379。
3.如权利要求1所述的分离的因子叙衍生物多肽，其中，所述修饰是S379A。
4.如权利要求1至3任一项所述的分离的因子衍生物，其中，所述重链还包括在氨基酸的Arg306、Glu310、Arg347、Lya35ULys414或Arg4M位置的至少一种氨基酸的取代。
5.如权利要求1至4任一项所述的分离的因子叙衍生物多肽，其中，所述分离的因子 )(a衍生物多肽不包括轻链。
6.如权利要求1至5任一项所述的分离的因子fe衍生物多肽，其中，所述分离的因子 Xa衍生物多肽包括Gla缺乏的轻链。
7.如权利要求6所述的分离的因子fe衍生物多肽，其中，Gla结构域为未羧化的、羧化不全的或经脱羧的。
8.如权利要求1至5任一项所述的分离的fe衍生物多肽，其中，所述分离的fe衍生物多肽包含去Gla的轻链。
9.如权利要求8所述的分离的fe衍生物多肽，其中，所述轻链缺乏SEQID NO. 3的氨基酸残基 1-39、6-39、1-44 或 1-45
10.如权利要求1至9任一项所述的分离的fe衍生物多肽，其中，所述轻链不包括EGFl 结构域和/或EGF2结构域。
11.如权利要求1至10任一项所述的分离的fe衍生物多肽，其中，所述分离的衍生物多肽为具有分离的轻链和重量的双链多肽。
12.如权利要求11所述的分离的fe衍生物多肽，所述轻链和所述重链相连。
13.如权利要求12所述的分离的fe衍生物多肽，其中，所述分离的fe衍生物多肽还包含轻链和重链之间的肽连接体。
14.如权利要求13所述的分离的衍生物多肽，其中，所述肽连接体包含-RKRRKR-。
15.如权利要求1至14任一项所述的分离的fe衍生物多肽，其中，所述分离的fe衍生物多肽不包括活化的肽。
16.一种分离的双链多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13或与SEQ ID NO. 13 具有至少90%同源性的氨基酸序列，其中所述与SEQ ID NO. 13具有至少90%同源性的氨基酸序列(a)与野生型因子叙相比具有降低的促凝血活性，(b)能够结合至因子叙抑制剂并且(c)不会组装成凝血酶原酶复合物。
17.一种分离的双链多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13。
18.一种分离的多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID N0. 12或与SEQ ID N0. 12具有至少90%同源性的氨基酸序列，其中，所述与SEQ ID N0. 12具有至少90%同源性的氨基酸序列(a)与野生型因子叙相比具有降低的促凝血活性，(b)能够结合至因子叙抑制剂并且(c)不会组装成凝血酶原酶复合物。
19.一种分离的多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID N0. 12。
20.一种分离的多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID N0. 15或与SEQ ID N0. 15具有至少90%同源性的氨基酸序列，其中，所述与SEQ ID NO. 15具有至少90%同源性的氨基酸序列(a)与野生型因子叙相比具有降低的促凝血活性，(b)能够结合至因子叙抑制剂并且(c)不会组装成凝血酶原酶复合物。
21.一种分离的多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO. 15。
22.—种药物组合物，所述药物组合物包含载剂和权利要求1至21任一项所述的多肽。
23.一种多肽偶联物，所述多肽偶联物包含共价或非共价连接至权利要求1至21任一项所述的多肽的载剂。
24.如权利要求23所述的多肽偶联物，其中，所述载剂是脂质体、胶束、医药上可接受的聚合物或医药上可接受的载剂。
25.—种编码权利要求1至21任一项所述的多肽的多核苷酸。
26.一种抗体，所述抗体结合权利要求1至21任一项所述的多肽。
27.如权利要求沈所述的抗体，其中，所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
28.如权利要求沈或27所述的抗体，所述抗体还包含可检测的标记。
29.一种权利要求沈至观任一项所述的抗体的生物活性片段。
30.一种组合物，所述组合物包含权利要求沈至观任一项所述的抗体；以及载剂。
31.一种组合物，所述组合物包含权利要求四所述的抗体片段。
32.—种抗体-肽复合物，所述复合物包含权利要求沈至观任一项所述的抗体；以及特异性结合至所述抗体的多肽。
33.如权利要求32所述的复合物，其中，所述多肽为受到对抗可产生所述抗体的多肽。
34.如权利要求32或33所述的复合物，其中，所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
35.一种用于制备权利要求1至21任一项所述的多肽的体外方法，所述方法包括在原核或真核宿主细胞中表达编码所述多肽的多核苷酸。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述方法还包括除去连接体，并且所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO. 13。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中，所述宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
38.如权利要求35至37任一项所述的方法，所述方法还包括分离所述多肽。
39.一种分离的原核或真核宿主细胞，所述宿主细胞包含编码权利要求1至21任一项所述的多肽的多核苷酸。
40.一种组合物，所述组合物包含载剂和权利要求39所述的原核或真核宿主细胞。
41.一种用于阻止或降低正利用因子叙抑制剂进行抗凝血疗法的个体出血的权利要求22所述的组合物。
42.一种用于选择性结合并抑制正利用因子fe抑制剂进行抗凝血疗法的个体中以外源方式投与的因子)(a抑制剂的权利要求22所述的组合物。
43.如权利要求41或42所述的组合物，其中，所述因子叙抑制剂选自磺达肝素、 伊达肝素、生物素化的伊达肝素、依诺肝素、法安明、NAP-5、rNAPc2、组织因子途径抑制剂、DX-9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班、利伐沙班、PD_34^92、奥米沙班、DU_176b、 LY517717、GSK913893、雷扎沙班、低分子量肝素、贝特沙班或其医药上可接受的盐、和其组口 O
44.如权利要求43所述的组合物，其中，所述因子叙抑制剂选自贝特沙班、利伐沙班、阿哌沙班、低分子量肝素、和其组合。
45.如权利要求43所述的组合物，所述组合物的特征为在手术之前投与。
46.一种组合物，所述组合物包含因子fe蛋白质衍生物，所述因子fe蛋白质衍生物结合至因子fe抑制剂并且不会组装成凝血酶原酶复合物用于阻止或降低正利用因子fe抑制剂进行抗凝血疗法的个体出血。
47.一种组合物，所述组合物包含因子fe蛋白质衍生物，所述因子fe蛋白质衍生物结合至因子fe抑制剂并且不会组装成凝血酶原酶复合物用于选择性结合并抑制个体中以外源方式投与的因子)(a抑制剂。
48.权利要求46或47所述的组合物，其中，所述衍生物为Gla缺乏的因子蛋白质衍生物或去Gla的因子fe蛋白质。
49.如权利要求46至48任一项所述的组合物，其中，所述衍生物具有修饰的活性位点。
50.如权利要求46至49任一项所述的组合物，其中，所述衍生物包括催化结构域，所述催化结构域任选地以化学方式或重组方式修饰以失去蛋白水解活性但保持结合所需的结构特性，所述结构域源自以下中的任一种a.选自血浆激肽释放酶、凝血酵素和胰蛋白酶的哺乳动物蛋白酶；或b.细菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶。
51.如权利要求46至50任一项所述的组合物，所述组合物的特征在于所述组合物与有效量的药剂联合投与，所述药剂延长所述衍生物的半寿期。
52.如权利要求51所述的组合物，其中，所述药剂为抗因子fe抗体，所述抗因子叙抗体特异性识别并结合因子)(a的外部位点或结合因子fe衍生物的α -2-巨球蛋白。
53.如权利要求46至52任一项所述的组合物，其中，所述因子fe抑制剂选自磺达肝素、伊达肝素、生物素化的伊达肝素、依诺肝素、法安明、NAP-5、rNAPc2、组织因子途径抑制剂、DX-9065a、YM-60828、YM-150、阿哌沙班、利伐沙班、PD_348^2、奥米沙班、DU_176b、 LY517717、GSK913893、雷扎沙班、低分子量肝素、贝特沙班或其医药上可接受的盐、和其组口 O
54.如权利要求46至53任一项所述的组合物，其中，所述个体正经历选自下组的临床重大出血事件失血、重要器官出血、需要再次手术或新的治疗程序的出血和出血指数等于或大于2.0并伴有明显出血。
55.如权利要求46至M任一项所述的组合物，其中，所述个体正经历选自下组的出血事件持续性或复发性鼻出血、不需要治疗程序的直肠或泌尿道出血、显著的注射位点血肿、非注射位点的自发性血肿、伴随轻微创伤出现的血肿、大量血液流失和需要非计划性输血的出血。
全文摘要
本发明涉及靶向因子Xa的抗凝血剂的解毒剂。所述解毒剂是因子Xa蛋白质衍生物，所述因子Xa蛋白质衍生物结合至因子Xa抑制剂，由此实质上中和所述因子Xa抑制剂而不会组装成凝血酶原酶复合物。本文所述衍生物缺少固有凝血活性或具有降低的固有凝血活性。本文揭示了停止或阻止目前正利用因子Xa抑制剂进行抗凝血疗法的患者出血的方法。
文档编号A61K47/48GK102533702SQ20111044720
公开日2012年7月4日 申请日期2008年9月26日 优先权日2007年9月28日
发明者乌马·辛哈, 卢根民, 帕特里克·安德烈, 戴维·R·菲利普斯 申请人:普托拉制药有限公司