一种微小rna纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种微小RNA纳米微球的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用，该纳米微球包括纳米载体和由载体包裹或吸附的体外合成的微小RNA miR-125b的反义链miR-125b-AS。本发明将miR-125-AS制备为纳米微球，其稳定性显著增强，在25℃条件下保存一周而不降解，经MTT法检测，该纳米微球可以不借助转染试剂转染至人神经胶质瘤细胞U87细胞中，可明显抑制肿瘤细胞的增殖。侵袭和迁移实验表明该纳米微球可显著抑制肿瘤细胞的转移能力；用流式细胞术和TUNEL法可检测到该纳米微球对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响；同时RT-PCR、Western-blot检测结果表明，该纳米微球可引起其相应的靶基因和蛋白表达的变化。
【专利说明】一种微小RNA纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于肿瘤分子生物学领域，特别是涉及一种微小RNA纳米微球的制备及其在抗肿瘤方面的应用。
【背景技术】
[0002]非编码小RNA (microRNA，miRNA)通过调控癌基因或抑癌基因的表达参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、迀移、血管生成、蛋白裂解等生物程序的调控。除了调控基因表达外，miRNA本身也可以作为癌基因或抑癌基因而成为肿瘤治疗的靶标。通过导入抑癌miRNAs可控制肿瘤或诱导其向正常方向发展，甚至逆转至正常；同时，引入与具有癌基因特性的miRNA互补的miRNA反义寡核苷酸，降低肿瘤中miRNA的表达，可以抑制致癌miRNA的表达，抑制癌细胞生长，从而达到控制肿瘤生长的目的。阐明内源性miRNA作用原理，对于疾病的基因诊断和治疗具有重要意义。miR-125b属于癌基因，在多种肿瘤组织中表达量显著升高，其反义寡核苷酸(miR-125b-AS)可以抑制miR_125b的抑制肿瘤生长的作用，具有成为抗癌药物的可能性。
[0003]目前对于miRNA的研宄一般采用过表达或缺失表达技术研宄miRNA的体内功能，通常将miRNA的模拟物(即合成双链的miRNA)借助转染试剂转染细胞，实现细胞内miRNA的瞬时转染、短暂的过表达，或以miRNA为革E点设计小分子物质措抗miRNA的作用，如，miRNA反义寡聚(脱氧)核苷酸(anti—miRNA oligonucleotides, AMOs)、核酸修饰的寡核苷酸[locked nucleic acid(LNA) 一 modified oligonucleotides]以及 miRNA 措抗分子(antagomirs)等。但miRNA模拟物和AMOs的应用都存在一些问题，包括I)稳定性差，miRNA模拟物或miRNA-AMOs不能长期保存，且外源的小分子RNA在血清中很快被降解，经化学修饰后虽然稳定性可增加，但在机体中也很快被清除。2)不能直接进入细胞发挥生物学功能。小分子RNA属于极性大分子，需要借助转染试剂才能进入细胞发挥作用，上述问题极大地限制了小分子RNA的应用。
[0004]纳米颗粒作为基因治疗的载体具有一些显著地优点，例如能够保护核酸不被核酸酶降解、具有生物亲和性等，尤其适用于基因的体内转染。因此，纳米技术与miRNA结合将为miRNA的研宄提供更好的技术平台。发展具有更长体内半衰期且生物安全性好的改良miRNA分子和miRNA反义分子，是目前研宄miRNA的体内功能迫切需要解决的问题，也是将基础研宄进展转化为临床的技术保障。miR-125b是具有致癌作用的微小RNA，前期研宄证实miR_125b反义分子(miR_125b antisense)具有良好的抑制肿瘤生长的作用，但miRNA目前研宄尚存在转染困难、稳定性差、在生物体内的作用难以证实等问题，难以在肿瘤病人中应用等难题。本发明将其制备为纳米微球，可以直接在生物体内发挥抗肿瘤作用。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种稳定性好，直接进入细胞发挥功能的微小RNA纳米微球，并提供了该纳米微球的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
一种微小RNA纳米微球，其特征在于:包括纳米载体和由载体包裹或吸附的体外合成的微小 RNA miR-125b 的反义链 miR-125b_AS。
[0007]优选的，所述miR_125b的寡核苷酸序列为:
5， UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA3，；
所述miR-125b反义链，即miR-125b-AS的核酸序列为:
5，UCACAAGUUAGG⑶CUCAGGGA 3、
[0008]优选的，所述纳米载体为植物油或十二烷制备的纳米颗粒，所述植物油包括大豆油，橄榄油或其它可食用非调合油。
[0009]更进一步的，所述的微小RNA纳米微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤:将miR-125b-AS溶于10倍体积蒸馏水制备为RNA水溶液，RNA水溶液按体积比3:2加入植物油或十二烷，将超声探头置于水油液面分界处，反应温度为20°C，超声强度为150 W/cm2，超声时间为3 Min，采用超滤膜分离纳米微球，即得。
[0010]本发明还提供了上述的微小RNA纳米微球在抗肿瘤基因治疗药物中的应用。
[0011]相对于现有技术，本发明具有以下有益效果:
I)微小RNA miR-125b具有显著的致癌作用，其反义链miR-125-AS具有良好的抗癌作用，但其稳定性差，同时不能直接进入细胞发挥抗肿瘤作用；本发明将微小RNA miR-125b的反义链(miR-125b-AS)分子制备成稳定的纳米微球(miR-125b-AS-RNs)，其稳定性显著增强，在室温(25°C)条件下保存一周而不降解，这种颗粒可以不借助任何转染试剂进入到细胞内发挥生物学功能。不但解决了 RNA的保存问题，并且为微小RNA的应用开辟了新的途径。
[0012]2)本发明将具有显著的抑癌作用的miRNA-125b的反义链miR-125b_AS制备为miRNA纳米颗粒(miR-25-AS-RNs)，经MTT法检测，该纳米微球可以不借助转染试剂转染至人神经胶质瘤细胞U87细胞中，可明显抑制肿瘤细胞的增殖。侵袭和迀移实验表明该纳米微球可显著抑制肿瘤细胞的转移能力；用流式细胞术和TUNEL法可检测到该纳米微球对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响；同时RT-PCR、ffestern-blot检测结果表明，该纳米微球可引起其相应的靶基因和蛋白表达的变化。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]下面结合附图对本发明进一步说明。
[0014]附图1为本发明的miR-125b-AS纳米微球用戊二醛固定后的电镜扫描图。
[0015]附图2为本发明的miR-125b-AS纳米微球的甲醛变性PAGE凝胶电泳图。
[0016]附图3为本发明的miR-125b-AS纳米微球对神经胶质瘤细胞U87增殖和凋亡作用图；图中，A:TUNEL分析125b-AS-RNs对U87细胞凋亡的影响；B:Annexin V-FITC和Propidium 1dide双染，然后在流式细胞仪上分析细胞凋亡情况；C:ffestern-blot分析125b-AS-RNs对U87细胞凋亡相关基因PARP、Caspase-3、Caspase-9表达的影响。
[0017]附图4为本发明的miR-125b-AS纳米微球(125b-AS-RNs)对靶基因表达的ffestern-blot 检测图。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例对本发明进一步说明。
[0019]实施例1.微小纳米微球制备方案
将miR-125b-AS (为购买的上海吉玛医药生物公司的合成miR-125b_AS样品)溶于10倍体积蒸馏水制备为RNA水溶液，RNA水溶液按体积比3:2加入保护油层(大豆油)，将超声探头置于水油液面分界处150 W/cm2)，反应温度设定为20°C，超声时间为3 Min。采用20kDa的超滤膜分离纳米微球，纳米微球分离出来后经DLS和SME方法分析其大小及粒径分布。125b-AS-RNs纳米颗粒用戊二醛固定后用扫描电镜分析，实施结果见附图1所示，标尺:500nm。结果表明应用此方法可制备为500纳米直径大小的纳米RNA微球，且成均质分布在溶液中。
[0020]实施例2.微小RNA纳米微球体外稳定性检测
为检测微小RNA纳米微球的体外稳定性，将购买的上海吉玛医药生物公司合成的miR-125b-AS样品和采用本发明制备的纳米微球mil25b_AS-RNs样品，分别在25°C条件下放置0-7天，期间用紫外分光广度计在260纳米处监测RNA的紫外吸收值变化，结果表明，miR-125b-AS放置7天后，吸收度显著降低，但其纳米微球，吸收度没有变化，说明微小RNA制备为纳米微球后稳定性显著升高。
[0021]进一步我们采用甲醛变性PAGE凝胶电泳检测RNA的完整性，以评价微小RNA纳米微球在室温条件下的保存时间。实施结果见附图2，结果表明:微小RNA应用实施例1的方法制备为微小RNA纳米颗粒后可以在室温25°C条件下存放7天而保持RNA的完整性，但未经处理的微小RNA在室温条件下存放7天完全降解。
[0022]实施例3.miR_125b反义核苷酸纳米颗粒对恶性胶质瘤细胞生长和凋亡的影响将细胞以13/个每孔接种于96孔板，培养24小时，将87细胞分别转染阴性对照miRNA
(NC-AS)、miR-125b 反义链(miR-125b_AS、图中标记为 125b_AS)，采用 Invitrogen 公司的转染试剂 Iipofectamine 2000 ;米用 Invitrogen 公司的转染试剂 Iipofectamine 2000 ；miR-125b-AS的纳米微球(125b_AS-RNs)采用直接转染，不加转染试剂lipofectamin2000，终浓度均为100nM/L。培养72h后收集细胞转染后24小时，收集细胞应用TUNEL实验及流式细胞术AV/FITC双染检测细胞凋亡情况，结果表明，miR-125b-AS和其纳米微球均可以诱导胶质瘤细胞凋亡，说明纳米微球不需要借助于转染试剂即可以进入细胞发挥功能。用Western-blot法检测凋亡相关蛋白PARP，Caspase9及Caspase3的表达情况，结果证明miR-125b-AS纳米颗粒125b_AS_RNs不需要转染试剂，即能够成功转染神经胶质瘤U87细胞，并能够有效促进U87细胞调亡的发生，激活调亡相关蛋白的表达。
[0023]实施例4.miR-125b-AS纳米颗粒对miR_125b靶基因表达的影响
将细胞以13/个每孔接种于96孔板，培养24小时，以miRNA-125b-AS (图中标记为125b-AS)为阳性对照，miRNA 2’-修饰的反义核苷酸(图中标记为NC-AS)为阴性对照，采用Invitrogen公司的转染试剂Iipofectamine 2000转染U87细胞；miR-125b_AS的纳米微球(125b-AS-RNs)采用直接转染U87细胞，不加转染试剂lipofectamin2000，终浓度均为100nM/Lo转染后24小时后，收集细胞提取细胞总蛋白，采用Western blot测定miR_125b靶基因p53、Bcl-2与E2F2的表达，图中β -actin作为上样量一致情况的对照。实施结果见附图4，结果表明，125b-AS-RNs不需要借助于转染试剂，即能够进人神经胶质瘤U87细胞，并能够发挥对靶基因的调节作用，与对照125b-AS并无显著差别，表明微小RNA纳米颗粒可以在细胞中发挥功能。
【权利要求】
1.一种微小八纳米微球，其特征在于:包括纳米载体和由载体包裹或吸附的体外合成的微小觀八1111^-125?的反义链11118-12513-八3。
2.根据权利要求1所述的微小八纳米微球，其特征在于:所述018-12513的寡核苷酸序列为:5’ ^000^6^6^000^0^^6^6^3？；所述 11111^-12513 反义链，即八3 的核酸序列为:5’?:魈⑶臥⑶⑶0\%以3’。
3.根据权利要求1所述的微小纳米微球，其特征在于:所述纳米载体为植物油或十二烷制备的纳米颗粒，所述植物油包括大豆油，橄榄油或其它可食用非调合油。
4.如权利要求3所述的微小纳米微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤:将01^-12513-^8溶于10倍体积蒸馏水制备为水溶液，^水溶液按体积比3:2加入植物油或十二烷，将超声探头置于水油液面分界处，反应温度为201，超声强度为150 1八！112，超声时间为3 1111，采用超滤膜分离纳米微球，即得。
5.如权利要求1-4任一所述的微小纳米微球在抗肿瘤基因治疗药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK104436217SQ201410815926
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】林秀坤, 吴宁, 许焕丽, 刘晓卉 申请人:首都医科大学