一种治疗肿瘤的药物组合物及用途
【专利摘要】本发明提供一种用于治疗肿瘤的组合药物，由吖啶黄或药学上可接受的盐、美法仑或药学上可接受的盐和药用载体组成，其中吖啶黄以及美法仑的摩尔配比为1∶100到1∶10，所述肿瘤包括血液性肿瘤及实体瘤。药物形式选用将吖啶黄及美法仑分别制成单一的制剂，或者药物形式选用将吖啶黄及美法仑制成复方制剂。本发明制备的组合药物，可以提高肿瘤治疗效果，并可以降低其毒性，减缓肿瘤生长的速度。
【专利说明】一种治疗肿瘤的药物组合物及用途
【技术领域】
[0001]本发明属于药物用途领域，涉及用于治疗肿瘤的联合用药物组合物，尤其涉及用于治疗肿瘤的吖啶黄和美法仑的药物组合物，及其制药用途。
【背景技术】
[0002]肿瘤是世界严重的公共卫生问题，根据2012年中国肿瘤年报的数据，目前我国肿瘤的发病率为285.91/10万，全国每年新发肿瘤病例估计约为312万例，平均每天每分钟有6人被诊断为恶性肿瘤。我国居民一生罹患肿瘤的概率为22%。全国肿瘤死亡率为180.54/10万。估计每年因癌症死 亡病例达270万例。我国居民因癌症死亡的几率为13%。
[0003]烷化剂是临床常用的化疗药物，其在体内能形成缺电子中间体，使生物大分子富电子基团烷基化，从而改变生物大分子的结构域功能，使细胞的分裂增殖受到抑制或引起细胞死亡。烷化剂对快速分裂增殖的恶性肿瘤细胞最为敏感，但由于其还影响体内增值较快的正常细胞，因此存在着一定的毒性。以多发性骨髓瘤及晚期卵巢癌的一线用药美法仑(又名马法兰、米尔法兰或左旋苯丙氨酸氮芥等)为例，其能够引起患者的骨髓抑制，导致白细胞及血小板下降。因此临床上大多采取联合用药的方案，以在保持和提高抗肿瘤药物疗效的同时，减少其毒性作用。
[0004]吖啶黄是由盐酸3，6- 二氨基-10-甲基吖啶及3，6- 二氨基吖啶所组成的混合物，是一类煤焦油中提取的染料。它于1921年被德国科学家Paul Ehrlich发现可用作抗菌药，并在第一次世界大战期间被广泛应用于睡眠病的治疗。此外其稀水溶液还被用作表面抗菌剂或口服尿路抗菌药；随着抗生素的问世及应用，吖啶黄逐渐退出临床，目前多被当做兽药使用。长期的临床应用显示，给予病人吖啶黄五个月以上，未发现有明显的毒副作用反应，这显示了其在临床应用中良好的前景。目前，尚未有将吖啶黄同烷化剂联合使用用于治疗肿瘤的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对上述现有技术存在的不足，提供一种用于治疗肿瘤的药物组合物，由吖啶黄或药学上可接受的盐、美法仑或药学上可接受的盐组成，其中吖啶黄以及美法仑的摩尔配比为1:100到1:10。和药用载体
所述的吖啶黄为盐酸3，6- 二氨基-10-甲基吖啶及3，6- 二氨基吖啶的混合物，CAS号为 8048-52-0。
[0006]所述的可药用的盐为与酸加成的盐，选用的酸为盐酸、富马酸、马来酸、柠檬酸或琥珀酸。
[0007]本发明的另一个目的是提供所述的组合药物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。所述吖啶黄的有效体外治疗浓度为0.1-lOMmol/L，优选0.5-1.5Mmol/L，有效体内治疗浓度为l_50mg/kg体重(裸鼠),优选5-20mg/kg体重(裸鼠)。所述的肿瘤包括血液性肿瘤及实体瘤。[0008]所述可药用载体为本领域技术人员所公知和常用的，如丸剂、片剂、胶囊剂等中的填充物或载体物质，这些物质通常被保健专家认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。
[0009]所述组合药物可以制成任意剂型。
[0010]应当理解，本发明所述的药物使用包括以下两种方式:
一是将吖啶黄及美法仑分别制成单独的制剂，两种制剂的剂型可以不同，并且可联合使用的药物可以采用其现有剂型。在使用时可以将这两种药物先后使用，也可以同时使用。将两种药物先后使用时，吖啶黄的单独制剂可以首先服用。依次给药时，给予第二种组分时第一种组分应该还未丧失其在体内的有效作用。
[0011]二是将上述吖啶黄及美法仑制成单一的复方制剂，使用时同时服用。
[0012]配置药物组合物及使用时，需要产生作用的吖啶黄及美法仑的剂量可以改变，且最终由医务人员决定，所考虑的因素包括患者年龄及疾病性质和严重程度。[0013]本发明做了一系列相关实验研究证明，将吖啶黄与美法仑联合使用的药物联合用药，可以提高肿瘤治疗效果，并可以降低其毒性，减缓肿瘤生长的速度。所述的肿瘤包括血液性肿瘤及实体瘤。
[0014]吖啶黄本身曾在临床上作为抗菌药使用，未曾见其被用于临床治疗肿瘤的相关报道。同时吖啶黄与烷化剂美法仑的联合用药也未见报道。
[0015]本发明公开了一种用于治疗肿瘤的吖啶黄-美法仑联合用药物，包括抗菌药吖啶黄以及烷化剂美法仑或其药学上可接受的盐且任选的可以包括一种或多种可药用载体。本申请的发明人做了一系列相关实验研究，结果表明，将未曾在临床上用于肿瘤治疗的抗菌药吖啶黄与双功能烷化剂美法仑联合用药后，可以显著提高肿瘤治疗效果，而不增加其毒性，表现出显著的药理学协同作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为体外通过磺酰罗丹明B (Sulforhodamine B, SRB)比色法或水溶性四唑盐-WST-8比色法测定的对宫颈癌、结肠癌及多发性骨髓瘤细胞系的增值影响。其中在结肠癌HCT116细胞中所使用吖啶黄的浓度为0.5Mmol/L，在宫颈癌Hela及多发性骨髓瘤RPM1-8226细胞中所使用吖啶黄的浓度为0.75Mmol/L。
[0017]图2为体外通过PI单染结合流式细胞术测定的吖啶黄与美法仑联合用药物对宫颈癌、结肠癌及多发性骨髓瘤细胞系凋亡的影响示意图。其中在宫颈癌Hela上，对照组凋亡率3.88 ± 1.29%，吖啶黄单用组凋亡率6.65 ± 1.82%，美法仑单用组凋亡率24.82土 1.48%，合用组凋亡率40.35±0.01% ;在结肠癌HCTl 16上，对照组凋亡率
5.60±0.38%，吖啶黄单用组凋亡率13.16±0.61%，美法仑单用组凋亡率17.69±1.65%，合用组凋亡率38.49±1.97% ;在多发性骨髓瘤RPM1-8226上，对照组凋亡率0.04±0.02%,吖啶黄单用组凋亡率0.09±0.09%,美法仑单用组凋亡率26.52± 1.57%，合用组凋亡率50.33 ±2.72%。
[0018]图3为体内裸鼠实验中，吖啶黄与美法仑联合用药物对宫颈癌细胞移植瘤的影响示意图。
[0019]图4为体内裸鼠实验中，吖啶黄与美法仑联合用药物对结肠癌细胞移植瘤的影响示意图。
[0020]图5为体内裸鼠实验中，利用TUNEL标记法测定的宫颈癌细胞凋亡示意图。正在凋亡的细胞因连接上的辣根过氧化酶HRP与二氨基联苯胺DAB发生反应而呈现深棕色。
【具体实施方式】
[0021]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0022]实施例1:结肠癌此1'116、宫颈癌抱1&及多发性骨髓瘤1?^1-8226细胞株中，吖啶黄与美法仑单用及合用对细胞增殖的影响。
[0023]实验材料:结肠癌HCT116、宫颈癌Hela及多发性骨髓瘤RPM1-8226细胞株购自中科院上海细胞库；吖啶黄、美 法仑及磺酰罗丹明B购自Sigma公司；水溶性四唑盐-WST-8试剂盒购自Dojindo东仁化学科技公司。
[0024]实验方法:
Cl)细胞处理:细胞以0.5X104个细胞每孔的密度接种于96孔板，加入吖啶黄DMSO溶液(终浓度0.5或0.75μΜ)预处理8小时后再加入梯度浓度的美法仑，处理24小时。
[0025](2)细胞增殖测定:对于贴壁细胞，弃去上清液后加入100μL三氯乙酸，4°C固定I小时后三蒸水冲洗、晾干；加入100μL乙酸溶液配制的磺酰罗丹明B作用15分钟后，用10%乙酸溶液冲洗，晾干。加入150μL Tris碱溶液，振荡溶解后用酶标仪测定Α540并计算增殖抑制率。对于悬浮细胞，直接加入20μL水溶性四唑盐WST-8，37°C孵育2到4小时后用酶标仪测定A450并计算增殖抑制率。
[0026]实验结果:加入吖啶黄预处理能够显著增加美法仑对肿瘤细胞的增值抑制作用，根据国际通用的合用协同指数Cl计算，证明两药之间存在良好的协同作用。增殖抑制率参见图1。
[0027]实施例2:吖啶黄增加美法仑引起的肿瘤细胞凋亡。
[0028]实验材料:细胞株及药品来源同实施例1。溴化乙锭(PI)购自BD公司。
[0029]仪器:FACSCalibur流式细胞仪购自BD公司。
[0030]实验方法:贴壁细胞以每孔IO6个的密度接种于Corning 6孔细胞培养板，悬浮细胞以IO6每mL培养液的密度接种于3mL细胞培养瓶。过夜后加入吖啶黄预处理8小时，然后加入美法仑共同培养。24小时后将离心收集得到的细胞用PBS洗3次，加入75%酒精在-20°C固定2小时，离心并洗涤3次后加入含RNA酶的PBS溶液消化30分钟，加入溴化乙锭染色并用流式细胞仪测定sub-Gl期细胞百分比，从而确定细胞凋亡率。
[0031]实验结果:吖啶黄与美法仑合用组细胞凋亡率对比单用组有显著增加，参见图2。
[0032]实施例3:吖啶黄可以增加美法仑对于裸鼠移植瘤的作用
实验材料:药物来源同实施例1，裸鼠来自上海斯莱克公司，均为雌性，2-3周龄。
[0033]实验方法:裸鼠随机分为4个实验组，分别为对照组、吖啶黄组、美法仑组合吖啶黄美法仑合用组，每组5只，皮下接种Hela细胞株或HCT116细胞株，IO7个细胞每只，每天或隔天测定瘤体积并记录。待肿瘤长至70mm3时，对照组给予生理盐水，吖啶黄组给予IOmg/kg，美法仑组给予0.25mg/kg,隔天给药，合用组两种药物都给。实验周期约为2周。
[0034]实验结果:合用组肿瘤生长明显慢于其他3组，实验结束后取出肿瘤并称量，瘤重也显著小于其他3组。参见图3、图4及表1、表2。
【权利要求】
1.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，由吖啶黄或药学上可接受的盐、美法仑或药学上可接受的盐组成，其中吖啶黄或药学上可接受的盐与美法仑或药学上可接受的盐的摩尔配比为1:100到1:10，所述的吖啶黄为盐酸3，6-二氨基-10-甲基吖啶及3，6-二氨基吖啶的混合物，CAS号为8048-52-0，所述的肿瘤包括血液性肿瘤及实体瘤。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的可药用的盐为与酸加成的盐，选用的酸为盐酸、富马酸、马来酸、柠檬酸或琥珀酸。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于治疗肿瘤的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，药物形式选用将吖啶黄及美法仑分别制成单一的制剂，或者药物形式选用将吖啶黄及美法仑制成复方制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，单一制剂使用选择同时服用或按顺序服用，按顺序服用时先服吖啶黄制剂再服美法仑制剂，且服用美法仑制剂需在吖啶黄制剂在体内任然保持有效浓度范围时。
5.根据权利要 求4所述的应用，其特征在于，吖啶黄的有效体内治疗浓度为l-50mg/kg体重。
【文档编号】A61K31/196GK103933044SQ201410190126
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】杨波, 何俏军, 曹戟, 朱虹, 应美丹, 林冠宇 申请人:浙江大学