一种靶向hif低毒性的磁性纳米棒的制备方法
【专利摘要】本发明一种靶向HIF低毒性的磁性纳米棒的制备方法，属于靶向肿瘤细胞治疗磁性纳米。在氨基功能化磁性纳米离子(Fe3O4)表面修饰了溴化4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯（ILs)获得带正电荷的磁性纳米离子(Fe3O4-ILs)，接着这种纳米离子通过静电吸附结合HIF的识别序列，该磁性纳米颗粒大小为8nm。细胞毒性实验显示该纳米棒是一种低毒性的纳米材料。磁共振成像实验显示纳米棒能显著区别肿瘤肝细胞与正常肝细胞，我们的发明为构建新型系列核酸诱导的靶向性磁性纳米载体奠定了基础。
【专利说明】一种靶向HIF低毒性的磁性纳米棒的制备方
法
【技术领域】
[0001]本发明属于祀向肿瘤细胞治疗磁性纳米材料制备领域,特指一种纳米Fe3O4表面改性的修饰、组装的方法及其在靶向肿瘤细胞磁性成像中的运用。
【背景技术】[0002]四氧化三铁磁性颗粒广泛应用于生物医药和生物技术行业，例如，作为药物载体、MR成像剂、蛋白纯化剂、吸附剂和生物传感器。表面修饰磁性纳米颗粒可以通过外部磁场将其集中到特定位置，激活药物靶向性，用于可控肿瘤特异性纳米传输载体。纳米颗粒药物传输体、诊断剂必须具有对靶点的特异性结合作用，可以区分正常细胞和疾病细胞，有效避免治疗的系统毒性。
[0003]缺氧诱导因子(HIFs)是缺氧条件下触发线粒体从氧化磷酸化向厌氧糖酵解转换的开关，在实现能量代谢适应性调节的过程中起关键性作用。厌氧的糖酵解过程是它通过增加编码糖酵解酶和糖转运体基因的表达激活的。HIFs是细胞氧代谢、细胞恶性繁殖和癌细胞代谢变化之间普遍链接(G.L.Semenza, Hypoxia-1nducible Factors: Mediatorsof Cancer Progression and Targets for Cancer Therapy.Trends Pharmacol.Science2012，33，207 - 214; N.God, M.Kanai，Hypoxia-1nducible Factors and their Rolesin Energy Metabolism.1nt J Hematol，2012，95，457 - 463.)。作为一个转录激活因子，HIF与编码酶基因中的缺氧反应原件(HRE)的结合是在胞内O2浓度降低时细胞正常代谢的关键。Semenza 等人(G.L Semenza, ; G.L Wang, A Nuclear Factor Inducedby Hypoxia via De Novo Protein Synthesis Binds to the Human ErythropoietinGene Enhancer at a Site Required for Transcriptional Activation.Mol.Cell.Biol.1992，12，5447 - 5454.)发现，在人血红蛋白(EPO)基因中HIF的结合位点为5’ -TACGTGCT-3，序列，还推测这种结合主要是两个鸟嘌呤的残基嵌入到HIF的大沟中，并且这个推测被Forsythe 等证实(J.A.Forsythe, B.H.Jiang, N.V.1yer, F.Agani，S.W.Leung, R.D.Koosj G.L Semenza, Activation of Vascular EndothelialGrowth Factor Gene Transcription by Hypoxia-1nducible Factorl.Mol cell.biol.1996，16，4604 - 4613.)。随后，在许多不同代谢相关酶基因的HRE中鉴定出作为HIF的识别位点5’ -RCGTG-3’序列，这些酶包括编码转铁蛋白、血管生长因子(VEGF)和糖酵解酶缩醛酶A、乳酸脱氢酶A、乳酸转运体、烯醇酶1、磷酸果糖激酶L、磷酸甘油酸激酶I等(G.L Semenza, B.H.Jiang, S.W.Leung, R.Passantino，J.-P.Concordeti，P.Mairei， A.Giallongo， Hypoxia Response Elements in the Aldolase A， Enolase 1，and Lactate Dehydrogenase A Gene Promoters Contain Essential Binding Sites forHypoxia-1nducible Factor 1.Biochem.Mol.Biol.1nt.1996，32529 - 32537; M.S.Ullah， A.J.Davies, A.P.Halestrap， The Plasma Membrane Lactate TransporterMCT4，but Not MCTlj Is Up-regulated by Hypoxia through a HIF-1 a -dependentMechanism.J.Bi0.Chem.2006, 281，9030 - 9037.)因此，HIF 在大多数癌细胞中高表达。高表达的HIF是一项正常细胞与癌细胞不同的指标，可以作为靶向癌细胞的靶点。我们将磁性纳米颗粒经过表面修饰制备了一种可附载HIF靶向核酸适配体的新型磁性纳米棒，该纳米棒能借助磁共振成像技术识别肿瘤细胞，可望运用与肿瘤诊断和靶向药物输送体。
[0004]
【发明内容】
[0005]本发明设计了一种表面修饰靶向细胞缺氧诱导因子(HIF)核酸序列的新型Fe3O4纳米磁性棒^ESFe3O4-1Ls-DNAX其特点为在氨基功能化磁性纳米离子(Fe3O4)表面修饰了溴化4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯(ILs)获得带正电荷的磁性纳米离子(Fe3O4-1Ls),接着这种纳米离子通过静电吸附结合HIF的识别序列(DNA1:5’ CTACGTGCT3)或DNAl的互补序列(DNA2:5’ -AGCACGTAG-3’ )形成纳米立方体 Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)，该磁性纳米颗粒大小为8 nm。将Fe3O4-1Ls-DNAl和Fe304-1Ls_DNA2混合组装形成新型Fe3O4纳米磁性棒(标记为Fe3O4-1Ls-DNAX该纳米棒为40~50 nm,宽为8 nm的棒状结构。磁共振成像实验表明该纳米离子能选择性识别肿瘤细胞；细胞毒性试验表明磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)和 Fe3O4-1Ls-DNAl 和 Fe304-1Ls_DNA2 对 H印G-2 细胞的毒性很小，适用于做癌细胞靶向HIF治疗的药物载体。这是国际上第一个靶向HIF的磁性药物载体。
[0006]一种靶向HIF低毒性的磁性载体的制备方法，按照下述步骤进行:
(I)Fe3O4 表面修饰制备(Fe3O4-1Ls)
将氨基功能化磁性纳米离子Fe3O4和4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯按质量比为18: f 18:3(最佳比为18:2)混合溶解于二甲基二乙酰胺(DMF)后转入三口烧瓶中，加入乙醇(按与混合液体积比为4:3-4:10,最佳为4:6),搅拌6~20 h (最佳12 h后),转入60°C水浴中回流2-6 h (最佳6h)。分别加入与反应液体积比为1: f 4:1的丙酮(最佳为2:1)促降，离心分离，得到溶解性好的Fe304-1Ls。
[0007](2) Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)的制备
1)配制2mg/mL Fe3O4-1Ls磷酸盐缓冲溶液(PBS) (10 mM, pH=7.4)中，分散均匀
2)按与Fe3O4-1Ls质量比为1:500~4:500(最佳为500:2)，向其中滴加DNAl(或DNA2)(100 uM) PBS溶液，搅拌均匀。
[0008]3)将混合溶液置于摇床室温摇动1~4 h,最佳2 ho
[0009]4)离心分离得黑色纳米颗粒 Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)。
[0010](3)磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的制备
将制备好的Fe3O4-1L-DNAl和Fe304-1L_DNA2以质量比(1:2~2: 1，最佳比例1:1)混合均匀，于水浴中加热到广60°C (最佳30 °C)，稳定广6 min (最佳3min)，缓慢冷却到室温(T3 h,最佳3h)，离心分离得磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)15样品放于冰箱中4°C储存。
[0011]其中所述的DNAl的序列为5’ -CTACGTGCT-3’。
[0012]其中所述的DNA2的序列为5 ’ -AGCACGTAG-3 ’。
[0013]本发明利用HIF与特定核酸序列的特异结合，将这种结合作为癌细胞中的靶点，来实现靶向性磁性材料的构建，是一种简便，直观的构建方法。磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)是国际上第一个具有HIF靶向性磁性纳米载体。TEM成像显示该纳米棒为4(T50 nm，宽为8 nm的棒状结构(附图1)。细胞毒性实验(实施例10)显示该纳米棒是一种低毒性的纳米材料(图2)。磁共振成像实验显示纳米棒能显著区别肿瘤肝细胞与正常肝细胞(图3，实施例11)，我们的发明为构建新型系列核酸诱导的靶向性磁性纳米载体奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为组装后的磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的透射电镜图；
图2磁性棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的细胞毒性实验结果，纳米颗粒的浓度分别为20mg/ml，40mg/ml, 60 mg/ml。
[0015]图3为磁性纳米棒-锰基造影剂复合纳米粒子(10 ug/ml)对正常肝细胞WRL-68(a, 0 min; b, 10 min; c; 30; d, 60 min)和肿瘤肝细胞 HepG-2 细胞(a, 0 min; b,10 min; c; 30; d, 60 min)的 Tl 磁共振成像。
[0016]【具体实施方式】:
试剂和原料:氨基功能化磁性纳米颗粒根据文献方法合成和4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯(ILs)根据文献方法合成(Qiu-Yun Chen, Zh1-ffei Wang, Xia Yang, Li Wang,Indole conjugated silica and magnetic nanoparticles as inhibitors of HIF.Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 114 (2014) 158 - 163.),溶剂为分析纯试剂。DNAl和DNA2核酸序列由我们自己设计，DNAl和DNA2委托上海生物生工公司根据我们提供的核酸序列合成。其中所述的DNAl的序列为5’ CTACGTGCT3。其中所述的DNA2的序列为 5’ -AGCACGTAG-3’。
[0017]一种靶向HIF低毒性的磁性载体的制备方法，按照下述步骤进行:
实施例1.Fe3O4表面修饰制备(Fe3O4-1Ls)的最佳实施方案
称取氨基功能化磁性纳米离子(Fe3O4) 70.2 mg与4-乙酰基吡啶_2溴丙酸乙酯ILs(4mL 0.089M)混合溶解后转入三口烧瓶中，加入6 mL乙醇，搅拌12 h后，转入60°C水浴中回流6 ho分别加入20 mL丙酮促降，离心分离，得到Fe3O4-1ls 93 mg。
[0018]实施例2.Fe3O4表面修饰制备(Fe3O4-1Ls)
称取氨基功能化磁性纳米离子(Fe3O4) 70.2 mg与4-乙酰基吡啶_2溴丙酸乙酯ILs(2 mL 0.045M)混合溶解后转入三口烧瓶中，加入3 mL乙醇，搅拌6 h后，转入60°C水浴中回流2 ho分别加入IOmL丙酮促降，离心分离，Fe3O4-1Ls, 45 mg。
[0019]实施例3.Fe3O4表面修饰制备(Fe3O4-1Ls)
称取氨基功能化磁性纳米离子(Fe3O4) 70.2 mg与4-乙酰基吡啶_2溴丙酸乙酯ILs(6 mL 0.13M)混合溶解后转入三口烧瓶中，加入10 mL乙醇，搅拌20 h后，转入60°C水浴中回流2 ho分别加入40 mL丙酮促降，离心分离，得Fe3O4-1ls 67 mg。
[0020]实施例4.Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)的制备(最佳实施方案)
称取10 mg Fe3O4-1Ls分散于5 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS) (10 mM, pH=7.4)中，再向其中滴加160 uLDNAl (或DNA2) (100 uM)PBS溶液。将混合溶液于摇床室温摇动2 h。
[0021]离心分离得黑色纳米颗粒Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2) 9 mg。
[0022]实施例5.Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)的制备
称取IOmgFe3O4-1Ls分散于5mL磷酸盐缓冲溶液(PBS) (10 mM, pH=7.4)中，再向其中滴加320 uLDNAl (或DNA2) (200 uM) PBS溶液。将混合溶液于摇床室温摇动4h。[0023]离心分离得黑色纳米颗粒Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2) 6mg。
[0024]实施例6.Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2)的制备
称取IOmgFe3O4-1Ls分散于5 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS) (10 mM, pH=7.4)中，再向其中滴加80 uLDNAl (或DNA2) (50 uM) PBS溶液。将混合溶液于摇床室温摇动lh。
[0025]离心分离得黑色纳米颗粒Fe3O4-1Ls-DNAl (或 Fe304-1Ls_DNA2) 4 mg。
[0026]实施例7磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的制备(最佳实施方案)
将10 mg Fe3O4-1L-DNAl和10 mg Fe304-1L_DNA2混合均匀，于水浴中加热到30°C，稳定
3min,缓慢冷却到室温(2 h)，离心分离得磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)，18 mg。
[0027]实施例8磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的制备
将10 mg Fe3O4-1L-DNAl和5 mg Fe304-1L_DNA2混合均匀，于水浴中加热到60°C，稳定I min,缓慢冷却到室温(3 h)，离心分离得磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)，9 mg。
[0028]实施例9磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的制备
将IOmg Fe3O4-1L-DNAl和15 mg Fe304-1L_DNA2混合均匀，于水浴中加热到10°C，稳定6 min,缓慢冷却到室温(I h)，离心分离得磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)，12 mg。
[0029]实施例10细胞毒性实验
以实施例7得到的磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)为受试化合物将H印G-2细胞在含10%热灭活的胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液中，于CO2培养箱(37 °C，5%C02、饱和湿度)内连续培养。取对数生长期细胞，消化、计数，以2X104/ml的密度接种于96孔培养板中，每孔100 ill。培养24 h后，分别用浓度为20 ug/ml, 40 u g/ml,和60 U g/ml的(Fe3O4-1Ls-DNA)水溶液加入培养基中作用24h。吸取去上清液，每孔加入100 mM MTT (lmg/ml),继续培养4h，吸取上清液，用酶标仪在570 nm处测定吸光度值，数据见附图2。数据显示我们制备的(Fe3O4-1Ls-DNA)具有低毒性。
[0030]实施例11:磁共振成像检测肿瘤靶向实验
将WRL-68细胞和IfepG2细胞在含10%热灭活的胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液中，于CO2培养箱(37 °C, 5%C02、饱和湿度)内连续培养。取对数生长期的WRL-68细胞和IfepG2细胞，消化、计数，以2X104/ml的密度接种到96孔培养板中，每孔100 yl。培养24 h后，分别用不同浓度的实施例1得到的磁性纳米棒为受试化合物处理肿瘤细胞。为得到清晰的Tl图像，每克磁性纳米棒负载IOOmg锰基造影剂(二吡啶甲醇氯化锰即MnDPDP)(负载量为100 mg/g磁性纳米棒)。连续培养4 h后，于室温在匪120磁共振成像仪(0.53 T)上进行Tl加权成像测试，见图3。设置参数为重复采样次数(NS)为8，反转恢复序列循环采样次数(TlIRCount)为300，每次增加的步长(AddDl)为2000，90。脉宽(P90)为4.5，180°脉宽(P180)为9。
[0031]图3数据显示磁性纳米棒显著增强肿瘤细胞的磁共振成像清晰度，而正常细胞中含量较低。目前临床运用的锰基磁共振成像剂二吡啶甲醇氯化锰不稳定且没有肿瘤靶向性。本发明磁性纳米棒能提高负载的锰基造影剂的靶向性，纳米棒负载锰基造影剂后显著区别肿瘤细胞和正常细胞，所以磁性纳米棒可作为新型低毒性多功能肿瘤靶向型药物输送体。
【权利要求】
1.一种靶向HIF低毒性的磁性载体的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行: (1)Fe3O4表面修饰制备Fe3O4-1Ls 将氨基功能化磁性纳米离子Fe3O4和4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯按质量比为18: f 18:3混合溶解于二甲基二乙酰胺后转入三口烧瓶中，按与混合液体积比为4:3-4:10加入乙醇，搅拌6~20 h，转入60°C水浴中回流2-6 h ；分别加入与反应液体积比为1: f 4:1的丙酮促降，离心分离，得到溶解性好的Fe3O4-1Ls ；
(2)Fe3O4-1Ls-DNAl 或 Fe304-1Ls_DNA2 的制备: 1)配制2mg/mL Fe3O4-1Ls磷酸盐缓冲溶液(10 mM, pH=7.4)中，分散均匀 2)按与Fe3O4-1Ls 质量比为 1:500~4:500，向其中滴加 DNAl (或 DNA2) (100 uM) PBS溶液，搅拌均匀； 3)将混合溶液置于摇床室温摇动f4 h， 4)离心分离得黑色纳米颗粒Fe3O4-1Ls-DNAl或Fe304-1Ls_DNA2； (3)磁性纳米棒(Fe3O4-1Ls-DNA)的制备: 将制备好的Fe3O4-1L-DNAl和Fe304-1L_DNA2以质量比1:2~2: 1，混合均匀，于水浴中加热到广60°C，稳定广6 min缓慢冷却到室温广3 h，离心分离得磁性纳米棒Fe3O4-1Ls-DNA,样品放于冰箱中4 C储存。
2.根据权利要求1所述的一种靶向HIF低毒性的磁性载体的制备方法，其特征在于其中所述的DNAl的序列为CTACGTGCT。
3.根据权利要求1所述的一种靶向HIF低毒性的磁性载体的制备方法，其特征在于其中所述的DNA2的序列为AGCACGTAG。
4.根据权利要求1所述的一种靶向HIF低毒性的磁性载体的制备方法，其特征在于步骤⑴中4-乙酰基吡啶-2溴丙酸乙酯按质量比为18:2，乙醇与混合液体积比为4:6，搅拌12 h，转入60°C水浴中回流6 h，分别加入与反应液体积比为2:1的丙酮。
5.根据权利要求1所述的一种靶向HIF低毒性的磁性载体的制备方法，其特征在于步骤⑵磷酸盐缓冲溶液浓度为10 mM, pH=7.4，按与Fe3O4-1Ls质量比为500:2向其中滴加DNAl或DNA2，将混合溶液置于摇床室温摇动2 h，步骤(3)制备好的Fe3O4-1L-DNAl和Fe304-1L-DNA2的质量比为1:1混合均匀，于水浴中加热到30°C，稳定3 min, 3h缓慢冷却到室温。
【文档编号】A61K49/08GK103638533SQ201310670483
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】陈秋云, 赵婷婷 申请人:江苏大学