MDM2抑制剂的间歇给药的制作方法

本发明涉及用于特定剂量方案中的mdm2抑制剂。

背景技术：

蛋白质p53为控制参与DNA损伤修复、细胞凋亡及细胞周期休止(其均为对抗恶性肿瘤生长的重要现象)的多个靶基因的表达的转录因子。因此，p53对于维持遗传稳定性及防止肿瘤发生至关重要。TP53基因为人类癌症中最频繁突变的基因之一。据报导，所有癌症中的约一半具有由直接突变导致的失活p53。在p53基因未发生突变的癌症中，已显示蛋白质水平上的功能失活。所述p53失活的一个机制为通过其与MDM2(小鼠双倍微体蛋白2)的人类同系物的相互作用。因此，Mdm2为p53肿瘤阻抑因子的重要负向调控因子。Mdm2蛋白作为引起p53的蛋白酶体降解的E3泛素连接酶及p53转录活化抑制因子二者起作用。时常发现Mdm2在p53野生型肿瘤中扩增。

已开发出抑制p53-mdm2相互作用且可引发抗肿瘤效应的Mdm2抑制剂。

US2013/0245089公开了一种治疗患有癌症的患者的方法，其通过在28天治疗周期的至多达约7天(在第1-7天)的施用期间向患者施用约800mg/天至约3000mg/天的量的4-{[(2R,3S,4R,5S)-4-(4-氯-2-氟-苯基)-3-(3-氯-2-氟-苯基)-4-氰基-5-(2,2-二甲基-丙基)-吡咯啶-2-羰基]-氨基}-3-甲氧基-苯甲酸，然后跟随约21天至约23天的停药期间。

B.Higgins等人(2014年5月)于Clinical Cancer Research中的论文公开了28天周期方案，其中每周一次施用RG7388，共三次，然后停药13天(28天周期方案)，或其中在28天方案的连续5天施用药物。

Mdm2抑制剂及其制备方法公开于例如WO2013111105或WO2011076786中。

技术实现要素：

已意外地发现，可通过理解药物靶点的生物学及Mdm2i浓度如何能够改变下游通路的信号来影响抗肿瘤效力及耐受性来设计Mdm2抑制剂(下文称为“Mdm2i”)的有利剂量方案。令人惊讶的是，发现若使用足够强效的Mdm2i或足够高剂量的Mdm2i，则其可通过触发细胞中的显著更长效抗增生机制引起抗肿瘤效应。当癌细胞暴露于足够高浓度的各Mdm2i下仅8小时之短(且若使用较低浓度则按比例延长)时，Mdm2i使得p21及Puma mRNA表达在随后48至72小时内达到峰值，从而显著诱导半胱天冬酶3/7活性且因此导致实质性细胞凋亡。在已皮下植入癌细胞的动物中，在用足够高的单次剂量治疗动物后观察到相同效应。此导致实质性肿瘤缩小。当Mdm2i暴露低于某一域值时(低于该域值Mdm2i的此第二模式不活化)无法检测到任何所述效应。对Mdm2i的第二模式的知识可以帮助设计临床试验以减少因药物的靶向效应(on-target effect)引起的副作用。

令人感兴趣的是，观察到长效效应可在单次剂量后持续若干周，这消除了对每天治疗的需要且允许间歇施用药物。在不施用药物的中断期间，生物体可自可能的靶向效应或副作用恢复；特别是可恢复白血球(WBC)、嗜中性粒细胞及血小板的数量。以触发长效效应的剂量施用Mdm2i使得Mdm2i至少与以较低剂量每天给药时一样有效，且可更好地被耐受。较不频繁给药也可产生更好的患者友好性、患者依从性，特别是当药物为经静脉内施用时可具有显著的患者益处。举例而言，局部注射位点刺激可在需下一次给药之前痊愈。

具有持续效应的Mdm2i的间歇给药可与另一给药方案组合，该另一给药方案包含每天施用与用于达成持续效应的剂量相比较低的剂量。第一剂量的间歇给药及第二剂量的每天给药的组合产生化合物效力方面的协同效应，其可被观察为例如肿瘤缩小或肿瘤消退。另外，由于Mdm2i在间歇施用时更好的耐受性，该药物可与其他抗肿瘤剂组合使用。Mdm2i及另一抗肿瘤剂的组合可利用Mdm2i间歇给药时的改善的耐受性，同时增加与第二抗肿瘤剂的组合疗法的总体效力。

具体而言，本发明分别单独或以组合形式提供以下方面、有利特征及具体实施方式，如以下条目中所示：

1.一种用于治疗癌症的MDM2i，其中MDM2i以至少三个连续剂量间歇施用于对象，且每两个连续剂量之间的间隔为至少2周。

2.如第1条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中MDM2i间歇施用于对象，且每两次连续施用之间的间隔为至少3周且不长于60天。

3.如第1或2条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中MDM2i间歇施用于对象且连续施用之间的间隔为3周。

4.如第1至3条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中MDM2i为静脉内施用。

5.一种用于治疗癌症的MDM2i，其中MDM2i以第一及第二剂量施用于对象，且第一剂量在与第二剂量同一天、连续日或与第二剂量不同日施用，其中第一剂量的两次连续施用为至少每1周、2周、3周、4周、6周或每60天且不长于每60天间歇施用，且第一与第二剂量不同。

6.如第5条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中每天施用第二剂量，任选地有中断。

7.如第6条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中中断为至少1天、长2天、3天、4天、1周、2周或3周及至多26天。

8.如第5至7条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中在施用第一剂量后1至14天施用第二剂量。

9.如第5至8条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中持续两周施用第二剂量、然后为两周无治疗时段且然后重复该周期。

10.如第5至9条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中第一剂量高于第二剂量。

11.如第5至10条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中第一或第二剂量中的至少一者为静脉内施用。

12.如第5至11条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中第一剂量的两次连续施用为至少每2周间歇施用。

13.如第5至11条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中第一剂量的两次连续施用为至少每3周间歇施用。

14.如第1至13条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中癌症为膀胱癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、肝癌、口腔癌、胆道癌、急性及慢性淋巴性白血病、急性及慢性骨髓性白血病、慢性骨髓单核球性白血病、结肠直肠癌、胃癌、胃肠基质癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生病、神经内分泌癌、肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、脂肪肉瘤及甲状腺癌。

15.如第1至13条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中癌症为黑色素瘤、肺癌或神经母细胞瘤。

16.如第1至13条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，其中癌症为黑色素瘤。

17.MDM2i在制备用来治疗癌症的药物中的用途，其中MDM2i以至少三个连续剂量间歇施用，且每两个连续剂量之间的间隔为至少2周、至少3周、至少4周、至少6周或60天且不长于60天。

18.一种治疗癌症的方法，其中MDM2i以至少三个连续剂量间歇施用于有需要的对象，且每两个连续剂量之间的间隔为至少2周、3周、至少4周、至少6周或60天且不长于60天。

19.如第1至16条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，如第17条所述的MDM2i在制备用来治疗癌症的药物中的用途、或如第18条所述的治疗癌症的方法，其中MDM2i施用于人类。

20.如第1至16或19条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i、如第17或19条所述的MDM2i在制备用来治疗癌症的药物中的用途、或如第18或19条所述的治疗癌症的方法，其中MDM2i选自下组：

(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(6-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-吡啶-3-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(6-{甲基-[4-(3-甲基-4-氧-咪唑啶-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-吡啶-3-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(5-{甲基-[4-(3-甲基-4-氧-咪唑啶-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-吡嗪-2-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮，

(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮，

4-[(S)-5-(3-氯-2-氟-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-3-异丙基-6-氧-3,4,5,6-四氢-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-基]-苯甲腈，

(S)-5-(5-氯-2-侧氧基-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮，

(S)-5-(3-氯-4-氟苯基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮，

及

(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基-d6-嘧啶-5-基)-1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮。

21.如第1至16或19条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i、如第17或19条所述的MDM2i在制备用来治疗癌症的药物中的用途、或根据如第18或19条所述的治疗癌症的方法，其中MDM2i为

(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮或

(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮。

22.如第1至16或19条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i、如第17或19条所述的MDM2i在制备用来治疗癌症的药物中的用途、或如第18或19条所述的治疗癌症的方法，其中MDM2i为(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮。

23.如第1至16或19至22条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i、如第17或19至22条中任一条所述的MDM2i在用于制备用来治疗癌症的药物中的用途、或如第18或19至22条所述的治疗癌症的方法，其中用于治疗癌症的MDM2i、MDM2i在制备药物中的用途或治疗癌症的方法进一步包含施用于患者的另一药物成份。

24.如第23条所述的用于治疗癌症的MDM2i、如第23条所述的MDM2i在制备用于治疗癌症的药物中的用途、或如第23条所述的治疗癌症的方法，其中另一药物成份为另一抗肿瘤剂。

25.如第24条所述的用于治疗癌症的MDM2i、如第24条所述的MDM2i在制备用于治疗癌症的药物中的用途、或如第24条所述的治疗癌症的方法，其中施用一种以上的其他抗肿瘤剂。

26.如第23至25条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i、如第23至25条中任一条所述的MDM2i在制备用于治疗癌症的药物中的用途、或如第23至25条中任一条所述的治疗癌症的方法，其中MDM2i为以至少三个连续剂量间歇施用，且每两个连续剂量之间的间隔为至少1周。

27.如第23至25条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，如第23至25条中任一条所述的MDM2i在制备用于治疗癌症的药物中的用途，或第23至25条中任一条所述的治疗癌症的方法，其中MDM2i以至少三个连续剂量间歇施用，且每两个连续剂量之间的间隔为至少2周。

28.如第23至25条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，如第23至25条中任一者所述的MDM2i在制备用来治疗癌症的药物中的用途，或如第23至25条中任一者所述的治疗癌症的方法，其中MDM2i以至少三个连续剂量间歇施用，且每两个连续剂量之间的间隔为至少3周。

29.如第1至16或19至28条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，如第17或19至28条中任一条所述的MDM2i在制备用于治疗癌症的药物中的用途，或如第18或19至28条所述的治疗癌症的方法，其中MDM2i为(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮。

30.如第1至16或19至28条中任一条所述的用于治疗癌症的MDM2i，如第17或19至28条中任一条所述的MDM2i在制备用于治疗癌症的药物中的用途，或如第18或19至28条所述的治疗癌症的方法，其中MDM2i为(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮。

术语“Mdm2抑制剂”或“Mdm2i”在本文中表示经时间解析荧光能量转移(TR-FRET)分析测量以小于10μM、优选小于1μM、优选在nM量级的IC₅₀抑制HDM-2/p53或HDM-4/p53相互作用的任何化合物。对p53-Hdm2及p53-Hdm4相互作用的抑制通过时间解析荧光能量转移(TR-FRET)来测量。荧光能量转移(或Foerster共振能量转移)阐述供体与受体5荧光分子之间的能量转移。对于此分析，使用带有C端生物素部分标签的MDM2蛋白(氨基酸2-188)及MDM4蛋白(氨基酸2-185)与用作供体荧光分子的经铕标记的链霉抗生物素蛋白(Perkin Elmer,Inc.,Waltham,MA,美国)组合。p53衍生的经Cy5标记的肽Cy5-TFSDLWKLL(p53aa18-26)为能量受体。在340nm激发供体10分子后，MDM2或MDM4与p53肽之间的结合相互作用诱导在665nm的受体发射波长下的能量转移及增强的反应。因抑制剂分子结合至MDM2或MDM4的p53结合位点破坏p53-MDM2或p53-MDM4复合物的形成造成在615nm的供体发射增加。由时间解析模式中所测量的两个不同荧光信号的15个原始数据计算比率型的FRET分析读数(计数率665nm/计数率615nm×1000)。该分析可根据以下步骤来实施：以下列方式实施测试：在白色1536w微量滴定板(Greiner Bio-One GmbH,Frickenhausen,德国)中，以3.1μl的总体积，在反应缓冲液(PBS、125mM NaCl、0.001％Novexin(包含碳水化合物聚合物(Novexin聚合物)，其设计用于增加蛋白质的溶解度及稳定性；Novexin Ltd，ambridgeshire,英国)、0.01％明胶、0.2％Pluronic(来自环氧乙烷及环氧丙烷的嵌段共聚物，BASF,Ludwigshafen,德国)、1mM DTT组成)中，混合于90％DMSO/10％H₂O中稀释的100nl化合物(3.2％最终DMSO浓度)与2μl经铕20标记的链霉抗生物素蛋白(最终浓度2.5nM)，然后添加0.5μl稀释于分析缓冲液中的MDM2-Bio或MDM4-Bio(最终浓度10nM)。在室温下将溶液预培育15分钟，然后添加0.5μl于分析缓冲液中的Cy5-p53肽(最终浓度20nM)。在室温下培育10分钟，然后读取板。为测量样品，使用具有以下设置30的Analyst GT多模式酶标仪(Molecular Devices)：二向分光镜380nm、激发330nm、发射供体615nm及发射受体665nm。通过使用XLfit曲线拟合来计算IC₅₀值。若未说明，则试剂购自Sigma Chemical公司，St.Louis,MO,美国。

根据一个实施方式，Mdm2抑制剂可为例如任一下式的化合物：

S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(6-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-吡啶-3-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(6-{甲基-[4-(3-甲基-4-氧-咪唑啶-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-吡啶-3-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(5-{甲基-[4-(3-甲基-4-氧-咪唑啶-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-吡嗪-2-基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-侧氧基-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮

4-[(S)-5-(3-氯-2-氟-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-3-异丙基-6-侧氧基-3,4,5,6-四氢-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-基]-苯甲腈

(S)-5-(5-氯-2-侧氧基-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮

(S)-5-(3-氯-4-氟苯基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基嘧啶-5-基)-1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮，

或

(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-侧氧基-1,2-二氢吡啶-3-基)-6-(4-氯苯基)-2-(2,4-二甲氧基-d6-嘧啶-5-基)-1-((R)-1-甲氧基丙-2-基)-5,6-二氢吡咯并[3,4-d]咪唑-4(1H)-酮。

在一具体实施方式中，MDM2i为(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮(下文称为化合物A)或其药学上可接受的盐。

在另一实施方式中，MDM2i为(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮(下文称为化合物B)。

如本文所用的术语“对象”或“患者”包括能够遭受或患有癌症或直接或间接涉及癌症的任何病症的动物。对象的示例包括哺乳动物，例如人类、犬、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠及转基因非人类动物。在优选实施方式中，个体为人类，例如患有癌症、存在患癌风险或可能患有癌症的人类。在一具体实施方式中，对象或患者为人类。

如本文所用的术语“治疗”或“处理”表示阻滞、延迟疾病的发作(即，疾病的临床表现前的时段)及/或降低罹患疾病或其恶化的风险，或包含减轻、减少或缓和对象中至少一种症状或实现疾病进展的延迟。举例而言，治疗可以减少病症的一种或若干种症状或完全根除病症，例如癌症。

术语“抗肿瘤剂”为展现抗增生或抗癌症活性的药物活性成份。可能适于组合治疗的抗肿瘤剂包括(但不限于)BRAF抑制剂(例如(S)-1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰胺基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯或威罗菲尼)；间变型淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂(例如色瑞替尼、AE684、阿雷替尼、克唑替尼、AP26113、ASP3026、ADZ3463)；芳香酶抑制剂(例如阿他美坦、依西美坦及福美坦、氨鲁米特、洛太米特(roglethimide)、吡鲁米特(pyridoglutethimide)、曲洛司坦、睪内酯、酮康唑、伏氯唑、法曲唑、阿那曲唑或来曲唑)；抗雌激素药(他莫昔芬、氟维司群、雷洛昔芬或雷洛昔芬盐酸盐)；抗雄激素药(例如比卡鲁胺)；拓扑异构酶I抑制剂(例如拓扑替康、吉马替康、伊立替康、喜树碱及其类似物、9-硝基喜树碱及大分子喜树碱偶联物PNU-166148(WO99/17804中的化合物A1)；拓扑异构酶II抑制剂(例如多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、奈莫柔比星、米托蒽醌、洛索蒽醌、依托泊苷或替尼泊苷)；微管活性化合物(例如太平洋紫杉醇、多西他赛、长春碱、硫酸长春碱、长春新碱、硫酸长春新碱、长春瑞滨、迪莫利德(discodermolide)、秋水仙素；烷基化化合物(例如环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑或亚硝基脲)；组蛋白去乙酰酶抑制剂；诱导细胞分化过程的化合物；环氧合酶抑制剂；MMP抑制剂；mTOR抑制剂；抗肿瘤抗代谢物；铂化合物；靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性的化合物；抗血管生成化合物；靶向、降低或抑制蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物；戈那瑞林激动剂(例如阿巴瑞克、戈舍瑞林(及乙酸戈舍瑞林)；甲硫氨酸氨基肽酶抑制剂；双磷酸盐；生物反应调节剂；抗增生抗体；肝素酶抑制剂；Ras致癌同种型抑制剂；端粒酶抑制剂；蛋白酶体抑制剂；用于治疗血液恶性病的化合物；靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；Hsp90抑制剂；纺锤体驱动蛋白抑制剂；MEK抑制剂；甲酰四氢叶酸；EDG结合剂；抗白血病化合物；核糖核苷酸还原酶抑制剂；S-腺苷甲硫氨酸去羧酶抑制剂；血管生成抑制类固醇；皮质类固醇；其他化学治疗性化合物(如下文所定义)；光敏化化合物(例如VISUDYNE及卟吩姆钠)。

附图简要说明

图1在一次单一静脉内(i.v.)治疗后化合物A对带有SJSA-1肿瘤的大鼠的PK。

图2在一次单一i.v.治疗后化合物A对带有SJSA-1肿瘤的大鼠的PK及PD。

图3在用化合物A单一i.v.治疗带有SJSA-1肿瘤的裸大鼠后的肿瘤生长。

图4在用化合物A单一i.v.治疗带有SJSA-1肿瘤的裸大鼠后体重(BW)的变化。

图5化合物A在单一i.v.治疗带有SJSA-1肿瘤的裸大鼠后的效力-个体数据。

图6单一i.v.治疗后的骨髓恢复。

图7血液中与胸骨骨髓切片上的白血球计数之间的相关性。

图8显示在i.v.(q3w，即每三周一次)治疗带有SJSA-1肿瘤的裸大鼠后42天内裸大鼠的肿瘤生长及体重变化。

图9 i.v.治疗(q3w)对白血球(WBC)、嗜中性粒细胞及血小板计数的效应。

图10显示在用13.7mg/kg及18.2mg/kg的化合物A q3w i.v.治疗的42天内裸大鼠的肿瘤生长及体重变化。

图11使用13.7mg/kg及18.2mg/kg的化合物A的i.v.治疗(q3w)对白血球(WBC)、嗜中性粒细胞及血小板计数的效应。

图12对用化合物A口服一次单一治疗后带有SJSA-1肿瘤的大鼠的PK研究。

图13显示单一口服施用化合物A后肿瘤中的药物浓度及PD反应。

图14显示在用化合物A q3w p.o.治疗的42天内裸大鼠的肿瘤生长及体重变化。

图15显示在用化合物A q3w p.o.治疗42天内的白血球及血小板计数。

图16低剂量的Mdm2i并不触发与高剂量所触发的相同的生物化学效应。

图17 Mdm2i的间歇及更频繁给药方案的组合对效力具有协同效应。

图18在以高剂量间歇、以低剂量每天及两种剂量方案的组合施用化合物A后，对带有SJSA-1肿瘤的大鼠的效力。

图19在以高剂量间歇、以低剂量每天及两种剂量方案的组合施用化合物A后，带有SJSA-1肿瘤的大鼠的耐受性。

图20在带有黑色素瘤PTX的大鼠中27mg/kg q3w口服Mdm2i的效力。“Cmp A”为“化合物A”的缩写。

图21在带有黑色素瘤PTX的大鼠中27mg/kg q3w口服Mdm2i的耐受性。

图22在带有SHSY5Y肿瘤的小鼠中间歇施用化合物A与塞瑞替尼的组合的效力。“Cmp A”为“化合物A”的缩写。

具体实施方式

当前，Mdm2抑制剂为每天给药，可选具有药物假期。在某些情形下因耐受性问题，使用Mdm2i的一组每天治疗后的中断可能延长。特例地，Mdm2抑制剂以每周间隔来给药。现发现，静脉内或口服施用的较高单次剂量的(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮(化合物A)第一次允许强Puma mRNA诱导(Emax≥70倍诱导)，先前使用较低口服(p.o.)剂量的化合物A或(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮(化合物B)从未达到此诱导。令人感兴趣的是，注意到p53抑制剂Mdm2具有最低mRNA诱导。在肿瘤中的该高Puma mRNA诱导后，在治疗后24h发生强半胱天冬酶-3活化，其转换为在治疗后48h及72h肿瘤细胞密度显著降低。由高剂量的单一治疗引起的显著且意外的肿瘤消退明确确认为细胞凋亡路径的强诱导的主要驱动者。实际上，在82％(9/11)的经治疗大鼠中，使用20mg/kg的化合物A的单一i.v.治疗诱导完全的SJSA-1肿瘤反应(100％消退)达42天。此外，使用27mg/kg的化合物A每3周一次(q3w)p.o.治疗在一个及两个周期后分别诱导88％及27％的SJSA-1肿瘤消退。

发现为触发具有强Puma诱导(即与未经治疗的癌细胞中的mRNA表现相比，诱导至少20倍的mRNA表达)的延长的细胞凋亡或持续抗增生效应，必须施用足够高剂量的化合物A。该剂量允许间歇施用药物而不显著损失效力且可能改善耐受性。化合物A的单次剂量可以每2周给药。而且，中断3周、4周、6周或甚至间歇60天仍可显示对肿瘤的显著效应。低于该高剂量，化合物A仅诱导至多约5-6倍的Puma mRNA表达，且因此需要持续施用，例如每天，以获得持续抗增生效应。在施用药物足够长时间后，即使在较低剂量下，仍可中断治疗，但必须在至少约2周内重复该治疗周期，否则不再观察到抗增生效应。

在一个实施方式中，根据本发明，提供用于治疗癌症的Mdm2i，其中单剂量的Mdm2i以至少每两周且不长于每60天施用。在另一实施方式中，单剂量的Mdm2i以至少每三周且不长于每60天施用。

除化合物A外的Mdm2i亦可实现强Puma诱导，但使用的剂量依赖于化合物的效力。在不希望受限于任何理论下，相信当Mdm2i更强效时，由极显著的Puma诱导而产生延长效应所需的Mdm2i的剂量应更低。但在原则上，若以达到足够血浆暴露的剂量施用，则低效力Mdm2i亦可激活此产生长效效应的第二级模式。若Mdm2i高于GI80浓度至少8小时，则可达到约26％肿瘤消退，且若Mdm2i暴露高于GI80持续至少17小时，则可达到大于90％的肿瘤消退。GI-80为引起80％肿瘤细胞生长抑制所需的剂量。因此，一般而言，Mdm2i的高剂量或较高剂量为使得Mdm2i在体内血浆中至少某一浓度持续至少8小时、优选至少10小时的剂量，当肿瘤细胞于体外暴露于Mdm2i 8小时，该浓度会导致GI-80。GI-80浓度可通过任何增生测试测量。举例而言，使用发光细胞活力分析。例如，细胞于体外用Mdm2i治疗8小时，然后洗涤细胞以去除培养基中的化合物并在72小时后测定活细胞数。使用不同浓度重复此步骤以确定GI-80浓度。该高剂量必须在体内达到或替代Mdm2i的该GI-80浓度至少8小时。低剂量为低于最低高剂量。不幸地，仅因该化合物的特定药物动力学，特别是若口服给予，施用较高剂量的Mdm2i不总是转换成足够血浆暴露，因为例如低生物利用度可阻碍药物达到足够高的血浆含量。静脉内施用Mdm2i克服此口服施用的缺点。

如本文在施用剂量的语境中所提及的“剂量”亦可意指强度。

因此，本发明的一个目标为提供用于治疗癌症的MDM2i，其中MDM2i间歇施用于个体，且至少三个连续剂量之间的间隔为至少2周、至少3周、至少4周、至少6周或60天且不长于60天。MDM2i以至少三个连续剂量间歇施用于个体，且三个剂量的每两个连续剂量之间的间隔为至少2周、至少3周、至少4周、至少6周或60天。基于可用数据设定上限，但允许甚至更不频繁的施用可能产生临床上可接受的结果且可能有用的可能性。为改善患者依从性，Mdm2i的施用方案可为每3周或4周一次、尤其每3周一次。

发现可通过静脉内施用药物解决Mdm2i于体内的次最佳暴露的问题，尤其在其具有大于1μM的细胞增殖IC₅₀时。作为示例，发现可静脉内施用较低剂量的化合物A(20mg/kg)，而需要口服施用27mg/kg以刺激相同反应。因此，静脉内施用Mdm2i为具有较低效力的Mdm2i达到上文所提及具有延长的抗增生效应的第二反应性阶段提供了机会。因此，由于仅静脉内施用将产生所需暴露，故可较不频繁地施用药物。另外，静脉内施用与口服施用所需的剂量相比较低剂量的Mdm2i可至少提供一些耐受性优点。

因此，在一个实施方式中，提供用于治疗癌症的Mdm2i，其中MDM2i经静脉内施用。

在另一实施方式中，MDM2i的间歇给药可通过与用于单次剂量的间歇给药的剂量不同的第二剂量的MDM2i的另一给药方案来补充。组合间歇剂量方案与另一更频繁方案允许降低用于每一方案中的Mdm2i剂量，且因此进一步改善耐受性。在间歇施用高剂量Mdm2i的同时亦更频繁(例如每天)地施用较低剂量的Mdm2i使得能够将两个方案的剂量降低至某水平，若单独使用这些剂量方案，至少在该两个剂量方案的一者中，该水平无效。亦证实组合具有不同方案的高及低剂量的治疗协同地有效。在一个实施例中，其中至少每2周施用Mdm2i的间歇给药可与每天Mdm2i治疗重迭。发现组合化合物A的两种给药方案(即使用较高剂量的每3周一次治疗及2周的使用较低剂量的每天治疗，且每28天周期中断2周)产生两种治疗的协同抗肿瘤效应。添加至间歇治疗中的第二给药方案可开始于同一天、第二天或其他时间。第二给药方案可为例如每天，可选地具有中断。一组每天治疗后的中断可为至少1天、2天、3天、4天、1周、2周或3周及至多26天。在一个实施方式中，在施用第一剂量后1至14天施用第二给药方案的剂量。在一具体实施方式中，使用较低Mdm2i剂量的第二剂量方案开始于施用单一高剂量后的第二天。可施用每天施用的剂量达两周，然后为两周无治疗时段，然后可重复该治疗周期。一般而言，用于间歇给药的剂量将高于用于添加至间歇给药中的更频繁给药的第二剂量。Mdm2i可经口或静脉内或以其组合施用。举例而言，可至少每2周、3周、4周、6周或60天静脉内施用间歇剂量，而可口服给予第二日剂量。然而，两个剂量可都经静脉内施用，或都口服施用。在一个实施方式中，间歇施用的第一剂量可以两次连续施用之间至少为2周的间隔施用。

在一方面，添加至间歇剂量方案中的第二剂量方案可包含施用Mdm2i达至少5天的时间，然后为1天或更长的时间，及重复该周期，同时用不同剂量的Mdm2i间歇治疗该患者。然而，其他第二剂量方案包括(例如)以下周期：2周给药，1周或2周停药；3周给药，1周、2周或3周停药；4周给药，1周、2周、3周或4周停药；1周给药，3周停药；3周给药，1周停药；4周给药，1周停药。

除将第二剂量方案添加至间歇给药中外，可通过向对象施用另一药物成份来改善利用间歇给药进行MDM2i治疗的临床结果。另一药物成份可为另一Mdm2i，但最通常其将为具有不同作用机制的药物。本文涵盖在间歇投用的Mdm2i之外给予另一抗肿瘤剂可达到改善的抗肿瘤效应。另外，间歇给药增加了组合Mdm2i与另一抗肿瘤剂的更大灵活性，这是因为通过降低Mdm2i给药的频率可改善耐受性且因此允许添加另一抗癌药物的更多选择。在一个实施方式中，Mdm2i如本文所述与BRAF抑制剂或ALK抑制剂组合间歇施用。具体而言，另一药物成份为(S)-1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰胺基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯。在另一实施方式中，组合含有塞瑞替尼。当Mdm2i与另一药物成份组合时，可间歇施用Mdm2i且单次剂量之间的间隔为至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少6周或60天且不长于60天。

本发明亦提供用于治疗的化合物A，其中化合物A为间歇施用，例如至少三个剂量的每两个剂量之间的间隔为至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少6周或60天且不长于60天，亦使用(S)-1-(4-(3-(5-氯-2-氟-3-(甲基磺酰胺基)苯基)-1-异丙基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-2-基氨基)丙-2-基氨基甲酸酯或塞瑞替尼。具体而言，化合物A为以单次剂量至少每周或至少每三周施用。

Mdm2i及另一药物成份可作为单独伴侣施用或配制，含有或不含有，优选含有组合使用或组合产品的说明书。因此，组合中的化合物可完全单独施用或为完全独立的药物剂型。组合伴侣可为彼此独立地出售的药物组合物，且其组合使用的说明书仅在例如插页等的包装或在例如提供至医师及医务人员的其他信息(例如口头沟通、书面沟通等)中提供，以供同时或相继用于共同起作用。Mdm2i及另一活性药物成份可以活性成份的固定或非固定组合来提供。术语“固定组合”指活性成份(例如Mdm2抑制剂与抗肿瘤剂)以单一实体或剂量形式同时施用患者。在其他术语中：活性成份存在于一种剂型中，例如存在于一种片剂或一种胶囊中。术语“非固定组合”意指将活性成份都作为分离的实体同时、并行或相继且无特定时间限制地施用与患者，其中该施用在患者体内提供该两种化合物的治疗有效含量。

如本文所述通过使用Mdm2i治疗的癌症包括诸如(但不限于)以下癌症：膀胱癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌、肝癌、口腔癌、胆道癌、急性及慢性淋巴性白血病、急性及慢性骨髓性白血病、慢性骨髓单核球性白血病、结肠直肠癌、胃癌、胃肠基质癌、肝细胞癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生病、神经内分泌癌、肺癌、非小细胞肺癌、胰脏癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、脂肪肉瘤及甲状腺癌。在特定实施方式中，癌症为黑色素瘤。在另一实施方式中，癌症为神经母细胞瘤。在另一实施方式中，癌症为白血病。

基于使用化合物A所获得的数据且已知(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮(化合物B)的生物化学反应，可预期所提出的给药方案可使用至少上文所列示的Mdm2i来提供有利效力或耐受性。

Mdm2i可通过药物组合物递送至对象。使用的口服剂型为例如片剂、胶囊、小药囊、微粒、颗粒等。除Mdm2i外，口服剂型可进一步包含药学上的常用的载体或辅料。这些载体或辅料的示例包括(但不限于)崩解剂、黏合剂、润滑剂、助流剂、稳定剂及填充剂、稀释剂、着色剂、增味剂及防腐剂。本领域技术人员可根据剂型的具体期望性质通过常规实验且在无任何过重负担下选择上文所提及载体中的一或多者。每一所用载体的量可在本领域常用范围内变化。以下参考文献公开用于制剂口服剂型的技术及辅料。参见The Handbook of Pharmaceutical Excipients，第4版，Rowe等人编辑，American Pharmaceuticals Association(2003)；及Remington:the Science and Practice of Pharmacy，第20版，Gennaro编辑，Lippincott Williams&Wilkins(2003)。剂型通过例如掺和、造粒、压缩、压实、填充、筛分、混合及/或制片来制备。

Mdm2i可于体内例如以溶液形式经静脉内施用。一般而言，该剂型在施用前高压釜处理或使用其他方法进行灭菌。该药物可通过注射或输注经静脉内施用。优选地，Mdm2i在小于3小时的时间内、优选在至多2小时内、尤其在约1小时内经静脉内输注。

Mdm2i可用于制备药物，其中制备一种剂型。后者可进一步被包装且补充有患者信息插页。

Mdm2i为以治疗有效量来施用。术语Mdm2i的“治疗有效量”为指化合物的将引发对象的生物或医学反应(例如改善症状、缓和病况、减缓或延迟疾病进展、减慢肿瘤生长或引起肿瘤消退等)的量。在一个实施方式中，体内治疗有效量视给药途径介于约0.1-500mg/kg或介于约1-100mg/kg范围内。举例而言，对于化合物A，当口服施用时，体内有效量介于每三周100mg与1500mg之间，具体而言每三周100mg与800mg之间，或介于每天50mg与600mg之间。对于化合物B，当口服施用时，有效量介于500mg及4000mg之间，具体而言介于1500mg与4000mg之间。因此，静脉内剂量应较低。

以下实施例说明本发明。

用于实施例中的方法及材料

化合物A-(S)-5-(5-氯-1-甲基-2-氧-1,2-二氢-吡啶-3-基)-6-(4-氯-苯基)-2-(2,4-二甲氧基-嘧啶-5-基)-1-异丙基-5,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑-4-酮

化合物B-(S)-1-(4-氯-苯基)-7-异丙氧基-6-甲氧基-2-(4-{甲基-[4-(4-甲基-3-氧-哌嗪-1-基)-反式-环己基甲基]-氨基}-苯基)-1,4-二氢-2H-异喹啉-3-酮

细胞培养

SJSA-1骨肉瘤细胞(CRL-2098,ATCC)为p53野生型且在Mdm2(16.9拷贝，SNP6.0)而非Mdm4扩增。将其在补充有10％FCS(编号2-01F16-I,AMIMED)、2mM L-谷氨酰胺(编号5-10K00-H,AMIMED)的RPMI 1640(编号1-41F01-I,AMIMED)中进行培养。通过首先用不含Ca2+/Mg2+的达尔伯克氏(Dulbecco)PBS(编号3-05F29-I,AMIMED)洗涤、用在含有EDTA的PBS中的0.05％胰蛋白酶(编号5-51F00-H,AMIMED)处理细胞、离心各培养基及将细胞以1:8的比率每周2次分流至新鲜培养基中使细胞传代。

动物

允许所有裸大鼠(Hsd:RH-Fox1^rnu，Harlan Sprague Dawley；SF480)适应4天且将其圈养于病原体受控环境(5只小鼠/III型笼)中且自由获取食物及水。使用应答器鉴别动物。此报告中所述的研究根据Kantonales Basel-Stadt的许可号1975所涵盖的程序实施且严格遵守 Tierschutzgesetz及 Tierschutzverordnung。所有实验皆使用4至7只大鼠来进行。使用小鼠进行利用化合物组合的实验。

肿瘤模型

通过于50％中浓缩1.0×10⁷个SJSA-1细胞并注射于Harlan裸大鼠的右侧腹中来诱导皮下肿瘤。可在细胞注射后14天开始效力实验。制备新鲜化合物A用于每一次施用。对于i.v.注射(4ml/kg)，将化合物A溶解于30％PEG300、10％Solutol HS 15、6％Pluronic F68及54％水中。对于口服(p.o.)注射(5ml/kg)，将化合物A溶解于含0.5％w/V甲基纤维素的50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中。每3周一次(q3w)以高剂量(20mg/kg i.v.或27mg/kg p.o.)治疗动物，或在高剂量(15mg/kg p.o.)治疗后24h后进行每天低剂量治疗(3mg/kg p.o.，2周给药/2周停药)。

每周测量三次动物的肿瘤体积(TVol)及体重(BW)，从而允许计算任一具体时间点下相对于起始治疗日(第0天)的TVol变化％(Δ％TVol)。通过肿瘤体积的变化(终点减去起始值，以mm³表示)将肿瘤反应量化为T/C，即在肿瘤消退的情形下或为评价TVol的变化％，通过起始TVol的消退％来量化肿瘤反应，即

类似地，每周测量三次动物的体重(BW)，从而允许计算任一具体时间点处相对于起始治疗日(第0天)的BW变化％(Δ％BW)。

使用Sysmex(XT-2000i)对白血球(WBC)、嗜中性粒细胞及血小板计数。将血液收集至商业制备的EDTA包覆的微量管(BD Microtainer，目录编号365975)中。

药物动力学(PK)及药效学(PD)

在所指示时间下，通过暴露于医用氧中的2％-3％v/v异氟烷下使动物麻醉：

·在血液取样后杀死动物而不使其自麻醉剂恢复。将血液收集至商业制备的EDTA包覆的管(Milian，目录编号TOM-14C)中以提取血浆。将组织切除、称重并快速冷冻于液氮中。

·或通过使用活检枪并在Barney橡皮管(Covaris，目录编号520048)中用RLT缓冲液冲洗针来收集肿瘤活检。另外，可自尾静脉收集20μl血液且稀释于20μl水中。自麻醉恢复后，将动物转移至其各笼中。

将组织、血液及血浆样品冷冻储存在-80℃下直至分析。

组织的制备

将冷冻组织低温干式粉碎且使用来自Covaris的CryoPrep^TM系统(型号CP-02)对活检样本进行超音波处理。更具体而言，将冷冻组织转移至丢弃式管(称为TissueTubes^TM)，置于CryoPrep^TM系统中，且然后使用适宜撞击设置进行粉碎。用刮勺收集所得粉末且称重以供进一步处理(组织中的化合物的mRNA纯化或定量)。在Barney橡皮玻璃管中用350μl RLT缓冲液冲洗活检样本且将其置于Covaris中用于超音波处理(1min/活检样本)。将所得溶解物转移至QIAshredder(79654,Qiagen)柱中用于RNA提取。

药效学(qRT-PCR)

根据制造商的说明书使用QIAshredder(79654,Qiagen)及RNeasy Mini Kit(74106,Qiagen)自细胞沉淀纯化总RNA，只是不实施DNA消化。用50μL不含RNA酶的水洗脱总RNA。使用分光光度计ND-1000定量总RNA。使用One-step RT qPCR Master Mix Plus(RT-QPRT-032X,Eurogentec)、使用对照引物或针对靶标引物、即表1中所列示的TaqMan基因表达分析(20×探针染料FAM^TM(或VIC)-TAMRA(或MGB)；Applied Biosystems)对每个样品以一式三份设定qRT-PCR(定量逆转录酶聚合酶链式反应)。

表1qRT-PCR引物的来源

药物动力学

样品制备及生物分析方法

通过UPLC/MS-MS分析同时测定血浆及组织中化合物A的浓度。在等体积HPLC水(用于层析的水，Merck)中使用Fast系统(M.P.Biomedicals,Irvine,CA,USA)将组织均质化。将25μl内参混合物(1μg/ml)添加至血浆或组织均质物的分析等份(25μl)中后，通过添加200μl乙腈使蛋白质沉淀。将上清液转移至新鲜小瓶中。蒸发至干燥后，将样品再溶解于60μl乙腈/水(1/1v/v)中。在ACQUITY UPLC BEH C18柱(Waters^TM1.7μm粒径，2.1×50mm)上，使用由含有0.1％甲酸的水(溶剂A)的及含有0.1％甲酸的乙腈(溶剂B)的混合物组成的移动相分离一等份(5μl)此溶液。梯度程序化使用600μl/min的流速。用95％溶剂A平衡后，注射5μl样品。在0.25min的等待时间后，用线性梯度的5％-100％溶剂B经0.65分钟的时间、然后保持0.35分钟来洗脱样品。通过0.25分钟再平衡至起始条件准备用于下一样品的柱。将柱洗脱物直接引入由Masslynx^TM4.1软件控制的三段四极质谱仪TQD^TM(Waters公司，Milford,MA,USA)的离子源中。使用电喷雾阳极电离(ESI+)多重反应监测进行分析物的MS/MS检测。对化合物A使用m/z 555.3→m/z 329.2的前体至产物离子过渡。将化合物的定量限值(LOQ)设定为0.7ng/mL(CV及总偏移小于30％)。使用QuanLynx^TM4.1(Micromass)及Excel^TM2007(Microsoft)实施回归分析及其他计算。根据使用掺入载剂处理的动物获得的空白血浆或组织中的校准样品构筑的校准曲线基于分析物/IS的峰面积比率反计算未知样品的浓度。

药物动力学参数的计算

使用线性梯形法则自平均值来计算血浆浓度对时间曲线下面积(AUC)，使用血管外给药的非隔室模型计算他相关参数( Professional 5.2版，Pharsight公司，CA,US)。

免疫组织化学

根据常规程序将所有组织处理成FFPE，且在固定后，于柠檬酸盐/EDTA缓冲液中将大鼠胸骨脱钙5天，且每24h更换缓冲液。使用切片机以3μm切割切片。在Ventana Discovery XT自动化免疫染色仪上使用OmniMap抗小鼠或抗兔HRP二级试剂及ChromoMap DAB色原体系统(Ventana/Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)实施p21及裂解的半胱天冬酶-3免疫组织化学。通过使用Cell Conditioning Discovery CC1(Ventana/Roche Diagnostics)在温和(95°8min+100°20min，用于裂解的半胱天冬酶-3)或标准(95°8min+100°36min，用于p21)条件下进行抗原修复。在Dako抗体稀释剂中人工按期望稀释度加入一级抗体，然后在室温下孵育1小时。将相应阴性对照仅与AbD一起孵育。使用苏木素(Ventana/Roche Diagnostics)复染切片。自动化染色运行后，将装片于梯度乙醇中脱水，于二甲苯中清洁且使用Pertex封固剂封固。

用于免疫组织化学的一级抗体描述于表2中。

表2用于免疫组织化学的抗体

此表用于显示免疫组织化学的抗体的来源以及其稀释度。

mRNA原位杂交

使用QuantiGene ViewRNA FFPE Assay试剂盒(Affymetrix/Panomics)遵循制造商的方案实施原位杂交。由Affymetrix定制设计并合成用于大鼠Ubc(泛素C)及Bbc3(PUMA)mRNA的基因特异性探针组。在1型/坚固红中使用Bbc3探针且在6型/坚固蓝中使用Ubc探针。严格遵循QuantiGene方案处理装片。发现在预处理溶液(Affymetrix)中煮沸10分钟且在40℃下蛋白酶QF(Affymetrix)消化10分钟的预杂交条件最佳。简言之，切割5微米切片，用10％甲醛固定，脱蜡且再水合。为增加mRNA的可及性，然后将装片于预处理溶液(Affymetrix)中煮沸且在最佳条件下用蛋白酶QF(Affymetrix)消化。然后在40℃下将切片与针对Bbc3及对照基因Ubc的定制设计的QuantiGene ViewRNA探针杂交3小时。根据Affymetrix手册的建议使用无探针样品作为阴性对照。杂交后，用洗涤缓冲液(Affymetrix)冲洗掉未结合的探针，而后根据Affymetrix的方案(分支链DNA扩增)使用PreAmp扩增结合探针(在40℃下25分钟)，然后使用Amp分子扩增(在40℃下15分钟)，且最终使用偶联至碱性磷酸酶的多个标记探针寡核苷酸(LP-AP)在40℃下扩增15分钟。使用坚固蓝底物(蓝点，Cy5荧光)在室温下在黑暗中保持30分钟进行信号的LP-AP 6型探针检测，然后使用坚固红底物(红点，Cy3荧光)在40℃下保持30分钟进行信号的LP-AP 1型探针检测。信号检测后，则用Mayer氏苏木精复染装片，清洗并通过使用Ultramount水性封固剂(DAKO)封固/盖上盖玻片。使用配备有ColorViewIII彩色照相机(Soft Imaging Sytem)的Olympus BX51显微镜采集图像。

用于mRNA ISH的探针描述于表3中。

表3用于mRNA ISH的探针

实施例1

化合物A在以20mg/kg单一i.v.注射后的药物动力学(PK)

图1显示在一次单一i.v.注射后144小时内血浆、肿瘤及肝中的化合物A浓度。化合物的Tmax在血浆及肝中为5min且在肿瘤中为1h。与血浆(AUC_0-144hdn＝8.1h.μM)相比，化合物A在肿瘤中具有两倍高的暴露(AUC_0-144hdn＝16.5h.nmol/g)。图2显示肿瘤中的化合物A浓度及肿瘤中的药效学(PD)反应。Puma及p21具有极相似的mRNA诱导，其在治疗后24小时分别达到180倍及200倍的表达峰值。

实施例2

化合物A(i.v.，一次)对带有SJSA-1肿瘤的大鼠的PK、PD、效力及耐受性

图3及4分别显示裸大鼠在42天内的肿瘤生长及体重变化。使用20mg/kg(较高剂量)的化合物A的单一i.v.治疗在治疗后14天诱导92％的肿瘤消退。在治疗后第9天时因过度体重(BW)损失必须杀死一只大鼠。尽管在治疗后3天所有其他大鼠的BW稍微减小，但其快速恢复且在整个实验期间增加BW。11个肿瘤中仅2个具有不完全反应且再生长(图5)。以15mg/kg i.v.再治疗该2只动物且肿瘤仍敏感。然而，肿瘤消退减弱，其可归因于肿瘤体积较大。在第一次治疗后，肿瘤中的p21及Puma mRNA表达增加50倍以上。Mdm2具有低得多的mRNA诱导(Emax＝10倍)。在第一次治疗后第59天时，以20mg/kg i.v.治疗所有大鼠以评价药物对宿主的效应。化合物A的暴露在心脏、空肠、脾、肝及骨髓中相似，但在血浆中高至两倍(Cmax未知)。在治疗后3h总是观察到p21、Mdm2及裂解的半胱天冬酶-3在空肠及骨髓(胸骨)中的最大增加。在治疗后7天，所有染色返回至基线。空肠切片上裂解的半胱天冬酶-3的增加显示与mRNA ISH检测到的Puma(Bbc3)mRNA诱导强相关。实际上，在最后一次治疗后3h观察到Puma的最大增加且在治疗后7天返回至基线。RNA ISH明确显示仅腺窝细胞在空肠切片上染色。在脾及心脏中亦如此。最后，在治疗后14天可观察到严重骨髓耗竭，且在第22天时部分恢复(图6)。白血球计数显示其与骨髓耗竭显著相关(R²＝0.59,P＝0.006，图7)。这表明因允许骨髓恢复，间歇给药可改善耐受性。

实施例3

化合物A(i.v.，q3w)对带有SJSA-1肿瘤的大鼠的PK、PD、效力及耐受性

图8显示裸大鼠在42天内的肿瘤生长及体重变化。在以20mg/kg第一次治疗后三周，化合物A诱导平均6％的肿瘤消退。然而，个体数据显示3只大鼠具有完全反应(100％消退)，2只具有部分反应(大于50％消退)，1只具有稳定疾病，且1只具有进行性疾病，尽管在治疗后1周具有早期80％消退。在第二次治疗后，化合物A诱导100％的肿瘤消退，但仅2/7动物存活2个完整周期。实际上，在第二次治疗后因过度BW损失必须杀死5只大鼠：在第二次治疗后10天杀死第一只，且在8天后杀死其他四只。图9显示在实验的42天内的白血球(WBC)、嗜中性粒细胞及血小板计数。在第一次治疗后，化合物A诱导WBC、嗜中性粒细胞及血小板的显著减少，且在治疗后第21天时大多数大鼠仅部分恢复。因此，第二次治疗使WBC、嗜中性球及血小板减少至接近0的极低含量。

实施例4

化合物A(i.v.，q3w)对带有SJSA-1肿瘤的大鼠的PK、PD、效力及耐受性

图10显示裸大鼠在42天内的肿瘤生长及体重变化。使用13.7mg/kg及18.2mg/kg化合物A治疗在治疗后一周可诱导平均66％及88％的肿瘤消退。两周后，以13.7mg/kg治疗的所有肿瘤都再生长，因此决定终止此治疗组。在以18.2mg/kg治疗后三周，肿瘤仍消退36％且2只具有完全反应。在第二次治疗对肿瘤生长的效应往往平均较小，肿瘤进展118％(表4)且两个相同肿瘤具有完全反应。因此，第二次治疗并不增加完全反应的数量。在耐受性方面，大鼠在治疗后3天具有轻微BW损失，但其通过以下治疗快速恢复且增加BW。实际上，在实验最后一天期间仅一只大鼠具有显著BW损失且无法确定其是否为治疗相关的。图11显示在实验42天内的白血球、嗜中性粒细胞及血小板计数。化合物A在第一次治疗后诱导WBC、嗜中性粒细胞及血小板的大量减少，但所有经测量的大鼠在治疗后第21天时完全恢复。第二次治疗具有类似的对细胞计数的效应，但大鼠在第二次治疗后第21天时仅部分恢复。

表4化合物A在i.v.治疗(q3w)带有SJSA-1肿瘤的裸大鼠(SF480)的效力及耐受性

实施例5

在单一口服施用(27mg/kg)后化合物A对带有SJSA-1肿瘤的大鼠的PK及PD

图12显示在一次单一口服注射化合物A后144小时内血浆、肿瘤及肝中的药物浓度。化合物在所有基质中的Tmax为3小时(h)。相比于血浆(AUC_0-144h＝111.5h.μM)相比，化合物A在肿瘤(AUC_0-144h＝277.7h.nmol/g)中的显示较高暴露。图13显示肿瘤中的药物浓度及PD反应。Puma及p21具有相似的mRNA诱导，其在治疗后48h达到162倍及180倍的Emax。在该p.o.剂量下，Mdm2具有低得多的Emax(34倍)。

实施例6

使用3qw给药方案(p.o.)对带有SJSA-1肿瘤的大鼠的效力

图14显示裸大鼠在使用化合物A q3w p.o.治疗42天内的肿瘤生长及体重变化。在第一次治疗后三周，两个剂量可诱导肿瘤消退(对于剂量20mg/kg及27mg/kg分别为27％及88％)。然而，在第二次治疗后对肿瘤生长的效应往往减轻，仅最高剂量仍可诱导肿瘤消退(在27mg/kg下为27％)。在第一次治疗后，血液中的化合物A的Cmax及AUC_0-24h以及肿瘤中的p21及Puma mRNA表达令人满意地且剂量依赖性增加。在每一治疗后3天，两个剂量皆诱导体重(BW)的稍微减小，但所有动物都快速恢复且在治疗后3周具有BW增加。图15显示在实验42天内的白血球及血小板计数。化合物A诱导WBC、嗜中性粒细胞及血小板的剂量依赖性减少。WBC及血小板在以20mg/kg第二次治疗的前完全恢复。对于以27mg/kg的治疗，血小板亦完全恢复，但WBC仅部分恢复。

实施例7

低剂量对比高剂量的效应

进行实验以评估高剂量及低剂量的反应。使用5mg/kg p.o.的低剂量或27mg/kg p.o.或20mg/kg i.v.的高剂量治疗动物。Mdm2i的低剂量并不触发与高剂量所触发相同的生物化学效应(图16)。

实施例8

高及低剂量治疗的组合高度协同

通过组合化合物A的两个剂量方案，一次间歇(15mg/kg，一次)及每天给药(1.5mg/kg))对带有SJSA-1肿瘤的大鼠重复这些实验。在图17显示组合两种给药方案具有高度协同的效应。此为多个实验的示意性呈现。在图18及19上亦可见其他明显协同作用。使用其他剂量及不同剂量方案(15mg/kg q4w(第0天)+3mg/kg q24h 2w on/2won(第1天)；21mg/kg q4w(第0天)+1.5mg/kg q24h 3w on/1w on(第1天)进一步测试对带有SJSA-1肿瘤的大鼠的效力(图18)及耐受性(图19)。显示组合剂量方案会增加效力且可增加耐受性，特别是使用较低剂量仍可实现更好的肿瘤缩小。

实施例9

带有黑色素瘤患者源性异种移植物(PDX)的大鼠中的效力及耐受性(口服)

使用带有黑色素瘤PTX的大鼠重复相同实验。以27mg/kg q3w测试化合物A的效力(图20)及耐受性(图21)。间歇给药在黑色素瘤模型中亦显示效力。

实施例10

在带有SHSY5Y肿瘤的小鼠中间歇施用化合物A与塞瑞替尼的组合的效力

通过向小鼠施用塞瑞替尼及化合物A的组合来实施类似实验。这些实验显示(图22)化合物A在与另一化合物组合时可每周给药。与单独塞瑞替尼相比或与塞瑞替尼+每天20mg/kg化合物A的组合(n＝5)相比，塞瑞替尼与每周120mg/kg(40mg/kg×3每3小时)的化合物A产生更好的抗肿瘤效应。小鼠具有与大鼠不同的药物动力学。因此，必须每3小时施用该剂量3次以达到所需暴露。考虑到小鼠模型的此特异性，具体而言高得多的清除率，对小鼠的实验可外推至大鼠及其他对象，且认为小鼠模型证实，即使化合物A以至少每三周施用，在大鼠或其他对象、尤其人类中仍可达到至少相同的效应。