以细胞核内组织蛋白酶L为靶点的灵芝酮二醇在制药中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及一种灵芝酮二醇在抗大肠癌中的应用。

背景技术：

大肠癌包括结肠癌和直肠癌，指的是发生在盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠的恶性肿瘤，是最常见的消化道恶性肿瘤之一。世界卫生组织最新数据显示大肠癌死亡人数位于癌症死亡人数第三位，每年全球有超过120万名患者被确诊为大肠癌，而有超过70万名患者直接或间接死于大肠癌。其在各地区的发病率有显著差异，通常男性大肠癌的发病率高于女性。此外，大肠癌的发病率会随着年龄的增大而增加。大肠癌在中国也是最常见的恶性肿瘤之一，在2012年诊断的全球136万例大肠癌中，中国的新发病例数达到25万例，占全球大肠癌新发病例的18.6％，是全球大肠癌每年新发病例最多的国家。

大肠癌起源于大肠粘膜上皮或粘膜下间叶组织，其分子发病机制是遗传或环境因素所致的基因突变。有流行病学研究发现：社会发展状况、生活方式及膳食结构与大肠癌密切相关。目前大肠癌的治疗是以手术切除为主，结合放疗、化疗或靶向治疗的综合治疗。术后5年生存率与大肠癌病理分期密切相关，早期大肠癌术后5年生存率可达80％以上，而中晚期者仅为40％-10％。化学治疗的主要目的是防止和减少复发与转移，从而提高手术治疗的远期疗效，可分为手术前、手术中及术后化疗。现阶段主要的化疗药物以5-氟脲嘧啶(5-fu)为主，还包括有亚叶酸钙(lv)、卡培他滨、奥沙利铂、伊力替康及生物靶向治疗药贝伐珠单抗等。5-fu对大肠癌的有效率仅为20％左右，联合用药方案可提高一定的有效率。目前抗大肠癌化疗药物的弱点是有效率不高，选择性低，毒副作用大。如联用5-fu及lv治疗晚期大肠癌的化疗方案会造成胃肠道反应及骨髓抑制等毒副作用，使用奥沙利铂会造成神经系统毒性，使用伊力替康联合5-fu及lv的治疗晚期大肠癌标准方案会引起胆碱能综合症及迟发性腹泻等。以阻断血管内皮生长因子(vegf)或表皮生长因子(egf)的生物活性为靶点的单克隆抗体类药物除了毒性问题外，还存在因下游信号通路分子发生突变而失效的威胁。寻找新的药物靶点及开发高效率低毒副作用的抗大肠癌药物，在这个领域依然是非常迫切的需要。

组织蛋白酶l(cathepsinl，cl)是半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，大小为333个氨基酸，广泛存在于人体各种正常组织和肿瘤细胞中，是溶酶体的主要分泌蛋白。它的主要功能是降解蛋白，水解某些前体蛋白(酶原和激素原)生成其活性形式，或激活其他蛋白水解酶系统，从而参与机体的多种生理活动。如：抗原的递呈、精子和卵子的发生、骨基质的降解、中枢神经系统的成熟和发育等。病理状态下，由于转录、翻译、修饰、定位、成熟、ph变化和与抑制剂间相互作用的异常而广泛参与多种疾病发生发展，如肿瘤的浸润与转移、关节炎、骨质疏松、阿尔茨海姆病、多发性硬化症及其他慢性炎症性疾病等。近年来国内外许多学者对cl进行了研究，发现其在前列腺癌、黑色素瘤、胃癌、大肠癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中呈现高表达。

研究发现cl在细胞内存在多种不同的形式，并且发现cl可以进入细胞核内通过切割核转录因子cux1前体增强cux1的dna结合能力从而促进细胞的细胞周期进程。也有研究发现大肠癌细胞的细胞周期进程依赖细胞核内的cl酶活性。在一项涉及186位大肠癌病人的组织切片的研究中发现，大肠癌细胞核内的cl水平与大肠癌的进程和愈后呈正相关。尽管这些现象提示细胞核内的cl与大肠癌密切相关，以细胞核内cl为靶点的抗大肠癌药物尚未见报道。因此，发现大肠细胞核内cl抑制剂对大肠癌高选择性治疗新药的开发具有显著意义。

灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，是中医药珍品，在我国有着悠久药用历史。灵芝酮二醇(ganodermanondiol,gmd)是从灵芝子实体分离得到的一种三萜化合物，其抗大肠癌的活性未见报道。多年前曾有研究利用mtt法在基因微卫星稳定(mss)型结肠癌细胞sw480和sw1116细胞上进行灵芝酮二醇抗大肠癌活性研究，但并没发现灵芝酮二醇具有明显活性。在我们的研究中，我们使用更灵敏和稳定的cck-8细胞毒性与增殖检测法对包括基因微卫星不稳定(msi)型的大肠癌细胞hct116进抗大肠癌活性研究及作用靶点分析发现，灵芝酮二醇对大肠癌细胞具有非常显著的抑制作用，且证据表明其发挥作用的机理是通过特异性靶向大肠癌细胞核内的组织蛋白酶cl从而抑制癌细胞的细胞周期达到抗癌效果。这个发现对于进一步研发具有克服已有药物特异性不高及毒副作用大缺点潜力的抗大肠癌新药具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供一种灵芝酮二醇在制备预防或治疗与大肠癌相关的疾病的药物中的应用，优选地可用于直肠癌、结肠癌、以及由直肠癌或结肠癌引起的便秘、便血、腹痛、腹部痉挛、肠癌细胞浸润及转移等多种相关疾病。

进一步地，本发明还提供一种用于预防或治疗与大肠癌相关的疾病的药物组合物，其包含灵芝酮二醇或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的载体和/或稀释剂，其中灵芝酮二醇或其药学上可接受的盐抑制大肠癌细胞的ic50低于10μm，优选低于2.5μm。

本发明的药物组合物可以作为口服或非肠道给药(例如经静脉内、皮下或肌肉内给药)的制剂形式。所述的口服给药的制剂形式为片剂、缓释片、控释片、锭剂、硬或软胶囊、水性或油混悬剂、乳剂、可分散的散剂或颗粒剂、糖浆剂或酏剂、滴丸、微丸或口服溶液，所述的非肠道给药的制剂形式为灭菌的水性或油性溶液、无菌粉末、脂质体、乳剂、微乳剂、纳米乳剂或微囊。

本发明的药物组合物可以通过常规方法，利用本领域熟知的常规药物赋形剂来获得。所以，用于口服使用的组合物可以含有例如一种或多种着色剂、甜味剂、矫味剂和/或防腐剂。

用于片剂制剂的适宜的可药用赋形剂包括例如，惰性稀释剂例如乳糖、碳酸钠、磷酸钙或碳酸钙；制粒和崩解剂例如玉米淀粉和藻酸；粘合剂例如淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉；防腐剂例如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯，和抗氧剂，例如抗坏血酸。片剂制剂可以是未包衣的，也可以采用包衣以改变其崩解作用以及活性成分在胃肠道内的后续吸收作用，或改进其稳定性和/或外观，在任意情况中，均可使用该领域熟知的常规包衣剂和方法。

口服使用的组合物可以是硬明胶胶囊的形式，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或是软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

水性混悬剂一般含有微粉形式的活性成分和一种或多种助悬剂，所述助悬剂例如为羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯-吡咯烷酮、西黄蓍胶和阿拉伯胶；分散或湿润剂，例如卵磷脂或烯基氧化物与脂肪酸的缩合物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如十七氧化亚乙基鲸蜡醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸与己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。水性混悬剂还可含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或丙酯)、抗氧剂(例如抗坏血酸)、着色剂、矫味剂、和/或甜味剂(例如蔗糖，糖精和天冬酰苯丙氨酸甲酯)。

可通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中来配制油性混悬剂。油性混悬剂也可含有增稠剂例如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可以加入如上所述的甜味剂和矫味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧剂例如抗坏血酸来防腐。

适合通过加入水制成水性混悬剂的可分散的散剂和颗粒剂一般含有活性成分和分散剂或湿润剂、助悬剂和一种或多种防腐剂。适当的分散或湿润剂和助悬剂如上所述。也存在另外的赋形剂例如甜味剂、矫味剂和着色剂。

本发明药物组合物也可以采用水包油的乳剂的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，或者矿物油，例如液体石蜡或者它们的混合物。适当的乳化剂可以是例如，天然树胶例如阿拉伯胶或西黄芪胶，天然磷脂例如大豆卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脱水山梨糖醇一油酸酯)，以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧化乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯。乳剂也可含有甜味剂、矫味剂和防腐剂。

糖浆剂和酏剂可与甜味剂(例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、阿司帕坦或蔗糖)配制，并且也可含有缓和剂、防腐剂、矫味剂和/或着色剂。

所述药物组合物还可以是注射用无菌水性或油性混悬剂的形式，其可以按照已知方法利用一种或多种适宜的分散或湿润剂和助悬剂来配制，这些试剂如上所述。无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的注射用无菌水性或油性混悬剂，例如在1，3-丁二醇中的溶液。

可以根据被治疗宿主和具体给药途径的不同，来确定与一种或多种赋形剂混合以制备单一剂量形式活性成分的量。例如，用于对人口服给药的制剂一般含有例如0.5mg-2g的活性剂以及适当的和常规量的赋形剂(约占组合物总重的5-98％)。单位制剂中一般约含有1mg-500mg的活性成分。

本发明所述的灵芝酮二醇用于制备疗或预防大肠癌的用途时，对于癌症细胞株的有效剂量为0.01-10μm，进一步优选的为0.8-5μm。

本发明所述灵芝酮二醇可应用于单独治疗中，或者与一种或多种其他物质和/或适应症治疗联合。这样的联合治疗是可以通过各个治疗组分的同时、顺序或分开施用的方式达到的。同时治疗可以采用单一片剂或采用分开的片剂形式。例如，在大肠癌的治疗中，还可以包括下列主要种类的治疗：抗肿瘤剂，免疫增强剂。

附图说明

图1灵芝酮二醇结构图；

图2灵芝酮二醇(gmd)进行体外抑制癌细胞生长活性评价；

图3灵芝酮二醇(gmd)使大肠癌细胞周期停滞于s期；

图4基因芯片分析灵芝酮二醇(gmd)处理后大肠癌细胞基因表达变化情况图；

图5灵芝酮二醇(gmd)抑制组织蛋白酶l(cathepsinl)的活性效果；

图6不同细胞核内组织蛋白酶l(cathepsinl)表达水平；

图7灵芝酮二醇(gmd)降低大肠细胞核内的截短cux1转录因子表达的水平。

具体实施方式

实施例1：基于细胞生长检测的抗大肠癌活性实验及细胞毒性实验

1.1实验对象：大肠癌(hct116细胞株、caco2细胞株)、乳腺癌(mcf-7细胞株)、肺癌(hlc-1细胞株)、肝癌(hepg2细胞株)、胃癌(hgc-27细胞株)、前列腺癌(lncap细胞株)、子宫癌(hela细胞株)和白血病(hl60细胞株)、4种人类正常细胞(正常皮肤纤维细胞nhdf,正常脐带细胞huc-f2,肺正常纤维细胞tig-1,肺纤维细胞hf19)。

1.2实验药物：灵芝酮二醇(购自湖北省武汉市chemfaces有限公司，hplc≥98％)。

1.3实验试剂及设备：cck-8试剂盒(购自日本同仁化工),5-氟脲嘧啶(5-fu,购自美国invivogen公司),超级酶标仪(md,flexstation3)。

1.4实验方法：各种细胞以1×10⁴个/每孔的密度接种于96孔细胞培养板内，待过夜培养细胞长成单层后加入用细胞培养基梯度稀释的灵芝二酮醇溶液，同时实验设置阳性药物(5-fu)对照组，正常细胞对照组和样品毒性对照组。培养板在37℃培养3天后，使用cck8细胞增殖与毒性检测方法对细胞的增殖和毒性进行检测，所用检测设备为美国md公司的超级酶标仪(flexstation3)。然后利用软件spss的probitregression功能计算半数抑制浓度(ic50)。样品的选择指数(si)最终通过公式ic50(癌细胞)/ic50(正常细胞)确定。

结果表明，灵芝酮二醇对大肠癌细胞hct116及caco2的ic50分别为0.78±0.5μm及2.25±2.0μm，远低于乳腺癌细胞的72.08μm及其它癌细胞与正常细胞的大于200μm，表现出显著的选择性抑制大肠癌细胞的活性(图2)。

实施例2：对大肠癌细胞凋亡及细胞周期影响实验：

2.1实验对象：大肠癌hct116细胞株。

2.2实验药物：灵芝酮二醇(购自湖北省武汉市chemfaces有限公司，hplc≥98％)，灵芝马酮(购自湖北省武汉市chemfaces有限公司，hplc≥98％)，胸苷(购自南京森贝伽生物科技有限公司)。

2.3实验试剂及设备：荧光染料pi(碘化丙啶，购自深圳莱伯生物科技有限公司)，细胞凋亡annexinv-fitc试剂盒(购自英国abcam有限公司)，流式细胞仪sh800(日本sony)。

2.4实验方法：大肠癌细胞hct116以3×10⁵个/孔的密度接种于6孔板内，过夜培养长成细胞单层后将含10％胎牛血清的培养液更换为含1％胎牛血清的培养液。低血清培养液培养16h后，细胞被加入100μm的样品溶液，结构类似但无明显抑制大肠癌细胞增殖活性的三萜化合物灵芝马酮(ganodermanontriol,gmt)与及细胞s周期阻断剂胸苷(thymidine)分别作为阴性及阳性对照。37℃继续培养，分别于24h、48h和72h后收集细胞，经乙醇固定后进行pi染色，最后通过流式细胞仪进细胞周期检测。对于细胞凋亡效果实验，使用annexinv-fitc试剂进行检测。

结果显示，gmd对大肠癌细胞的凋亡没有显著影响，但可以使大肠癌细胞的细胞周停滞于s期，从而抑制其生长(图3)。

实施例3：基因芯片分析实验：

3.1实验对象：大肠癌hct116细胞株。

3.2实验药物：灵芝酮二醇(购自湖北省武汉市chemfaces有限公司，hplc≥98％)，灵芝马酮(购自湖北省武汉市chemfaces有限公司，hplc≥98％)。

3.3实验试剂及设备：agilent人表达谱基因芯片sureprintg3humangemicroarray8x60kv2.0(购自美国agilent公司)，rna提取试剂盒(购自美国invivogen公司)。

3.4实验方法：hct116细胞首先接种于10cm直径培养皿内并培养至细胞单层覆盖90％的表面，然后加入100μm灵芝酮二醇(gmd)，同时设溶剂dmso溶剂对照组及灵芝马酮(gmt)阴性对照组。37℃培养48h后，收集细胞并提取rna，然后使用agilent人表达谱基因芯片进行人类基因组表达谱分析(日本cellinnovator公司)。

结果显示gmd下调大肠癌细胞的细胞周期蛋白cycline2的表达，进一步证实了gmd通过调节细胞周期抑制大肠癌细胞的增殖(图4)。

实施例4：抑制细胞组织蛋白酶l(cathepsinl，cl)活性实验：

4.1实验材料灵芝酮二醇及其它三萜类化合物(购自湖北省武汉市chemfaces有限公司，hplc≥98％)，组织蛋白酶l抑制剂筛选试剂盒(购自美国biovision公司)，超级酶标仪(md,flexstation3)。

4.2实验方法：使用商业化试剂盒对灵芝酮二醇进行细胞组织蛋白酶l酶活性抑制实验。在96-孔细胞培养板的每个孔内依次加入49μl的分析缓冲液(试剂盒自带)、1μl(0.2mu/μl)细胞组织蛋白酶l以及1μldtt,充分混合配成酶反应溶液。然后使用分析缓冲液稀释各个待分析样品，并以每孔10μl的量加入到酶反应溶液中，混匀，室温反应15分钟。实验设置阳性及阴性对照组，每个浓度6个复孔。室温反应结束后，每孔加入40μl稀释好的底物溶液并混匀。最后，在超级酶标仪上进行37℃，30分钟的动态荧光信号检测，所用波长为ex/em＝400/500nm。

结果显示，灵芝酮二醇可以显著抑制细胞组织蛋白酶l活性，ic50值为15.56μm，较其它三萜化合物效果明显(图5)。

实施例5：确认大肠癌细胞核内细胞组织蛋白酶l(cathepsinl，cl)的表达实验

5.1实验对象：大肠癌细胞hct116、caco2,乳腺癌细胞(mcf-7)，宫颈癌细胞(hela)，正常人成纤维细胞hfli及正常大肠细胞ccd841。

5.2实验试剂：兔抗cathepsinl单克隆抗体(ab58991,购自英国abcam有限公司)，fitc标记的羊抗兔iggh&l单克隆抗体(ab6717,购自英国abcam有限公司),核染料hoechst33528(购自美国mce公司)，激光共聚焦显微镜(德国徕卡leicatcssp8sted)。

5.3实验方法：细胞以0.5×10⁴个/孔的密度接种至96孔细胞培养板并以含1％胎牛血清的细胞培养液进行培养，24小时后更换为含有10％胎牛血清的细胞培养液并继续培养24小时。然后培养液被移去，细胞用pbs洗一遍后使用预冷的甲醇进行固定(100μl/孔)，室温5分钟。固定后，移去甲醇并用pbs洗涤细胞三次，每次5分钟。然后，每孔加入100μl含0.25％tritox-100的细胞穿透液，室温处理10分钟。pbs洗涤三次后，使用含10％山羊血清和0.1％吐温20的pbs溶液进行封闭，室温30分钟。封闭后加入一抗兔抗cathepsinl单克隆抗体(1/100稀释)并于4℃孵育过夜。pbst洗涤三次后加入二抗hrp标记的羊抗兔iggh&l单克隆抗体(1/250稀释)，室温避光孵育1小时。pbst洗涤三次后，进行hoechst核染色(0.2μg/ml)，室温染色10分钟。最后，移去染色液pbs洗涤后进行激光共聚焦荧光显微镜观察和拍照(fitc:ex/em＝495/528nm，hoechst:ex/em＝352/461nm),并使用软件(cellprofiler)对图片进行处理分析计算出各种细胞的细胞核内和核外的cl表达水平的比例。

结果显示，大肠癌细胞及正常大肠细胞的核内cl表达水平都比其它细胞的高(图6)。

实施例6：减少细胞核内cl下游的截短cux1转录因子水平的实验

细胞核内的组织蛋白酶cl可以通过对cux1进行切割产生活化的截短cux1，然后调节细胞周期蛋白cycline2以促进细胞周期进程。为了进一步证实细胞核内cl是灵芝酮二醇的作用靶点，对其进行测试。

6.1实验对象：大肠癌细胞hct116、正常大肠细胞ccd841。

6.2实验药物：灵芝酮二醇(购自湖北省武汉市chemfaces有限公司，hplc≥98％)。

6.3实验试剂：兔抗cux1单克隆抗体(pa5-25788，购自美国invitrogen有限公司)，兔抗hdac1单克隆抗体(ab32103,购自英国abcam有限公司),hrp标记的羊抗兔iggh&l单克隆抗体(ab6721,购自英国abcam有限公司)，亚细胞蛋白组抽提试剂盒(购自美国emdbiosciences公司)，ecl化学发光底物(购自美国thermo公司)。

6.4实验方法：细胞培养于10cm直径培养皿内，待长成单层后加入不同浓度的灵芝酮二醇(gmd),同时药物溶剂(dmso)对照组。继续培养48小时后，收集细胞，使用emd试剂盒进行亚细胞蛋白组组分分离，获得细胞核和细胞质蛋白组样品。对该亚蛋白组样品进行sds-page电泳，然后westernblotting分析，转膜后使用5％牛奶溶液进行封闭，然后分别进行抗cux1抗体或抗hdac1抗体的孵育。最后经洗涤后上二抗并使用ecl底物进行检测。

结果显示，50μm的gmd处理就可以显著降低大肠癌或大肠正常细胞内截短cux1的水平，间接证实了细胞核内的组织蛋白酶cl是gmd靶标分子的事实(图7)。

从体外抗癌细胞增殖实验及细胞凋亡与细胞周期实验结果看，灵芝酮二醇可以特异地抑制大肠癌细胞的增殖，可以把大肠癌细胞的细胞周期阻滞于s期。作用机制分析表明细胞核内的组织蛋白酶l(cl)是其作用靶点，gmd通过抑制大肠癌细胞核内cl活性从而减少截短的cux1因子(活化形式)，然后下调细胞周期蛋白cycline2的表达，最终使大肠癌细胞停留在细胞周期s期，从而实现抑制癌细胞生长的效果。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。