一种新型靶向脂质体骨架材料及其制备方法与流程

本发明涉及一种靶向新型脂质体骨架材料及其制备方法，特别是涉及适合癌症靶点，具体说是以特定受体为目标的主动靶向的新型脂质体骨架材料及制备方法。

背景技术：

脂质体(liposome)是一种人工膜，具体来说是仿细胞膜的新型制剂技术，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，可以将药物送入细胞内部。脂质体主要由具有亲水亲脂两性的磷酸分子作为骨架材料组成。当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，即为脂质体。脂质体具有肝、脾网状内皮系统的被动靶向性，然而，普通脂质体也极易在体循环中被肝、脾巨噬细胞迅速清除。1984年，通过酰胺键、羧基-PEG和纯化的磷脂酰乙醇胺(PE)耦合成功使磷脂质偶联到PEG上被全球研究人员所知。从此，通过聚乙二醇修饰解决了可以使脂质体在血液中保留较长时间，增加了药物的被动靶向功能。由于聚乙二醇价廉易得、可以大规模生产、分子量易于控制、良好的物理化学性质，同时可以事先将其制备成聚乙二醇－磷脂衍生物，制剂工艺相对简单等优点，成为目前高分子修饰脂质体的研究重点，然而这样的修饰并没有改变脂质体被动被“吞噬”，即被动到达靶器官这一特点。

除了磷脂外，胆固醇是是共同构成细胞膜和脂质体的基础物质。胆固醇具有调节膜流动性的作用，故可称为脂质体“流动性缓冲剂”，对脂质体的稳定性具有重要作用。相对于磷脂组成的双分子层作为脂质体主要骨架，胆固醇穿插于磷脂双分子层之间，位置相对分散，且相对于磷脂来说，在脂质体组成所占比例较低。近年来，也有通过PEG修饰胆固醇来达到长循环作用，例如公开号为CN102038640A的中国发明专利申请中披露，通过胆固醇的PEG化达到延长长春碱类药物在体内的滞留作用。同样，这样的修饰并没有改变脂质体被动被“吞噬”，即被动到达靶器官这一特点。近年来，恶性肿瘤的发病率越来越高。肿瘤细胞与正常细胞的最大区别是过度增殖。换言之，肿瘤细胞与正常细胞都属于人体自己细胞，这给治疗恶性肿瘤带来了挑战。在目前治疗恶性肿瘤的方法中，常用为手术、化疗、放疗及近年来探索性采用的肿瘤免疫疗法等，除了手术治疗外，化疗和放疗作为常规治疗方法，在杀死肿瘤的同时对机体正常细胞也具有巨大杀伤作用，这是造成癌症死亡率极高的主要原因之一。因此，如何靶向杀伤肿瘤细胞，是目前治疗的难题之一。

近二十多年来的研究表明，叶酸等受体在多种肿瘤细胞表面高度表达，其数量和活性远远超过正常细胞，具有良好的肿瘤组织特异性，即肿瘤特异性受体。例如，非转移性癌表面表达的叶酸水平较高度未分化的转移性癌细胞要低得多，说明中晚期肿瘤较早期肿瘤更易结合叶酸。因此，叶酸及其受体不断成为癌症诊断及治疗研究的新热点。相比于通常釆用的具有较大分子量的肿瘤特异性单克隆抗体，叶酸等作为小分子物质，具有较高的化学生物稳定性、组织相容性强、穿透能力强、达到靶点时间短、与受体亲和力高、几乎无免疫原性、价廉易得等优点，因此，成为了引起广泛关注的介导递药系统主动靶向肿瘤的寻靶分子。

另外，由于肿瘤组织中缺乏淋巴系统，难以清除脂类等大分子物质，因此对于叶酸介导的抗肿瘤药物给药系统通常采用脂质体作为药物载体，而且，脂质体还可以通过增强渗透保留作用(EPR效应)，提高抗肿瘤药物在肿瘤组织中的浓度和延长药物半衰期。

因此，通过修饰新型脂质体骨架材料，使之从被动靶向转为主动靶向肿瘤等组织，是本发明研究的重点。

技术实现要素：

本发明主要提供一种主动靶向新型脂质体骨架材料，能够加载特定靶向小分子的同时，保持脂质体的稳定性，该新型脂质体骨架材料具有如下结构：

R₀-(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂-R-R'

其中，R₀具有如下结构：

其中，R₂、R₃、R₄、R₅为H含有取代或非取代C1-C10的直链或支链的小分子烷基取代，R₁为具有取代或非取代的酯键或酰胺结构，具体为CO₂-或CO₂NH-。

其中，R₀与(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂部分通过R₁相连，R为碳键或酯键或酰胺键，R′的分子量为小于5000的靶向小分子化合物，n＝3-100。优选地，n＝30-70。本发明n约等于70，进一步，优选地，R为酰胺键。

发明人经验地发现，当n在3-100，R₀部分能够很好地嵌入脂质体的双分子层中，使得脂质体有很好的稳定性，而R′部分通过中间(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂长链，能够保持其作为游离分子的活性，即对靶部位的亲和力。特别是30-70之间时，能够更好得发挥R′部分的导向性同时又能保证磷脂双分子层的稳定性。

进一步，(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂平均分子量优选为2000-3400。

进一步，R₀为胆固醇及结构类似物。

进一步，R′包括但不限于特定靶点受体激动剂或抑制剂、特定信号通路信号因子、特定器官或组织(例如肝脏、脾脏、淋巴组织)特异性表达受体抑制剂或激动剂；进一步，优选为肿瘤特异性受体抑制剂，例如叶酸、PD-L1、VEGFR、CD28等。本发明所述新型脂质体骨架材料在制备成脂质体后，由作为特定靶向的R′引导进入特定靶部位，即能够将脂质体及其载药主动进入靶标后再降解释放药物，避免了被动靶向的“吞噬”，达到预定靶向释放药物的作用，避免了对机体正常细胞的杀伤。

本发明还提供一种制备该新型脂质体骨架材料的方法，发明人采用生物催化反应，具体来说，是将靶向小分子化合物、胆固醇及其类似物的氯甲酸酯、不同分子量的双氨基聚乙二醇经不同生物酶促反应生成。具体来说，是将R₀端酯或酰胺与双氨基聚乙二醇及R端酯经过生物催化反应制得。所述生物酶为缩合酶或酯化酶或酰胺化酶。该反应方法能够一步完成，副反应少甚至几乎没有。

进一步，所述反应在恒温条件，最好在30℃-80℃完成。

生物催化反应过程中，选用Novozym 435、Lipozyme ^IM TL、Protease P、Protease N、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶PS1作为催化剂，其中，优选地，所述生物酶为Novozym脂肪酶435。

本发明惊讶地发现，采用Novozym脂肪酶435能够将高效地定向地将R₀端酯或酰胺与双氨基聚乙二醇及R端酯键合，产物得率高。

进一步，本发明提供一种采用上述新型材料制备的脂质体。

进一步，该新型脂质体骨架材料具有如下结构：

具体地，该新型脂质体

骨架材料具有如下结构：

其中，取代基R₁、R₂、R₃为H或OH或C1-C4取代基；R₄或R₅为H或OH，优先地，R₄为H，且R₅为OH。

进一步，n＝3-100。优选地，n＝30-70。

进一步，该新型脂质体骨架材料具有如下结构：

进一步，上述靶向新型脂质体骨架材料的制备方法，是用R端酯与胆固醇氯甲酸酯、双氨基聚乙二醇经生物催化反应生成新型脂质体骨架材料。所述生物催化反应为酶促反应，所述生物酶为Novozym脂肪酶435。

发明人发现，通过上述新型脂质体骨架材料制备的脂质体，能够与叶酸受体相结合，定向将药物传递至具有较高叶酸表达，比如癌细胞中。

进一步，本发明提供一种叶酸介导的靶向新型脂质体骨架材料，结构式如下：

其中，n＝3-100。优选地，n＝30-70。

进一步，本发明提高一种制备该叶酸介导的靶向新型脂质体骨架材料的方法：用叶酸与胆固醇氯甲酸酯、双氨基聚乙二醇经生物催化反应生成新型脂质体骨架材料。其中之一反应路线如下：

具体来说，在制备过程中，在反应瓶中加入溶剂，反应物叶酸、胆固醇氯甲酸酯、双氨基聚乙二醇和酶Novozym 435分别加入反应瓶中，混合均匀，避光，水浴恒温(40℃)振荡器内振荡(250r/min)，反应24h，该反应经一步完成。

本发明上述靶向新型脂质体骨架材料，嵌入脂质体双分子层，制备成为能够特定受体的主动靶向脂质体，该脂质体的配方如下：

进一步，该脂质体的配方(重量比)如下：

上述靶向脂质体，因具有在胆固醇及其类似物端嵌合入在磷脂双分子层中，而以特定长度的PEG为桥梁，能够“跨越”磷脂双分子层，将靶向分子露出在磷脂双分子层外侧，从而能够“施展”其介导作用。

所述药学上可以接受的辅料优选为DSPE-PEG及其衍生物。

进一步，该脂质体的配方(重量比)如下：

上述g/ml是指在上述重量比中，取1份，即1g时，加入PBS(7.4)1000份，即1000ml。

进一步，本发明提供一种靶向小分子化合物介导的载药脂质体，具体来说，该脂质体以白桦脂酸为作为活性成分，借助具有R₀-(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂-R-R'结构的靶向新型脂质体骨架材料，制备成脂质体后能够使得脂质体“靶向”前往癌细胞组织，在癌细胞组织中逐步释放白桦脂酸从而发挥其细胞毒作用，杀伤癌细胞，清除肿瘤。

该脂质体的配方(重量比)如下：

进一步，该脂质体的配方(重量比)如下：

下面通过具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

附图1：叶酸-聚乙二醇-胆固醇IR图谱

附图2：叶酸-聚乙二醇-胆固醇质谱图

附图3：白桦脂酸脂质体透射电镜照片(×25000)

附图4：白桦脂酸脂质体的粒径分布

附图5：白桦脂酸脂质体细胞毒性评价

附图6：蟾酥提取物脂质体透射电镜照片

附图7：蟾酥提取物脂质体粒径分布

附图8：叶酸修饰的蟾酥提取物脂质体Zeta电位

附图9：蟾酥提取物脂质体细胞毒性评价

附图10：PA-PEG-CHOL的IR图谱

附图11：PA-PEG-CHOL质谱图

具体实施方式

下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

实施例1叶酸受体介导的靶向脂质体骨架材料的合成

方法：在15mL带塞三角瓶中加入10mL二甲基亚砜、25μmol叶酸、25μmol胆固醇氯甲酸酯、25μmol双氨基聚乙二醇和Novozym 435，混合均匀，避光，水浴恒温(40℃)振荡器内振荡(250r/min)，反应24h，反应混合物经过滤除酶，分离后得到的反应液置透析袋(MWCO 2000Da)中透析48小时，将透析袋内液体冻干得黄色固体。

合成产物鉴定

红外扫描分析：称取纯化后的产物1～2mg，在玛瑙研钵中研细后加入约100～200mg溴化钾粉末，一起研磨至2μm以下且混合均匀，转移至模具中，按顺序放好各部件后，置于压片机中抽真空5min，然后边抽气边加压，当达到68.6Mpa时，停止加压，维持5min后，解压至压力表指针为“0”，取出模具，即得到直径1cm、厚度约为1mm透明的晶片。以空气为对照，在样品架上插入产物样品置于红外光谱仪上分析，产物谱图见附图1。

质谱(MS)分析：产物用适量二甲基亚砜溶解后，用质谱分析仪(MS)分析，质参数：ESI源(+)模式，见附图2。

由于合成材料中PEG为聚合物，其平均分子量为3400，因此合成的叶酸PEG衍生物平均分子量约为4,175Da，在质谱图中，得到一系列以4,175Da为中心的正态分布分子离子峰，与合成产物分子量吻合，证明合成化合物为目标化合物。

实施例2白桦脂酸脂质体的制备

采用薄膜分散法注入法制备白桦脂酸脂质体。定量称取0.1g卵磷脂、0.010g白桦脂酸、0.033g胆固醇、0.033g采用实施例1方法制备的叶酸-聚乙二醇-胆固醇溶于适量氯仿中，真空旋转蒸去除氯仿，于前形瓶壁形成脂均匀的薄膜。真空干燥24h后再加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，55℃水浴振荡2h，45℃孵育30min，探头超声15min，依次挤压通过0.45、0.22μm微孔滤膜，即得。

脂质体形态观察：取脂质体混悬液适当稀释后，用质量分数为1％的磷钨酸负染，于透射电镜下观察形态。由电镜照片可知，白桦脂酸脂质体外观圆整，多为球形及类球形粒子，大小较均一，见附图3。

粒径及其分布考察：取脂质体混悬液，适当稀释后，用激光粒径分析仪测定粒径。结果脂质体平均体粒径为(235±8)nm，多分散系数为0.182，粒径分布见附图4。

MTT法检测白桦脂酸脂质体的细胞毒性：HepG2细胞用含有10％胎牛血清、50U/ml的青链霉素和10mmol/L HEP ES的RPMI 1640培养基在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。作用前24h,所有细胞以1×10⁴/孔的密度种植在96孔板内,每种细胞设6个复孔。24h后,细胞获得75％～85％的融合度。立即去掉原有培养基,用PBS洗涤1遍,更换含有常规方法制备的白桦脂酸(定量称取0.1g磷脂、0.010g白桦脂酸、0.021g胆固醇、0.012gDSEP-PEG-2000)和采用实施例2方法叶酸受体介导的白桦脂酸脂质体(CR为7.5％)溶液20l的100μL完全培养基。作用24h后,每孔更换200μL的完全培养基。孵育过夜后,MTT法检测细胞活性。细胞活性(％)＝处理细胞D₅₇₀/阴性对照D₅₇₀×100％。见附图5。

实施例3蟾酥提取物脂质体

将处方量药物、磷脂、胆固醇及叶酸-PEG-CHOL用适量氯仿溶解，减压下旋转蒸发，保持水浴温度40℃，形成均匀白色薄膜后加入10mL pH 7.4磷酸盐缓冲液，50℃水化过夜，呈乳白色混悬液，过0.45、0.2μm微孔滤膜，即得。

脂质体配方如下：

透射电镜形态考察：采用磷钨酸负染色法，观察脂质体微粒的微观形态，具体操作方法如下：脂质体混悬液适当稀释后，取1滴滴于喷膜的铜网上，静置5分钟，滴加质量分数为1％磷钨酸负染色约30秒，用滤纸吸去大部分染色液，在电镜下观察脂质体微粒的形态和大小，并摄相，电镜观察照片见附图6。由透射电镜照片可见脂质体外观圆整，多为球形及类球形粒子，大小较均一，分散性好。

粒径及其分布考察：样品粒径的测定方式如下：样品用水稀释成适当浓度，激光粒度测定仪测定样品粒径，结果叶酸修饰的脂质体平均体粒径为(161±15)nm，呈单峰分布，粒径分布范围较窄且符合正态分布，多分散系数别为0.154±0.013，见附图7。

表面电位测定：脂质体混悬液用水适当稀释，激光粒径分析仪测定脂质体的Zeta电位。结果叶酸修饰的脂质体的Zeta电位值为(4.2±1.2)mV，见附图8。

包封率测定：精密量取3批蟾酥脂质体样品各0.2mL，置高速离心机中，25000转/min离心2.5小时，取上清液20μL测定，代入标准曲线计算C_u。另取0.2mL置10mL量瓶中，加入适量甲醇充分振摇破乳，用流动相定容，微孔滤膜过滤后取20μL进样测定，代入标准曲线计算C_t。根据下面公式计算脂质体的包封率。包封率计算公式：包封率＝(1-C_u/C_t)×100％，C_u为未被脂质体包封的游离药物(或浓度)，C_t为总的药物浓度。结果叶酸修饰的脂质体中BL、CBG、RBG的包封率分别为93.52±0.56％、97.94％±0.04％、96.29±0.51。

表1包封率测定

MTT法检测脂质体的细胞毒性：HepG2细胞用含有10％胎牛血清、50U/ml的青链霉素和10mmol/L HEP ES的RPMI 1640培养基在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。作用前24h,所有细胞以1×10⁴/孔的密度种植在96孔板内,每种细胞设6个复孔。24h后,细胞获得75％～85％的融合度。立即去掉原有培养基,用PBS洗涤1遍,更换含有采用实施例3方法制备的叶酸受体介导的蟾酥脂质体(CR为7.5％)溶液20l的100μL完全培养基。作用24h后,每孔更换200μL的完全培养基。孵育过夜后,MTT法检测细胞活性。细胞活性(％)＝处理细胞D₅₇₀/阴性对照D₅₇₀×100％。

实施例4钙黄绿素脂质体

制备方法:分别精密称取0.06g卵磷脂、0.015胆固醇、0.01g实施例1制备的靶向脂质体骨架材料、0.01gDSPE-PEG于小烧杯中。加入约适量无水乙醇(预热至55℃)溶解。取约5mL 0.454mol/L硫酸铵溶液于小烧杯中，将烧杯置于恒温搅拌器中，温度调节为55℃，用1mL注射器，将上述小烧杯中的混合溶液缓慢注入到硫酸铵溶液中。待注入完毕后，继续恒温搅拌约半小时，挥走乙醇。待乙醇挥发后，将其放入再生纤维素透析袋(分子截留量1000)中，在500mLPBS缓冲溶液(pH＝7.4)中透析24h，期间更换3次透析液。可得外观均匀的乳白色脂质体混悬液。

取出透析袋中的脂质体于小烧杯中，加入0.5mL 1mg/mL的钙黄绿素溶液，在磁力搅拌器中45℃恒温孵育30分钟，用PBS缓冲溶液(pH＝7.4)定容至10mL，混匀。依次用0.45μm，0.22μm的微孔滤膜过滤整粒，置西林瓶中密封避光，放冰箱(4℃)备用，即得叶酸修饰的钙黄绿素脂质体。同法制备钙黄绿素脂质体(处方中不含靶向新型脂质体骨架材料)

人口腔表皮癌细胞(KB细胞)摄取率的定量分析:

利用钙黄绿素具有绿色荧光的特性，将其作为荧光标记物包裹至脂质体内来考查叶酸受体过度表达人口腔表皮癌细胞(KB)细胞摄取非靶向和叶酸靶向脂质体的差异性，从而验证所制备的靶向新型脂质体骨架材料的叶酸受体靶向摄取性能。

(1)KB细胞培养至对数生长期，弃原细胞培养液，加2mLPBS洗涤1次，再加1.5ml胰蛋白酶进行消化，消化完成后加5mL无叶酸的RPMI-1640培养液进行吹打，至细胞从培养瓶瓶壁脱落，收集细胞至离心管中；

(2)1000X g离心5min，弃上清，加PBS 2mL洗漆1次，除去残留的胰蛋白酵。再加4.5mL无叶酸的RPMI-1640培养液重悬细胞，并调整细胞浓度为Ix10⁶个/ml,分装置4支1.5mL Eppendorf管中，每管加0.69mL无叶酸的RPMI-1640培养液；

(3)每管分别加入PBS(空白对照组)、15μM钙黄绿素脂质体(非靶向组)、15μM叶酸修饰的钙黄绿素脂质体(叶酸受体靶向组)、15μM叶酸修饰的钙黄绿素脂质体+1mM·L^-1叶酸(叶酸阻断组)，使其终体积为ImL，每组设3个复孔，再在37℃下继续培养Ih；

(4)培养结束后，1000X g离心5mim弃上清，加1mL预冷的PBS洗漆3次以除去未被细胞摄取的药物，每管加0.3mLPBS重悬细胞；

(5)重悬后的KB细胞用激发波长为488nm的激发光进行流式细胞术定量分析来确定细胞摄取叶酸靶向脂质体的效率。

结果具体荧光强度数值分别如下：PBS空白对照组的荧光强度为2.35；钙黄绿素脂质体(非靶向组)的荧光强度为18.92；叶酸修饰的钙黄绿素脂质体(靶向组)的荧光强度为614.48；FR阻断组的荧光强度为35.24。结果显示，叶酸修饰的钙黄绿素脂质体组的荧光强度比钙黄绿素脂质体提高了32倍，含靶向新型脂质体骨架材料的叶酸靶向脂质体能更多的被叶酸受体高表达的KB细胞所摄取，而未链接叶酸靶向材料的非靶向脂质体几乎无摄取，而且，摄取的效率几乎完全能够被1mM游离叶酸所阻断。因此，叶酸受体靶向脂质体和KB肿瘤细胞的结合是通过叶酸受体介导的通路来实现的。

实施例5pazopanib(PA)介导的靶向脂质体

PA-PEG-CHOL的合成：在15mL带塞三角瓶中加入10mL二甲基亚砜、25μmol pazopanib、25μmol双羧基聚乙二醇、25μmol胆固醇和Novozym 435，混合均匀，避光，水浴恒温(40℃)振荡器内振荡(250r/min)，反应24h，反应混合物经过滤除酶，分离后得到的反应液置透析袋(MWCO 2000Da)中透析48小时，将透析袋内液体冻干得白色固体。

用pazopanib与双羧基聚乙二醇、胆固醇反应，反应路线如下：

合成产物鉴定

红外扫描分析：称取纯化后的产物1～2mg，在玛瑙研钵中研细后加入约100～200mg溴化钾粉末，一起研磨至2μm以下且混合均匀，转移至模具中，按顺序放好各部件后，置于压片机中抽真空5min，然后边抽气边加压，当达到68.6Mpa时，停止加压，维持5min后，解压至压力表指针为“0”，取出模具，即得到直径1cm、厚度约为1mm透明的晶片。以空气为对照，在样品架上插入产物样品置于红外光谱仪上分析，产物谱图见附图10。

表2PA-PEG-CHOL的红外特征吸收峰

质谱(MS)分析：产物用适量二甲基亚砜溶解后，用质谱分析仪(MS)分析，质参数：ESI源(+)模式，见附图11。

由于合成材料中PEG为聚合物，双羧基聚乙二醇的平均分子量为2000，因此合成的叶酸PEG衍生物平均分子量约为2,700Da，在质谱图中，得到一系列以2,700Da为中心的正态分布分子离子峰，与合成产物分子量吻合，证明合成化合物为目标化合物。

实施例6不同来源的酶促反应考察

计算方法:

(1)初速度V₀值

根据反应初始阶段单位时间内底物的减少量来计算初始反应速度：

反应初速度V₀＝(C₀－C_t)/t

其中：C₀、C_t分别表示反应前后叶酸的浓度(mmol/L)，t为反应时间(h)。

(2)底物转化率

根据底物的减少量与反应前底物的量的比值来计算转化率：

转化率C(％)＝(C₀－C_t)/C₀×100％

其中：C₀、C_t分别表示反应前后叶酸的浓度(mmol/L)。

实验方法：在15mL带塞三角瓶中加入10mL二甲基亚砜、25μmol叶酸、25μmol胆固醇氯甲酸酯、25μmol双氨基聚乙二醇和不同来源的水解酶(Novozym 435、Lipozyme^IM TL、Protease P、Protease N、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶PS1)，混合均匀，避光，水浴恒温(40℃)振荡器内振荡(250r/min)，反应24h，取样1mL，离心(10,000r/min)10min后，取上清液20μL，供高效液相色谱分析。结果见下表。

表3不同来源的酶促反应

由上表可知，在所考察的酶中，均能催化叶酸、胆固醇氯甲酸酯、双氨基聚乙二醇反应，Novozym 435底物转化率最高，反应初速度V₀最大。