专利名称：一种蟾毒灵脂质体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
:本发明属于医药技术领域，涉及ー种蟾毒灵脂质体及其制备方法，用于肿瘤，特别是肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌或白血病的治疗。
背景技术：
癌症是全球发病率最高的疾病之一。WHO数据显示，仅2008年癌症病死人数就高达7.6亿，其中60%来自低收入或中等收入国家，且该数字在未来将继续增加。在超过200种癌症中，乳腺癌、肺癌、肠癌及胰腺癌患者数占所有新增病例的54 %。目前，癌症的治疗方法根据癌症的类型及阶段，主要包括手术、放疗、化疗及以上方法联合运用等。其中，临床化疗药物种类较多，作用机制主要为针对肿瘤细胞快速分裂的特性杀死细胞。因此药物在杀死快速分裂的癌细胞时，也能杀死其它正常的快速分裂的细胞，如骨髄、消化道及毛囊中的细胞，产生了严重的副作用，损伤了正常组织。据此，亟需研发毒副作用小、抗肿瘤疗效高的新型治疗药物。提高药物对肿瘤的选择性，减少其在正常组织的分布是抗肿瘤新药研发的主要策略。蟾毒灵(3 3，14_ ニ羟-5 0，20(22)_蟾蜍ニ烯羟基内酷，5 0，20(22)_蟾蜍ニ烯羟基内酯-3 0，14-ニ醇)是中药蟾酥的主要抗肿瘤成分，是中华大蟾蜍或黑框蟾蜍的耳后腺分泌的白色浆液，可从蟾酥中提取。还可根据专利US 3134772和US 3687944进行人工合成。蟾毒灵是ー种类地高辛的免疫活`性成分，显示出各种生物活性，如强心、麻酔和刺激血管等。自1994年蟾毒灵抗肿瘤作用发现至今(Numazawa S, et al.J Cell Physiol,1994,160(1):113-20),已进行了大量研究，发现其具有广谱抗肿瘤作用。此外，蟾毒灵与其他化疗药物联用，如索拉菲尼等，对肿瘤细胞显示出化疗增敏作用(Gao Y，et al.MolBiol Rep.2012,39(2) =1683-9) 0近年来，更多的研究发现蟾毒灵可诱导细胞凋亡从而抑制多种癌细胞的増殖，如肝癌、骨瘤、结肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巣癌、胃癌、前列腺癌及白血病细胞等(Han KQ, et al.World J Gastroenterol.2007,13 (24):3374-9 ;Amano Y,et al.J Steroid Biochem Mol Biol.2009,114(3-5):144-51 ;Li D, etal.AnticancerDrugs.2009,20(1):59-64 ；Yu CH, et al.Cancer Sc1.2008，99 (12):2467-76 ;Takai N，etal.1nt J Mol Med.2008,21(5):637-43 ;Yeh JY, et al.Prostate.2003,54(2):112-24;Yin JQ, et al.Acta Pharmacol Sin.2007,28 (5):712-20 ;Zhu Z et al.1nt.J.Mol.Sc1.1nt J Mol Sc1.2012，13(2):2025-35 ;Xie CM, et al.Free Radic Biol Med.2011，51 (7):1365-75)。蟾毒灵可通过激活细胞死亡受体及线粒体通路触发癌细胞凋亡(Sun L,et al.Evid Based Complement AlternatMed.Epub 2011 Jun 18)。这些研究提不蟾毒灵可作为化疗药物用于癌症的治疗。然而，蟾毒灵由于毒性大、水溶性差、半衰期短、治疗窗窄，毒性剂量与治疗剂量接近等问题，严重制约了其临床应用(Gong LL et al.Food andDrug.2007,9(10):51-3)。此外，由于其在体内的广泛分布，更引起了其它临床副作用，如血管刺激性、过敏性休克、高热、窦性心动过缓等(Dasgupta A,et al.Life Sc1.1998,63(9):781-8 ；Bick RJ, et al.Life Sc1.2002，72(6):699-709 ；Kostakis C，Byard RW.ForensicSci Int.2009,188:el_e5)。目前，将蟾酥溶于生理盐水制得的华蟾素注射液已在中国用于临床癌症的治疗。已有报道吉西他滨一奥沙利钼与华蟾素合用可增强晚期胆囊癌病人的化疗作用(Qin TJ,et al.World JGastroenterol.2008,14(33):5210-6)。另有研究显示，对肝癌及胰腺癌病人使用8倍于标准剂量(20ml/m2/或20 25ml/人/天，含蟾毒灵14.3±0.03ng/ml)的华蟾素注射液未产生明显毒性(Meng Z.et al.Cancer.2009，115 (22):5309-18)，这意味着成年病人每天耐受的蟾毒灵有效治疗剂量可高达2.g。但是，华蟾素注射液是蟾酥中生物碱的混合物溶液，并且因为蟾毒灵水溶性较差，含有的蟾毒灵含量很低。因此，研发延长蟾毒灵在肿瘤病灶内持续时间、提高肿瘤靶向性、减少毒副作用的新剂型十分必要。脂质体是一种内水相的封闭的磷脂双分子结构，我们使用脂质体作为蟾毒灵的药物载体，可通过磷脂膜装载蟾毒灵解决其水溶性差的问题。此外，用PEG修饰的脂质体可将蟾毒灵被动靶向至肿瘤部位，减小其毒副作用。近20年来，脂质体已经被广泛用于包载抗肿瘤药物。已有多种用于临床或即将用于临床的抗肿瘤脂质体药物，如阿霉素脂质体(Doxil/Caelyx分别由Alza/Johnsonand Johnson在美国或Schering-Plough在其他国家销售)、柔红霉素脂质体(DaunoXome,Gilead)、阿糖胞苷脂质体(DepoCyte, Skye Pharma/Enzon/Mundipharma 出品)、顺钼脂质体(Lipoplatin，Regulon出品)，其中阿糖胞苷脂质体可用于治疗脑膜淋巴瘤。脂质体可通过磷脂膜结构提高水溶性差的抗癌药物的溶解度，通过PEG修饰实现肿瘤的被动靶向及通过结合载体实现肿瘤的主动靶向。传统的脂质体，是通过磷脂分散在水相中形成的，因此两亲性及脂溶性药物可插入脂质体的磷脂膜结构中，而亲水性药物则是直接包入脂质体的内部水相。脂质体载体对所包含药物的药代动力学、组织分布及毒副作用都产生较大的影响。如，临床实验证明在保持抗肿瘤活性的同时使用阿霉素脂质体比阿霉素单体的毒性作用明显减小(SafraT.0ncologist.2003,8Suppl 2:17-24)。但由于脂质体可被巨噬细胞快速捕获，给药后其在体内的停留时间只有几小吋。为了提高脂质体在体内循环的半衰期，可将糖脂或亲水性聚合物如PEG应用于脂质体。将生物相容性的聚合物PEG结合在脂质体上，使其具有保护性的亲水的表面，被称为“ニ代脂质体”或“隐形脂质体”。PEG在脂质体表面形成了位阻效应，可阻碍调理素及血浆蛋白的吸附，減少巨噬细胞受体与磷脂膜上磷酸基团的结合，从而延迟其在血液循环中的保留时间。此外，通过化学修饰磷脂基团或者结合蛋白、多肽或其他大分子在脂质体表面，可改变脂质体的药代动力学属性。PEG脂质体结合载体如小分子、肽类或单克隆抗体已广泛的用于肿瘤治疗，如结合叶酸的柔红霉素和阿霉素脂质体(Pan XQ, Lee RJ.AnticancerRes.2005，25 (IA):343-6 ;Shmeeda H，et al.Mol Cancer Ther.2006,5(4):818-24)层粘性蛋白脂质体(Zalipsky S, et al.Bioconjug Chem.1995,6(6):705-8)或结合了 0V-TL3 单克隆抗体的脂质体(Vingerhoeds MH, et al.Br J Cancer.1996,74(7):1023-9)。
脂质体表面包裹闻分子也已经成为一种提闻其粘附性的有效方法，能够提闻药物 ロ服后的生物利用度及稳定性(Nguyen S, et al.Eur J Pharm Biopharm.2011, 77 (I):75-83)。这些高分子包括壳聚糖、淀粉、葡聚糖、普鲁兰多糖、果胶等。果胶是植物细胞壁表面的水溶性多糖，由于它的凝胶作用、生物相容性及无毒性等特性，已成为ー种有希望的提高药物ロ服后吸收度及在胃肠道内稳定性的大分子(Nguyen S,et al.Colloids Surf BBiointerfaces.2011,88(2):664-73)。本发明提供的蟾毒灵脂质体及其制备エ艺，与蟾毒灵単体相比，用于哺乳动物后，可増加抗肿瘤作用，同时减小毒副作用
发明内容
:本发明的目的在于提供一种蟾毒灵脂质体及其制备エ艺，该脂质体可用于肿瘤的治疗，尤其是肝癌、肺癌、卵巣癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌或白血病的治疗。本发明的蟾毒灵脂质体双分子层包含磷脂、留醇和PEG修饰物。其中磷脂的含量占脂质体双分子层总重量的20 80%，可选用的磷脂为卵磷脂、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰こ醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂(SM)、ニ棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、ニ棕榈酰磷脂酰こ醇胺(DPPE)、ニ硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或上述一种或多种的混合物。留醇的含量占脂质体双分子层总重量的10 30%，可选用的留醇为胆固醇、表胆留醇、麦角固醇，豆留醇或胆固醇的PEG修饰物。PEG修饰物的含量占脂质体双分子层总重量的2 50%，可选用的PEG修饰物为PEG-PE、甲氧基聚こニ醇(mPEG) -PE, ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺(DSPE)-PEG或上述ー种或多种的混合物。本发明的蟾毒灵脂质体脂质双分子层和蟾毒灵的重量比为(5 20): I。本发明的蟾毒灵脂质体可采用常规方法，薄膜法、注入法、冻融法中任ー种方法制备。薄膜法制备包括下述步骤:将蟾毒灵和磷质材料分别或同时溶解于非极性或弱极性溶剂中，如甲醇、こ醇、氯仿、こ酸こ酷、正己烷、こ腈或上述ー种或多种混合液，混合均匀，用旋转蒸发仪减压除去有机溶剂`，瓶壁形成均匀薄膜，再将蒸馏水或缓冲溶液加入薄膜水化，匀质、搅拌、涡旋或超声，得到脂质体。こ醇注入法包括下述步骤:将脂质材料和蟾毒灵溶于こ醇中，溶解完全后用注射器注入蒸馏水或缓冲溶液，搅拌将こ醇除尽，匀质、搅拌、涡旋或超声，得到脂质体；こ醚注入法包括下述步骤:将脂质材料和蟾毒灵溶于こ醚或こ醚、甲醇混合物中，溶解完全后用注射器注入蒸馏水或缓冲溶液，搅拌将こ醚除尽，匀质、搅拌、涡旋或超声，得到脂质体；冻融法包括下述步骤:将以上任一方法制备的蟾毒灵脂质体0 _80°C冰箱或液氮中冷冻，置室温溶解，再放入0 -80°c冰箱或液氮中冷冻，置室温溶解，重复2 8次，得到脂质体。上述方法中，水相可以是蒸馏水或缓冲液溶液，如生理盐水、磷酸缓冲盐(PBS)、三氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)溶液、4-羟こ基哌嗪こ磺酸(HEPES)溶液或甘露醇溶液等。缓冲液pH为5.0-9.5之间。脂质体制备完后可通过挤压过膜控制其粒径分布。可通过5 ii m、l ii m, IOOnm,200nm或其它所需孔径的膜得到相应粒径的脂质体。蟾毒灵是ー种有效的抗癌药物，但其毒性较大限制了应用。我们发现蟾毒灵脂质体能增强抗癌作用的同时减少毒性。经静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射或ロ服的方式作用于哺乳动物，蟾毒灵脂质体较蟾毒灵单体抗癌作用增强，毒副作用減少。本发明的蟾毒灵脂质体可制备癌症治疗药物。如，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸齐U、糖浆粉剂、水剂或混悬剂用于ロ服给药。对于片剂可添加乳糖、淀粉、柠檬酸钠等填充齐U，羧甲基淀粉钠等崩解剂和硬脂酸镁、滑石等润滑剤。对于胶囊剂可添加乳糖、聚こニ醇等填充剂。对于非肠道给药或静脉注射、腹腔注射、肌肉注射或皮下注射给药，生理盐水可作为药学上可接受的溶媒。其他溶媒包括蒸馏水、缓冲液、0.3%甘氨酸溶液等。该制剂可通过紫外照射或过膜等常规方法灭菌后，冻干保存。为了达到生理环境要求，还需加入药学上可接受的PH调节剂及压カ调节剂，如氯化钠、醋酸钠或钾盐等。为了提高脂质体稳定性，还可參考专利US5605703和EP1325739加入磷脂氧化抑制齐U，包括维生素或其衍生物、丁基轻基甲苯(BHT), chroman, ferrioxamine等上述ー种或多种的混合物。为了提高ロ服生物利用度，还可加入多糖高分子包括壳聚糖、淀粉、葡聚糖、普鲁兰多糖、果胶或上述ー种或多种的混合物。本发明的蟾毒灵脂质体可被用来治疗癌症，如肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌或白血病。药物的剂量需依据疾病的诊断情况及临床医师的判断给药，一般为0.01 50mg/kg，最好在 0.1 5mg/kg。
具体实施例方式下面列举典型实施例，对本发明进ー步说明，但不以任何形式构成对本发明的限制。实施例15mg蟾毒灵溶于5mlこ醇中，40mg磷脂，15mg胆固醇,5mgDSPE_PEG溶于氯仿中，将有机溶液混合于圆底烧瓶中，30°C减压旋转蒸发除去残留有机溶剤。磷脂薄膜再加入5mlPBS(5mM,pH 6.4 7.4)水化Ih后，超声0.5h。制得的脂质体在IL水中透析24h，再取少量脂质体加甲醇破乳，用HPLC法測量包封率。该蟾毒灵脂质体包封率为58.7%。包封率即磷脂中包入的药量占加入总药量的比例。实施例2制备方法及配料比例同实施例1，除了用生理盐水代替PBS，该蟾毒灵脂质体包封率为57.3%。实施例3`4mg蟾毒灵、6mg胆固醇、30mg磷脂及4mg mPEG_PE溶解在IOml氯仿:甲醇(2:1)中，将溶液减压旋转蒸发除去残留有机溶剂，加入Iml PBS(5mM,pH 6.4 7.4)，剧烈涡旋，冰浴中超声20min。透析完全后取少量脂质体加甲醇破乳，用HPLC法測量包封率。该蟾毒灵脂质体包封率为52.5%。实施例44mg蟾毒灵、6mg胆固醇、30mg磷脂及4mg mPEG-PE溶解在IOmlこ醇中，超声20min溶解完全。溶液用注射器注入20ml PBS (5mM, pH 6.4 7.4)中，50°C搅拌3h，除去こ醇。制得的脂质体在IL水中透析24h，再取少量脂质体加甲醇破乳，用HPLC法測量包封率。该蟾毒灵脂质体包封率为83.3%。实施例54mg蟾毒灵、15mg胆固醇、40mg磷脂及5mg mPEG-PE溶解在IOmlこ醚中，超声20min溶解完全。溶液用注射器注入20ml 6%甘露醇溶液中，50°C搅拌3h，除去こ醚。制得的脂质体在IL水中透析24h，再取少量脂质体加甲醇破乳，用HPLC法測量包封率。该蟾毒灵脂质体包封率为56.8%。实施例64mg蟾毒灵、6mg胆固醇、30mg磷脂及4mg mPEG_PE溶解在IOml氯仿:甲醇(2:1)中，将溶液减压旋转蒸发除去残留有机溶剂，加入Iml PBS(5mM,pH 6.4 7.4)，剧烈涡旋，冰浴中超声20min。-20°C冰箱冷冻5h，放置室温溶解，再放入冰箱冷冻，重复4次。透析完全后取少量脂质体加甲醇破乳，用HPLC法测量包封率。该蟾毒灵脂质体包封率为61.8%。实施例74mg蟾毒灵、6mg胆固醇、30mg磷脂及4mg mPEG-PE溶解在IOml氯仿:甲醇(2: I)中，将溶液在30°C下减压旋转蒸发除去残留有机试剂，薄膜中加入IOml PBS(5mM,pH 6.4 7.4)水化2h，再透过200nm的膜，得到的脂质体4°C保存。取Iml脂质体分散液加入4ml 0.2%的果胶溶液(柑橘果胶，溶解在的5mM的PBS中)搅拌lh，得到包裹果胶的脂质体。以下通过试验例来进ー步阐明本发明所述脂质体对癌症的治疗效果。试验例1:蟾毒灵和蟾毒灵脂质体对肿瘤细胞的生长抑制作用人宫颈癌HeLa、肺癌A549、胃癌SGC7901、肝癌HepG2、髓性白血病HL-60和结肠癌SWl 116细胞置于DMEM或RPMI 1640培养液(含10%灭活的胎牛血清、100U.mr1青霉素和IOOmg じ1链霉素)中，37°C、5% CO2孵箱中培养。取对数生长期的细胞，以3X IO3/孔的密度接种于96孔板，每孔lOOiil，在37°C、5% CO2饱和湿度条件下培养24h。试验设阴性对照组(培养液)、不同浓度给药组。每个培养孔加入I 300nmol/L的蟾毒灵或蟾毒灵脂质体(按实施例1方法制备)，37°C、5% CO2饱和湿度孵箱内培养48h后，每孔加入MTT液(5g/l) 20 u L，培养4h后，离心，吸弃培养液，每孔加入150 u L ニ甲基亚砜，轻度振荡溶解结晶，置自动酶标仪570nm波长处测OD值，按下列公式计算细胞生长的抑制率:细胞生长抑制率/% = 100-(给药组OD值-空白对照OD值)バ对照组OD值-空白对照OD值)X 100。
IC50(细胞増殖50%抑制时药物浓度)值由数学方法计算所得。数据以}C ±SEM表示，采用t检验或方差分析进行统计学处理，P < 0.05表示两组间具有显著性差异。从表1、2结果可见，在I 300nmol/L浓度范围内，蟾毒灵或蟾毒灵脂质体均能明显抑制6种肿瘤细胞的増殖，抑制作用具有浓度依赖性。蟾毒灵和蟾毒灵脂质体的IC50值差异不明显，表明蟾毒灵和蟾毒灵脂质体的体外抗肿瘤作用相当。表I蟾毒灵对肿瘤细胞增殖的抑制作用
权利要求
1.一种蟾毒灵脂质体，其特征在干:由脂质体双分子层和蟾毒灵组成，其中脂质体双分子层中包含磷脂、留醇和PEG修饰物。
2.根据权利要求1所述的蟾毒灵脂质体，其特征在于:所用的磷脂选自卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰こ醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、ニ棕榈酰磷脂酰胆碱、ニ棕榈酰磷脂酰こ醇胺、ニ硬脂酰磷脂酰胆碱或上述ー种或多种的混合物，且其含量占脂质体双分子层总重量的20 80%。
3.根据权利要求2所述的蟾毒灵脂质体，其特征在于:磷脂选自卵磷脂、磷脂酰胆碱或ニ硬脂酰磷脂酰胆碱。
4.根据权利要求1所述的蟾毒灵脂质体，其特征在于:所用的留醇选自胆固醇、表胆甾醇、麦角固醇，豆留醇或胆固醇的PEG修饰物，且其含量占脂质体双分子层总重量的10 30%。
5.根据权利要求1所述的蟾毒灵脂质体，其特征在于:所用的PEG修饰物选自PEG-磷脂酰こ醇胺、mPEG-磷脂酰こ醇胺，DSPE-PEG或上述ー种或多种的混合物，且其含量占脂质体双分子层总重量的2 50%。
6.根据权利要求1所述的蟾毒灵脂质体，其特征在于:脂质体双分子层和蟾毒灵的重量比为(5 20): I。
7.根据权利要求1所述的蟾毒灵脂质体，其特征在干:由薄膜法、注入法、冻融法中任ー种方法制备。
8.根据权利要求7所述的蟾毒灵脂质体，其特征在干: 薄膜法制备包括下述步骤:将蟾毒灵和`磷脂材料分别或同时溶解于非极性或弱极性溶剂中，如甲醇、こ醇、氯仿、こ酸こ酷、正己烷、こ腈或上述ー种或多种混合液，混合均匀，用旋转蒸发仪减压除去有机溶剤，瓶壁形成均匀薄膜，再将蒸馏水或缓冲溶液，如生理盐水、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl溶液、HEPES溶液或甘露醇溶液等，加入薄膜水化，匀质、搅拌、涡旋或超声，得到脂质体； こ醇注入法包括下述步骤:将磷脂材料和蟾毒灵溶于こ醇中，溶解完全后用注射器注入蒸馏水或缓冲溶液，搅拌将こ醇除尽，匀质、搅拌、涡旋或超声，得到脂质体； こ醚注入法包括下述步骤:将磷脂材料和蟾毒灵溶于こ醚或こ醚、甲醇混合物中，溶解完全后用注射器注入蒸馏水或缓冲溶液，搅拌将こ醚除尽，匀质、搅拌、涡旋或超声，得到脂质体； 冻融法包括下述步骤:将以上任一方法制备的蟾毒灵脂质体0 -80°C冰箱或液氮中冷冻，置室温溶解，再放入0 _80°C冰箱或液氮中冷冻，置室温溶解，重复2 8次，得到脂质体。
9.权利要求1所述的蟾毒灵脂质体在制备治疗癌症药物中的应用。
10.根据权利要求10所述应用，所述癌症包括肝癌、肺癌、卵巣癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、胃癌或白血病。
全文摘要
本发明涉及一种蟾毒灵脂质体，其特征在于该脂质体由脂质体双分子层和蟾毒灵组成，其中脂质体双分子层中包含磷脂、甾醇和PEG修饰物。本发明所述的蟾毒灵脂质体可通过薄膜法、注入法或冻融法制备得到，较蟾毒灵单体药物具有更强的抗癌作用和更低的毒副作用，可用于癌症包括肝癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、胃癌或白血病的治疗。
文档编号A61P35/00GK103083239SQ20121057074
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者曹蔚, 王四旺, 李瑛 , 谢艳华, 杨倩 申请人:中国人民解放军第四军医大学