稳定的水性抗体组合物的制作方法

稳定的水性抗体组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供包含浓度为至少约10mg/mL的抗体蛋白质和乙烯亚胺寡聚物的水溶液，其中寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目(n)在2-12的范围内。
【专利说明】稳定的水性抗体组合物

【背景技术】
[0001] 虽然多种化学过程（如氧化、脱酰胺作用和天冬氨酸异构化）可以影响治疗性蛋 白质（如抗体）的重要质量属性，但蛋白质聚集可论证地是最常见的影响蛋白质稳定性的 过程。聚集通常是加重的，且是以高浓度（如l〇mg/ml或更高）配制在水溶液中的蛋白质 的关键降解途径。在保存期间，聚集可以导致制剂中不可接受的高水平的高分子量种类 (HMWS)，或导致更大的不溶性聚集体（微粒）的形成。这类受污染的制剂可以落在美国食 品与药品管理局及其他药物监管机构设定的规格之外。
[0002] 在某种程度上，可以通过优化蛋白质组合物的多种参数来控制蛋白质聚集。例如， 控制聚集率的方法可以涉及优化pH、加入金属离子螯合剂或加入表面活性剂。
[0003] 组合物的离子强度也可以影响水性蛋白质组合物的聚集率。因此，治疗性蛋白质 的常规制剂开发通常包括渗涨度调节剂（tonicity modifier)的筛选，渗涨度调节剂可以选 自不带电荷的化学种类，如糖，或带电荷的化学种类，如无机盐或有机盐。如果聚集率在低 离子强度组合物中较低，则通常优选不带电荷的渗涨度调节剂，如果聚集率在较高离子强 度组合物中较低，则优选带电荷的渗涨度调节剂。通常在用于治疗性应用的水性蛋白质组 合物中使用的带电荷的渗涨度调节剂包括氯化钠。典型的不带电荷的渗涨度调节剂包括蔗 糖、海藻糖、甘油和甘露醇。
[0004] 蛋白质聚集是非常复杂的过程，涉及许多不同的机制。但是，据信，两种主要类型 的非共价相互作用驱动蛋白质聚集：（1)蛋白质分子的非极性部分之间的疏水相互作用； 和（2)蛋白质分子的带电荷区域之间的电荷-电荷相互作用。据信，当聚集率在较高离子 强度的组合物中比在较低离子强度的组合物中低的那些情况下，聚集的关键原因是由于蛋 白质分子之间的电荷-电荷相互作用。
[0005] 但是，如果能够控制蛋白质聚集的溶液和组合物将用于治疗性应用，则它们显示 有利的毒性谱也至关重要。因此，可以用来降低蛋白质聚集率的任意添加剂自身必须具有 有利的毒性谱。
[0006] 因此，存在对用于制备稳定、高度浓缩的蛋白质溶液，尤其是具有有利的毒性谱并 因此适合用于治疗性应用的高度浓缩的抗体溶液的改进方法的需要。
[0007] US 2007/0036866 (Kissel等）描述了包含PEI和PEG残基的阳离子嵌段聚合物。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明涉及抗体蛋白质，尤其是处于高浓度的抗体蛋白质的聚集问题。本发明还 涉及提供显示有利的毒性谱且适合用于治疗性应用的浓缩抗体溶液的问题。预期本发明的 应用导致水性抗体蛋白质组合物中的聚集率显著降低，同时提供显示有利的毒性谱并因此 可以用于治疗性应用的组合物。本发明还涉及抗体蛋白质及尤其是处于高抗体蛋白质浓度 的抗体蛋白质水性组合物中的自缔合问题，同时提供抗体蛋白质的显示有利毒性谱的治疗 用组合物。
[0010] 在一个实施方案中，本发明涉及包含浓度为至少约10mg/mL的抗体蛋白质和乙烯 亚胺的寡聚物的水溶液，其中该寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目（η)在2-12的范围内。
[0011] 在一个实施方案中，本发明提供降低浓度为至少约l〇mg/mL的水溶液中的抗体蛋 白质的聚集率的方法。该方法包括向该溶液中加入乙烯亚胺的寡聚物的步骤，其中η = 2-12。
[0012] 在一个实施方案中，本发明可以提供降低抗体浓度为至少约10mg/mL的水性抗体 蛋白质溶液在保存期间的黏度增加速率的方法。该方法包括向该溶液中加入乙烯亚胺的寡 聚物的步骤，其中η = 2-12。
[0013] 在一个实施方案中，本发明可以提供降低浓度为至少约10mg/mL的水溶液中的抗 体蛋白质的不希望的片段化的速率，该速率通过保存期间低分子量种类的形成来检测。具 体而言，这种不希望的片段化可以发生在包含一种或多种抗体片段的融合蛋白质中。该方 法包括向该溶液中加入乙烯亚胺的寡聚物的步骤，其中η = 2 - 12。
[0014] 本文公开的某些乙烯亚胺寡聚物是新的，因此作为本发明的一个方面要求保护。 因此，本发明还提供式（V)的化合物：
[0015] X-Y「[CH2CH2NH]n_R
[0016] 式 V
[0017] 其在下文中更详细地描述，其用于本发明的溶液、组合物和方法。
[0018] 预期本文所述实施方案的溶液和组合物显示有利的毒性谱并因此适合用于治疗 性应用。
[0019] 附图简述
[0020] 图1A-1F显示乙烯亚胺的PEG化和非PEG化寡聚物及5k mPEG在40°C对利妥昔单 抗（rituximab)制剂的聚集率的影响。
[0021] 图2显示PEI的大小对HEK293和Vero细胞的细胞毒性作用的影响。
[0022] 图3显示乙烯亚胺寡聚物的大小对Vero细胞抑制的影响。每个点旁边的数字表 示所测试的寡聚物或聚合物的分子量（Da)。
[0023] 图4显示乙烯亚胺寡聚物的大小对MDCK细胞抑制的影响。每个点旁边的数字表 示所测试的寡聚物的分子量（Da)。
[0024] 图5显示五亚乙基六胺和2K mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺（化合物（1))对Vero 细胞抑制的影响。
[0025] 发明详述
[0026] 本发明涉及其中η = 2-12的乙烯亚胺寡聚物稳定高度浓缩的抗体水溶液（即至 少约10mg/mL的浓度）同时预期显示有利的毒性谱的发现。具体而言，预期本发明的乙烯 亚胺寡聚物显示比高级同系物（例如，分子量大于600Da的聚乙烯亚胺）更有利的毒性谱。
[0027] 由于此预期的有利毒性谱，本发明尤其适用于治疗性应用的抗体蛋白质的水性组 合物。
[0028] 与现有的用于稳定抗体蛋白质的高浓度水性制剂的方法相比，尤其是就降低的聚 集率和可逆的自缔合而言，本发明提供了几个优势。例如，本发明应允许更合理的制剂开发 方法，在设计试验制剂中需要更少的试验和差错。结果是，这使得能够以加速、更低成本的 途径来优化符合保存稳定性和对低体积皮下注射的适合性的关键性能要求的制剂。
[0029] 与现有技术的方法相比，本发明所显示的稳定性益处和预期的有利毒性谱应使得 能够使用治疗上重要的抗体蛋白质的更高浓度水性制剂。
[0030] 本文所用的术语"抗体蛋白质"指抗体、抗体片段、与活性部分缀合的抗体、包含一 种或多种抗体片段（如免疫球蛋白Fc结构域）的融合蛋白质、或前述任一种的衍生物。衍 生物的实例包括缀合衍生物，例如，与另一部分缀合的抗体或抗体片段。这类部分包括化学 惰性聚合物，如PEG。优选的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体，优选单克隆抗体。单克隆 抗体可以是例如哺乳动物或禽类抗体、嵌合抗体（例如人/小鼠或人/灵长类嵌合体）、人 源化抗体或全人抗体。适宜的抗体包括免疫球蛋白，如IgG(包括IgGpIgGylgQ* IgG4)、 IgM、IgA(如IgAi或IgA2)、IgD、IgE或IgY。适宜的抗体还包括单链抗体。还包括抗体片 段，包括Fc、Fab、Fab 2、ScFv片段等。还包括单结构域抗体，包括纳米抗体。
[0031] 抗体蛋白质优选是治疗性抗体蛋白质。这种抗体蛋白质具有希望的治疗或预防活 性，且标示用于治疗、抑制或预防疾病或医学障碍。
[0032] 术语"PEI"指聚乙烯亚胺（包含多个重复基团的乙二胺聚合物），其可以可选地被 衍生化。
[0033] 术语"0ΕΙ"指包含2-12个重复单位的乙烯亚胺寡聚物，其可以可选地被衍生化。
[0034] 本文所用的术语"水溶液"指水中，优选蒸馏水、去离子水、注射用水、无菌注射用 水或注射用制菌水中的溶液。本发明的水溶液包含溶解的抗体蛋白质、乙烯亚胺寡聚物及 可选的一种或多种添加剂和/或赋形剂。水溶液还可以包含一种或多种部分溶解或不溶解 的成分，如添加剂或赋形剂。这种或这类成分的存在将产生多相组合物，如悬液或乳状液。 优选地，如通过眼睛或光散射确定，本发明的水溶液是均相溶液。
[0035] 寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目（η)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物通常基 本上由其中η在2-12范围内的化学式-(CH 2CH2NH)η-的部分或其支化衍生物组成，或包含其 中η在2-12范围内的化学式_(CH 2CH2NH)n-的部分或其支化衍生物。线性乙烯亚胺寡聚物 仅包含仲氨基（不考虑寡聚物的末端官能度），而支化的乙烯亚胺寡聚物可以包含伯氨基、 仲氨基和叔氨基。在本发明中，也考虑包含线性和支化的乙烯亚胺寡聚物的混合物的水溶 液。适宜地，本发明的乙烯亚胺寡聚物是线性的。
[0036] 例如，n = 2、n = 3、n = 4、n = 5、n = 6、n = 7、n = 8、n = 9、n = 10、n = 11 或 11=12。在一个实施方案中，11 = 3-12、4-12、5-12或6-12。在另一实施方案中，11 = 2-11、 2-10、2-9、2-8、2-7、2-6或2-5，例如3-5。在另一实施方案中，11 = 3-9、4-8或5-7。还在 另一实施方案中，η = 2-ll、3-ll、4-10、5-9或6-8。还在另一实施方案中，η = 4-7、4-6或 4-5。其中η = 2-12的乙烯亚胺寡聚物可以是衍生化的或未衍生化的。在一个实施方案中， 乙烯亚胺寡聚物是未衍生化的，且适宜地选自二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺 和五亚乙基六胺。未衍生的乙烯亚胺寡聚物成本较低，且比对应的衍生化寡聚物更易于获 得。
[0037] 术语"乙烯亚胺寡聚物"包括其中例如通过惰性聚合物或封端基团衍生化（例如 化学修饰）寡聚物的一个或多个末端的衍生物。
[0038] 本文所用的"Ci-C；烷基"定义为包含1-6个碳原子的直链或支化的脂肪族碳链，例 如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基和己基，及对应的亚烧 基，如亚甲基、1，2-亚乙基等。
[0039] 还可以用化学惰性聚合物衍生化乙烯亚胺寡聚物。除非另有说明，本文所用的术 语"聚合物"包括共聚物。化学惰性聚合物可以例如通过提高水溶性、提高稳定性或降低 毒性来赋予乙烯亚胺寡聚物本身物理化学益处。备选地或此外，化学惰性聚合物可以例如 通过增强乙烯亚胺寡聚物在减少抗体蛋白质聚集中的作用来赋予水溶液中的抗体蛋白质 物理化学益处。在一个实施方案中，用选自聚乙二醇（PEG和mPEG(mPEG是用甲氧基封端 的聚乙二醇聚合物））、聚丙二醇（PPG)和聚氨基酸的一种或多种聚合物衍生化乙烯亚胺寡 聚物。在另一实施方案中，用共聚物衍生化乙烯亚胺寡聚物，其中该共聚物由选自聚乙二 醇（PEG和mPEG)、聚丙二醇（PPG)和聚氨基酸的聚合物（和/或其相关单体）组成。适宜 的聚氨基酸包括具有不带电荷的侧链或无侧链的那些，且包括聚甘氨酸、聚丙氨酸、聚缬氨 酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸和聚苯丙氨酸。适宜地，用一个或多个聚乙二醇（PEG)基团衍生 化乙烯亚胺寡聚物。
[0040] 在用化学惰性聚合物衍生化乙烯亚胺寡聚物时，该聚合物通常具有约500至约 lOOOODa，例如约1000至约5000Da的范围内的分子量。
[0041] 聚合物聚乙二醇（例如PEG和mPEG)、聚丙二醇（PPG)在化学式上定义为PEG-0-、 mPEG-Ο-和PPG-0-(及其共聚物），即PEG、mPEG、PPG或共聚物分子在作为衍生物发挥作用 时以-0-终止。例如，在代表件化学式PEG-0-(OiOiNH) ,Η或PEG-0-0EI中，-〇-部分与PEG 分子缔合而不是与乙烯亚胺寡聚物缔合。在这种背景下，本文所用的"PEG"和"PEG-0-"应 认为是在结构上等同，只是在后一种情况下，明确地定义了 PEG的末端基团。以类似的方 式，取决于它所结合的寡聚物上的基团的官能度，本文在化学式上将聚氨基酸定义为包括 氨基端或羧基端。例如，在代表性化学式[聚氨基酸]-MI-(ch 2ch2nh)4H中，-腿-部分与聚 氨基酸缔合。备选地，在代表性化学式H 2N- (CH2CH2NH) ,-C(0)~ [聚氨基酸]中，-cm-部分 与聚氨基酸缔合。
[0042] 如果存在的话，化学惰性聚合物可以是封端的，即以通常与具体聚合物相关的官 能度不同的官能度终止。例如，在一个实施方案中，该化学惰性聚合物是聚乙二醇，且用甲 氧基封端，即Me0CH2CH2-PEG-0-。如之前所述，用甲氧基封端的聚乙二醇聚合物可以表示为 "mPEG"。在优选实施方案中，用一个或多个PEG或mPEG基团衍生化乙烯亚胺寡聚物。PEG或 mPEG亚单位可以选择最佳大小。在一个实施方案中，PEG或mPEG为约500Da至约10000Da， 例如约1000Da、2000Da或5000Da。希望得到PEG和mPEG亚单位的低多分散性。优选地，多 分散性小于1. 2,更优选小于1. 1。
[0043] 可以通过可选的桥连基（即定位在乙烯亚胺寡聚物和衍生化基团（例如封端基团 或载体基团或化学惰性聚合物）之间的基团）来衍生化乙烯亚胺寡聚物。可选的桥连基优 选具有低反应性，且对本发明的组合物的水溶液中的水解稳定。例如，适宜的桥连基包括 羰基、酰胺、氨基甲酸酯和脲。可选地，可以在该桥连基和衍生化基团之间插入亚烷基（如 c2-c1(l亚烷基或c3-c1(l亚烷基）。优选地，桥连基是可选地与亚烷基连接的酰胺。在备选实 施方案中，桥连基仅由c 3-c1(l亚烷基组成，适宜地，c3-c6亚烷基，更适宜地，c 3或c4亚烷基， 其在乙烯亚胺寡聚物的一个末端与NH直接连接。
[0044] 可以按上文所述衍生化乙烯亚胺寡聚物，其中衍生化寡聚物的一个或多个末端。 备选地，可以衍生化乙烯亚胺寡聚物的一个或多个末端，且可以用-H或惰性封端基团封端 寡聚物的一个或多个备选末端。
[0045] 适宜的惰性封端基团包括-CfQ烷基、-(C2_C6烷基）-0H和-(C 2_C6烷 基）-0- (CfC；烷基）。优选的封端基团是ch2ch2oh。
[0046] 备选地，乙烯亚胺寡聚物可以是未衍生化的，但可以用-Η或上文所述的惰性封端 基团在寡聚物的一个或多个末端封端。
[0047] 上文所述的任意乙烯亚胺寡聚物可以是线性的或支化的。
[0048] 在一个实施方案中，提供式I的乙烯亚胺寡聚物：
[0049] R-K-[CH2CH2NH]n-R
[0050] 式 I
[0051] 其中，K代表0或ΝΗ，η = 2-12,且每个R独立地是Η或选自-Q-C；烷基、_(C2_C6 烷基）-0H和-(C2-C6烷基）-0- (Q-C；烷基）的惰性封端基团。
[0052] 在一个实施方案中，K代表NH。
[0053] 在一个实施方案中，提供式II的乙烯亚胺寡聚物：
[0054] X-Yr[CH2CH2NH]n-Y2-X
[0055] 式 II
[0056] 其中，η = 2-12,每个X独立地选自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-0-)、聚丙 二醇（PPG-0-)和聚氨基酸；Yi是可选的，且选自-(Qj-Ce)烧基-C(0)-NH_、_(C 2_C6)烧 基-0C(0)-NH-、_(C2_C6)烷基-NHC(0)NH-和 _(CH上K-，其中 m = 3-10, K 代表 0 或 NH ;Y2 选自(0) - (CQ_C6)烧基-、-C (0) 0 (C2_C6)烧基-、-C (0) -ΝΗ- (C2_C6)烧基-和-(CH2) m-， 其中 m = 2-10。
[0057] 在一个实施方案中，可选的￥1选自-(CQ-C6)烷基-C (0) -NH-、- (C2_C6)烷 基-0C (0) -NH-、- (C2-C6)烷基-NHC (0) NH-和-(CH2) J-，其中 m = 3-10, K 代表 NH。
[0058] 在一个实施方案中，可选的￥1选自-（C2_C6)烷基-C (0) -NH-、- (C2_C6)烷 基-0C (0) -NH-、- (c2-c6)烷基-NHC (0) NH 和（CH上K，其中 m = 3-10, K 代表 0 或 NH。
[0059] 在一个实施方案中，可选的￥1选自-（C2_C6)烷基-C (0) -NH-、- (C2_C6)烷 基-0C (0) -NH-、- (c2-c6)烷基-NHC (0) NH 和（CH上K，其中 m = 3-10, K 代表 NH。
[0060] 在一个实施方案中，Y2 选自-c(o)-(c2-c6)烷基-、-c(o)o(c2-c 6)烷基-、-C(0)-NH-(C2-C6)烷基-和 _(CH2)m，其中 m= 2-10。
[0061] 在备选实施方案中，提供式III的乙烯亚胺寡聚物：
[0062] X-Y「[CH2CH2NH]n_R
[0063] 式 III
[0064] 其中，η = 2-12 ;X选自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-0-)、聚丙二醇 (PPG-0-)和聚氨基酸；Yi是可选的，且选自-(Qj-Ce)烧基-C(0)-NH_、_(C 2_C6)烧 基-0C(0)-NH-、-(C2-C6)烷基-NHC(0)NH-和（CH上K，其中 m = 3-10，K 代表 0 或 NH;R 是 Η 或选自-CfQ烷基、-(C2-C6烷基）-0Η和-(C2-C 6烷基）-0- (CrC6烷基）的惰性封端基团。
[0065] 在一个实施方案中，Yi是可选的，且选自-(Qj-Ce)烧基-C(0)-NH_、_(C 2_C6)烧 基-0C (0) -NH-、- (C2-C6)烷基-NHC (0) NH-和（CH上K，其中 m = 3-10, K 代表 NH。
[0066] 在一个实施方案中，可选的￥1选自-（C2_C6)烷基-C (0) -NH-、- (C2_C6)烷 基-0C (0) -NH-、- (c2-c6)烷基-NHC (0) NH 和（CH上K，其中 m = 3-10, K 代表 0 或 NH。
[0067] 在一个实施方案中，可选的￥1选自-（C2_C6)烷基-C (0) -NH-、- (C2_C6)烷 基-0C (0) -NH-、- (c2-c6)烷基-NHC (0) NH 和（CH上K，其中 m = 3-10, K 代表 NH。
[0068] 在式（III)的一个实施方案中，n = 2-12;X是PEG-0-或mPEG-0-，Y1缺乏，R是-H 或-CH2CH2OH。在另一实施方案中，η = 2-12 ;X是mPEG-O-A缺乏，R是-Η。在另一实施 方案中，η = 2-12 ;Χ是mPEG-0- Α缺乏，R是-CH2CH20H。在另一实施方案中，η = 2-8 ;Χ 是mPEG-0- Α缺乏，R是-CH2CH20H。在另一实施方案中，η = 2 ;Χ是mPEG-0- Α缺乏，R 是-CH2CH20H。在另一实施方案中，n = 5;X是mPEG-0-Α缺乏，R是-CH2CH20H。在另一实 施方案中，η = 8 ;X 是 mPEG-0- A 缺乏，R 是-CH2CH20H。
[0069] 在式（III)的一个实施方案中，η = 2-12 ;X是mPEG-O-J存在，且选自-(CQ-C6) 烧基-C (0) -NH-、- (C2_C6)烧基-〇C (0) -NH-、- (C2_C6)烧基-NHC (0) NH-和-(CH2)mK_，其中 m =3-10，K 代表 0 或 NH ;R 是-Η 或 CH2CH20H。在另一实施方案中，η = 4-8 ;X 是 m PEG-0- ;Y 是-(CQ_C6)烧基-C(0)_NH-，R是-Η。在另一实施方案中，η = 5 ;Χ是mPEG-〇-;Υ是_(C2)烧 基-C(0)-NH -，R是-H。在另一实施方案中，η = 5 ;X是mPEG-0- ;Y是-(C4)烧基-C(0)-NH-， R 是-Η。
[0070] 在备选实施方案中，提供式IV的乙烯亚胺寡聚物：
[0071] R-K-[CH2CH2NH]n-Y2-X 2
[0072] 式 IV
[0073] 其中，η = 2-12, K代表0或NH ;X2选自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-0-)、 聚丙二醇（PPG-0-)和聚氨基酸；Y 2选自-(：(0)-%-(；)烷基-、-C(0)0(C2-C6)烷基-、-C (0) -NH- (C2_C6)烧基-和-(CH2)m-，其中 m = 2-10 ;R 是-H 或选自-CfCg 烧基、-(C2_C6 烧 基）-0H和-(C2-C6烷基）-0- (CfC；烷基）的惰性封端基团。
[0074] 在式IV的一个实施方案中，η = 2 ;K表示0, X2是11^6-0_ ;Y2是-C(0)-(C2) 烷基-;R是-Η。类似地，在式IV的另一实施方案中，η = 2 ;K代表0;X2是mPEG-0-;Y2 是-(CH2)3-;R 是- Η。在一个实施方案中，Υ2 选自-c(o)-(c2-c6)烷基-、-c(o)o(c2-c 6)烷 基-、-C(0)-NH-(C2_C6)烧基-和-(CH 2)m_，其中 m = 2-10。
[0075] 可以通过常规方法制备乙烯亚胺寡聚物（包括其衍生物），例如通过包括以下的 步骤：
[0076] ⑴聚合乙烯亚胺或聚合2-甲基-2-K恶唑啉或2-乙基-2-5恶唑啉，然后 通过碱水解脱酰。例如，此方法可应用于制备用mPEG衍生化的乙烯亚胺寡聚物，其中 用mPEG衍生物mPEG-X(其中X是NH 2、0H、0-甲磺酰基或0-甲苯磺酰基）作为聚合 的起始反应剂。这类方法可以基于Kissel等在US20070036866A1中及Akiyama等在 Macromolecules, 2000, 33, 5841-5845 中所述的那些方法。
[0077] (ii)通过与载体聚合物的活化羧基衍生物反应来酰化预形成的乙烯亚胺寡聚物。 例如，在基于mPEG的载体聚合物的情况下，适宜的活化羧基衍生物是mPEG-琥珀酰亚胺 基丙酸酯和mPEG-琥珀酰亚胺基戊酸酯，从而掺入烷基-酰胺桥连基。这类方法可以基于 Wagner等在US20040248842A1中及Schlu印在US20050031579A1中所述的那些方法。
[0078] (iii)使预形成的乙烯亚胺寡聚物与载体聚合物的异氰酸酯衍生物反应，从而掺 入烷基-脲桥连基。例如，在基于mPEG的载体聚合物的情况下，从mPEG-醇和1，6-己二 异氰酸酯制备适宜的异氰酸酯衍生物。这类方法可以基于Petersen等在Macromolecules 2002, 35, 6867-6874中所述的那些方法。
[0079] (iv)利用预形成的乙烯亚胺寡聚物和载体聚合物的醛衍生物的还原性胺化，从而 掺入（CH 2)m桥连基。例如，在基于mPEG的载体聚合物的情况下，适宜的醛衍生物是mPEG 丙醛和mPEG 丁醛。也可以利用相应的醛水合物。这类方法可以基于例如Kintsler在 US5824784中及Bentley和Harris在US5990237中所述的用于蛋白质的N端PEG化的那些 方法。
[0080] 示例性条件描述于实施例章节中。
[0081] 乙烯亚胺寡聚物可以以游离碱形式或以盐的形式加至本发明的水溶液或组合物。 水溶液或组合物的pH优选足够低，使得乙烯亚胺寡聚物的至少部分碱性基团在溶液中质 子化。通常，本发明的水溶液或组合物的pH在4至8,例如5. 0至7. 5或5. 5至7. 0的范围 内。优选地，本发明的水溶液或组合物的pH可以在5. 5至6. 0、6. 0至6. 5或6. 5至7. 0的 范围内。
[0082] 乙烯亚胺寡聚物还可以作为适宜的酸（如可药用酸）的盐加至水溶液或组合物。 适宜的酸包括盐酸、氢溴酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、磷酸、甲磺酸、乙酸、甲酸、马来酸、延胡 索酸、苹果酸、琥珀酸、丙二酸、硫酸、L-谷氨酸、酒石酸、L-天冬氨酸、丙酮酸、粘酸、苯甲 酸、葡糖醛酸、草酸和抗坏血酸。在一个实施方案中，该酸是包含两个或多个酸性基团的多 酸。应注意，虽然式Ι、Π 、ΙΙΙ和IV的衍生化聚乙二醇寡聚物以未质子化的氮中心显示，但 这些化学式的部分或实际上全部碱性氮中心质子化的寡聚物也旨在认为包含在本发明的 范围之内。考虑其中部分或全部碱性氮中心质子化的未衍生化的乙烯亚胺寡聚物的所有实 施方案也认为包含在本发明的范围之内。
[0083] 在一个实施方案中，乙烯亚胺寡聚物的50-100%的碱性氮中心质子化。在另一实 施方案中，乙烯亚胺寡聚物的80-100%的碱性氮中心质子化。优选地，乙烯亚胺寡聚物的至 少95%的碱性氮中心质子化。不希望受限于理论，考虑在乙烯亚胺寡聚物的至少95%的碱 性氮中心质子化时，掩盖了抗体蛋白质表面的高电荷密度，从而抑制抗体蛋白质的聚集。具 体而言，不希望受限于理论，考虑乙烯亚胺寡聚物掩盖了抗体蛋白质表面带负电荷的区块， 从而抑制抗体蛋白质的电荷驱动的聚集。
[0084] 在一个实施方案中，包含抗体蛋白质的水溶液的pH低于蛋白质的等电点（pi)。在 一个实施方案中，抗体蛋白质的pi高于溶液的pH,适宜地，高至少0. 5个单位，更适宜地， 高0. 5至5个单位之间，甚至更适宜地，高1至3个单位之间。在一个实施方案中，抗体蛋 白质的pi为至少7,例如，在7-10或7. 5-9的范围内。
[0085] 在一个实施方案中，包含抗体蛋白质的水溶液是等渗的。在一个实施方案中，包含 抗体蛋白质的水溶液是高渗的。在一个实施方案中，包含抗体蛋白质的水溶液是低渗的。 [0086] 乙烯亚胺寡聚物以足以提供希望的稳定性的浓度存在于组合物中。在一个实施 方案中，乙烯亚胺寡聚物的浓度从约0. 01至约10mg/mL，例如从约0. 01至约0. lmg/mL、约 0. 1至约0. 25mg/mL、约0. 25至约lmg/mL、约1至约2mg/mL、约2至约5mg/mL或约5至约 10mg/mL。在一个实施方案中，乙烯亚胺寡聚物的浓度为约0. 2mg/mL至约2mg/mL。如本文 中所使用，本发明的组合物中乙烯亚胺寡聚物的质量指游离碱当量，即它不包括任何抗衡 阴离子（如果存在）。
[0087] 在某些实施方案中，抗体蛋白质与乙烯亚胺寡聚物的比（wt/wt)为至少10,例如， 至少20。在某些实施方案中，蛋白质与乙烯亚胺寡聚物的重量比从约20至约300,优选从 约50至约200。在某些实施方案中，蛋白质与乙烯亚胺寡聚物的重量比为约100。在某些 实施方案中，蛋白质与乙烯亚胺寡聚物的重量比可以高于300,例如，高达500、800或1000。 这些重量比指排除任意衍生化基团（例如PEG基团）的乙烯亚胺寡聚物含量本身的重量。 在一个实施方案中，抗体蛋白质与寡聚物的比（wt/wt)从约100至约200。
[0088] 本发明的溶液优选包含缓冲剂。通常，选择缓冲剂来提供允许蛋白质溶解至希望 的浓度的pH。优选地，pH足够低，使得乙烯亚胺寡聚物中的至少部分碱性基团质子化。还 可以选择缓冲剂来增强蛋白质稳定性。
[0089] 本发明人已研究了乙烯亚胺寡聚物和聚合物的大小对细胞毒性的影响，如实施例 7和8中所述。结果显示在图2、3和4中，并清楚地证明，随着聚乙烯亚胺的大小的减小，其 细胞毒性作用也减小。证明了重量从约50, OOODa减小至约800Da的聚乙烯亚胺的逐渐减小 的细胞毒性（见实施例7)。此细胞毒性逐渐减小的趋势可以合理地外推，暗示寡聚物中乙 烯亚胺重复单位的数目（η)在2-12范围内（即重量<800Da)的乙烯亚胺寡聚物将具有甚至 更低的细胞毒性。实际上，进一步证明了向下至约l〇〇Da的逐渐降低的细胞毒性（见实施 例8)。不希望受限于理论，本发明人认为，寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目（η)在2-12 范围内的乙烯亚胺寡聚物具有足够的大小来掩盖抗体蛋白质表面具有高电荷密度的区域， 从而解决浓缩溶液中抗体蛋白质聚集的问题。具体而言，不希望受限于理论，考虑η = 2-12 的乙烯亚胺寡聚物具有足够的大小来掩盖抗体蛋白质的具有高负电荷密度的区块，从而解 决浓缩溶液中电荷驱动的抗体蛋白质聚集的问题。此外，作为本发明人的研究的结果（见 图2、3和4)，且同样不希望受限于理论，本发明人认为，寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目 (η)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物还具有足够小的大小，以避免施加与细胞膜的破坏相 关的任意毒性作用。因此，这类寡聚物可以减少浓缩抗体蛋白质溶液中的聚集，同时显示有 利的毒性谱。因此，这类寡聚物在治疗性应用中尤其有用。
[0090] 如实施例1-6中所述，已发现，在相同条件下保存相同时长后，与缺乏该乙烯亚胺 寡聚物但其他方面相似或相同的组合物相比，本文定义的乙烯亚胺寡聚物可以显著降低组 合物（如水性抗体蛋白质溶液）中抗体蛋白质的聚集率。
[0091] 在一个实施方案中，寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目（η)在2-12范围内的乙烯 亚胺寡聚物在抗体蛋白质的浓缩水溶液中的存在将高分子量蛋白质种类的增加限制于在 40°C保存一个月后不超过5% (按总蛋白质重量计），适宜地，不超过3%，更适宜地，不超 过2%。在一个实施方案中，寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目（η)在2-12范围内的乙烯 亚胺寡聚物在抗体蛋白质的浓缩水溶液中的存在将高分子量蛋白质种类的增加限制于在 2-8°C保存多达两年后不超过5% (按总蛋白质重量计），适宜地，不超过3%，更适宜地，不 超过2%。高分子量种类的定量按组合物中总蛋白质的重量的百分比计。
[0092] 在一个实施方案中，在相同条件下保存相同时长后，与缺乏乙烯亚胺寡聚物但其 他方面相同的组合物相比，寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目（η)在2-12范围内的乙烯亚 胺寡聚物在抗体蛋白质的浓缩水溶液中的存在将高分子量蛋白质种类的增加限制了至少 10 %，优选至少25 %，更优选至少50 %。
[0093] 在一个实施方案中，在相同条件下保存相同时长后，寡聚物中乙烯亚胺重复单位 的数目（η)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物在抗体蛋白质的浓缩水溶液中的存在保持蛋 白质的水性组合物不含可见聚集体，而在缺乏乙烯亚胺寡聚物但其他方面相同的组合物中 观察到了可见聚集体的形成。可见聚集体的定量可以通过浊度或其他类型的光散射测量来 进行。
[0094] 在某些实施方案中，将抗体融合或缀合至活性分子，如毒素或能够结合诸如"Tc、 mIr、131I或9°Y的放射性金属离子的螯合剂。在这类实施方案中，抗体通常作为靶向剂发挥 作用，例如将活性分子定向至展示某种细胞表面蛋白质的细胞。
[0095] 可以按本文所述配制的具体抗体包括但不限于：英夫利昔单抗（infliximab) (嵌合抗体，抗 -TNF α )、阿达木单抗（adal imumab)(人抗体，抗-TNF α )、巴利昔单抗 (basiliximab)(嵌合抗体，抗-IL-2)、阿昔单抗（abciximab)(嵌合抗体，抗-GpIIb/ 111&)、达利珠单抗（(^]^111]^13)(人源化抗体，抗-11^-2)、吉妥珠单抗&61111：112111]^13) (人源化抗体，抗-⑶33)、阿伦单抗（alemtuzumab)(人源化抗体，抗-⑶52)、依决洛单 抗（edrecolomab)(鼠 Ig2a，抗-EpCAM)、利妥昔单抗（嵌合抗体，抗-⑶20)、帕利珠单抗 (palivizumab)(人源化抗体，抗-呼吸道合胞病毒）、曲妥珠单抗（trastuzumab)(人源 化抗体，抗-HER2/neu(erbB2)受体）、贝伐单抗（bevacizumab)(人源化抗体，抗-VEGF)、 西妥昔单抗（cetuximab)(嵌合抗体，抗-EGFR)、艾库组单抗（eculizumab)(人源化抗 体，抗 -补体系统蛋白质C5)、依法利珠单抗（efalizumab)(人源化抗体，抗-CD 11a)、替 伊莫单抗（ibritumomab)(鼠抗体，抗-⑶20)、莫洛单抗-⑶3(muromonab_⑶3)(鼠抗体， 抗-T细胞CD3受体）、那他珠单抗（natalizumab)(人源化抗体，抗-α 4整联蛋白）、尼 妥珠单抗（nimotuzumab)(人源化IgG，抗-EGF受体）、奥马珠单抗（omalizumab)(人源 化抗体，抗-IgE)、帕尼单抗（panitumumab)(人抗体，抗-EGFR)、兰尼单抗（ranibizumab) (人源化抗体，抗-VEGF)、1-131托西莫单抗（tositumomab)(人源化抗体，抗-⑶20)、奥 法木单抗（ofatumumab)(人抗体，抗-⑶-20)、赛妥珠单抗（certolizumab)(人源化抗体， 抗-TNF-α )、戈利木单抗（golimumab)(人抗体，抗-TNFa )和地诺单抗（denosumab)(人抗 体，抗-RANK配体）。优选的抗体包括曲妥珠单抗和利妥昔单抗。另一种目的抗体是英夫利 昔单抗。
[0096] 可以按本文所述配制的其他嵌合抗体包括巴维昔单抗（bavituximab)(抗-磷酯 酰丝氨酸）、brentuximab (抗-0)30)、司妥昔单抗（siltuximab)(抗-IL-6)、克立昔单抗 (clenoliximab)(抗-0)4)、加利昔单抗（galiximab)(抗-0)80)、鲁昔单抗（gomiliximab) (抗-⑶23)、凯利昔单抗（keliximab)(抗-0)4)、鲁西单抗（lumiliximab)(抗-0)23)、 普立昔单抗（priliximab)(抗-0)4)、替奈昔单抗（teneliximab)(抗-0)40)、伐利昔 单抗（vapaliximab)(抗-VAP1)、依美昔单抗（ecromeximab)(抗-GD3)和帕基昔单抗 (pagibaximab)(抗-葡萄球菌脂磷壁质）。
[0097] 可以按本文所述配制的其他人源化抗体包括依帕珠单抗（epratuzumab) (抗-CD 22)、阿夫土株单抗（afutuzumab)(抗_CD2〇)、比伐单抗（bivatuzumab mertansine) (抗-⑶44)、坎图珠单抗（cantuzumab mertansine)(抗-黏蛋白）、泊西他珠单 抗（citatuzumab bogatox)(抗-TACSTD1)、达塞珠单抗（dacetuzumab)(抗-CD40)、 elotuzumab (抗-0)319)、伊瑞珠单抗（etaracizumab)(抗-ανβ3-整联蛋白）、 farletuzumab (抗-FR α)、沃伊图珠单抗（inotuzumab ozogamicin)(抗-CD22)、拉贝珠 单抗（labetuzumab)(抗-癌胚抗原）、林妥珠单抗（lintuzumab)(抗-⑶33)、米拉图单抗 (milatuzumab)(抗-CD74)、尼妥珠单抗（抗-EGFR)、oportuzumab monatox (抗-EpCAM)、 帕妥珠单抗（pertuzumab)(抗-HER2)、西罗珠单抗（sibrotuzumab)(抗-FAP)、他珠单抗 (tacatuzumab tetraxetan)(抗-甲胎蛋白）、替加珠单抗（tigatuzumab)(抗-TRAIL-2)、 图考珠单抗（tucotuzumab celmoleukin)(抗-EpCAM)、维妥珠单抗（veltuzumab) (抗-⑶20)、阿塞珠单抗（aselizumab)(抗-⑶62L)、阿泊珠单抗（apolizumab) (抗-HLA-DRB)、benralizumab (抗-CD125)、西利珠单抗（cedelizumab)(抗-CD4)、依帕 珠单抗（抗-⑶22)、厄利珠单抗（erlizumab)(抗-⑶18)、芳妥珠单抗（fontolizumab) (抗 -干扰素1)、美泊利单抗（mepolizumab)(抗-IL5)、奥瑞珠单抗（ocrelizumab) (抗-⑶20)、帕考珠单抗（pascolizumab)(抗-IL4)、培克珠单抗（pexelizumab)(抗-补 体组分5)、PR0-140 (抗-CCR5)、瑞利珠单抗（reslizumab)(抗-IL5)、隆塔珠单抗 (rontalizumab)(抗-干扰素 -α )、罗维珠单抗（rovelizumab)(抗-⑶11XD18)、西利珠单 抗（siplizumab)(抗-⑶2)、他利珠单抗（talizumab)(抗-IgE)、替丽珠单抗（teplizumab) (抗-⑶3)、托珠单抗（tocilizumab)(抗-IL6R)、维多珠单抗（vedolizumab)(抗-α 4β 7-整 联蛋白）、维西珠单抗（visilizumab)(抗-CD3)、伊利珠单抗（ibalizumab)(抗-CD4)、替 巴珠单抗（tefibazumab)(抗-聚集因子A)、他西珠单抗（tadocizumab)(抗-a llb β 3-整联 蛋白）、内珠单抗（bapineuzumab)(抗-淀粉状-β )、solanezumab(抗-淀粉状-β )、他 尼珠单抗（tanezumab)(抗-NGF)、乌珠单抗（urtoxazumab)(抗-大肠杆菌志贺样毒素 II B亚基）、非维珠单抗（felvizumab)(抗-呼吸道合胞病毒）、莫维珠单抗（motavizumab) (抗 -呼吸道合胞病毒糖蛋白F)和lebrikizumab (抗-IL13)。
[0098] 可以按本文所述配制的其他人抗体包括阿托木单抗（atorolimumab)(抗-Rh因 子）、夫苏木单抗（fresolimumab)(抗-TGF0-1、_2 和-3)、乐德木单抗（lerdelimumab) (抗-TGF0-2)、美替木单抗（metelimumab)(抗-TGF0_1)、莫罗木单抗（morolimumab) (抗-Rh 因子）、伊匹单抗（ipilimumab)(抗-CTLA-4)、曲利木单抗（tremelimumab) (抗-CTLA-4)、桕替木单抗（bertilimumab)(抗-CCL11)、扎木单抗（zanolimumab) (抗-Q)4)、巴列津单抗（briakinumab)(抗-IL12、-23)、康纳单抗（canakinumab) (抗-IL1 β )、优特克单抗（ustekinumab)(抗-IL12、-23)、阿德姆单抗（adecatumumab) (抗-EpCAM)、贝利单抗（belimumab)(抗-B细胞激活因子）、西妥木单抗（cixutumumab) (抗-IGF-1 受体）、可那木单抗（conatumumab)(抗-TRAIL-R2)、figitumumab (抗-IGF-1 受 体）、伊妥木单抗（iratumumab)(抗-⑶30)、来沙莫单抗（lexatumumab)(抗-TRAIL-R2)、 鲁图莫单抗（lucatumumab)(抗-⑶40)、马帕木单抗（mapatumumab)(抗-TRAIL-R4)、 necitumumab (抗-EGFR)、olaratumab (抗-PDGF-R α )、普林木单抗（pritumumab)(抗-波 形蛋白）、罗妥木单抗（robatumumab)(抗-IGF-1受体）、伏妥莫单抗（votumumab)(抗-肿 瘤抗原 CTAA16. 88)、杂鲁木单抗（zalutumumab)(抗-EGFR)、斯达卢单抗（stamulumab) (抗肌生成抑制素）、依芬古单抗（efungumab)(抗真菌HSP90)、艾韦单抗（exbivirumab) (抗 -乙型肝炎表面抗原）、foravirumab (抗-狂犬病糖蛋白）、利韦单抗（libivirumab) (抗-乙型肝炎表面抗原）、瑞非韦鲁单抗（rafivirumab)(抗-狂犬病糖蛋白）、瑞加韦单抗 (regavirumab)(抗-巨细胞病毒糖蛋白B)、司韦单抗（sevirumab)(抗-巨细胞病毒）、妥 韦单抗（tuvirumab)(抗-乙型肝炎病毒）、panobacumab (抗-铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)血清型IATS011)、雷西巴单抗（raxibacumab)(抗-炭疽毒素）、雷莫芦单抗 (ramucirumab)(抗-VEGF-R2)和刚奈鲁单抗（gantenerumab)(抗-淀粉状-β )。
[0099] 包含免疫球蛋白分子的片段的融合蛋白质也可以按照本发明配制。适宜的融合蛋 白质包括含有与一个或多个免疫球蛋白片段（如Fc结构域）融合的活性蛋白质结构域的 蛋白质。这类融合蛋白质包括具有单体单位的二聚体蛋白质，该单体单位包含诸如可溶性 受体或受体胞外配体结合结构域的活性蛋白质结构域，该活性蛋白质结构域与免疫球蛋白 Fc结构域融合。两个Fc结构域可以通过二硫键结合形成二聚体蛋白质。这类融合蛋白质 包括依那西普（etanercept)、阿巴西普（abatacept)和贝拉西普（belatacept)。
[0100] 包含抗体（或一个或多个抗体片段）和诸如PEG的化学惰性聚合物的缀合衍生物 也可以按照本发明配制。这类衍生物包括赛妥珠单抗（certolizumab pegol)。
[0101] 抗体蛋白质可以分离自天然来源或可以是重组蛋白质。
[0102] 在某些实施方案中，抗体蛋白质基本上纯，也就是说，组合物包含单种蛋白质，且 无实质性量的任意额外蛋白质。在优选实施方案中，蛋白质包含组合物的总蛋白质含量的 至少99%、优选至少99. 5%和更优选至少约99. 9%。在优选实施方案中，蛋白质对在药物 组合物中的用途而言足够纯。
[0103] 水溶液中抗体蛋白质的浓度为至少约10mg/mL，且优选在约25mg/mL至约400mg/ mL的范围内。在某些实施方案中，浓度为至少约25mg/mL。在某些实施方案中，蛋白质浓度 为至少约3〇11^/1]1]^、4〇11^/1]1]^、5〇11^/1]1]^、6〇11^/1]1]^、7〇11^/1]1]^、8〇11^/1]1]^、9〇11^/1]11^或10〇11^/1]1]^。更 优选地，蛋白质浓度高于50mg/mL，例如至少约80mg/mL。浓度可以是多达约400mg/mL，例如 多达约350mg/mL、300mg/mL、250mg/mL、200mg/mL或175mg/mL。本文考虑通过前述下限之一 和前述上限之一限定的每个浓度范围。
[0104] 本文所用的术语"可药用"指药物组合物的成分，其适合用于预期的用途及对人或 动物（如哺乳动物）身体施用的方式而无过度的不良结果，如毒性、刺激和变态反应，且具 有合理的风险/收益比。
[0105] 适宜地，本发明的组合物包含缓冲剂来稳定组合物的pH，还可以选择缓冲剂来增 强蛋白质稳定性。在一个实施方案中，选择具有接近组合物pH的pKa的缓冲剂；例如，在组 合物的pH在4. 5-5. 5范围内时，适宜地利用乙酸作为缓冲剂，在组合物的pH在5. 6-6. 5范 围内时，适宜地利用组氨酸作为缓冲剂。备选地，在另一实施方案中，按W02008/084237中 所公开进一步稳定本发明的组合物，W02008/084237描述了包含蛋白质和一种或多种添加 剂的组合物，其特征在于该系统基本上不含常规缓冲剂，即在保存组合物的预期温度范围 内具有组合物的pH的1个单位之内的pKa的化合物。在此实施方案中，将组合物的pH设在 这样的值，组合物在该pH值下具有就pH而言的最大可测量稳定性；一种或多种添加剂（替 换缓冲液）能够与蛋白质交换质子，且在保存组合物的预期温度范围内具有比组合物的pH 高或低至少1个单位的pKa值。通过保持蛋白质处于适宜的pH，处于或接近可测量稳定性 最大的值，在缺乏常规缓冲剂的情况下，可以实质性提高蛋白质的保存稳定性。在某些实施 方案中，通过使用在组合物的预期保存温度范围内具有水性组合物pH的1至5个pH单位 之间、优选1至3个pH单位之间、最优选1. 5至2. 5个pH单位之间的pKa的添加剂，通常 可以可能实质性地进一步增强保存稳定性。
[0106] 本发明的溶液可以进一步包括一种或多种常规赋形剂，如无机盐，优选钠、钾、钙 或铵与氯、硫酸、碳酸、亚硫酸、硝酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、马来酸或乳酸组合的盐；氨基酸， 优选组氨酸、甘氨酸、精氨酸或甲硫氨酸（例如作为抗氧化剂）；糖或糖醇，优选海藻糖、蔗 糖、甘露醇、棉子糖、山梨醇、乳糖醇、甘油或1，2-丙二醇；表面活性剂，优选聚山梨酸酯20、 聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯80、泊洛沙姆188或泊洛沙姆407 ;痕量金属螯合剂，优选ETDA ; 防腐剂，优选苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或苯索氯铵。镁与氯、硫 酸、碳酸、亚硫酸、硝酸、乳酸、琥珀酸、乙酸、马来酸或乳酸组合的无机盐也是适宜的赋形 剂。
[0107] 本发明的溶液可选地包含渗涨度调节剂。适宜的渗涨度调节剂在上文【背景技术】中 列出，且可以是带电荷或不带电荷的化学种类。典型的不带电荷的渗涨度调节剂包括糖类， 如蔗糖、海藻糖、甘油和甘露醇。典型的带电荷的渗涨度调节剂包括带电荷的化学种类，如 精氨酸或氯化钠。
[0108] 在一个实施方案中，用诸如无机盐或有机盐的带电荷种类调节抗体蛋白质的水溶 液的渗涨度。在一个实施方案中，用诸如糖类或糖醇的不带电荷种类调节抗体蛋白质的水 溶液的渗涨度。
[0109] 本发明的水性组合物涵盖广范围的摩尔渗透压浓度，包括低渗、等渗和高渗的组 合物。优选地，本发明的溶液基本上等渗。优选的溶液具有约200至约500m0sm/L范围内 的摩尔渗透压浓度。优选地，摩尔渗透压浓度在约250至约350m0sm/L的范围内。更优选 地，摩尔渗透压浓度为约300m0sm/L。在一个实施方案中，溶液预期用于通过肌内或皮下注 射来对受试者施用，且选择溶液的摩尔渗透压浓度来最小化注射时的疼痛。
[0110] 本文所用的术语"高分子量种类"指蛋白质含量的任意成分，其具有至少两倍于亲 本活性蛋白质的分子量的表观分子量。也就是说，高分子量种类是亲本蛋白质的多聚聚集 体。多聚聚集体可以包含具有显著改变的构象的亲本蛋白质分子，或者它们可以是处于天 然构象或近天然构象的亲本蛋白质单位的组装。高分子量种类的测定可以用本领域已知的 方法进行，包括大小排阻层析、电泳、分析型超速离心/沉降速度、光散射、动态光散射、静 态光散射和场流分级分离。
[0111] 优选地，在40°c保存至少一个月、两个月或三个月后，本发明的组合物包含不超过 5% (按总蛋白质重量计）高分子量种类。在一个实施方案中，在40°C保存至少一个月、两个 月或三个月后，高分子量种类的量增加不超过5% (按总蛋白质重量计），优选不超过3%。 高分子量种类的定量按组合物中总蛋白质的重量的百分比计。
[0112] 在优选实施方案中，在相同条件下保存相同时长后，本发明的组合物应显示保存 期间高分子量种类的增加比缺乏乙烯亚胺寡聚物但其他方面相同的组合物低至少10%，优 选低至少25 %，更优选低至少50 %。
[0113] 在一个实施方案中，本发明的组合物是适合用于对有需要的受试者施用治疗性抗 体蛋白质的药物组合物。这类组合物可以在用于对受试者施用治疗性蛋白质的方法中使 用。
[0114] 在另一实施方案中，本发明提供用于对有需要的受试者施用治疗性抗体蛋白质的 方法。该方法包括施用水溶液的步骤，该水溶液包含浓度为至少约10mg/mL的抗体蛋白质 及寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目（η)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物。优选地，通过 静脉内、皮下或肌内注射施用该组合物。更优选地，通过皮下注射施用该组合物。
[0115] 在优选实施方案中，蛋白质浓度足够高，使得每次施用的总体积不超过约2mL。优 选地，每次施用的总体积不超过约1. 5mL或约1. OmL。在一个实施方案中，每次施用的溶液 体积从约〇. 5至约2mL，优选从约0. 5至约1. 5mL。
[0116] 在另一实施方案中，本发明提供适合用于对有需要的受试者施用的包装的药物组 合物。该药物组合物包含水溶液，该水溶液包含浓度为至少约lOmg/mL的治疗性抗体蛋白 质及寡聚物中乙烯亚胺重复单位的数目（η)在2-12范围内的乙烯亚胺寡聚物。
[0117] 优选地，溶液的体积为约2mL或更少。在一个实施方案中，溶液的体积提供约0. 5 至约2mL的施用体积，具有足够的过剩来适应经注射器摄取溶液的限制。在一个实施方案 中，该过剩为施用体积的约10%至约20%。药物组合物优选包装在适于插入针头来吸出溶 液的小瓶中。在一个实施方案中，该药物组合物包装在具有胶塞的玻璃瓶中。包装的药物 组合物可以作为试剂盒提供，该试剂盒进一步包含使用说明和可选的适合用于肌内或皮下 施用的注射器。备选地，包装的药物组合物可以以适合用于肌内或皮下施用的预装一次性 注射器的形式提供。预装自动注射装置也将适合用于肌内或皮下施用。
[0118] 本文所用的乙烯亚胺寡聚物的百分比指基于乙烯亚胺寡聚物的游离碱的重量 (即排除任意抗衡离子的重量）。
[0119] 在另一方面，本发明提供式V的化合物：
[0120] X-Y「[CH2CH2NH]n_R
[0121] 式 V
[0122] 其中，η = 2-6 ;X选自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-0-)、聚丙二醇（PPG-0-)和 聚氨基酸A选自- (C2-C6)烷基-C(0)-NH-和（CH2)mK，其中m= 3-10，K代表NH;R是Η或 选自-CfQ烷基、-(C2-C6烷基）-0Η和-(C 2-C6烷基）-0- (CrC6烷基）的惰性封端基团。
[0123] 在式（V)的一个实施方案中，η为3-5。
[0124] 在式（V)的一个实施方案中，X具有500Da至5000Da的丽，且是聚乙二醇（例如 PEG-0-和mPEG-0-)或聚丙二醇（PPG-0-)，适宜地，X具有约2000Da或约5000Da的MW，且 是 mPEG-0-。
[0125] 在式（V)的一个实施方案中，Yi是-((：2_(：6)烷基-C(0)-NH-，适宜地，是（C 2_C4)烷 基 _C (0)_NH_。
[0126] 在式（V)的一个实施方案中，￥1是（CH2)mK，其中m = 3-10,例如m = 3或4,且K 代表NH。
[0127] 在式（V)的一个实施方案中，R是H。在式（V)的一个实施方案中，R是_((：2-(；烷 基） _0H。
[0128] 在式（V)的一个实施方案中，η = 2_6，X具有500Da至5000Da的MW，且是聚乙二 醇（例如 PEG-0-和 mPEG-0-)或聚丙二醇（PPG-0-) A 选自- (C2-C6)烷基-C(0)-NH-和 (CH2) mK，其中 m = 3-10, K 代表 NH ;R 是 Η 或选自-C「C6 烷基、-(C2-C6 烷基）-0H 和-(C2-C6 烷基）-0- (Q-Q烷基）的惰性封端基团。
[0129] 在式（V)的一个实施方案中，η = 2-6, X是聚乙二醇（例如PEG-0-和/或 mPEG-0-) Α 选自 _(C2_C6)烷基-C(0)-NH-和（CHiK，其中 m = 3-4, Κ 代表 NH ;R 是 Η 或 选自-CfQ烷基、-(C2-C6烷基）-0Η和-(C2-C 6烷基）-0- (CrC6烷基）的惰性封端基团。
[0130] 在式（V)的一个实施方案中，η = 2-6, X是mPEG-0- A选自_(C2_C6)烷 基-C (0) -NH-和（CH丄K，其中 m = 3-4, K 代表 NH ;R 是 Η 或-(c2-c6 烷基）-0H。
[0131] 在式（V)的一个实施方案中，η = 2-6, X是聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-0-); Yi 选自-(c2-c6)烷基-c (0) -NH-和（CH2) mK，其中 m = 3-4, K 代表 NH ;R 是 Η 或-(c2-c6 烷 基）-0H ;其中在 Yi 是（CH2)mK 时，R 是-(C2-C6 烷基）-0H。
[0132] 式（V)的示例性化合物包括mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺（例如，其中mPEG是 2KmPEG)、mPEG戊酸酰氨基四亚乙基五胺（例如，其中mPEG是2KmPEG)、mPEG戊酸酰氨基三 亚乙基四胺（例如，其中mPEG是2KmPEG)、mPEG丙基三亚乙基四胺乙醇（例如，其中mPEG 是2K或5KmPEG)和mPEG丙基五亚乙基六胺乙醇（例如，其中mPEG是2K或5KmPEG)。
[0133] 可以用实施例中所述的方法和与之类似的方法连同技术人员已知的方法来制备 式（V)的化合物。
[0134] 例如，其中Yi是-(C2_C6)烧基-C(0)-NH-的式（V)的化合物可以如下制备，其中 LG代表离去基团，如0-琥珀酰亚胺（见例如化合物（I)的合成）：
[0135]

【权利要求】
1. 水溶液，其包含浓度为至少约lOmg/mL的抗体蛋白质和乙烯亚胺寡聚物，其中寡聚 物中乙烯亚胺重复单位的数目（η)在2-12范围内。
2. 降低水溶液中的抗体蛋白质的聚集率的方法，其中抗体蛋白质浓度为至少约10mg/ mL，其包括向所述溶液中加入乙烯亚胺寡聚物的步骤，其中寡聚物中乙烯亚胺重复单位的 数目（η)在η = 2-12的范围内。
3. 权利要求1的水溶液或权利要求2的方法，其中η = 3-11。
4. 权利要求3的水溶液或方法，其中η = 6-8。
5. 权利要求4的水溶液或方法，其中η = 2-6,例如3-5。
6. 权利要求1至5中任一项的水溶液或方法，其中用选自聚乙二醇（例如PEG和 mPEG)、聚丙二醇（PPG)和聚氨基酸的一种或多种聚合物衍生化所述乙烯亚胺寡聚物。
7. 权利要求1至6中任一项的水溶液或方法，其中用一种或多种共聚物衍生化所述乙 烯亚胺寡聚物，其中所述共聚物由选自聚乙二醇（例如PEG和mPEG)、聚丙二醇（PPG)和聚 氨基酸的聚合物（及其相关单体）组成。
8. 权利要求1至5中任一项的水溶液或方法，其中用一种或多种PEG或mPEG衍生化所 述乙烯亚胺寡聚物。
9. 权利要求6至8中任一项的水溶液或方法，其中经可选的桥连基衍生化所述乙烯亚 胺寡聚物，其中桥连基选自羰基、酰胺、氨基甲酸酯、脲和亚烷基。
10. 权利要求1的水溶液或权利要求2的方法，其中乙烯亚胺寡聚物选自二亚乙基三 胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺和五亚乙基六胺。
11. 权利要求1至10中任一项的水溶液或方法，其中用选自-CfQ烷基、-((：2-(：6烷 基）-0H和-(Q-C；烷基）-0- (C2-C6烷基）的惰性封端基团封端乙烯亚胺寡聚物。
12. 权利要求1或权利要求2的水溶液或方法，其中乙烯亚胺寡聚物为式III : X-Y「[CH2CH2NH]n-R 式III 其中，η = 2-12 ;X选自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-Ο-)、聚丙二醇（PPG-0-)和聚 氨基酸；￥1是可选的，且选自_(〇|^6)烧基-(](0)-順-、-((] 2-(]6)烧基-0(](0)-順-、-((]2-〇6) 烷基-NHC(0)NH-和（CH丄K，其中m = 3-10,且K代表0或NH;且R是Η或选自-C「C6烷 基、-(C2-C 6烷基）-0H和-(C2-C6烷基）-0- (CrC6烷基）的惰性封端基团。
13. 权利要求1至7或9至12中任一项的水溶液或方法，其中聚氨基酸选自聚甘氨酸、 聚丙氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸和聚苯丙氨酸。
14. 权利要求12的水溶液或方法，其中η = 2-12, X是PEG-0-或mPEG-Ο- A缺乏，且 R 是-H 或-CH2CH20H。
15. 权利要求12的水溶液或方法，其中η = 2-12 ;X是mPEG-Ο- ;Y存在，且选 J，其中m = 3-10,且Κ代表0或NH ;R是Η。
16. 权利要求15的水溶液或方法，其中η = 4-8 ;X是mPEG-Ο- ;Y是-(CQ-C6)烷 基-C (0) -NH-，且 R 是 _H。
17. 权利要求12至16中任一项的水溶液或方法，其中K是NH。
18. 权利要求1至17中任一项的水溶液或方法，其中乙烯亚胺寡聚物的碱性氮中心的 至少95%质子化。
19. 权利要求1至18中任一项的水溶液或方法，其中乙烯亚胺寡聚物以约0. 2mg/mL至 约5mg/mL的浓度存在。
20. 权利要求1至19中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质是治疗剂。
21. 权利要求1至20中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质是抗体、抗体片段、与 活性部分缀合的抗体、包含一个或多个抗体片段的融合蛋白质、或前述任一种的衍生物。
22. 权利要求21的水溶液或方法，其中抗体蛋白质是单克隆抗体。
23. 权利要求22的水溶液或方法，其中单克隆抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或 人抗体。
24. 权利要求22的水溶液或方法，其中单克隆抗体是曲妥珠单抗或利妥昔单抗。
25. 权利要求22的水溶液或方法，其中单克隆抗体是英夫利昔单抗。
26. 权利要求21的水溶液或方法，其中抗体蛋白质是包含与一个或多个免疫球蛋白Fc 片段融合的活性蛋白质结构域的融合蛋白质。
27. 权利要求26的水溶液或方法，其中抗体蛋白质是依那西普、阿巴西普或贝拉西普。
28. 权利要求21的水溶液或方法，其中衍生物是包含一种或多种抗体或抗体片段和化 学惰性聚合物的缀合衍生物。
29. 权利要求28的水溶液或方法，其中缀合衍生物是赛妥珠单抗。
30. 权利要求1至29中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质浓度在约25mg/mL和 约300mg/mL之间。
31. 权利要求1至30中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质浓度高于50mg/mL。
32. 权利要求1至31中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质与所述乙烯亚胺寡聚 物的重量比（wt/wt)为约50至约100。
33. 权利要求32的水溶液或方法，其中抗体蛋白质与所述乙烯亚胺寡聚物的重量比 (wt/wt)为约 100 至约 200。
34. 用于对有需要的受试者施用抗体蛋白质的方法，其包括对所述受试者施用权利要 求1至33中任一项的水溶液的步骤。
35. 权利要求34的方法，其中通过皮下或肌内注射或通过静脉内注射或输注施用所述 溶液。
36. 权利要求34或权利要求35的方法，其中所施用的溶液的总体积为约2mL或更少。
37. 权利要求1至36中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质的pi高于溶液的pH。
38. 权利要求37的水溶液或方法，其中抗体蛋白质的pi比溶液的pH高至少0. 5个单 位。
39. 权利要求1至38中任一项的水溶液或方法，其中抗体蛋白质的pi为至少7。
40. 权利要求39的水溶液或方法，其中抗体蛋白质的pi在7-10的范围内。
41. 权利要求1至40中任一项的水溶液或方法，其中水溶液是等渗的。
42. 权利要求1至41中任一项的水溶液或方法，其中水溶液包含不带电荷的渗涨度调 节剂。
43. 权利要求1至41中任一项的水溶液或方法，其中水溶液包含带电荷的渗涨度调节 剂。
44. 式V的化合物： X-Y「[CH2CH2NH]n-R 式V 其中，η = 2-6 ;X选自聚乙二醇（例如PEG-0-和mPEG-O-)、聚丙二醇（PPG-0-)和聚 氨基酸A选自_(C2_C6)烷基-C(0)-NH-和（CH2) mK，其中m= 3-10,且K代表NH;且R是Η 或选自烷基、-(C2-C6烷基）-OH和-(C 2-C6烷基）-0- (Q-C；烷基）的惰性封端基团。
45. 权利要求44的化合物，其中η为3-5。
46. 权利要求44或45的化合物，其中X具有500Da至5000Da的丽，且是聚乙二醇（例 如 PEG-0-和 mPEG-0-)或聚丙二醇（PPG-0-)。
47. 权利要求44至46中任一项的化合物，其中Yi是-(C2-C6)烷基-C(0) -NH-。
48. 权利要求44至46中任一项的化合物，其中Yi是（CH2)mK ;m = 3或4,且K代表NH。
49. 权利要求44至48中任一项的化合物，其中R是H。
50. 权利要求44至48中任一项的化合物，其中R是- (C2-C4烷基）-0H。
51. 权利要求44的化合物，其选自mPEG戊酸酰氨基五亚乙基六胺、mPEG戊酸酰氨基四 亚乙基五胺、mPEG戊酸酰氨基三亚乙基四胺、mPEG丙基三亚乙基四胺乙醇和mPEG丙基五亚 乙基六胺乙醇。
52. 权利要求1的水溶液，其中乙烯亚胺寡聚物是权利要求44至51中任一项的化合 物。
53. 适用于对有需要的受试者施用的包装的药物组合物，其包含权利要求1至33、权利 要求37至43或52中任一项的水溶液。
【文档编号】A61K39/395GK104203282SQ201380017932
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年1月30日 优先权日:2012年1月30日
【发明者】G·卡西, B·K·德勒姆, J·耶热克, N·罗伊勒 申请人:艾瑞克有限公司