野马追黄酮部位在制备抗乙肝病毒药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种野马追在制备抗乙肝病毒药物中的应用，更具体的说，涉及野马追的野马追乙醇提取物、野马追黄酮部位、野马追倍半萜部位、野马追70％乙醇水洗脱部位、链状二萜化合物在制备抗乙肝病毒药物中的应用。
背景技术：
：乙肝病毒(HBV)感染是影响人类健康的主要疾病之一，全世界大约有3亿人为慢性乙肝病毒携带者，中国是乙肝病毒携带者最多的国家，约有0.93亿人。急性乙肝易转变为慢性肝炎，甚至恶化为肝硬化和肝癌。目前国内用于治疗慢性病毒性肝炎的药物，主要为1、口服核苷(酸)类化学药物，如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦等，但容易产生耐药性；2、生物制剂，干扰素，如：常用的为干扰素α和聚乙二醇化干扰素α，但大多数病人在停药后有反跳现象，并且干扰素价格较贵(每一疗程约需2～4万元)，不能经胃肠道用药，使用不方便，长期用药易产生副作用，如：类似感冒症状的副作用和血小板减少等；3、传统中药，苦参素、齐墩果酸及其衍生物、植物多糖、五味子中化学成分等，临床医学实践和实验研究证明，中药在防治肝炎疾病上可以在一定程度上抑制肝炎病毒复制，尤其在改善病人症状和肝脏功能，增强机体免疫功能，并且植物药来源丰富，价廉易得，毒副作用小。(参见：李长恭,渠桂荣.天然产物研究与开发,2002,14(6):81-87；徐聪,曾苏.抗肝病毒药物的药物代谢动力学研究进展,中国药学杂志,2012,47(18):1430-1433)因此研究并开发出新的治疗乙肝病毒的中药具有及其重要的意义。野马追是菊科植物尖佩兰EupatoriumlindleyanumDC.的全草，江苏道地药材。味苦、性平，归肝、脾经，具有化痰止咳、清热解毒、利尿消肿、降压的功能，用于感冒、咳嗽多痰、头疼、扁桃体炎、菌痢和高血压(参见：国家中医药管理局，中华本草，上海:上海科技出版社,1999:7,6876)。野马追提取液具有对急性肺损伤大鼠保护作用，复方野马追胶囊体外对流感病毒有一定抑制作用，野马追糖浆浓缩液对革兰阳性和阴性菌及白色念珠球菌均具有一定的抗菌作用，野马追总黄酮提取液具有降低血粘度作用(参见：江舟,杨辉,何海霞,等.野马追对大鼠急性肺损伤保护作用研究。中国药房，2007，18(27)：2094；周远大，吴妍，等。野马追抗菌、止咳、平喘作用.中国药房，2001，12(12)：716-718；彭蕴茹，窦洁，黄芳，等.复方野马追胶囊抗流感病毒实验研究.中成药，2008，30(5)：650-654；王柯静,秦剑，陈万一，等。野马追改善高脂血症大鼠血液流变性及抗氧化作用研究。中药药理与临床，2009，25(2)：80-82。)但野马追是否具有抗乙肝病毒作用，未见报道，本发明发现其具有抗乙肝病毒的活性。技术实现要素：本发明目的是：提供一种野马追黄酮部位在制备抗乙肝病毒药物中的应用。本发明的技术方案是：野马追在制备抗乙肝病毒药物中的应用。所述野马追为野马追乙醇提取物，所述乙醇提取物采取下述方法得到：取野马追干燥全草，切段2～3cm，加8～15倍体积的体积分数为60％～95％乙醇水溶液，回流提取1～3小时，重复1～3次，40℃～60℃减压回收溶剂，得野马追乙醇提取物。所述野马追为含有棕矢车菊素和泽兰叶黄素的野马追黄酮部位，其化学结构式分别为：所述野马追为含有野马追内酯F、野马追内酯G、野马追内酯H、野马追内酯I和野马追内酯K的野马追倍半萜部位；其化学结构式如下：所述野马追为野马追70％乙醇水洗脱部位，其采取下述方法制备得到：取野马追干燥全草，切段2～3cm，加8～15倍体积的体积分数为60％～95％乙醇水溶液，回流提取1～3小时，重复1～3次，40℃～60℃减压回收溶剂，得野马追乙醇提取物；将该提取物溶于水中，制备成浓度为0.5～1g/ml的溶液，经弱极性大孔吸附树脂吸附，先以水洗脱除去大分子化合物，然后用体积分数为90％～95％乙醇水溶液洗脱，40℃～60℃减压回收溶剂得大孔树脂部位；所得大孔树脂部位经ODS反相硅胶色谱柱吸附，先以体积分数为50％甲醇水溶液洗脱，然后用70％～75％甲醇水溶液洗脱，40℃～60℃减压回收溶剂后，再经30～60目聚酰胺色谱柱吸附，以体积分数为70％乙醇水溶液洗脱，得野马追70％乙醇水部位。进一步，优选的，所述弱极性大孔吸附树脂为AB-8、D101、HPD-100、HPD-200A、HPD-200B、HPD-300、HPD-700或HPD-722大孔吸附树脂；进一步，优选的，所述ODS反相硅胶色谱柱为DAISOGELODS反相硅胶填料粒径50～70um、CosmsilODS反相硅胶填料粒径50～70um或YMCODS-A反相硅胶填料粒径50～70um；更进一步，优选的，所述水与弱极性大孔吸附树脂体积比为8～15:1；所述90％～95％乙醇水溶液与大孔吸附树脂体积比为8～15:1；所述ODS反相硅胶色谱柱柱体积与所得大孔树脂部位质量比为20～30:1；所述50％甲醇水溶液和70％～75％甲醇水溶液与ODS反相硅胶色谱柱的体积比均为5～8:1；所述聚酰胺色谱柱柱体积与吸附样品的质量比为20～30:1；所述70％乙醇水溶液与聚酰胺色谱柱体积比为4～10:1。所述野马追为野马追中链状二萜化合物，选自(1)3-(hydroxymethyl)-1，14，15-trihydroxy-7，11，15-trimethyl-2，6，10-hexadecatrien-13-acetat和(2)3-(hydroxymethyl)-1，13，15-trihydroxy-7，11，15-trimethyl-2，6，10-hexadecatrien-14-acetate，其化合物结构式分别为：本发明对上述四种提取物与两个链状二萜化合物进行体外抗乙肝病毒HBV实验，得出其均对乙肝表面抗原HBsAg及乙肝核心抗原HBeAg均具有显著的抑制作用，表明所述提取物具有显著抗乙肝病毒HBV作用，可用于制备抗乙肝病毒的药物。本发明的优点是为抗乙肝病毒药物提供了新来源。附图说明下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：图1为实施例2中野马追倍半萜部位高效液相色谱图；图2为实施例2中对照品野马追内酯F高效液相色谱图；图3为实施例2中对照品野马追内酯G高效液相色谱图；图4为实施例2中对照品野马追内酯H高效液相色谱图；图5为实施例2中对照品野马追内酯I高效液相色谱图；图6为实施例2中对照品野马追内酯K高效液相色谱图；图7为实施例2中野马追黄酮部位高效液相色谱图；图8为实施例2中对照品泽兰叶黄素高效液相色谱图；图9为实施例2中对照品棕矢车菊素高效液相色谱图；具体实施方式以下结合实施例对本发明应用进一步说明。实施例1：四组野马追提取物及野马追中链状二萜化合物的制备(1)称取1000g野马追干燥全草，切段2～3cm，加15倍体积的体积分数为80％乙醇水溶液，回流提取2小时，重复2次，60℃减压回收溶剂，得野马追乙醇提取物(EUP-EtOH)158g，溶于约150ml水中，经1800mlAB-8大孔吸附树脂吸附，先以20000ml水洗脱除去大分子化合物，后用20000ml体积分数95％乙醇水溶液洗脱，60℃减压回收溶剂，得61g大孔树脂部位；所得大孔树脂部位经1500mlCosmsilODS反相硅胶填料粒径70um反相硅胶色谱柱吸附，以10000ml体积分数为50％甲醇水溶液洗脱，60℃减压回收溶剂，得野马追倍半萜部位(EUP-SQT)21g。然后10000ml70％甲醇水溶液洗脱，60℃减压回收溶剂，得20g提取物，该提取物再经600ml30～60目聚酰胺色谱柱吸附，先以4000ml70％乙醇水溶液洗脱，60℃减压回收溶剂，得野马追70％乙醇水洗脱部分(EUP-DIT)14.7g。后用4000ml100％乙醇洗脱，60℃减压回收溶剂，得野马追黄酮部位(EUP-FLA)2.8g。(2)野马追中链状二萜化合物的制备：干燥野马追药材2000g，以10倍药材体积的80％乙醇-水，回流提取2次，每次2小时，合并滤液，减压回收乙醇，得浸膏250g；将浸膏溶解在100mL水中，经100mL石油醚萃取脱脂，再以氯仿萃取两次，每次100mL，30℃减压浓缩氯仿萃取层，得氯仿部分约11g；氯仿部分经300g硅胶柱层析，用氯仿-甲醇100:2洗脱，得到洗脱部分1.08g。对其采用200mL罗门哈斯树脂柱层析，以60％-80％甲醇-水系统进行洗脱，收集80％甲醇洗脱部分0.5g，后继续经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇(50:1)进行洗脱得到2a部分112mg，对2a采用高效液相法进行制备，北京慧德易ILC-P3050制备色谱仪，色谱柱YMC-PackODS-Acolumn(250mm￡20mm,YMC,Kyoto,Japan)，检测波长210nm，以70％甲醇-水系统进行洗脱，流速5mL/min，38.5min分离得到化合物(a)31mg，42.8min分离得到化合物(b)26mg。实施例2：野马追倍半萜部位、野马追黄酮部位以及野马追中链状二萜化合物活性成分的检测(1)野马追倍半萜部位(EUP-SQT)活性成分检测：本实施例中采用高效液相色谱分析法测定其成分。高效液相色谱仪(Agilent1260Infinity，美国安捷伦公司)，其中流动相A为乙腈；流动相B为水；流动相条件见表1。色谱柱：YMC-PACKODS-A(Ф4.6mm×250mm,5μm)；柱温：28℃；检测波长：210nm；进样量：20μl；流速：1ml·min-1。表1HPLC色谱分析条件时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0307053070153268253664403664分别精密称取对照品eupalinolideF(野马追内酯F)6.02mg、eupalinolideG(野马追内酯G)14.94mg、eupalinolideH(野马追内酯H)5.08mg、eupalinolideI(野马追内酯I)10.04mg、eupalinolideK(野马追内酯K)13.98mg，用流动相A定容至10ml，作为储备液。加流动相A对倍稀释配成1:2、1:4、1:8、1:16和1:32，0.22μm滤膜过滤，滤液备用。取5个浓度的对照品进行色谱的测定，并绘制标准曲线，每个浓度点平行分析3次。记录各色谱峰峰面积，以对照品峰面积(y)对其浓度(x)进行线性回归，得到对照品的标准曲线，eupalinolideF，y＝63403x-15.408；eupalinolideG，y＝24720x-20.065；eupalinolideH，y＝79063x+6.7811；eupalinolideI，y＝239018x+53.303；eupalinolideK，y＝7913.5x+62.857。精密称取实施例1中制备的野马追倍半萜部位EUP-SQT6mg，并用流动相A定容至10ml容量瓶，0.22μm滤膜过滤，滤液备用，分别取滤液进行色谱测定。图1-6为野马追倍半萜部位(EUP-SQT)样品、对照品eupalinolideF、eupalinolideG、eupalinolideH、eupalinolideI以及eupalinolideK高效液相色谱图。通过对高效液相色谱结果的分析，可以得出野马追倍半萜部位(EUP-SQT)样品中含有eupalinolideF(野马追内酯F)、eupalinolideG(野马追内酯G)、eupalinolideH(野马追内酯H)、eupalinolideI(野马追内酯I)和eupalinolideK(野马追内酯K)成分，将样品色谱信号值代入标准曲线，进一步得出各组分的具体含量，其具体含量如表2所示。表2野马追倍半萜部位(EUP-SQT)样品中5种野马追内酯含量样品eupalinolideFeupalinolideGeupalinolideHeupalinolideIeupalinolideK比例含量4.1％31.8％6.8％3.4％47.7％93.8％(2)野马追黄酮部位(EUP-FLA)活性成分检测：方法同野马追倍半萜部位活性成分的检测。高效液相色谱条件为：流动相A为乙腈(含0.1％甲酸)；流动相B为水(含0.1％甲酸)；流动相条件：见表3；色谱柱：YMC-PACKODS-A(Ф4.6mm×250mm,5μm)；柱温：28℃；检测波长：365nm；进样量：20μl；流速：1ml·min-1。表3HPLC色谱分析条件时间(min)流动相A(％)流动相B(％)03664153664309010分别精密称取对照品泽兰叶黄素4.67mg和棕矢车菊素8.17mg；并用流动相A定容至10ml，作为储备液，加流动相A对倍稀释配成1:2、1:4、1:8、1:16和1:32，用0.22μm滤膜过滤，滤液备用。取5个浓度的对照品进行色谱的测定，并绘制标准曲线，每个浓度点平行分析3次。记录各色谱峰峰面积，以对照品峰面积(y)对其浓度(x)进行线性回归，得到对照品的标准曲线，泽兰叶黄素y＝52964x+19.30，棕矢车菊素y＝55161x+210.79。精密称取实施例1中制备的野马追黄酮部位EUP-FLA样品6mg，并用流动相A定容至10ml容量瓶，0.22μm滤膜过滤，滤液备用，分别取滤液进行色谱测定。图7-9为野马追黄酮部位样品、对照品泽兰叶黄素、对照品棕矢车菊素的高效液相色谱图。经过高效液相色谱分析方法分析得出野马追黄酮部位样品中含有泽兰叶黄素和棕矢车菊素，将样品的色谱信号值代入标准曲线，进一步得出各组分的具体含量，如表4所示。表4野马追黄酮部位中2种黄酮的含量样品泽兰叶黄素棕矢车菊素总比例含量26.0％66.1％92.1％(3)野马追中链状二萜化合物活性成分的检测：取上述实施例1中制备得到的化合物(a)和化合物(b)进行波谱测定，其波谱数据如下：化合物(a)无色油状，红外光谱IR(KBr)显示νmax：3424，2974，2930，1717，1653，1373，1258，1024cm-1；HR-ESI-MS给出分子离子峰m/z421.2568[M+Na]+(calcdforC22H38O6Na，421.2561)，表明其分子式为C22H38O6。其1HNMR和13CNMR谱在CDCl3中测定。结果如表1所示；化合物(b)无色油状，红外光谱IR(KBr)显示νmax：3402，2972，2932，1653，1576，1418，1051，1015cm-1；HR-ESI-MS给出分子离子峰值m/z421.2565[M+Na]+(calcd.forC22H38O6Na，421.2561)，表明其分子式为C22H38O6。其1HNMR和13CNMR谱在CDCl3中测定。结果如表5所示，表5化合物(a)、(b)的1HNMR和13CNMR波谱数据其中，1HNMR和13CNMR分别采用400MHz和125MHz。通过化合物的红外光谱、HR-ESI-MS、1HNMR和13CNMR谱的数据分析，与文献(参见：ShuangqingWu,NaiyuXu,JianZhang*,ShiYao,ChunjunChu.ThreenewacyclicditerpenoidsfromEupatoriumlindleyanumDC..JournalofAsianNaturalProductResearch.2012,14(7):652-656.)相比较，波谱数据一致，结果表明：化合物(a)即为化合物(1)：3-(hydroxymethyl)-1，14，15-trihydroxy-7，11，15-trimethyl-2，6，10-hexadecatrien-13-acetat，其化合物结构式为：化合物(b)即为化合物(2)：3-(hydroxymethyl)-1，13，15-trihydroxy-7，11，15-trimethyl-2，6，10-hexadecatrien-14-acetate，其化合物结构式为：实施例3：四种野马追提取物与野马追中链状二萜化合物外抗乙肝病毒HBV实验1、实验药品与试剂：上述实施例1制备链状二萜化合物(1)和(2)；二甲基亚砜；MTT(噻唑蓝)，上海江莱生物科技有限公司；对照药品，拉米呋啶片(3TC)；葛兰素史克制药(苏州)有限公司；细胞培养基DMEM，生长液，配制，其中含10％胎牛血清，380μg/mlG418，0.03％谷胺酰胺，青霉素、链霉素各100μg/ml等；2、实验器材：检测乙肝表面抗原HBsAg和乙肝核心抗原HBeAg的ELISA试剂盒；孵箱；24孔板等。3、细胞株：HepG2的2.2.15细胞株，教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海。4、实验方法：取HepG2的2.2.15细胞株，以每孔10×105个细胞接种于24孔板，在5％CO2孵箱中37℃培养，48小时后，分别将生长液换成二甲基亚砜助溶的含化合物(1)和化合物(2)的药物培养液，每组药物培养液设置5个浓度12.5μg/ml～200μg/ml(如表2所示)，每个浓度设4个平行孔，继续培养9天，每3天换液一次。阳性对照组药物为拉米呋啶(3TC)，同时以不含药物的培养液作为空白对照组，两个对照组各设置1孔，除生长液相应的换成拉米呋啶药物与不含药物的培养液外，两对照组与药物培养液的操作相同。收集上清液用ELISA试剂盒检测HBsAg及HBeAg含量，同时用MTT测定上述两组化合物不同浓度药物对细胞的毒性。其结果如表6。野马追乙醇提取物、野马追黄酮部位、野马追倍半萜部位、野马追70％乙醇水洗脱部位分别重复上述实验步骤，得到如表6所示结果。由表6可以看出，链状二萜化合物(1)和化合物(2)对乙肝表面抗原HBsAg和乙肝核心抗原HBeAg均具有抑制作用。化合物(1)和(2)对HBsAg、HBeAg的抑制，随着浓度的增加，抑制率增加；化合物(1)在50μg/mL时，对HBsAg、HBeAg的抑制率明显高于3TC；化合物(2)与3TC在相同浓度下，化合物(2)对HBsAg、HBeAg的抑制率明显高于3TC；与3TC相比，低浓度的化合物(1)和(2)对HBsAg、HBeAg的具有高抑制率。野马追乙醇提取物、野马追黄酮部位、野马追倍半萜部位、野马追70％乙醇洗脱部位对HBsAg、HBeAg的抑制，随着浓度的增加，抑制率增加；与3TC相比，低浓度的野马追乙醇提取物、野马追黄酮部位、野马追倍半萜部位、野马追70％乙醇洗脱部位对乙肝表面抗原HBsAg和乙肝核心抗原HBeAg均具有高抑制作用。表6四组野马追提取物及两组链状二萜化合物的抗乙肝病毒测试结果其中，+：“显示毒性”指细胞存活率＜75％；/：没有进行抑制率测试。通过上述实施例可以得到，从野马追中提取野马追乙醇提取物、野马追黄酮部位、野马追倍半萜部位、野马追70％乙醇水洗脱部位以及两种链状二萜化合物制备的药物，在体外抗乙肝病毒HBV实验中，表现出对乙肝表面抗原HBsAg和乙肝核心抗原HBeAg显著的抑制效果，与治疗乙肝的临床药物拉米呋啶(3TC)相比具有更好的药物活性。因此本发明所述的野马追中提取的野马追乙醇提取物、野马追黄酮部位、野马追倍半萜部位、野马追70％乙醇水洗脱部位以及两种链状二萜化合物可用于制备抗乙肝病毒的药物。当前第1页1 2 3