重组抗PD‑L1全人单克隆抗体的液体制剂的制作方法

本发明涉及生物制剂领域，特别是涉及一种稳定的重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂。
背景技术：
：pd-1全称程序性死亡受体1，英文名字为programmeddeath1，是一种重要的免疫抑制分子，为cd28家族成员。pd-l1全称程序性死亡受体-配体1，英文名字programmedcelldeath-ligand1，是大小为40kda的第一型跨膜蛋白。以pd-l1为靶点的免疫调节在抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等方面均有重要的意义。正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促进具有抗原特异性的t细胞增生。而细胞程序化死亡受体-1(pd-1)与细胞程式死亡-配体1(pd-l1)结合，可以传导抑制性的信号，减低t细胞的增生。肿瘤细胞逃避t细胞摧毁的一种途径是通过在它表面产生pd-l1，当免疫细胞t细胞表面的pd-1识别pd-l1后，可以传导抑制信号，t细胞就不能发现肿瘤细胞和向肿瘤细胞发出攻击信号。pd-1是通过解除肿瘤细胞逃避免疫系统的新型免疫疗法。pd-1免疫疗法的作用机制是针对pd-1或pd-l1设计特定的蛋白质抗体，阻止pd-1和pd-l1的识别过程，部分恢复t细胞功能，从而使t细胞可以杀死肿瘤细胞。近日，在2016年美国癌症研究协会(aacr)上关于癌症治疗的临床进展中提出使用抗pd-1抗体药物pembrolizumab作为一线系统治疗可诱导高级别默克尔细胞癌(merkelcellcarcinoma)的高反应性。pd-1抗体又重新回到大家的视野，pd-1抗体是当前备受瞩目，广为关注的一类肿瘤免疫疗法，也是肿瘤免疫疗法中的主力军。2015年12月，美国第39届总统吉米·卡特在接受靶向放疗和免疫抗癌新药keytruda治疗后发表声明说，医生在给他做完最近一次脑部磁力共振扫瞄后，没有发现此前在他大脑中出现的黑色素瘤(melanoma)或新的癌细胞，这成功引起广泛关注同时彰显了pd-1免疫疗法在肿瘤治疗方面的潜力。蛋白质(抗体等)的液体制剂适合于非肠道给药，包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下注射等给药方式。但蛋白质在溶液中易形成凝聚物和颗粒，这一直是开发非胃肠道给药蛋白产品的一个难题。尤其是对于公开号cn106432501a专利中的pd-l1全人单克隆抗体，试验发现其在溶液状态下非常容易形成凝聚物，难以得到稳定的液体制剂。因此，开发重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液态制剂首先需要解决抗体的稳定性问题。稳定的蛋白制剂是该制剂中的蛋白质在储藏期能基本上保持其物理稳定性、化学稳定性和生物稳定性的制剂。现有技术中测定蛋白质稳定性的方法有多种，主要是测定在所选温度所选时间内的稳定性。稳定的抗体液态制剂一般要求在冷藏温度下(5±3℃)至少12个月未观察到显著变化的抗体液态制剂。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种稳定的重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂。重组抗pd-l1全人单克隆抗体在这个制剂处方中稳定性好，并且给药方便。本发明所涉及重组抗pd-l1全人单克隆抗体为公开号cn106432501a专利中的抗体。一种稳定的重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂，含有重组抗pd-l1全人单克隆抗体、缓冲液、稳定剂、渗透压调节剂和表面活性剂。各组分较佳浓度为，重组抗pd-l1全人单克隆抗体的浓度为10-50mg/ml；所述缓冲液的浓度为10-50mm；所述纯度稳定剂的浓度为50-250mm；所述渗透压调节剂的浓度为20-100mm；所述表面活性剂的浓度为0.005-0.05wt％，溶液的ph值为5.0-6.0。所述的重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂，其中缓冲液为醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、组氨酸缓冲液之一，优选的缓冲液为组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，浓度为20mm。所述的重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂，其中稳定剂为蔗糖、甘露醇、甘氨酸之一。优选的稳定剂为甘露醇，浓度为150mm。所述的重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂，其中渗透压调节剂为氯化钠，浓度为45mm。所述的重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂，其中表面活性剂为聚山梨酯80，浓度为0.01wt％。所述的重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂，其中重组抗pd-l1全人单克隆抗体的浓度为30mg/ml。所述的重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂，溶液的ph值为5.5。所述的重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂，重组抗pd-l1全人单克隆抗体为公开号cn106432501a专利中的抗体。。本发明的重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂的稳定性好，采用cex-hplc检测方法，在5℃±3℃温度条件下至少可稳定保存24个月，主峰纯度控制在≥50％。附图说明图1是实施例1中各配方样品放置2～8℃条件和40℃75％rh条件考察结果汇总的趋势图。图2是实施例2中各配方样品放置25℃100rpm振摇条件和40℃75％rh条件考察结果汇总的趋势图。图3是实施例3中各配方样品放置25℃100rpm振摇条件和40℃75％rh条件考察结果汇总的趋势图。图4是实施例4中三批重组抗pd-l1全人单克隆抗体液体制剂在2～8℃条件下长期稳定性检测结果汇总的趋势图。图5是实施例5中三批重组抗pd-l1全人单克隆抗体液体制剂在25℃条件下加速稳定性检测结果汇总的趋势图。具体实施方式下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合具体实施例，对本发明作进一步详细的说明。实施例中所用辅料，如果没有特别说明，均为市售药用级别。本申请的实施例1-4中所涉及的重组抗pd-l1全人源单克隆抗体选自以下一种或多种的组合：具有如seqidno：43所示的重链可变区、如seqidno：45所示的轻链可变区和人源igg4同种型恒定区的全人源单克隆抗体(抗体“1.4.1”)；具有如seqidno:47所示的重链可变区、如seqidno:49所示的轻链可变区和人源igg4同种型恒定区的全单克隆人源抗体(抗体“1.14.4”)；具有如seqidno:51所示的重链可变区、如seqidno:53所示的轻链可变区和人源igg4同种型恒定区的全单克隆人源抗体(抗体“1.20.15”)；具有如seqidno:55所示的重链可变区、如seqidno:49所示的轻链可变区和人源igg4同种型恒定区的全单克隆人源抗体(抗体“1.46.11”)。本申请的实施例中涉及的重组抗pd-l1全人源单克隆抗体“1.4.1”、“1.14.4”、“1.20.15”和“1.46.11”，其cdr序列如表1-表4中所示，并且重链或轻链可变区序列也如下列出。表1表2表3表41.4.1-vh(30511)：(seqidno:43为氨基酸，seqidno:44为核酸)重链cdr1-3:seqidno:1、3、5为氨基酸序列和seqidno:2、4、6为核酸序列。1.4.1-vl(30027):(seqidno:45为氨基酸和seqidno:46为核酸)轻链cdr1-3：seqidnos:7、9、11为氨基酸序列和seqidno:8、10、12为核酸序列。1.14.4-vh(29812):(seqidno:47为氨基酸，seqidno:48为核酸)重链cdr1-3：seqidnos:13、15、17为氨基酸序列和seqidno:14、16、18为核酸序列。1.14.4-vl和1.46.11-vl(29841):(seqidno:49为氨基酸，seqidno:50为核酸)轻链cdr1-3：seqidnos:19、21、23为氨基酸序列和seqidno:20、22、24为核酸序列。1.20.15-vh(30712):(seqidno:51为氨基酸，seqidno:52为核酸)轻链cdr1-3：seqidnos:25、27、29为氨基酸序列和seqidno:26、28、30为核酸序列。1.20.15-vl(29907):(seqidno:53为氨基酸，seqidno:54为核酸)轻链cdr1-3：seqidnos:31、33、35为氨基酸序列和seqidno:32、34、36为核酸序列。1.46.11-vh(30626):(seqidno:55为氨基酸，seqidno:56为核酸)轻链cdr1-3：seqidnos:37、39、41为氨基酸序列和seqidno:38、40、42为核酸序列。1.46.11-vl(29841):(seqidno:49为氨基酸，seqidno:50为核酸)轻链cdr1-3：seqidnos:19、21、23为氨基酸序列和seqidno:20、22、24为核酸序列。本申请的其他实施方式中涉及的重组抗pd-l1全人源单克隆抗体和其抗原结合片段还包括选自下组的重链cdr序列：seqidno:1、3、5、13、15、17、25、27、29、37、39和41；所述重组抗pd-l1全人源单克隆抗体和其抗原结合片段还包括选自下组的轻链cdr序列：seqidno:7、9、11、19、21、23、31、33和35。本申请的其他实施方式中涉及的重组抗pd-l1全人源单克隆抗体和其抗原结合片段还包括选自下组的重链可变区：重链可变区，其包括seqidno:1、seqidno:3、和/或seqidno:5；重链可变区，其包括seqidno:13、seqidno:15、和/或seqidno:17；重链可变区，其包括seqidno:25、seqidno:27和/或seqidno:29；以及重链可变区，其包括seqidno:37、seqidno:39和/或seqidno:41。本申请的其他实施方式中涉及的重组抗pd-l1全人源单克隆抗体和其抗原结合片段还包括选自下组的轻链可变区：轻链可变区，其包括seqidno:7、seqidno:9和/或seqidno:11；轻链可变区，其包括seqidno:19、seqidno:21和/或seqidno:23；以及轻链可变区，其包括seqidno:31、seqidno:33和/或seqidno:35。本申请的其他实施方式中涉及的重组抗pd-l1全人源单克隆抗体和其抗原结合片段还包括：a)重链可变区，其包括seqidno:1、seqidno:3、和/或seqidno:5；和轻链可变区，其包括seqidno:7、seqidno:9和/或seqidno:11；b)重链可变区，其包括seqidno:13、seqidno:15和/或seqidno:17；和轻链可变区，其包括seqidno:19、seqidno:21和/或seqidno:23；c)重链可变区，其包括seqidno:25、seqidno:27和/或seqidno:29；和轻链可变区，其包括seqidno:31、seqidno:33和/或seqidno:35；以及d)重链可变区，其包括seqidno:37、seqidno:39和/或seqidno:41；和轻链可变区，其包括seqidno:19、seqidno:21和/或seqidno:23。实施例中cex-hplc检测方法为阳离子交换色谱法，阳离子交换色谱根据待分析物所带电荷数的差别进行分离，能够分离单克隆抗体中的电荷异质体，此方法为药物审评中心规定的考察单克隆抗体药物稳定性的常用方法。实施例1缓冲体系种类的筛选本实施例的重组抗pd-l1全人单克隆抗体液体制剂的配方如下所示：配方1：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm醋酸/醋酸钠缓冲体系，ph值为4.5；配方2：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm醋酸/醋酸钠缓冲体系，ph值为5.0；配方3：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm枸橼酸/枸橼酸钠缓冲体系，ph值为5.0；配方4：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm枸橼酸/枸橼酸钠缓冲体系，ph值为5.5；配方5：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm枸橼酸/枸橼酸钠缓冲体系，ph值为6.0；配方6：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm组氨酸/盐酸组氨酸缓冲体系，ph值为5.5；配方7：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm组氨酸/盐酸组氨酸缓冲体系，ph值为6.0；配方8：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm组氨酸/盐酸组氨酸缓冲体系，ph值为6.5；上述各配方的重组抗pd-l1全人单克隆抗体液体制剂的制备方法为：将重组抗pd-l1全人单克隆抗体原液(原液编号：315sd141229h01x01)经超滤换液到实施例1中的8种缓冲体系溶液中，调节浓度至30mg/ml获得半成品，半成品在层流条件下经0.22微米的pvdf除菌过滤器过滤后灌装至西林瓶即获得待考察样品。上述配方1～8的样品取样并分为两组，分别放置于40℃75％rh条件和2～8℃条件下进行考察，在2周和4周取样进行纯度检测，采用阳离子交换色谱法cex-hplc进行检测，考察结果见表1：表1各实施例cex-hplc考察结果注：t0为表示样品起始点，t2w表示考察2周后的取样点，t4w表示考察4周后的取样点，2～8℃表示2～8℃的考察条件，40℃表示40℃75％rh的考察条件。结果表明，重组抗pd-l1全人单克隆抗体在配方6中的主峰纯度较其他七个配方都高，表明配方6对重组抗pd-l1全人单克隆抗体的稳定性较其他七个配方的缓冲体系更好。实施例2辅料筛选试验本实施例的重组抗pd-l1全人单克隆抗体液体制剂的配方如下所示：配方9：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液+150mm海藻糖+55mm氯化钠+0.01wt％聚山梨酯80；配方10：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液+150mm蔗糖+55mm氯化钠+0.03wt％聚山梨酯80；配方11：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液+150mm甘氨酸+55mm氯化钠+0.05wt％聚山梨酯80；配方12：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液+150mm甘露醇+55mm氯化钠+0.05wt％聚山梨酯80；上述各配方的重组抗pd-l1全人单克隆抗体液体制剂的制备方法同实施例1，所用原液编号为3155sd150514h01m01。上述配方9、10、11、12的样品取样并分为两组，分别放置于40℃75％rh条件和25℃100rpm振摇条件下进行考察，在2周和4周取样进行纯度检测，采用阳离子交换色谱cex-hplc进行检测，考察结果见表2：表2各实施例cex-hplc考察结果注：t0为表示样品起始点，t2w表示考察2周后的取样点，t4w表示考察4周后的取样点，a-25℃表示25℃振摇100rpm的考察条件，40℃表示40℃75％rh的考察条件。结果表明，重组抗pd-l1全人单克隆抗体在配方12的中稳定性较其他四个配方的更好。实施例3表面活性剂的筛选试验配方13：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液+150mm甘露醇+55mm氯化钠+0.01wt％聚山梨酯80；配方14：30mg/ml重组抗pd-l1全人单克隆抗体+20mm柠檬酸缓冲液+150mm甘露醇+55mm氯化钠+0.05wt％聚山梨酯80；上述各配方的重组抗pd-l1全人单克隆抗体液体制剂的制备方法同实施例1。上述配方13、14的样品取样并分为两组，分别放置于40℃75％rh条件和25℃100rpm振摇条件下进行考察，在2周和4周取样进行纯度检测，采用阳离子交换色谱cex-hplc进行检测，考察结果见表3：表3各实施例cex-hplc考察结果注：t0为表示样品起始点，t2w表示考察2周后的取样点，t4w表示考察4周后的取样点，a-25℃表示25℃振摇100rpm的考察条件，40℃表示40℃75％rh的考察条件。结果表明，重组抗pd-l1全人单克隆抗体在配方13的中稳定性较另一个配方的更好，所以选定配方13为重组抗pd-l1全人单克隆抗体的制剂配方。实施例4对三批配方13的重组抗pd-l1全人单克隆抗体液体制剂进行2～8℃长期和25℃±2℃加速稳定性考察，考察项为阳离子交换色谱法，即cex-hplc，5℃±3℃长期稳定性考察结果见表4，25℃±2℃加速稳定性考察结果见表5。表4三批成品在2～8℃温度条件下的cex-hplc结果(单位：％)成品批号0月3月6月12月2015100264.563.763.664.32015110364.664.464.364.42015110462.962.662.662.6表5三批成品在25℃±2℃温度条件下cex-hplc结果(单位：％)成品批号0月1月2月3月6月2015100264.563.462.059.957.12015110364.664.062.261.157.22015110462.962.461.359.955.9三批成稳定性考察结果说明本发明公开的重组抗pd-l1全人单克隆抗体液体制剂具有稳定性好的优点，2～8℃温度条件下至少可稳定保存12个月，主峰纯度均≥50％，在25℃±2℃温度条件下至少可保存6个月，主峰纯度均≥50％，达到了本发明的目的。综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。<110>上海药明生物技术有限公司、无锡药明康德生物技术股份有限公司、苏州药明康德检测检验有限责任公司<120>重组抗pd-l1全人单克隆抗体的液体制剂<130>cpc-np-17-100475<160>56<170>patentinversion3.5<210>1<211>7<212>prt<213>智人<400>1ileargthrtyrtyrtrpgly15<210>2<211>21<212>dna<213>智人<400>2attagaacttactactggggc21<210>3<211>16<212>prt<213>智人<400>3tyriletyrtyrserglyserthrargtyrasnproserleulysser151015<210>4<211>48<212>dna<213>智人<400>4tatatctattatagtgggagcacccgctacaacccgtccctcaagagt48<210>5<211>7<212>prt<213>智人<400>5leusertyrphepheasptyr15<210>6<211>21<212>dna<213>智人<400>6cttagctacttctttgactac21<210>7<211>11<212>prt<213>智人<400>7serglyasplysleuglyasplystyralacys1510<210>8<211>33<212>dna<213>智人<400>8tctggagataaattgggggataaatatgcttgc33<210>9<211>7<212>prt<213>智人<400>9glnaspthrlysargproser15<210>10<211>21<212>dna<213>智人<400>10caagataccaagcggccctca21<210>11<211>9<212>prt<213>智人<400>11glnalatrpaspserglythrvalile15<210>12<211>27<212>dna<213>智人<400>12caggcgtgggacagcggcactgtgata27<210>13<211>5<212>prt<213>智人<400>13sertyralametser15<210>14<211>15<212>dna<213>智人<400>14agctatgccatgagt15<210>15<211>17<212>prt<213>智人<400>15glyileserglyserglyglyphethrtyrtyralaaspservallysgly151015<210>16<211>51<212>dna<213>智人<400>16ggtattagtggtagtggtggtttcacttactacgcagactccgtgaagggc51<210>17<211>12<212>prt<213>智人<400>15proproargglytyrasntyrglypropheasptyr1510<210>18<211>36<212>dna<213>智人<400>18cctcctcgtggatacaactatggcccttttgactac36<210>19<211>11<212>prt<213>智人<400>19glyglyasnasnileglyserlysservalhis1510<210>20<211>33<212>dna<213>智人<400>20gggggaaacaacattggaagtaaaagtgtacac33<210>21<211>7<212>prt<213>智人<400>21aspaspseraspargproser15<210>22<211>21<212>dna<213>智人<400>22gatgatagcgaccggccctca21<210>23<211>11<212>prt<213>智人<400>23glnvaltrpaspserserserasphisvalval1510<210>24<211>33<212>dna<213>智人<400>24caggtgtgggatagtagtagtgatcacgtggta33<210>25<211>7<212>prt<213>智人<400>25serileserasntyrtrpgly15<210>26<211>21<212>dna<213>智人<400>26agtattagtaactactggggc21<210>27<211>16<212>prt<213>智人<400>27seriletyrtyrserglyserthrasntyrasnproproleulysser151015<210>28<211>48<212>dna<213>智人<400>28agtatctattatagtgggagcacgaactacaatccgcccctcaagagt48<210>29<211>7<212>prt<213>智人<400>29leuthrtyrtyrpheasptyr15<210>30<211>21<212>dna<213>智人<400>30ctgacctactactttgattac21<210>31<211>11<212>prt<213>智人<400>31serglyasplysleuglyasplystyralacys1510<210>32<211>33<212>dna<213>智人<400>32tctggagataaattgggggataaatatgcttgc33<210>33<211>7<212>prt<213>智人<400>33glnaspserlysargproser15<210>34<211>21<212>dna<213>智人<400>34caagatagcaagcggccctca21<210>35<211>9<212>prt<213>智人<400>35glnthrtrpaspserserthrvalval15<210>36<211>27<212>dna<213>智人<400>36cagacgtgggacagcagcactgtggta27<210>37<211>5<212>prt<213>智人<400>37sertyralametser15<210>38<211>15<212>dna<213>智人<400>38agctatgccatgagt15<210>39<211>17<212>prt<213>智人<40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