利用短期饥饿方案结合激酶抑制剂来增强传统化学药物功效和可行性并逆转激酶在正常细胞和组织中的副作用的制作方法

本申请要求2014年3月6日提交的美国临时申请序列号61/948,792的权益，其公开内容以其整体通过引用并入本文。

关于联邦资助的研究或开发的声明

根据由国立卫生研究院批出的合约号IPOIAG034906，利用政府支持做出本发明。政府对本发明拥有一定权利。

技术领域

在至少一方面，本发明涉及具体地靶向并杀死癌细胞以及减轻化疗的毒性作用的方法。

背景技术：

癌症是折磨哺乳动物尤其是人类的普遍存在的疾病。尽管在大多数癌症中还没有实现非外科治愈，但治疗癌症中的进步已经稳定。研究已经表明癌症是一种目前还未完全理解的多方面疾病。因此，未来的治疗方案无疑将涉及目前未预期到的途径。

治疗癌症的相对新的途径涉及短期饥饿(STS)和禁食模仿膳食。通过差别胁迫敏感(DSS)，短期饥饿和禁食模仿膳食已经显示出在多种癌细胞类型对化疗的敏感作用中是有效的，同时通过差别胁迫抗性(DSR)保护正常细胞和组织。

因此，需要改进的治疗受癌症折磨受试者的方法。

技术实现要素：

本发明通过在至少一种实施方式中提供一种减轻或治疗癌症症状和/或化疗或激酶抑制剂的作用的方法，来解决现有技术中的一个或多个问题。所述方法包括鉴定患有癌症的受试者。在第一时间段内向受试者施用减少卡路里的膳食。特征性地，减少卡路里的膳食每天提供最多1000千卡。向受试者施用激酶抑制剂。

在另一种实施方式中，提供了一种治疗癌症和/或减轻化疗症状的方法。所述方法包括鉴定患有癌症的受试者的步骤。在第一时间段内向受试者施用减少卡路里的膳食。特征性地，减少卡路里的膳食每天提供最多1000千卡。在第一时间段之后向受试者施用化疗剂。

在另一种实施方式中，提供了一种减轻激酶抑制剂治疗的副作用的方法。所述方法包括鉴定要用激酶抑制剂治疗的受试者的步骤。在第一时间段内向受试者施用减少卡路里的膳食。特征性地，减少卡路里的膳食每天提供最多1000千卡。向受试者施用激酶抑制剂。

有利地，在本发明的实施方式中，STS或FMD与激酶抑制剂联合用于：a)在没有化疗的癌症治疗中提供安全且强有力的工具，b)增强在癌症治疗中与化学药物联合的短期饥饿的已有有益效果(图3和4)，以及c)逆转施用单独与传统化学药物联合的激酶抑制剂期间观察到的毒性作用(图2)。

附图说明

图1A提供了用STS、雷帕霉素、以及雷帕霉素与STS治疗的小鼠的血糖水平图；

图1B提供了用STS、雷帕霉素、以及雷帕霉素与STS治疗的小鼠的酮体水平图；

图2A提供了表示施用于12周龄雌性C57BL/6小鼠的胁迫抗性实验方案的示意性时间轴。

图2B提供了图3A实验的第20天(结束-时间点)的生存率结果。

图2C提供了证实图3A的STS的有效性的血糖水平图。

图3A提供了在任意喂食或STS条件下用雷帕霉素和化疗药物混合物TVD(拓扑替康+长春新碱+阿霉素)治疗的人成神经细胞瘤细胞系的细胞生存力的图。

图3B提供了在任意喂食或STS条件下用雷帕霉素和化疗药物阿霉素(DXR)治疗的鼠乳腺癌(4T1)细胞系的细胞生存力的图。

图3C提供了在任意喂食或STS条件下用雷帕霉素和化疗药物阿霉素(DXR)治疗的鼠黑色素瘤(B16)细胞系的细胞生存力的图。

图4A提供了表示涉及减少卡路里的膳食和雷帕霉素的肿瘤进展研究方案的时间轴。

图4B提供了用雷帕霉素和多周期的与DXR联用的STS治疗的BALB/c小鼠中的4T1鼠乳腺癌模型的肿瘤体积与时间的图。

图4C是表示图4B中实验结束时的肿瘤体积的柱状图。

图4D提供了用雷帕霉素和多周期的与DXR联用的STS治疗的C57BL/6小鼠中的鼠黑色素瘤模型的肿瘤体积与时间的图。

图4E是表示图4D中实验结束时的肿瘤体积的柱状图。

具体实施方式

现在将详细参考本发明的现在优选的组成、实施方式和方法。图不一定是按比例的。公开的实施方式仅仅是可以以各种和可选形式呈现的本发明的示例。因此，在此公开的特定细节不应解释为限制，而仅仅是本发明任意方面的代表性基础和/或教导本领域技术人员多方面利用本发明的代表性基础。

除了在这些实施例中，或另外明确表示之外，该描述中所有表示物质的量或反应条件和/或用途的数量应理解为由描述本发明最宽范围的词语“约”来修饰。所述数值限制内的实践通常是优选的。而且，除非明确相反表述：百分比、“部分”和比值是以重量计的；对于与本发明有关的给定目的描述为适合或优选的一组或一类物质意味着所述组或类的成员中的任意两个或更多个的混合物是同等适合或优选的；化学术语中对组分的描述指的是在添加至描述中指定的任意组合时的组分，一旦混合时并不必然排除混合物的组分之间的化学相互作用；首字母缩写或其他缩写的首次定义适用于相同缩写的在此的所有随后使用，并且将必要的修改应用于最初定义缩写的正常语法变化；以及，除非明确相反表述，性质的测量是通过与同一性质参考的在先或之后技术相同的技术来确定的。

本发明不限于以下描述的具体实施方式和方法，因为特定组分和/或条件当然可以变化。而且，在此使用的术语仅为描述本发明的特别实施方式的目的使用，而不是旨在以任意方式限制。

如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种”、“一个/一种”和“所述”包括复数指示物，除非文中另有明确指示。例如，引用单数组分旨在包括多种组分。

术语“必需氨基酸”指的是不能由有机体合成的氨基酸。在人类中，必需氨基酸包括异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸。另外，以下氨基酸在某些条件下也是人类必需的——组氨酸、酪氨酸和硒代半胱氨酸。

术语“千卡”(kcal)和“卡”指的是食物卡路里。术语“卡”指的是所谓的小卡路里。

术语“受试者”指的是人类或动物，包括所有哺乳动物，例如灵长类动物(特别是更高级灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔子和牛。

缩写：

“AL”意思是任意地。

“DSS”意思是差别胁迫敏感。

“DXR”意思是阿霉素。

“FMD”意思是禁食模仿膳食。

“KB”意思是酮体。

“mTOR”意思是雷帕霉素的哺乳动物靶向物。

“PKA”意思是蛋白激酶A。

“Rapa”意思是雷帕霉素。

“STS”意思是短期饥饿。

“TVD”意思是拓扑替康+长春新碱+阿霉素。

在一种实施方式中，减轻或治疗癌症症状和/或化疗副作用或激酶抑制剂副作用的方法包括鉴定有需要的受试者的步骤。在第一时间段内向受试者施用减少卡路里的膳食。特征性地，减少卡路里的膳食每天提供最多1000千卡。在第一时间段之前、之后或期间向受试者施用激酶抑制剂。

在另一种实施方式中，提供了减轻激酶抑制剂治疗的副作用的方法。所述方法包括鉴定要用激酶抑制剂治疗的受试者的步骤。在改进的实施方式中，激酶抑制剂是mTOR蛋白激酶。在第一时间段内向受试者施用减少卡路里的膳食。特征性地，减少卡路里的膳食每天提供最多1000千卡。向受试者施用激酶抑制剂。在一些改进的实施方式中，施用减少卡路里的膳食和施用激酶抑制剂的步骤构成了如下所述的可重复多次的治疗周期。

在本发明的再一种实施方式中，鉴定患有癌症和/或接受化疗的受试者。向受试者施用激酶抑制剂(例如雷帕霉素)与减少卡路里的膳食。所述减少卡路里的膳食是第一时间段施用的短期饥饿(STS)或禁食模仿膳食(FMD)。在改进的实施方式中，激酶抑制剂是mTOR蛋白激酶。在短期饥饿中，每天为受试者提供基本上0千卡。通常，当施用时FMD膳食每天提供小于约1000千卡。FMD膳食的详情在下面更详细地阐述。在另一个变型中，在治疗期间还向受试者施用不同于激酶抑制剂的化疗剂。适合的化疗剂的实例包括但不限于拓扑替康、长春新碱、阿霉素，及其组合。化疗剂的剂量是利用这样的药剂治疗各种癌症的本领域中已知的那些。发现本实施方式对治疗患有黑色素瘤、成神经细胞瘤或乳腺癌或通过针对这些疾病的化疗治疗的受试者特别有用。而且，相比利用未使在此所述的激酶抑制剂和减少卡路里的膳食联合的化疗剂的治疗，本实施方式的治疗方案导致更小的肿瘤体积。在其他改进的实施方式中，施用减少卡路里的膳食、施用化疗剂和施用激酶抑制剂的步骤构成了可重复多次的治疗周期。有利地，包括STS和FMD的本发明的方法减少或完全逆转了由阿霉素诱导或由阿霉素和雷帕霉素的联合恶化的死亡率。

在本实施方式的上下文中，应当理解在STS和FMD期间，在分子和生理水平发生多种变化，包括(但不排外地)因子(包括IGF-I)和信号转导蛋白(如mTOR和PKA)的下调。有利地，本发明的方法引起多种氨基酸、胰岛素和葡萄糖的减少，同时增加酮体(KB)(见下面详述的图1)。特别地，所述方法诱导通常处于糖解状态(瓦博格效应)的癌细胞转换并依赖用于能量生产和生存的呼吸。所有这些分子、作用物和蛋白质通过调节丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶来部分调整正常细胞生长。实质上所有癌细胞在致癌基因中具有突变，这使得它们对外部变化无响应。然而，内在地，癌细胞在一些情况下可转换至旁路途径。有利地，这一现象支持施用激酶抑制剂与STS/FMD的发明构思，其中STS/FMD阻止或抑制旁路途径的激活。

特定激酶和其他生长抑制剂可降低癌症进展，特别是如果抑制剂在致癌基因突变的下游起作用。由STS和FMD诱导的多种变化促进了额外的生长抑制作用，该生长抑制作用可影响激酶抑制剂未靶向的途径。特别地，FMD引起很多种营养物的显著减少，连同其他如酮体和脂肪酸的显著增加。因此，STS和FMD与激酶抑制剂的联合为协同促死亡作用提供了激酶抑制剂和影响细胞生长的其他蛋白质。这些影响可发生于STS/FMD方案期间但可通过化疗被进一步增强(见下述图3和4)。另外，激酶和其他信号转导抑制剂可延缓癌症生长但是还可引起对正常细胞的主要副作用甚至死亡(图2D)。部分通过降低正常细胞中激酶抑制剂影响的途径的活性，STS或FMD逆转通过共同施用激酶抑制剂和化疗诱导的增高死亡率(见下述图2)。

可用于本实施方式中的STS或FMD方案的实例见于美国专利申请号12/430058和13/488590中；其全部公开内容通过参考并入此。在一个变形中，减少卡路里的膳食提供低卡路里或无卡路里膳食。所述膳食包括能够为人体受试者提供营养同时每天提供不超过1000千卡，特别地每天提供不超过813-957千卡的膳食物质。在一个变形中，减少卡路里的膳食每天为受试者提供约100-1000千卡。在改进的实施方式中，减少卡路里的膳食以递增的优选顺序每天为受试者提供最多1000、957、700、500、300或100千卡。在又一种改进的实施方式中，所述膳食每天提供0千卡。

在此所述的实施方式的变形中，减少卡路里的膳食每天为受试者提供小于或等于30-36克的量的蛋白质。在改进的实施方式中，减少卡路里的膳食递增的优选顺序每天为受试者提供小于或等于40、35、20、10或5克，或0克的量的蛋白质。如果碳水化合物存在于膳食物质中，减少卡路里的膳食的不超过一半的能量在碳水化合物中。在改进的实施方式中，在受试者暴露于化疗之前，可向受试者施用STS/FMD膳食连续3-10天。还可在暴露之后向受试者施用所述膳食24小时。优选地，在受试者暴露于化疗之前可向受试者施用STS/FMD膳食连续3-10天，并且在暴露之后向受试者施用所述膳食24小时。

在此所述的每一个实施方式的变形中，可在减少卡路里的膳食周期开始一周之内(即第一时间段)施用激酶抑制剂。在再一个改进的实施方式中，可在减少卡路里的膳食周期开始1、2、3、4或5天之内施用激酶抑制剂。在另一个变形中，在减少卡路里的膳食周期结束后一周之内施用激酶抑制剂。在又一种改进的实施方式中，可在减少卡路里的膳食周期结束后1、2、3、4或5天之内施用激酶抑制剂。在另一个变形中，每个治疗周期施用减少卡路里的膳食3-14天的总时间段。在又一种改进的实施方式中，每个治疗周期施用减少卡路里的膳食3-10天的总时间段。如上所述，施用减少卡路里的膳食、施用化疗剂(使用时)以及施用激酶抑制剂的步骤构成了可以以预定的间隔重复多次的治疗周期。例如，此治疗周期可以2周至2个月的间隔重复。在改进的实施方式中，此治疗周期可以2周至1个月的间隔重复。

在此所述的实施方式的其他变形中，减少卡路里的膳食提供营养，同时每天提供每千克受试者体重不超过11千卡(例如不超过8、5或2千卡，或0千卡)的能量，以及每天提供每千克动物或人体重不超过0.4克(例如0.3、0.2或0.1克，或0克)蛋白质。如果碳水化合物存在于膳食中，不超过一半的能量在碳水化合物中。在一些实施方式中，所述膳食能够每天提供不超过700千卡(例如600、400或200千卡，或0千卡)的总能量。当受试者暴露于化疗时，保护动物或人体中的正常细胞，而非异常细胞，如癌细胞。例如，在受试者暴露于化疗之前，可向动物或人施用所述膳食连续3-10天。暴露之后也可向受试者施用所述膳食24小时。优选地，在受试者暴露于化疗之前可向受试者施用所述膳食连续3-10天，并且在暴露之后可向受试者施用所述膳食24小时。

在另一个变形中，用于减少卡路里的膳食的STS/FMD方案涉及禁食模仿膳食。例如，遭受癌症之苦的受试者在一轮化疗之前可被禁食48-140小时，或在化疗之后被禁食4-56小时。优选地，遭受癌症之苦的受试者在一轮化疗之前被给予FMD 48-140小时，并且在化疗之后被给予FMD 4-56小时。

FMD膳食的实例见于美国专利申请号14060494和14178953中；其全部公开内容通过引用并入此。通常，在FMD方案中，在预定的天数(即5天)内替换受试者的膳食。在此期间，受试者消耗大量的水。对于正常重量(体质指数或BMI在18.5-25之间)的健康受试者，前3个月每月消耗所述膳食一次(5天所述膳食，25-26天他们的正常膳食)以及此后的每3个月消耗所述膳食一次(每3个月5天所述膳食)。测量受试者的重量，并且在下一周期开始之前，受试者必须恢复在所述膳食期间重量减少的至少95％。BMI小于18.5的受试者不应当进行FMD，除非被推荐并由医师监督。相同的方法(每月一次，持续3个月，接着此后每3个月一次)可被治疗采用，或支持治疗，存在于专利申请美国专利申请号14178953中的所有条件提供了低蛋白形式的FMD膳食。

如上所述，本发明的实施方式要求施用激酶抑制剂，并且特别是mTOR激酶抑制剂。雷帕霉素是一种特别有用的mTOR激酶抑制剂。通常，以每天5-20mg的剂量施用雷帕霉素。其他激酶抑制剂的实例包括：阿法替尼(Gilotrif)(靶向物是EGFR/ErbB2，用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)-每天一次口服40mg)；阿西替尼(靶向物是VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3/PDGFRB/c-KIT，用于治疗肾细胞癌，每天两次5mg)；鲁索利替尼(靶向物是JAK，用于治疗骨髓纤维化-根据白细胞计数一天两次口服5-25mg)；伊马替尼(格列卫)(靶向物是Bcr-Abl，用于治疗慢性粒细胞白血病(CML)-每天一次400mg-600mg)；维罗非尼(Zelboraf)(靶向物是BRAF，用于治疗晚期黑色素瘤-每12小时960mg)；博舒替尼(Bosulif)(靶向物是BcrAbl/SRC，用于治疗慢性粒细胞白血病-与食物一起一天一次500mg)；及其组合。

用于哺乳动物受试者以及特别是人的FMD替换癌症患者的正常饮食5-12天的时间，对于大部分患者来说最多17天(见以下)，基于其他治疗的频率和功效来确定频率，当其他治疗在癌症治疗中无效时需要更加频繁使用。还必须考虑患者在下一周期开始之前恢复重量的能力，能够恢复重量的具有更严重症状的患者像给予其他治疗一样频繁地接受所述膳食，没有恢复重量或不能经历全膳食时间段的患者只有在他们回到正常重量后才被置于FMD(开始治疗前的重量，但BMI也高于18)。FMD由通常视为安全(RGAS)的成分组成。根据受试者体重消耗卡路里。对于第1天，总卡路里消耗是每磅4.5-7卡(或每千克10-16卡)。所述膳食应当至少90％是植物基的。第1天膳食应当包含小于30g糖、小于28g植物基蛋白质、20-30g植物基单不饱和脂肪、6-10g植物基多不饱和脂肪和2-12g植物基饱和脂肪。对于第2-21天，总卡路里消耗是每磅3-5卡(或每千克7-11卡)。第2-21天膳食应当每天包含小于20g糖、小于18g植物基蛋白质、10-15g植物基单不饱和脂肪、3-5g植物基多不饱和脂肪和1-6g植物基饱和脂肪、10-30g稀释于1升水中的甘油，基于体重(对于100磅的人10克，对于200磅的人20克，对于300磅的人30克)。膳食还应当是对于维生素、矿物质+必需脂肪酸包含约50％的RDA(每天)的高营养品。最小长度是5或6天，最大长度是21天(基于禁食诊所的安全性数据和护理实践标准)。

以下实施例旨在阐明而非限制本发明的范围。同时这些实施例是可利用的那些的典型，可选地，可利用本领域技术人员已知的其它程序。确实，基于在此的教导，且无需过度实验，本领域普通技术人员可容易地设想并产生进一步的实施方式。

DSS和DSR实验

已经在体外和体内鼠模型中大量测试了本发明的方法。STS和FMD也已经在不同的临床试验中测试，其显示了两种膳食干预的安全性和可行性。FMD膳食已显示在唤起DSS和DSR两者上与STS一样有效。

方法：分别在48小时或4天的时间内，每两周施用一次短期饥饿(STS)或禁食模仿膳食(FMD)。膳食干预的结束与通过静脉注射施用阿霉素一致。在膳食干预的一个周期和下一个周期之间，在10-12天的时间内给予动物来恢复体重。对于整个实验期间，在任意喂食期间但不在膳食干预期间，每天腹腔内施用雷帕霉素。观察生理和分子标志物，如循环葡萄糖、酮体和S6K水平，以便证实治疗的功效。图1A显示了雷帕霉素治疗诱导引起血糖增加的胰岛素抗性样的状态。Rapa+STS/FMD小鼠中减少的血糖支持这一假说，即用Rapa和STS/FMD治疗的小鼠比单独用雷帕霉素治疗的小鼠更加具有抗性。图1B显示了正如预期地在有或无雷帕霉素施用的情况下在STS/FMD期间酮体(KB)水平显著增加。进行单因素方差分析(One-way ANOVA)测试，p值＜0.05的差异被认为是显著的(p值＜0.05、0.01和0.001分别表示为*、*和***)。

膳食(小鼠)：以辐照TD.7912啮齿类食物(Harlan Teklad)供养小鼠。简言之，此膳食包含3.T5千卡/克的易消化能量，由蛋白质、碳水化合物和脂肪供应的卡路里的百分比率为25∶58∶17。任意提供食物。对照组中的小鼠平均消耗14.9千卡/天(或3.9克/天)，我们的实验FMD膳食基于营养筛查，该营养筛查在低卡路里消耗期间鉴定允许高营养品的成分(Brandhorst，Wei等，2013.Exp Gerontol.2013年10月；48(10)：1120-8.doi：10.1016/j.exger.2013.02.016.Epub 2013年2月21日)。在供应FMD膳食之前，将动物转移至新笼子中以避免食用残留食物和食粪。FMD膳食由指定为第1天膳食和第2-4天膳食的两种不同组分组成，所述两种不同组分分别以此顺序喂食。第1天膳食包含1.88千卡/克并且设计为使小鼠在随后的喂食日子期间适应低卡路里摄入的时间段。第2-4天膳食在所有的喂食日子是相同的并包含0.36千卡/克。每两周，按照任意喂食对照组的平均摄入(～4克)喂食第1天和第2-4天膳食。由于供应的FMD膳食的不同卡路里密度，在此队列中的小鼠在第1天消耗的卡路里减少～50％，并且在第2-4天消耗对照队列的9.7％。小鼠在FMD方案的每一天消耗掉所有的供应食物并且没有显示出厌食迹象。在第2-4天膳食结束后，在开始另一个FMD周期前我们任意供应TD.7912食物持续10天。

图2A-C提供了显示小鼠中诱导胁迫抗性的实验结果。在这些实验中，12周龄雌性C57BL/6小鼠被分在以下实验组中；任意(任意喂食)、STS/FMD、DXR、STS/FMD+DXR(图2)。为了观察在雷帕霉素存在或不存在下对每次治疗的响应，每组一式两份存在，但只有一份经历雷帕霉素治疗。施用雷帕霉素持续14天的时间，在该时间结束时通过静脉注射施用高剂量的阿霉素(24mg/kg/)。在注射阿霉素前，对属于STS+DXR组的动物喂食非常低卡路里且无蛋白质的FMD 48小时。阿霉素注射之后，每天监测所述动物，记录生存率(图2)。图2A提供了此胁迫抗性实验的治疗方案。图2B提供了在第20天的存活数据。图2C提供了每个实验组的血糖水平图。还观察到在化疗期间施用雷帕霉素使小鼠对导致增加死亡率的药物敏感。然而，图2B的实验显示STS可逆转正常组织对由雷帕霉素诱导的化疗的敏感。

癌症相关实验

对动物、人受试者或癌细胞施用mTOR激酶抑制剂雷帕霉素与STS和化疗药物联合，以延迟癌细胞生长并改善存活率。测试的化疗药物是单独蒽环霉素阿霉素或与两种其他化学药物(拓扑替康和长春新碱(TVD)，其通常用于治疗患有癌症的成人和儿童)的混合物。

图3A-B提供了实验的结果，在该实验中针对人成神经细胞瘤(SH-SY5Y)、鼠乳腺癌(4T1)和鼠黑色素瘤(B16)细胞系在体外测试了STS与雷帕霉素联合在降低肿瘤生长中的功效。图3A提供了在任意喂食或STS条件下用雷帕霉素和化疗药物混合物TVD(拓扑替康+长春新碱+阿霉素)治疗的人成神经细胞瘤细胞系的细胞生存力的图。图3B提供了在任意喂食或STS条件下用雷帕霉素和化疗药物阿霉素(DXR)治疗的乳腺癌(4T1)细胞系的细胞生存力的图。图3B提供了在任意喂食或STS条件下用雷帕霉素和化疗药物阿霉素(DXR)治疗的黑色素瘤(B16)细胞系的细胞生存力的图。在这些实验中的每一个中，通过对所有测试的细胞系进行台盼蓝染色来确定细胞生存力，通过进行学生t-检验来确定每种治疗对细胞生存力的有效性(p值＜0.05、0.01和0.001分别表示为*、*和***)。结果显示在多种癌细胞系中短期饥饿(STS)增大了雷帕霉素和化疗在降低细胞生存力中的功效。

在鼠乳腺癌(4T1)和鼠黑色素瘤(B16)小鼠同种异体移植模型中，证明STS和雷帕霉素在降低肿瘤进展中有累加效应，这确认了STS增强mTOR激酶抑制剂雷帕霉素对癌细胞的作用。图4A-E提供了肿瘤进展研究的结果。图4A提供了表示肿瘤进展研究方案的时间轴，所述肿瘤进展研究涉及减少卡路里的膳食和雷帕霉素。通常，分别对Balb/c和C57BL/6小鼠皮下注射2×10⁵4T1或B16细胞。一旦肿瘤可感知，小鼠被分组并经历多周期的STS与DXR联合施用。图4B提供了用雷帕霉素和多周期STS(A中阴影柱)与DXR联合施用治疗的Balb/c小鼠中的4T1鼠乳腺癌模型的肿瘤体积与时间的图。图4C是表示图4B中的实验结束时的肿瘤体积的柱状图。图4D提供了用雷帕霉素和多周期的STS与DXR联合施用治疗的C57BL/6小鼠中的鼠黑色素瘤模型的肿瘤体积与时间的图。图4E是表示图4D中的实验结束时的肿瘤体积的柱状图。进行单因素方差分析以确定肿瘤尺寸差异的显著性和测试的治疗的有效性(p值＜0.05、0.01和0.001分别表示为*、*和***)。对于4T1鼠乳腺癌模型，对雌性Balb/c小鼠在右侧腹皮下注射2×10⁵个4T1癌细胞，并用标准膳食任意喂食直至肿瘤可感知。对于我们的B16鼠乳腺癌模型，对雌性C57BL/6小鼠在右侧腹皮下注射2×10⁵个B16癌细胞，并用标准膳食任意喂食直至肿瘤可感知。此时确定肿瘤体积，并将小鼠布置在以下实验组；任意(任意喂食)、STS/FMD、DXR、STS/FMD+DXR。为了观察在雷帕霉素存在或不存在下对每次治疗的响应，每组一式两份存在，但只有一份经历雷帕霉素治疗。小鼠经受每天雷帕霉素注射和多周期治疗(总计三次)，其中每一周期由以下构成：属于STS/FMD和STS/FMD+DXR组的小鼠经历48-72小时的完全食物剥夺，可自由饮水，然后在周期之间用标准食物膳食再喂食约10天以恢复丢失的体重。分别在第一、第二和第三周期结束时对来自STS/FMD+DXR组的动物也静脉注射阿霉素。任意喂食来自DXR组的动物并同样注射阿霉素。实验显示禁食增强了雷帕霉素在减小肿瘤进展中的作用。

总之，STS/FMD与mTOR抑制剂雷帕霉素的联合在延迟很多种癌细胞和肿瘤的生长和存活中具有累加效应。该联合治疗还阻止由单独施用雷帕霉素引起的正常细胞的化疗依赖性敏感作用。结果提示STS/FMD可增强营养信号传导路径的其他抑制剂的作用，所述信号传导路径包括AKT-TOR-S6K和Ras-cAMP-PKA和MAPK。由于STS或等价的FMD对细胞外侧和内侧的多种分子、生长因子和营养素的广泛/宽泛作用效果，利用雷帕霉素观察到的增强效果预期适用于多种不同的用于癌症治疗的激酶/生长抑制剂。由于雷帕霉素和多种其他激酶和/或生长抑制剂广泛用于人的特定肿瘤的治疗，这些结果对于那些疗法的安全性和功效具有重要的暗示。

虽然上面描述了示例性的实施方式，并非旨在这些实施方式描述了本发明的所有可能的形式。更确切地，说明书中使用的词语是描述性而非限制性的词语，并且应当理解可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下做出各种变化。另外，可以组合各种实施方式的特征来形成本发明的进一步的实施方式。