肿瘤治疗中肿瘤抑制基因治疗与化学治疗的联合应用的制作方法

专利名称：肿瘤治疗中肿瘤抑制基因治疗与化学治疗的联合应用的制作方法
技术领域：
本发明的领域本发明描述了对患有过度增殖性疾病如肿瘤或转移性疾病的个体进行治疗的新方法。尤其是，本发明提供了抑制细胞，特别是肿瘤细胞的过度增殖的方法，包括肿瘤抑制基因或基因产物与辅助抗癌剂的联合应用。
本发明的背景染色体异常通常与遗传学疾病，衰退性疾病，以及癌症相关。尤其是，癌症中常常发生整个染色体或染色体的片段的缺失或重复，以及基因组的特定区域的高水平扩增。例如参见Smith(1991)乳腺癌研究治疗，18增刊15-14；van de Viler(1991)Became.Beefiest.Acta.107233-50，Sato(1990)癌症研究，507184-7189。实际上，含有原癌基因的DNA序列的扩增和含有肿瘤抑制基因的DNA序列的缺失，都是肿瘤发生的常见特征。Dutrillaux(1990)，癌症遗传学与细胞遗传学，49203-217。
p53基因的突变是人类癌症最常见的遗传学变化(Bartek(1991)，癌基因，61699-1703，Hollstein(1991)科学，25349-53)。而且，在缺少内源性野生型p53蛋白的哺乳动物癌细胞中引入野生型的p53，将会抑制这些细胞的肿瘤表型(见，例如，美国专利No.5,532,220)。
在许多可以获得的化学疗法药物中，可以以Taxol(NSC编号125973)商购得的紫杉醇，很令人感兴趣，这是因为其在对一些药物无效的肿瘤，包括卵巢和乳腺肿瘤的临床试验中的效力(Hawkins(1992)癌基因，617-23，Horwitz(1992)药物科学进展，13134-146，Rowinsky(1990)，全国癌症研究所杂志，821247-1259)。近来关于紫杉醇和肿瘤抑制基因治疗的相互作用的研究表明，肿瘤抑制子(例如p53)的下降水平与增大的G2/M期停滞，微核化作用，以及p53单独的紫杉醇诱导的细胞凋亡相关。相反，进行了有丝分裂并短时间内聚集在接下来的G1期中的具有完整的p53的存活的细胞，与增加的p53和p21eipl，wafl蛋白水平相一致(Wahl(1996)自然医学，272-79)。相似地，Hawkins(1996)，癌症研究，56892-898，指出p53的灭活将增强对某些抗有丝分裂试剂包括紫杉醇的敏感性。作者提示p53可能在DNA修复中起作用，因而即使在药物存在的情况下也可以让细胞较容易地通过S期。因此，这些研究提示肿瘤抑制基因的治疗和抗有丝分裂剂的药物治疗(尤其是紫杉醇的治疗)具有相反的作用。
本发明概述本发明提供了治疗过度增殖的哺乳动物细胞的方法。本发明部分地基于令人惊奇的发现，即，将辅助抗癌剂与肿瘤抑制基因(例如p53)治疗联合应用，能对抑制肿瘤细胞或其他缺损肿瘤抑制因子活性的细胞的增殖提供增强的效果。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗哺乳动物的癌症或过度增殖的细胞的方法，将该细胞与肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸，并且与至少一种辅助抗癌剂相接触。在一些实施方案中，该方法包括联合施用肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸和辅助抗癌剂以及至少一种化学治疗剂。例如，肿瘤抑制核酸(例如，编码p53的核酸)可以与辅助抗癌剂(例如，紫杉醇)以及一种DNA损伤剂诸如顺铂、卡铂、navelbine(vinorelbine tartate)一起应用。
癌或过度增殖的细胞通常是肿瘤细胞。当细胞存在于肿瘤中时，该方法能抑制肿瘤的生长，因而也就提供了治疗该癌症的方法。这类癌症包括，但不限于，卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺瘤、结肠癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、卵巢瘤、骨肉瘤、肾癌、或头颈癌。
优选的辅助抗癌剂是紫杉醇或紫杉醇的衍生物，而优选的肿瘤抑制核酸是编码肿瘤抑制蛋白的核酸，该蛋白可选自p53蛋白及其类似物以及视网膜母细胞瘤(RB)蛋白。尤为优选的肿瘤抑制核酸编码野生型p53蛋白，尤为优选的视网膜母细胞瘤蛋白是p110RB或者p56RB。
肿瘤抑制核酸优选地通过载体输送到靶细胞中。这种载体病毒经重组DNA技术的修饰，从而能够在靶细胞中表达该肿瘤抑制核酸。这些载体可从非病毒型(例如质粒)或病毒型的(例如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、痘病毒)来源衍生得到。在本发明的优选的实践中，该载体是重组修饰的腺病毒载体。非病毒型载体优选地复合以试剂，而利于DNA穿过细胞膜的导入。这类非病毒载体复合物的实例包括具有多价阳离子试剂的配方，它能够有利于DNA的浓缩和脂类基础的输送系统。脂类基础的输送系统的实例包括基于脂质体的核酸输送。
尤为合适的腺病毒载体(例如用于输送编码野生型p53蛋白的核酸)含有IX蛋白的DNA的部分的或者全部的缺失。在一个实施方案中，IX蛋白的基因序列的缺失范围从5′病毒末端的约3500bp至5′病毒末端的约4000bp。载体还应含有在腺病毒早期区域3和/或腺病毒早期区域4上的非基本DNA序列缺失，并且在一个实施方案中，该缺失是E1a和/或E1b的DNA序列。尤为优选的用于输送人p53cDNA的腺病毒载体含有腺病毒2型主要晚期启动子或者人CMV启动子，以及腺病毒2型三联前导cDNA。这样的优选的腺病毒载体为ACN53。
优选的紫杉醇或紫杉醇衍生物包括紫杉醇和/或最为优选的带有紫杉醇(Taxol)的Taxotere。另一优选的辅助抗癌剂是Epotillone。在尤为优选的实施方案，肿瘤抑制因子是A/C/N/53并且辅助抗癌剂是紫杉醇。
肿瘤抑制核酸可以分散在药学上可接受的赋形剂中。类似地，辅助抗癌剂(例如紫杉醇或紫杉醇衍生物)可以分散于药学上可行的赋形剂中。肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸以及所说的紫杉醇或紫杉醇衍生物可以一起分散在单一组合物(含有一个或多个赋形剂)之中。
肿瘤抑制因子(蛋白或核酸)和/或辅助抗癌剂可以通过动脉、静脉(例如注射)、腹膜内和/或肿瘤内给药，可以同时或依次进行。优选的给药位置包括肝动脉内、腹膜内、或者当需要治疗头部细胞(例如，神经细胞)，给入颈动脉系统。
肿瘤抑制蛋白或核酸可以以单一剂量给药或者多次治疗，例如间隔至少6小时，更为优选地在24小时内分3次给药。
在另一个实施方案，肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸给药(带有或不带有辅助抗癌剂)的总剂量范围从约1×109至1×1014，或约1×109至7.5×1015，优选的是约1×1011至7.5×1013腺病毒颗粒，疗程可以选用一次全部剂量给药、全部剂量在5天内每日给药、全部剂量在15天内每日给药、或者全部剂量在30天内每日给药。剂量也可以连续给药1至30天。紫杉醇或紫杉醇衍生物在1小时、3小时、6小时或者24小时内给药的总剂量范围从约75至大约350mg/m2，治疗方案可以选用一次给药、总剂量在第1天和第2天每日给药、总剂量在第1天，第2天和第3天每日给药、以每日剂量给药15天、以每日剂量给药30天、每日连续输药15天、每日连续输药30天。优选的剂量是24小时内100-250mg/m2。或者，将紫杉醇或紫杉醇衍生物每周以60mg/m2给药。这种给药方法可以重复两至三个循环(更为优选的是三个循环)，两个或更多的循环之间间隔三或四周。
在一些优选的实施方案，每日剂量的范围从约7.5×109至7.5×1015，优选的是约1×1012至7.5×1013腺病毒颗粒，每日给药，多至30天(例如在2天内或者2至5天或至14天或至30天内，以相同的剂量每日给药)。多种给药方案可以在21至28天的循环中重复。优选的给药途径包括动脉内(例如肝动脉内)、瘤内、和腹膜内给药。
如果将在腺病毒载体中的肿瘤抑制核酸(例如p53)与辅助抗癌剂(紫杉醇)一起和DNA损伤剂(例如顺铂、卡铂，navelbine)联合给药，那么每日以约7.5×1012至7.5×1013腺病毒颗粒给药。如果将腺病毒载体和紫杉醇与卡铂一起给药，那么其剂量通常的是每日7.5×1013腺病毒颗粒。例如，用约7.5×1012腺病毒颗粒的每日剂量对肺部给药。
本发明还提供了用于治疗哺乳动物癌症和过度增殖细胞的试剂盒。试剂盒包括本文所述的肿瘤抑制蛋白或核酸(尤为优选的是野生型p53蛋白或核酸(例如，在病毒或非病毒载体上)，或视网膜母细胞瘤(RB)蛋白或核酸)；和本文所述的辅助抗癌剂(例如，紫杉醇或紫杉醇衍生物)和/或任选地本文所述的任何其他化学治疗剂。该试剂盒任选地进一步还包括给药说明，描述施用肿瘤抑制蛋白或核酸以及辅助抗癌剂(任选的任何其他化学治疗剂)，用以抑制癌细胞或过度增殖细胞生长或增殖。特别优选的试剂盒包括A/C/N/53和紫杉醇。
本发明的另一个实施方案提供了含有肿瘤抑制蛋白或核酸以及辅助抗癌剂的药物组合物。在各种的实施方案中，药物组合物可以任选地包括本文所述的任何其他的化学治疗化合物。尤为优选的组合物包括p53核酸(例如，A/C/N/53)和紫杉醇。肿瘤抑制蛋白或核酸以及化学治疗剂(例如，紫杉醇)可以包含在本文中所述的不同的赋型剂或同一赋型剂中。如果使用多种赋型剂，赋型剂可以是混合的或是分开的(例如，在微囊中)。
在另一个实施方案，本发明提供了含有哺乳动物癌或过度增殖细胞的组合物，其中所说的细胞含有外源基因肿瘤抑制核酸或肿瘤抑制蛋白。该细胞可另外包括辅助抗癌剂如紫杉醇或紫杉醇衍生物。该外源基因肿瘤抑制核酸或肿瘤抑制蛋白可以是任何一种或多种本文所述的肿瘤抑制核酸和/或肿瘤抑制蛋白。类似地，该细胞可以是任何一种或多种本文所述的过度增殖和/或癌细胞。
在另一个实施方案，本发明提供了治疗转移性细胞的方法。该方法包括将该细胞与肿瘤抑制核酸或肿瘤抑制多肽相接触。适当的肿瘤抑制核酸或多肽包括任何本文所公开的肿瘤抑制核酸和/或多肽。该方法另外还包括将该细胞与任何本文所公开的辅助抗癌剂相接触。在尤为优选的实施方案，该方法涉及以该肿瘤抑制核酸和/或多肽对外科伤口局部给药。
在另一个实施方案，本发明提供了尤为优选的剂量用法。因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗哺乳动物细胞的方法，其中该方法涉及对细胞施用全部剂量的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸，其中所说的全部剂量的给药，是多次施用递增剂量的所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸。优选的多次给药应相互间隔至少6小时。一种优选的给药是间隔约24小时的至少3次治疗。
在另一实施方案，本发明提供了治疗哺乳动物细胞的方法。该方法涉及对该细胞施用全部剂量的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸，其中所说的全部剂量的给药，是多次施用递增剂量的所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸。给药可相互间隔至少6小时。该方法还可涉及至少包括三次递增剂量并且每日施用该剂量。在一个实施方案中，该方法包括间隔约24小时的至少3次治疗。在另一个实施方案，该方法还可涉及，肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸给药的总剂量范围从约1×109至1×1015，或约1×1011至7.5×1013腺病毒颗粒，疗程可以选用一次全部剂量给药、全部剂量在5天内每日给药、全部剂量在15天内每日给药、或者全部剂量在30天内每日给药。该方法还进一步包含紫杉醇或紫杉醇衍生物在24小时内给药的总剂量范围从约75至约350mg/m2，疗程可以选用一次给药、在第1天和第2天每日按剂量给药、在第1天，第2天和第3天每日按剂量给药、以每日剂量给药15天、以每日剂量给药30天、每日连续输药15天、每日连续输药30天。给药方法可以重复两个或更多个疗程，两个或更多的疗程之间间隔三或四周。如此治疗的细胞包括的癌细胞有卵巢癌、间皮瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺瘤、结肠癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、卵巢瘤、骨肉瘤、肾癌、或头颈癌。这种治疗优选地可抑制肿瘤的生长或增殖，这可以通过对肿瘤体积测量来检验。
本发明还提供了含有肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸以及至少一种辅助抗癌剂的药物组合物。该辅助抗癌剂可以是紫杉醇或者是紫杉醇衍生物。该肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸可以是下列中的一种编码野生型p53蛋白的核酸、编码视网膜母细胞瘤(RB)蛋白的核酸、野生型p53蛋白或者视网膜母细胞瘤(RB)蛋白。
视网膜母细胞瘤蛋白可以是p110RB或者p56RB。该核酸可以位于重组腺病毒载体上，载体上含有部分的或全部的蛋白IX的DNA缺失，并含有编码P53蛋白的核酸。在另一个实施方案，蛋白IX的基因序列的缺失范围可以从5′病毒末端的约3500bp至5′病毒末端的4000bp处。该DNA缺失可以包括被称作E1a和E1b的序列。该重组腺病毒载体进一步含有腺病毒2型主要晚期启动子或人CMV启动子、腺病毒2型三联前导cDNA和人p53 cDNA。在优选的实施方案，该载体为A/C/N/53。该组合物可以是紫杉醇或者是紫杉醇衍生物、或者是紫杉醇类似物。
本发明进一步提供了含有哺乳动物癌或过度增殖细胞的组合物，其中所说的细胞含有外源的肿瘤抑制核酸或肿瘤抑制蛋白和辅助抗癌剂。该肿瘤抑制核酸可以是编码肿瘤抑制蛋白，包括野生型p53蛋白和视网膜母细胞瘤(RB)蛋白，的核酸。视网膜母细胞瘤蛋白可以是p110RB或者p56RB。该细胞可以存在于哺乳动物中。该细胞可以是癌细胞而且该癌细胞可以含有下列的癌症卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺瘤、结肠癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、卵巢瘤、骨肉瘤、肾癌、或头颈癌。
本发明提供了治疗转移性细胞的方法，该方法包括将所说的细胞与肿瘤抑制核酸或肿瘤抑制多肽和辅助抗癌剂相接触。这种接触可包括以该肿瘤抑制核酸对外科伤口局部给药。该方法可进一步包括与化疗药物联合给药，该化疗药物可以是顺铂，卡铂或者navelbine。
定义术语“辅助抗癌剂”是指一种具有至少一种以下活性的药物能够调节微管形成或运动、能够抑制聚异戊二烯蛋白转移酶活性、能够抑制血管发生、或者能够抑制内分泌活性。用于本发明的辅助抗癌剂在下文中有更详细的描述。在此，本发明的辅助抗癌剂不包括带有DNA损伤活性的化合物。
“肿瘤抑制基因”指其功能丧失突变是致癌性的核酸。因此，在即使正常的健康细胞中，肿瘤抑制基因的正常表达被缺失、突变、或者被破坏，将增大该细胞发展成为肿瘤状态的可能性或导致该细胞发展成为肿瘤状态。相反，当功能性肿瘤抑制基因或蛋白在细胞中存在时，它的存在会抑制宿主细胞的肿瘤发生、恶性化或过度增殖的表型。属于本定义的肿瘤抑制核酸的实例包括，但不局限于，p110RB、p56RB、p53、和其他在本文中和1994年10月25日申请的USSN 08/328,673相关申请中所描述的肿瘤抑制因子。肿瘤抑制核酸包括肿瘤抑制基因、或者其衍生核酸(例如，cDNAs、cRNAs、mRNAs、和它们编码相应的肿瘤抑制多肽的活性片段的亚序列)，以及含有这些序列的载体。
“肿瘤抑制多肽或蛋白”是指，当存在于细胞之中能够降低该细胞的肿瘤发生、恶性化或过度增殖的表型的多肽。
术语“病毒颗粒”是指完整的病毒粒子。感染性腺病毒颗粒的浓度通常通过DNA的分光光度法检测确定，例如Huyhge(1995)人类基因治疗61403-1416中所述。
术语“瘤形成”或“肿瘤的”是描述细胞生长和/或分裂的速度超过了该细胞类型生长的正常限度。
术语“致瘤的”或“致瘤性”是指具有形成肿瘤的能力或能够导致肿瘤形成。
术语“治疗细胞”是指抑制或改善疾病细胞的一个或者多个疾病特征。当用于指肿瘤性癌细胞(例如缺少内源野生型肿瘤抑制蛋白的哺乳动物癌细胞)时，术语“治疗细胞”是指缓解或消除肿瘤表型。典型地，相比于相同条件下但不予治疗(例如，辅助抗癌剂或肿瘤抑制核酸或多肽)的相同的细胞，这种治疗导致该细胞受到抑制(生长和/或增殖的下降或停滞)。这种抑制可包括细胞死亡(例如，凋亡)。当这些术语用于指肿瘤时是指瘤块生长或增殖的抑制(例如，瘤体积的测量所得出的)。这种抑制也可以通过含有瘤块的细胞的生长速度和/或增殖速度的下降和/或死亡来得出。生长的抑制或增殖的抑制可伴随有细胞表型的变化(例如，正常细胞形态学特征的恢复、接触抑制的恢复、侵袭性表型的丧失、不贴壁依赖生长的抑制，等等)。本文中，疾病细胞具有一个或多个病理学性状。这些疾病细胞的性状包括，尤其是，一种或多种肿瘤抑制蛋白的缺陷表达。缺陷表达的特征可以是一或多种功能性肿瘤抑制蛋白的完全丧失或一或多种功能性肿瘤抑制蛋白的表达水平的降低。这种细胞通常是肿瘤的和/或致瘤性的。
术语“系统给药”是指，对哺乳动物施用一种组合物或药物，诸如本发明的重组腺病毒载体或辅助抗癌剂或本文所述的化疗化合物，从而将该组合物或药物引入其循环系统。术语“区域给药”是指，在特定的解剖空间内施用一种组合物或药物，诸如腹膜内、鞘内、硬膜下、或特定组织中等等。例如，区域给药包括在肝动脉中施用该组合物或药物，从而对肝脏进行区域给药。术语“局部给药”是指，在有限的、界定的解剖学空间内施用一种组合物或药物，诸如在瘤块中的瘤内注射、皮下注射、肌肉注射等等。任何本领域的熟练技术人员都知道局部给药或区域给药都能使得该组合物或药物进入到循环系统中。
术语“降低的致瘤性”是指，过度增殖的(例如，肿瘤的)细胞向低增殖的状态的转化。对于肿瘤细胞，“降低的致瘤性”是指，转化成低致瘤性或非致瘤性或非肿瘤细胞的肿瘤细胞，它转变成为肿瘤细胞的能力被降低了或消除了。带有降低的致瘤性的细胞在体内不形成肿瘤，或者在表现出体内肿瘤生长之前延迟了几周至几个月的时间。与生长于相同环境下(例如，组织、生物年龄、生物性别、月经周期的时间，等等)带有完全失活的或者无功能的肿瘤抑制基因的细胞相比较，带有降低的致瘤性的细胞还会导致三维瘤块的较缓慢生长。
本文所用的基因或者多肽的“活性片段”包括，能够编码具有肿瘤抑制活性的蛋白的基因或其衍生的核酸(例如cDNA)的较小的部分(亚序列)。类似地，多肽的活性片段是指具有肿瘤抑制蛋白的多肽的亚序列。活性片段的实例是p56RB，例如1994年10月25日申请的USSN 08/328,673中所描述的。
术语“恶性”是描述致瘤性细胞具有的转移的能力。
本文中的“核酸”可以是DNA或RNA。核酸可包括经修饰的核苷酸，它能被聚合酶正确通读且不改变该核酸所编码的多肽的表达。
“核酸序列”包括单链形式的和双链形式的有义链和无义链。
“DNA序列”是指单链或双链DNA分子，它由核苷酸碱基、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤组成。
“核酸序列编码”是指指导特定蛋白或多肽表达的核酸。核酸序列包括转录出RNA的DNA链序列和翻译出蛋白的RNA序列。核酸序列包括全长的核酸序列以及衍生自全长序列的非全长序列。能够进而理解的是，该序列还包括原始序列的简并性密码或者能够在特定宿主细胞中提供密码偏爱性的序列。
“表达盒”是指在相容宿主中能够影响结构基因表达的核苷酸序列。这种表达盒至少包括启动子和任选的转录终止信号。还可以使用本文所述的必要的或有助于影响表达的其他因子。
本文所用的“可操作性连接的”是指DNA序列上游与启动子连接，从而启动子能介导该DNA序列的转录。
“分离的”或者“基本纯化的”在涉及编码肿瘤抑制蛋白或多肽或其片段的核酸序列时是指，分离的核酸，它不编码除了肿瘤抑制蛋白或多肽或其片段的以外的蛋白或多肽。
“重组体”是指从其天然的或内源的来源中分离的DNA，并经化学或酶学修饰去除了天然存在的侧翼核苷酸或者提供了非天然存在的侧翼核苷酸。侧翼核苷酸是指所述序列或核苷酸亚序列的上游或者下游的核苷酸。
“载体”包含有能够感染、转染、短暂或永久转导细胞的核酸。能够认识到的是，载体可以是裸露的核酸、或者复合有蛋白或脂类的核酸。载体可选择性地含有病毒的或细菌的核酸和/或蛋白、和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂类包膜等等)。能够认识到的是，载体通常包括表达盒，将所感兴趣的核酸置于启动子控制之下。载体包括，但不局限于，能够附着DNA片段并能复制的复制子(例如，质粒、噬菌体)。载体因而包括，但不局限于RNA、自主复制环状DNA(质粒)，并且包括表达型和非表达型质粒。当重组体微生物或细胞培养物被看作“表达载体”的宿主时，这就包括染色体外的环状DNA和掺入到宿主染色体上的DNA。当载体保存于宿主细胞中时，它在有丝分裂中作为自主结构，或者合并在宿主的基因组中，载体通过细胞可以稳定地复制。
术语“有效量”是指载体或药物能够对控制细胞生长和/或增殖得到阳性结果的量。
本文所用的缩写“C.I.U.”表示“细胞感染单位”。C.I.U.通过测量48小时感染后的病毒六邻体蛋白阳性细胞(例如，-293细胞)进行计算(Huyghe(1995)人类基因治疗61403-1416)。
本文所用的缩写“m.o.i.”表示“感染复数”，是每个细胞的C.I.U.值。
本文所用的术语“紫杉醇”是指商业上已知为Taxol的药物。Taxo增强微管蛋白的聚合形成稳定的微管束，使得无法重建出有丝分裂的适当结构，从而抑制真核细胞的复制。
术语“接触细胞”在涉及用本文所用的药物和/或核酸来接触时是指通过某种方法使得该药物和/或核酸进入到细胞中去。在文中，用核酸接触细胞相当于用核酸转染细胞。当药物是亲脂性的或者核酸复合于脂类(例如，阳离子脂类)，简单的接触可使之输送(主动的，被动的和/或扩散的)到细胞内。另外，药物和/或核酸自身可以，或者结合载体组合物主动地输送到细胞中。因此，例如，当核酸存在于感染性载体上(例如，腺病毒)，载体能够介导核酸吸收入细胞内。核酸可以与特异作用于细胞外受体的制剂复合，从而促进核酸运输到细胞内，实例包括有配体/多聚阳离子/DNA复合物，如美国专利No.5,166,320和5,635,383中描述的。另外，可以通过对病毒基因组的节点或纤维功能区的重组修饰，以掺入细胞定向基序，从而增强病毒的输送。
记作“A/C/N/53”，“A/M/N/53”，p110RB，p56RB的结构是指1994年10月25日申请的USSN 08/328,673，国际申请号WO95/11984中所同样标记的结构。
“保守取代”，在描述蛋白时是指，不会导致蛋白活性上实质变化的该蛋白氨基酸组成上的改变。因而，某个氨基酸序列的“保守性修饰变异”是指，对蛋白功能不重要的那些氨基酸的取代，或者用另具有相似特性(例如，酸性、碱性、正电荷或负电荷的、极性或非极性，等等)的氨基酸的取代，从而即使是重要的氨基酸的取代也不实质性地改变活性。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域所熟知的。例如，下面的六组中分别包含了互为保守取代的氨基酸。
1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
还可参见Creighton(1984)蛋白质W.H.Freeman and Company。另外，在编码序列上改变、增加或缺失单个氨基酸或小比例的一些氨基酸，这种个别的取代、缺失或增加也可看作“保守性修饰变异”。
附图的简要描述

图1表示不同浓度的p53(A/C/N/53)和/或Taxol对SK-OV-3卵巢瘤细胞的体外抑制。
图2提供了图1所示实验的等辐射图分析，当细胞在用p53处理前先用Taxol预处理24小时，发现Taxol与p53(A/C/N/53)之间存有协同作用。
图3a，3b和3c表示出p53 Ad抗异种移植在裸鼠上的人乳腺癌的效力。对于每只小鼠给予总剂量为2.2×109C.I.U.腺病毒(A/C/N/53或Ad)，在第0-4天和第7-11天分10次注射。小鼠用p53 Ad、β-gal Ad、或者单独的赋型剂处理。图3a表示使用MDA-MB-231肿瘤的结果。图3b表示使用MDA-MB-468(-468)肿瘤的结果，而图3c表示使用MDA-MB-435(-435)肿瘤的结果。
图4a和4b给出了p53 Ad(A/C/N/53)对MDA-MB-231(-231)肿瘤(图4a)和对MDA-MB-468(-468)肿瘤(图4b)的剂量反应曲线。小鼠给予的剂量为1×107至1×109C.I.U.p53 Ad(A/C/N/53)，在第0-4天和第7-11天分10次靠近肿瘤给药。在第14/15，18，21，24，28，30/32，和35天(MDA-MB-468肿瘤只在第35天)与缓冲液处理的肿瘤比较各个p53 Ad剂量下的肿瘤体积，计算平均抑制百分比。-231肿瘤在第0天平均为22.5±1.2mm3，而-468肿瘤在第0天平均为33.1±1.8mm3。
图5给出了以单一一次剂量和分隔多次剂量施用治疗药物的疗效的比较。肿瘤(MDA-MB-231)在第1周和第3周的每周总剂量为2.2×109C.I.U.p53 Ad。
图6表示以多次循环的低剂量p53 Ad抗大的、发育完整的肿瘤的疗效。在6周中对MDA-MB-468异体移植肿瘤给予总剂量1.32×109C.I.U.p53 Ad。(p＝控制肿瘤生长速度的平台，E＝剂量的结尾)。
图7a，7b和7c表示以单一一次注射(图7a)或者分为3次注射(图7b)或者分为5次注射(图7c)1×109C.I.U.p53 Ad，对裸鼠上MDA-MB-468肿瘤的体内抑制作用。
图8表示低剂量的地塞米松对严重联合免疫缺陷小鼠中NK细胞介导的肿瘤生长抑制的降低作用。MDA-MB-231肿瘤给药的总剂量2×109C.I.U.β-gal Ad(1.1×10011病毒颗粒)，在第14-18天和21-25天分成10次注射。皮下的地塞米松(或者安慰剂)药丸每天释放83.3μg类固醇。
图9示出对正常细胞和肿瘤细胞用p53和顺铂联合治疗的比较。
发明的详细描述本发明提供了抑制细胞生长和/或增殖，更为优选的是癌细胞的生长和增殖的新方法。在一个实施方案中，该方法涉及将该细胞与肿瘤抑制核酸，或肿瘤抑制蛋白，以及辅助抗癌剂相接触。典型地，此肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸与其所缺少的肿瘤抑制蛋白或核酸是相同物种的。因而在细胞缺少内源性p53活性时，将利用p53蛋白或p53核酸。
在本发明中，惊人的发现在于，与以前的研究(见，Wahl等(1996)自然医学，2(1)72-79，和Hawkins等(1996)癌症研究，56892-898)相反，利用辅助抗癌剂(如紫杉醇(Taxol))和肿瘤抑制基因或蛋白(如p53)一起，对缺少或缺损内源性野生型肿瘤抑制蛋白的哺乳动物细胞(例如，许多肿瘤细胞)的治疗，获得的对细胞增殖和/或生长的抑制远远大于单独使用化学治疗或者单独使用肿瘤抑制因子治疗所观察到的效果。而且，本发明还发现，抗癌剂的预处理能够惊人地提高肿瘤抑制因子的抗增殖效果。不附着与某个特定的理论，据信这可能解释为抗癌剂可能提供了这样的增强作用提高了多种基因治疗载体(如腺病毒载体)的转染效率；或者，提高肿瘤抑制基因的表达水平；或者，稳定微管以协助细胞内病毒的输送；或者，通过各种细胞内机制(如信号途径、凋亡途径、细胞周期途径)之间的相互作用产生了增强效应。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过与辅助抗癌剂以及肿瘤抑制核酸和/或肿瘤抑制多肽接触，来抑制缺少或缺损内源性野生型肿瘤抑制蛋白的哺乳动物疾病细胞。特别优选的肿瘤抑制核酸或多肽包括p53，RB，h-NUC(例如见，Chen(1995)，细胞生长与分化，6199-210)或其活性片段(如，p110RB,p56RB)，而优选的辅助抗癌剂(化合物)包括紫杉醇和带有紫杉醇类活性的化合物，诸如紫杉醇衍生物(如，类似物)。
本发明还发现将细胞与肿瘤抑制核酸和/或多肽相接触，能够抑制转移性细胞。这种抑制可以导致对转移性细胞的形成、生长、迁移、或繁殖的抑制。在一个实施方案中，这种抑制表现为在远离原位肿瘤的部位，肿瘤的出现受到抑制(如降低和/或消除)。本发明因而提供了治疗(缓解或消除)转移性肿瘤进程的方法。该方法涉及将转移性细胞与肿瘤抑制核酸和/或多肽相接触。在特别优选的实施方案，此方法涉及将外科伤口部位(如，在将瘤块去除(消肿)之后)的细胞接触肿瘤抑制核酸和/或肿瘤抑制多肽，并联合接触辅助抗癌剂。该细胞可以另外与本文所述的辅助抗癌剂相接触。
在另一个实施方案，本发明提供了利用肿瘤抑制基因和基因产物的有利的治疗方案。这些治疗方案部分地基于这样的惊人的发现肿瘤抑制核酸和/或多肽通过多次重复给药比一次性给药能够更为有效地抑制细胞或肿瘤生长。
对于本发明来说，肿瘤抑制因子和辅助抗癌剂的给药顺序并不重要。因此，这些组合物可以同时施用或者连续施用。例如，在一个实施方案中，用至少一种辅助抗癌剂(单独地或者联合化疗药剂)对细胞进行预处理，可以提高随后施用的肿瘤抑制核酸和/或多肽的效力。在另一个实施方案，辅助抗癌剂(单独地或者联合化疗药剂)与肿瘤抑制核酸和/或多肽同时施用。而在另一个实施方案，辅助抗癌剂在肿瘤抑制核酸和/或多肽之后施用。
施用本发明的组合物以及方法的抗瘤效力还包括，抗肿瘤的非特异性效力，也称作“旁观者效应”(例如见，Zhang(1996)癌转移综述15385-401和Okada(1996)基因治疗，3957-96)。而且，免疫系统能够被调节选择性地增强(或降低)免疫系统的激素水平或细胞学水平，即调节B细胞和/或T细胞(如，细胞毒素淋巴细胞(CTL)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))的应答。例如，对人体施用表达p53的腺病毒，会观察到TIL的增加。尤其是如下面所详细描述的，在肝内动脉施用表达p53的腺病毒可观察到TIL(表型为T辅助细胞，CD3+和CD4+)的增加。
应当认识到，本发明的方法并不限制使用一种辅助抗癌剂或者使用一种化疗药物。因而本发明提供了通过将细胞与肿瘤抑制核酸以及一或多个本文所述的辅助抗癌剂相接触，抑制缺少内源性野生型肿瘤抑制蛋白的哺乳动物疾病细胞，或者含有这种细胞的肿瘤的方法。
I.辅助抗癌剂A)微管影响剂如前面所作的解释，在一个实施方案中，本发明提供了通过将细胞与肿瘤抑制核酸或肿瘤抑制蛋白以及辅助抗癌剂诸如微管影响剂(如紫杉醇，紫杉醇衍生物或者紫杉醇类的化合物)相接触，抑制缺少内源性野生型肿瘤抑制蛋白的疾病细胞的方法。如本文所用的，微管影响剂是一种干扰细胞有丝分裂的化合物，即，通过影响微管的形成和/或运动，具有抗有丝分裂作用。此类药剂可以是，例如，扰乱微管形成的微管稳定剂。
可用于本发明的微管影响剂是本领域熟练技术人员所熟知的，它包括，但不局限于，异秋水仙素(NSC 406042)、Halichondrin B(NSC609395)、秋水仙素(NSC757)、秋水仙素衍生物(如，NSC 33410)、dolastatin 10(NSC376128)、美登素(NSC153858)、华根毒素(NSC332598)、紫杉醇(Taxol，NSC 125973)、Taxol衍生物(例如NSC608832)、硫代秋水仙素(NSC 361792)、三苯甲基半胱氨酸(NSC83265)、长春碱硫酸盐(NSC49842)、长春新碱硫酸盐(NSC 67574)、epothilone A，epothilone，和discodermolide(见服务商，(1996)，科学，2742009)，estramustine，nocodazole，MAP4等等。这些药剂的实例在一些科学文献和专利文献中有所描述，见，例如，Bulinski(1997)细胞科学杂志，1103055-3064；Panda(1997)美国科学院研究进展，9410560-10564；Muhlradt(1997)癌症研究，573344-3346；Nicolaou(1997)自然，387268-272；Vasquez(1997)细胞分子生物学，8973-985；Panda(1996)生物化学杂志，27129807-29812。
尤为优选的药剂是带有紫杉醇类活性的化合物。它们包括，但不局限于，紫杉醇，紫杉醇衍生物(紫杉醇类的化合物)和类似物。紫杉醇及其衍生物可以商业购得。另外，紫杉醇和紫杉醇衍生物和类似物的制造方法是本领域熟练技术人员所熟知的(参见，如，美国专利号5,569,729；5,565,478；5,530,020；5,527,924；5,508,447；5,489,589；5,488,116；5,484,809；5,478,854；5,478,736；5,475,120；5,468,769；5,461,169；5,440,057；5,422,364；5,411,984；5,405,972；和5,296,506)。
其他的微管影响剂可通过本领域所熟知的试验来确定，如测量紫杉醇类似物的微管蛋白聚集活性的半自动试验，并结合细胞学试验，测定这些化合物阻断细胞有丝分裂的能力(见Lope(1997)，癌症化疗药物学，4137-47)。
通常，被测化合物的活性通过将细胞与该化合物相接触来确定，并确定细胞周期是否被破坏，尤其是否有有丝分裂的抑制。这种抑制可被有丝分裂器的破坏而介导，如正常的纺锤体的被破坏。有丝分裂被扰乱的细胞可以通过形态学的变化来加以鉴定(如微小管收缩，染色体数量的增加，等等)。
在一个优选的实施方案，对可能具有微管蛋白聚合活性的化合物进行体外筛选。在一个优选的实施方案，根据该化合物对培养的WR21细胞(衍生自种系69-2 wap-ras小鼠)进行增殖抑制和/或形态学变化，尤其是微小管收缩进行筛选。然后在带有WR21肿瘤细胞的裸鼠中，对阳性反应的化合物进行体内筛选。筛选方法的详细的程序可见Porter(1995)，实验室动物科学，45145-150。
筛选所需活性的化合物的其他方法为本领域熟练技术人员所熟知。通常的此类试验涉及抑制微管的组装和/或去组装的试验。微管组装的试验可参见Gaskin等(1974)分子生物学杂志，89737-758。美国专利5,569,720也提供了对具有紫杉醇类活性的化合物进行体外和体内试验的方法。
B)聚异戊烯蛋白转移酶活抑制剂在另一个实施方案，本发明提供了联合应用肿瘤抑制核酸和/或多肽与聚异戊烯蛋白转移酶抑制剂的方法。尤为优选的聚异戊烯蛋白转移酶抑制剂包括，但不局限于，法尼基蛋白转移酶(FPT)抑制剂、香叶基香叶基(geranylgeranyl)蛋白转移酶抑制剂、和其他的单萜蛋白转移酶抑制剂。作为聚异戊烯蛋白转移酶抑制剂的化合物实例从一些科学文献和专利文献中可以更清楚地了解，见，例如，Zhang(1997)生物化学杂志，27210232-10239；Nioroge(1997)医学化学杂志，4042904301；Mallams(1997)生物组织医学化学，593-99。
法尼基蛋白转移酶抑制剂的化合物的实例如下所列FPT抑制剂，记作“FPT39＂，在1996年12月19日申请的国际申请WO97/23478，有所描述，在那里FPT39记作化合物“39.0”，见WO97/23478的第95页。
化合物FPT39
如下文所述，当将FPT39与本发明的表达p53的腺病毒一起用于联合治疗前列腺肿瘤细胞和乳腺肿瘤细胞时，这种联合在杀死肿瘤细胞方面，比单独使用两者中的任何一种都更为有效。
寡肽(大多数是四肽，但也有五肽，包括Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3的结构式EPA461,489；EPA520,823；EPA528,486；和WO95/11917)肽模拟化合物，尤其是Cys-Xaa-Xaa-Xaa模拟物EPA535,730，EPA535,731； EPA618,221； WO94/09766P；WO94/10138；WO94/07966；US5,326,773，US5,340,828，US5,420,245；WO95/20396；US5,439,918；和WO95/20396。
法尼基化肽模拟物--尤其是法尼基化的Cys-Xaa-Xaa-Xaa模拟物GB-A2.276,618。
其他的肽模拟化合物US5,352,705，WO94/00419；WO95/00497；WO95/09000；WO95/09001；WO91/12612；WO95/25086；EPA675,112，和FR-A2,718,149。
稠环三环苯并环庚吡啶WO95/10514；WO95/10515；WO95/10516；WO96/30363；WO96/30018；WO96/30017；WO96/30362；WO96/31111；WO96/31478；WO9631505；国际专利申请号PCT/US96/19603，WO97/23478；美国申请序列号08/728,104，美国申请序列号08/712,989，美国申请序列号08/713,326，美国申请序列号08/713,908，美国申请序列号08/713,705，美国申请序列号08/713,703，美国申请序列号08/710,225，美国申请序列号08/711,925，美国申请序列号08/712,924，美国申请序列号08/713,323；和美国申请序列号08/713,297。
法尼基衍生物EPA534,546；WO94/19357；WO95/08546，EPA537,007；和WO95/13059。
天然产物和衍生物WO94/18157；U.S.5,430,055；GB-A2,261,373，GB-A2,261,374，GB-A2,261,375；U.S.5,420,334，U.S.5,436,263。
其他化合物WO94/26723；WO95/08542；U.S.5,420,157；WO95/21815；和WO96/31501。
C)抗血管生成的化合物本发明的肿瘤抑制蛋白或核酸还可以与抗血管生成的化合物一起给药。优选的抗血管生成化合物抑制血管的形成或增殖，更为优选地抑制血管和形成和/或增殖成肿瘤。
合适的抗血管生成化合物包括，但不局限于Galardin(GM6001，Glycomed公司，Alameda，CA)，内皮应答抑制因子(如，诸如α干扰素、TNP470、和血管内皮生长因子抑制剂等药剂)，能够促使损坏细胞基质的药剂(如，Vitaxin(人LM-609抗体，Ixsys公司，圣地亚哥，CA；Metastat，CollaGenex，Newtown，PA；和MarimastatBB2516，British Biotech)，和能直接作用于血管生长的药剂(如，CM-101，它衍生自A类链球菌抗原的外毒素，并与诱发严重的宿主炎症应答新生血管相结合；和酞胺哌啶酮)。
几种类固酮也具有抗血管生成活性。特别是，有几篇报道提示6α-甲-17-羟孕酮乙酸(MPA)，一种合成的孕酮，在兔角膜试验中能有效地抑制新血管形成(Oikawa(1988)癌症通信4385)。一种5FU的前体药物，5′-脱氧-5-氟尿嘧啶(5′-DFUR)，也可被视作一种抗血管生成的化合物，因为5′-DFUR能被PD-ECGF/TP的胸苷磷酸酶活性转换成5-FU。5′-DFUR能够选择性地作用于具有高血管生成能力的PD-ECGF/TP阳性肿瘤细胞。最近的临床研究表明5′-DFUR对PD-ECGF/TP阳性肿瘤可能有效。研究还表明，与未转染的野生型细胞相比，在PD-ECGF/TP转染的细胞中表现出的5′-DFUR抗肿瘤作用惊人地增强了(Haraguchi(1993)癌症研究535680-5682)。另外，联合的5′-DFUR+MPA化合物也能有效地抗血管生成(Yayoi(1994)国际癌症学杂志，527-32)。5′-DFUR+MPA的联合可以被视作两种具有不同谱型的血管生成抑制剂，一种内皮生长因子抑制剂和一种蛋白酶抑制剂，的联合。另外，用DMBA诱导的大鼠乳腺癌进行的体内实验中，5′-DFUR与AGM-1470显示出一种联合效应(Yamamoto(1995)癌症学报道，2793-796)。
另一组本发明所用的抗血管生成化合物包括，能够对促进血管生成的肝素结合生长因子有干扰作用的多糖(如，硫酸聚戊糖)。
其他的血管生成效应物包括血小板因子IV和AGM1470。其他还有天然来源的胶原蛋白酶抑制剂、维生素D3类似物、furnigallin、除莠霉素A、和异黄酮衍生的物质。
D)内分泌治疗已经建立的内分泌治疗，作为一种代表性的细胞抑制治疗，能够导致激素依赖性细胞静止，并能体内降低肿瘤细胞数，而抑制带有激素依赖性细胞的患者的肿瘤生长。这种治疗的目的在于增强对过度增殖细胞的治疗中的肿瘤抑制因子的作用。因此，在另一个实施方案，本发明提供了，如肿瘤抑制核酸和/或多肽与抗雌激素、抗雄激素、或者抗孕酮的联合应用。内分泌治疗剂是本领域熟练技术人员所熟知的，包括，但不局限于三苯氧胺、托瑞米芬(见，如，U.S.4,696,949)、氟他胺、甲地孕酮、和lupron，见，如WO91/00732，WO93/10741，WO96/26201，和Gauthier等，医学化学杂志，402117-2122(1997))。
E)辅助抗癌剂的输送药物组合物药物组合物本发明的方法中所用的辅助抗癌剂典型地与药物学可接受的载体(赋型剂)联合而形成药物组合物。本发明的该药物组合物可含有一种或多种辅助抗癌剂，含有或不含有肿瘤抑制基因或多肽，如，p53或RB。
药物学可接受的载体可含有能够如稳定组合物或增强或降低该药剂和/或药物组合物的吸收的生理学可接受的化合物。生理学可接受的化合物可包括，例如，碳水化合物，诸如蔗糖，葡萄糖或葡聚糖，抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白，减少辅助抗癌剂清除或水解的组合物，或者赋型剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。去污剂也可用于稳定该组合物或增强或降低药物组合物的吸收(见下文中例举的去污剂)。
其他的生理学可接受的化合物包括湿化剂、乳化剂、分散剂或者特别用于防止微生物生长或作用的防腐剂。各种防腐剂是众所周知的，包括，例如，苯酚或抗坏血酸。本领域的熟练技术人员会了解选择药物学可接受载体包括生理学可接受的化合物依赖于，例如，辅助抗癌剂的给药途径和辅助抗癌剂特定的生理化学特性。
施用的组合物通常含有一种辅助抗癌剂溶解于药学可接受的载体中的溶液，优选地对于水溶性的辅助抗癌剂是一种水性载体。可使用各种诸如缓冲盐之类的载体。这些溶液是无菌的且基本不含杂质。这些组合物可通过常规的、所熟知的灭菌技术来除菌。组合物可含有药学可接受的辅助物质，以获得近似的生理条件，诸如pH调节缓冲剂，毒性调节剂等等，例如，醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等等。在这些配方中辅助抗癌剂的浓度范围可以非常宽，可以根据特定的给药方式和病人的需要，基本上从容液体积，粘度，体重等等方面来进行选择。
输送途径本发明所用的辅助抗癌剂可以单独地或者作为药物组合物(联合或不联合肿瘤抑制因子，如p53)使用和输送，通过任何一种本领域所知道的方法，如系统地，区域地，或者局部地；动脉内，瘤内，静脉内，肠道外，胸腔，局部，口服，或局部给药，皮下，气管内(如，通过气雾剂)或通过粘膜(如，口腔，膀胱，阴道，子宫，直肠，鼻腔粘膜)，瘤内(如，经皮应用或局部注射)。尤其优选的给药方法包括动脉内注射，特别是在需要“区域效果”时，如，集中于特定的器官(如，脑，干，脾，肺)。例如，如果需要肝脏的抗肿瘤区域效应，则优选肝内动脉注射；或者，当需要将组合物运入脑部(如，治疗脑瘤)，则选择颈动脉或动脉颈部系统的一条动脉(如，枕动脉，耳动脉，枕页动脉，脑动脉，上颌动脉等等)。
紫杉醇和某些紫杉醇衍生物在水溶液中可溶性差。在优选的实施方案，这些组合物要么直接输送到肿瘤局部(如，通过注射，穿管，或在外科手术中直接应用)，要么在可接受的赋型剂中加溶。紫杉醇和其衍生物的给药方法是本领域熟练技术人员所熟知的(见，如，美国专利号5,583,153，5,583,478，5,496,804，45,484,809)。其他的紫杉醇衍生物是水溶性的类似物和/或前体药物(见，美国专利5,411,984和5,422,364)，可通过上述的各种方法方便地给药。
本发明的药物组合物特别适于局部给药，如，在用以治疗初期肿瘤，肿瘤和转移性细胞及其前体的外科创口处。在另一个实施方案，该组合物可用于肠道外给药，诸如静脉给药或体腔内或组织内腔内给药。
治疗方案药物组合物可以根据给药方法以不同的剂量形式给药。例如，适于口服的单位剂量形式，包括粉剂，片剂，胶囊和锭剂。能够认识到的是，辅助抗癌剂化合物如，紫杉醇和所需的相关化合物，在口服时，必须防止消化。要达到这一点，一般通过将该辅助抗癌剂与组合物复合，以提高它对酸和酶水解的抗性，或者将该辅助抗癌剂包装于诸如脂质体的抗性载体中。保护化合物不被消化的方法是本领域所熟知的(见，如，美国专利5,391,377描述了用于口服输送治疗药物的脂类组合物)。
通常的化疗的剂量是本领域熟练技术人员所熟知的。而且，这种剂量实际上是推荐的，可根据特定的治疗过程和病人的耐受程度来调整。因而，例如，通常的药物组合物(如紫杉醇)的静脉注射(IV)剂量可以是，在1-24小时内(典型地在1，3，或6，优选地在3小时内)施用约135mg/m2，并且优选地3周内重复3至6个循环。为了降低超敏反应的频率和严重程度，患者还可以在此之前12至6小时之前口服接受约20mg的地塞米松(Decadron，和其他)，以及在用紫杉醇之前30至60分钟静脉注射50mg的苯海拉明(Benadryl，和其他)加上约300mg的西咪替丁或者50mg的雷尼替丁(Zantac)。可以考虑的较高剂量(如，提高至每日约350mg/m2)也可使用，特别是在对隔离的位点给药而不进入血液，诸如体腔或器官内腔中。基本上较高的剂量在任何的选择途径都是可以的，例如局部给药。制备肠道外给药的组合物的实际方法是本领域熟练技术人员所熟知的，并在许多出版物中有详细的描述，如，Remigton′s PharmaceutialScience，15版，Mack Publishing Company,Easton，Pennsylvania(1980)和美国专利5,583,153，5,565,478,5,496,804，和5,484,809。通常的剂量，如腹膜内给药，是每周20-150mg/m2，或者每3周250mg/m2。
含有辅助抗癌剂的组合物可施用于治疗应用中。在治疗应用中，对于患有表现出一种或多种细胞类型过度增殖的疾病的患者，施用足够数量的该组合物，以治愈或至少阻止该疾病和/或其并发症。可够完成此目的的剂量被称作“有疗效剂量”。为此目的的有效剂量依赖于疾病的严重程度和患者的总体状态。
根据所需的剂量和频率以及患者的耐受程度，该组合物可进行单一或多次给药。在任何情况下，组合物应提供足够量的辅助抗癌剂，以达到对患者的有效治疗。
II.肿瘤抑制基因和基因产物A)优选的已知的肿瘤抑制因子如上所述，在一个实施方案中，本发明提供了通过将细胞与肿瘤抑制核酸以及辅助抗癌剂(如紫杉醇、紫杉醇衍生物或紫杉醇的类似物)接触抑制细胞的生长和/或增殖的方法。
肿瘤抑制基因是本领域熟练技术人员所熟知的，它包括，但不限于RB，p53，APC，FHIT(见，如，Siprashvili(1997)美国科学院研究进展，9413771-13776)，BRACA1和BRCA2，VHL，WT，DCC，FAP，NF，MEN，E-钙粘着蛋白，nm23，MMACI和PTC。RB或称视网膜母细胞瘤基因是原型肿瘤抑制因子，已经得到了很好的鉴定(见，Booksterin(1990)科学247712-715，Benedict(1980)癌症调查8535-540，Riley(1990)细胞生物学年度评论10-1-29，和Wienberg(1992)科学2541138-1146。已经得到最好的鉴定的肿瘤抑制因子可能是p53，它涉及到许多新生肿瘤，以及在具有Li-Fraumeni综合症家族中具有发育成多种肿瘤的遗传易感性中(见，如，Wills(1994)人类基因治疗51079-1088，美国专利5,532,220，WO 95/289048，和Harris(1996)国家癌症研究杂志，88(20)1442)，文中描述了在基因治疗中p53的克隆表达和应用)。其他的肿瘤抑制因子包括Wilms氏肿瘤中的WT(即，11p13处的WT1)基因特征(见，Call等(1990)细胞，60509-520，Gessler(1990)自然343774-778，和Rose等(1990)细胞，60495-508)。被称作FHIT的肿瘤抑制因子，即脆弱组氨酸三联体，据发现位于3号染色体上(3p14.2，也有报道在3p21)，特别具有转座、断裂的倾向，其形成的缺口据信会导致食道癌，胃癌和结肠癌(见，如，Ohta等(1996)细胞，84587-597，GenBank序列号U469227)。肿瘤抑制基因DCC(18q21)和FAP与结肠癌相关(见，如，关于DCC的Hedrick等(1994)基因发育，8(10)1174-1183，GenBank序列号X76132，和关于FAP的Wienherg(1992)科学，2541138-1146)。NF肿瘤抑制因子(位于17q11的NF1和位于22q12的NF2)与神经肿瘤相关(如，NF1的神经纤维瘤，见Caivthon等(1990)，细胞，62193-201，Viskochil等(1990)，细胞，62187-192，Wallace等(1990)，科学，249181-186，和Xug等(1990)细胞，62599-608；和NF2的脑膜瘤和许旺细胞瘤)。肿瘤抑制因子MEN与多种内分泌成瘤综合症中的肿瘤相关(见，如，Wienberg科学，2541138-1146，和Marshall(1991)细胞，64313-326)VHL肿瘤抑制因子与von Hippel-Landau疾病相关(Latif(1993)，科学，26066-71，GenBank序列号L15409)。广泛公布的BRCA1和BRCA2基因于乳癌相关(见，如，关于BRCA1的Skolnick(1994)，科学，26666-71，GenBank序列号U14680，和关于BRCA2的Teng(1996)，自然遗传学，13241-244，GenBank序列号U43746)。另外，E-钙粘着蛋白与前列腺癌的侵袭性表型相关(Umbas(1992)癌症研究525104-5109，Bussemaker(1992)癌症研究，522916-2999，GenBank序列号272397)。NM23基因与肿瘤的转移相关(Dooley(1994)人类遗传学，93(1)63-66，GenBank序列号75598)。其他肿瘤抑制因子包括，与胰腺癌相关的DPC4(经鉴定位于18q21)，与结肠癌相关的hMLH1(3p)和hMSH2(2p)，与黑色素瘤，胰腺癌和食道癌相关的CDKN2(p16)和(9p)。最后，人PTC基因(果蝇修补基因(ptc)的同源基因)与痣样基细胞癌瘤综合症(NBCCS)和体基细胞癌瘤相关(见，如Hahn等，(1996)，细胞，85；841-851)。这些肿瘤抑制因子的列举并不完全，不是作为一种限制，而只是作为对大量的已知的肿瘤抑制因子的说明。
B)对先前未知的肿瘤抑制因子的鉴定和筛选对肿瘤抑制因子的鉴定和试验的方法是本领域熟练技术人员所熟知的。筛选典型的过度增殖细胞，寻找与其过度增殖相关的基因或突变。将基因确定为肿瘤抑制基因(TSG)的最有说服力的实验是该基因能够抑制肿瘤或来自肿瘤的细胞的肿瘤发生表型。将肿瘤抑制核酸优选地以在适当表达载体上克隆的cDNA形式引入到肿瘤细胞中，或者通过微细胞转移技术将带有候选肿瘤抑制基因的染色体引入肿瘤细胞。还可以，将肿瘤抑制基因产物(如，肿瘤抑制多肽)引入到细胞中，测量该细胞的增殖率(如，计数细胞或测量肿瘤体积等)。对增殖完全或部分抑制、细胞分化和凋亡，都是肿瘤发生表型被抑制(对肿瘤状态降低了易感性)的标志。
筛选肿瘤以确定改变了的或者表达降低的核酸的方法是本领域熟练技术人员所熟知的。这种方法包括，但不限于减数杂交(见，如，Hampson(1992)核酸研究，202899)，比较基因组杂交((CGH)，见，如WO93/18186，Kallioniemi(1992)，科学，258818)，和利用核酸探针的高密度矩阵进行的表达检测(见，如，Lockhart(1996)，自然生物技术，14(13)1675-1680)。
C)p53和其他肿瘤抑制因子的制备如上所述，本发明涉及将在例如体外生理溶液(如，血液)中的、在组织器官或生物体中的细胞与肿瘤抑制核酸或肿瘤抑制基因产物如多肽相接触。这些肿瘤抑制核酸或多肽可以是已知的肿瘤抑制因子包括，但不限于上述的RB，p53，h-NUC(Chen(1995)同上)，APC，FHIT，BRACA1，BRCA2，VHL，WT，DCC，FAP，NF，MEN，E-钙粘着蛋白，nm23，MMACI，和PTC中的任何一种的核酸或多肽。在一个优选的实施方案，肿瘤抑制因子是RB核酸或多肽或者p53核酸或多肽或者它们的活性片段。
在一个最优选的实施方案，p53或RB肿瘤抑制核酸存在于表达盒上，受启动子的控制，在靶细胞(如，肿瘤)内时表达肿瘤抑制基因或cDNA。构建这样的表达盒和/或编码肿瘤抑制基因的载体的方法是本领域熟练技术人员所熟知的，并在后文中有所描述。
1.肿瘤抑制核酸的制备本发明的编码肿瘤抑制蛋白或蛋白亚序列的DNA可以通过任何适当的方法制备，包括，例如，克隆和对适当序列的限制酶切，或者直接的化学合成(如，利用上文所述的已有的序列信息)，使用的方法有，诸如磷酸三酯法(Narang(1979)酶学方法，6890-99)；磷酸二酯法(Brown等，方法酶学，68109-151)；磷酰胺法(Beaucage等，tetra.Lett.，221859-1862(1981))；和固相载体方法(美国专利4,458,066)。
化学合成产生单链寡核苷酸。通过与互补序列杂交，或者将单链作为模板通过DNA聚合酶的聚合反应它可以转化成双链DNA。熟练技术人员能够认识到，化学合成的DNA局限于约100个碱基的序列，所以较长的序列可以通过短序列的连接而获得。
另外，可以克隆亚序列并用适当的限制酶切割适当的亚序列。然后将片段连接产生所需的DNA序列。
在一个实施方案中，本发明的肿瘤抑制核酸可以通过DNA扩增方法诸如聚合酶链反应(PCR)来克隆。因而，例如，利用含有一种限制位点(如，NdeI)的有义引物和含有另一种限制位点(如，HindIII)的无义引物，通过PCR扩增核酸序列或亚序列。这样可以产生编码所需的肿瘤抑制因子序列或亚序列并且带有末端限制位点的核酸。此核酸然后可以容易地连接到含有编码第二个分子并且带有适当的相应的限制位点的载体上。本领域熟练技术人员可以根据已经发表的任何特定的已知的肿瘤抑制基因、cDNA或蛋白的信息，确定出合适的PCR引物。通过定点诱变将适当的限制位点加入到编码肿瘤抑制蛋白或蛋白亚序列的核酸中。将含有肿瘤抑制因子序列或亚序列的质粒用适当的限制性核酸内酶切割，然后按照标准的方法连接到编码第二个分子载体上。
如上所述，许多肿瘤抑制核酸序列是已知的。例如，p53的核酸序列在Lamb等，(1986)，分子细胞生物学，61379-1385中(GenBank序列号M13111)有所描述。类似地，RB的核酸序列在Lee等，(1987)，自然，329642-645中(GenBank序列号M28419)有所描述。其他的肿瘤抑制核酸序列从前文II(a)的所述中获得。利用可获得的序列信息，本领域的不同技术人员可以将肿瘤抑制基因克隆到适合于本发明实验的载体中。
p53和RB肿瘤抑制因子在本发明的方法中是尤为优选应用的。将p53和RB克隆到适合表达相应的肿瘤抑制蛋白的载体中的方法是本领域熟练技术人员所熟知的。例如，p53的克隆和应用的详细描述可参见Wills(1994)，同上；美国专利5,533,220，及1994年10月25日申请的USSN 08/328,673，和WO95/1 1984。通常表达盒构建成将肿瘤抑制因子cDNA可操作性地连接于启动子，优选地是强启动子(如，Ad2主要晚期启动子(Ad2 MLP)，或者人巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV))。在特别优选的实施方案，启动子后面跟有三联前导cDNA，肿瘤抑制因子cDNA后面跟有多聚腺苷酰化位点(如，E1b多聚腺苷酰化位点)(见，如，USSN 08/328,673，WO95/11984和Wills(1994)同上)。可以理解的是，不同的组织特异性启动子也是合适的。例如，酪氨酸酶启动子可用于黑色素瘤的定向表达(见，如，Siders(1996)癌症研究，565638-5646)。在特别优选的实施方案，肿瘤抑制因子cDNA在适合于基因治疗的载体上表达，如下文所述。
2.肿瘤抑制蛋白的制备a)从头化学合成利用已知的肿瘤抑制多肽序列，肿瘤抑制蛋白或其亚序列可以通过标准的化学多肽合成技术合成。若所需序列相对小(如，需要特定的抗原决定蔟)，该分子则可以作为单一的连续多肽来合成。如需要的是大分子，可以分开(以一或多个单位)合成序列，然后再通过将一个分子的氨基端与另一个分子的羧基端缩合而形成肽键进行融合。
本发明的多肽的化学合成是固相合成，序列的C端附着于不溶性支撑物，在序列上顺序添加其余氨基酸。固相合成技术的描述可见Barany和Merrifield的′固相多肽合成′；pp.3-284，多肽分析、合成、生物学，Vo1.2多肽合成特殊方法，a部分，Merrifield等，美国化学协会杂志，852149-2156(1963)，和Stewart等，固相多肽合成，第二版，Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill.(1984)。
b)重组表达在一个优选的实施方案，肿瘤抑制蛋白或其亚序列通过重组DNA技术合成。这通常包括制造编码融合蛋白的DNA序列，将该DNA置于受特定的启动子控制的表达盒中，在宿主中表达该蛋白，分离表达的蛋白并，如需要，使蛋白复性。
将肿瘤抑制核酸克隆入特定的载体上的方法如上所述。编码肿瘤抑制蛋白或蛋白亚序列的核酸然后可在各种宿主细胞中表达，包括大肠杆菌、其他的细菌宿主、酵母、和各种高等真核细胞如COS、COH和Hela细胞系和骨髓瘤细胞系。由于肿瘤抑制蛋白通常发现于真核生物中，所以真核宿主是优选的。对于各种宿主重组蛋白基因应可操作性地连接适当的表达控制序列。对于大肠杆菌来说，它包括启动子诸如T7、trp、或λ启动子，核糖体结合序列以及优选地转录终止信号。对于真核细胞来说，控制序列包括启动子和优选地衍生自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子，和多聚腺苷酰化序列，还可以包括剪接供体和受体序列。
本发明的质粒可通过所熟知的方法，诸如大肠杆菌的氯化钙转化和哺乳动物细胞的磷酸钙处理或电转移，转入选择的宿主中。用质粒的转化细胞可通过质粒上含有的抗生素抗性基因，如amp，gpt，neo，hyg基因，提供的抗性来选出。
表达后，重组肿瘤抑制蛋白可按本领域标准的程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，凝胶电泳等等(见，一般性地，R.Scopes，蛋白纯化，Spriger-Verlag，N.Y(1982)，Deutscher，酶学方法，vol.182蛋白纯化指导，学术出版公司，N.Y(1990)。优选的是90％-95％纯度的基本纯的组合物，更为优选的是98-99％或更高纯度。经过部分的或者达到所需纯度的纯化之后，多肽则可以使用了(如，作为抗体生产的免疫原)。
本领域的熟练技术人员能够认识到，化学合成，生物表达，或者纯化之后，肿瘤抑制蛋白会具有与该组成多肽的天然构象不同的构象。这种情况下，需要变性并使多肽还原，然后使得多肽重新折叠成优选的构象。还原和变性蛋白以及诱导重新折叠的方法是本领域的熟练技术人员所熟知的(见，Debinski(1993)，生物化学杂志，26214065-14070；Kreitman(1993)生物结合化学，4581-585；和Buchner(1992)分析化学，205263-270)。例如，Debinski(1993)，同上，描述了在胍-DTE中的包涵体蛋白的变性和还原。蛋白然后在含有氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲液中重新折叠。
熟练技术人员能够认识到，本文描述的核酸和多肽序列的许多保守型变异可以产生功能上相同的产物。例如，根据遗传密码简并性，“沉默取代”(即，不导致编码的多肽改变的核酸序列的取代)对于任何编码氨基酸序列的核酸序列都有此内在的特性。类似地，“保守氨基酸取代”也可以容易地确定，即在氨基酸序列上的一个或几个氨基酸，被其他的具有高度相似特性的氨基酸取代，从而与公开的氨基酸或者公开的编码氨基酸的核酸具有高度相似性。这种对各个明确描述的序列的保守型取代变异也是本发明的特征。
熟练技术人员能够认识到，可以对肿瘤抑制蛋白进行修饰而不降低其生物活性。一些修饰可以帮助克隆、表达、或者将靶分子连接入融合蛋白。这种修饰是本领域的熟练技术人员所熟知的，包括，例如，在氨基端加上甲硫氨酸以提供起始位点，或在某一端加上附加的氨基酸(如，多His)以产生方便的定位限制位点或终止密码子或纯化序列。
对核酸和多肽的修饰可以利用常规技术通过对所设计的特性进行适当的试验来评估。例如，多肽的免疫学特征的改变可以通过适当的免疫学试验来检测。其他的特性的修饰诸如核酸与靶核酸的杂交、蛋白的氧化还原或温度稳定性、疏水性、蛋白水解的敏感性、或者聚集的趋势都可以按照标准技术进行试验。
D)肿瘤抑制因子向靶细胞的输送本发明的肿瘤抑制因子可以以蛋白或核酸的形式被引入细胞。若肿瘤抑制因子是作为蛋白而提供，肿瘤抑制基因的表达产物(如，p53或RB多肽或其具有肿瘤抑制因子活性的片段)则可以通过标准的蛋白输送方法(见下文的讨论)运入靶细胞。另外，若肿瘤抑制因子是核酸(如，基因、cDNA、mRNA等等)，可以通过常规的向细胞输送核酸的方法将核酸引入细胞。这些方法通常包括如下文所述的体内或回体基因治疗的方法。特别优选的输送p53或RB的方法包括脂类或脂质体输送和/或使用逆转录病毒或腺病毒载体。
1.体内基因治疗在一个优选的实施方案，将肿瘤抑制核酸(如，编码肿瘤抑制蛋白的cDNA)克隆到能够体内和/或体外转染细胞(诸如人或其他哺乳动物细胞)的载体上。
利用了几种体内、回体和体外向细胞导入核酸的方法。它们包括基于脂类或脂质体的基因输送(WO96/18372；WO93/24640；Mannino(1988)生物技术，6(7)682-691；Rose，美国专利5,279,833；WO91/06309；和Felgner(1987)，美国科学院研究进展，847413-7414，及复制缺陷型的逆转录病毒载体，其上带有作为逆转录病毒基因组的一部分的治疗性多核苷酸(如，Miller(1990)，分子细胞生物学，104239(1990)；Kolberg(1992)，NIH研究杂志，43，和Cornetta(1991)，人类基因治疗，2215。
关于基因治疗程序的综述，可参见，如，Zhang(1996)，癌症转移综述，15385-401；Anderson，科学，(1992)256808-813；Nabel(1993)TIBTCH 11211-217；Mitani(1993)TIBTCH 11167-175；Miller(1992)自然，357455-460；Van Brunt(1988)生物技术6(10)1149-1154；Vigne(1995)恢复神经学与神经科学835-36；Kemer(1995)英国医学公告51(1)31-44；Haddada(1995)微生物学和免疫学当代观点，Doerfler和Bohm(eds)Springer-Verlag，Heidelberg Germany；和Yu(1994)基因治疗，113-26。
本发明的实践中所使用的载体通常来自病毒基因组。可使用的载体包括重组修饰的有包膜的或无包膜的DNA和RNA病毒，优选的可以选自杆状病毒科，细小病毒科，picomoviridiae，疱疹病毒科，痘病毒科，腺病毒科或小RNA病毒科。还可以使用嵌合载体，其综合获得各个父本载体特性的优点(如，Feng(1997)自然生物技术，15866-870)。这些病毒基因组可以通过重组DNA技术进行改造，使得含有肿瘤抑制基因，并可被设计成为复制缺陷型，条件复制型或复制型。本发明优选的实践中，载体是复制缺陷的或条件复制的。优选的载体来自腺病毒、腺相关病毒和逆转录病毒。在本发明最为优选的实践中，载体是来自人腺病毒基因组的复制机能不全的载体。
使用条件复制型病毒以进行特定细胞内的选择表达，而防止不必要的广谱感染。条件复制型载体的实例可参见Bischoff等(1996)科学，274373-376；Pennisi，E.(1996)科学274342-343；Russell，S.J.(1994)欧洲癌症杂志30A1165-1171。此外，可以将载体修改使之含有诱导型启动子，从而只在特定的条件下才能完成转基因的复制和表达。诱导型启动子的实例在科学文献中可以得知(见，如，Yoshida和Hamada(1997)生物化学与生物物理学研究评论230426-430；Iide等(1996)病毒学杂志70(9)6054-6059；Hwang等(1997)病毒学杂志71(9)7128-7131；Lee等(1997)分子细胞生物学，17(9)5097-5105；和Dreher等(1997)生物化学杂志272(46)29364-29371。转基因还可以受组织特异的启动子区域控制，从而使转基因只在特定的细胞类型中表达。
广为使用的逆转录病毒包括那些源于鼠白血病病毒(MuLV)，长臂猿白血病病毒(GaLV)，猿免疫缺损病毒(SIV)，人免疫缺损病毒(HIV)，以及它们的联合的病毒。见，如，Buchscher(1992)病毒学杂志，66(5)2231-2239；Johann(1992)病毒学杂志，66(5)1635-1640；Sommerfelt(1990)病毒学，17658-59；Wilson(1989)病毒学杂志，632374-2378；Miller(1991)病毒学杂志，652220-2224；Wong-Staal等，PCT/US94/05700；和Rosenburg和Fauci(1993)的＂基础免疫学＂，第3版，Paul(ed)Raven出版，New York及其参考文献，和Yu(1994)同上)。载体任选地可以是假型的，从而使载体的宿主范围扩大到那些不被相应于该载体的逆转录病毒感染的细胞。利用水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白(VSV-G)构建VSV-G-假型HIV载体，它可以感染造血干细胞(Naldini等(1996)科学272263，和Akkina(1996)病毒学杂志，702581)。
基于腺相关病毒(AAV)的载体也可以用于携带靶核酸转导细胞，如，在核酸和肽的体外生产，和体内及回体的基因治疗过程中。关于AAV载体的概况可见，Okada(1996)基因治疗，3957-964；West(1987)病毒学，16038-47；Carter(1989)美国专利4,797,368；Carter等WO93/24641(1993)；Kotin(1994)人类基因治疗，5793-801；Muzyczka(1994)临床调查杂志，941351。重组AAV载体的构建在很多的出版文献中有所描述，包括，Lebkowski，美国专利5,173,414；Tratschin(1985)分子细胞生物学，5(11)3251-3260；Tratschin(1984)分子生物学，42072-2081；Hermonat(1984)美国科学院研究进展，816466-6471；McLaughlin(1988)和Samulski(1989)病毒学杂志，6303822-3828。可被AAV转化的细胞系包括文献Lebkowski(1988)分子细胞生物学，83988-3996中所述的那些。其他合适的病毒载体包括疱疹病毒和牛痘病毒。
在特别优选的实施方案，肿瘤抑制基因在适合于基因治疗的腺病毒载体中表达。体内应用腺病毒载体，并用于基因治疗在专利和科学文献中有详细的描述，如，见Hermens(1997)神经科学方法杂志，Jan，71(1)85-98；Zeiger(1996)外科学120921-925；Channon(1996)心血管研究，32962-972；Huang(1996)基因治疗3980-987；Zepeda(1996)基因治疗3973-979；Yang(1996)人类分子遗传学，51703-1712；Caruso(1996)美国科学院研究进展9311302-11306；Rothmann(1996)基因治疗，3919-926；Haechker(1996)人类基因治疗71907-1914。腺病毒载体的应用在WO96/25507中有详细的描述。特别优选的腺病毒载体在Wills(1994)同上；以及USSN08/328,673和WO95/11984中有所描述。
特别优选的腺病毒载体包括蛋白IX基因的部分或全部的缺失。在一个实施方案中，腺病毒载体包括E1a和E1b序列的缺失。在最为优选的实施方案，腺病毒结构是p53编码结构，诸如，A/C/N53或者A/M/N/53(见，如，USSN 08/328/673，和WO95/11984)。
优选的还有衍生于人腺病毒2型和5型的载体。这种载体优选地由于E1a和E1b编码区域的修饰或缺失而成为复制缺陷型。其他可以产生特定的表达特性或允许重复给药或降低免疫反应等对病毒基因组的修饰也是优选的。更为优选的是E4编码区完全或部分缺失，任选地保留E4 ORF6和ORF6/7的重组腺病毒载体。E3编码序列可以缺失但优选的是保留。优选地，E3的启动子操纵子区被修饰以增加E3的表达，从而使该治疗载体有更有利的免疫学特性。最为优选的是人腺病毒5型载体，其中含有巨细胞病毒启动子控制下的编码p53的DNA序列，和CMV启动子控制下带有E3的三联前导序列，和保留了E4 ORF6和ORF6/7的E4编码区的缺失。如在此所例举的，在本发明最为优选的实践中，此载体为ACN53。
在一个特别优选的实施方案，肿瘤抑制基因是p53或RB。如上文所解释的，p53的克隆和应用的详细描述可见Wills(1994)同上；及USSN 08/328,673(1994年10月25日申请)，和WO95/11984。
2.回体基因治疗在一个实施方案中，本发明的方法可用于抑制研究对象(如，哺乳动物包括但不限于大鼠，小鼠，牛，猪，马，犬，猫，兔，或人)中过度增殖的(例如肿瘤)细胞。病理学过度增殖细胞表现的特征性病状包括但不限于Grave氏病，牛皮癣，良性前列腺肥大，Li-Fraumei综合症，乳腺癌，肉瘤，膀胱癌，结肠癌，肺癌，各种白血病和淋巴瘤，及其它肿瘤。
本发明的回体应用提供了使得适当取样的病理过度增殖细胞消除的方法。因此，例如在骨髓重建中混在造血前体中的过度增殖细胞可以通过本发明方法的回体应用被消除。通常该方法包括从被研究个体中获得样品，样品通常是异质性细胞制备物，含有正常表性的细胞和病状(过度增殖)细胞。按照本发明的方法，将样品与肿瘤抑制核酸或蛋白和辅助抗癌剂相接触。肿瘤抑制基因通过病毒载体，诸如逆病毒载体或腺病毒载体输送。该治疗降低了病态细胞的增殖，从而得到的样品中含有的正常细胞对病态细胞比的值更高，它可以重新导回至被研究的生物体中。
用于诊断、研究、或基因治疗(如，通过宿主生物中转化细胞的再注入)的回体细胞转化是本领域熟练技术人员所熟知的。在一个优选的实施方案，从被研究生物体中分离细胞，用本发明的肿瘤抑制基因转化，并再注回被研究个体(如，病人)。各种适合于回体基因治疗的细胞是本领域熟练技术人员所熟知的。特别优选的细胞是祖细胞或干细胞(见，如Freshney(1994)动物细胞培养，基本技术手册，第3版，Wiley-Liss，New York，及其在讨论怎样分离和培养病人的细胞时的参考文献)。转化的细胞通过本领域所熟知的方法培养。见，Kuchler(1997)细胞培养和病毒学中的生物化学方法，Kuchler，R.J.，Dowden，Hutchinson和Ross Press，Boca Roton，F1。哺乳动物细胞系统通常是单层细胞的形式，虽然也使用哺乳动物细胞的悬浮液。另外，细胞也可以来自细胞库的储存品(如，血库)。作为说明性的哺乳动物细胞系的实例包括HEC-1-B细胞系，VERO和Hela细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，W138，BHK，Cos-7或MDCK细胞系(见，如Freshney，同上)。
在一个特别优选的实施方案，在细胞转化和基因治疗的回体程序中使用干细胞。使用干细胞的优点在于，它可以体外分化成其他的细胞类型，或被引入到哺乳动物中(如细胞供体)而移植入骨髓。利用细胞因子诸如GM-CSF，IFNγ和TFNα，体外分化干细胞(如，CD34+干细胞)成为临床上重要的免疫细胞类型的方法是已知的(见，如Inaba(1992)实验医学，1761693-1702；Szabolcs 91995)，1545851-5861)。
在一些实施方案的回体程序中，没有使用干细胞而使用T细胞或B细胞。已经知道几种技术可以用于分离T和B细胞。表面标记的表达可助于这些细胞的鉴定和纯化。鉴定和分离细胞的方法包括FACS，用备好的可结合特定细胞类型的抗体摇瓶培养并用磁珠筛选。
利用已知的方法分离干细胞用于转导和分化。例如，在小鼠中，通过处死小鼠并用剪刀切开腿骨，分离骨髓细胞。通过抗体的淘选从骨髓中分离干细胞，该抗体可结合不需要的细胞，诸如CD4+和CD8+(T细胞)，CD45+(panB细胞)，GR-1(粒细胞)，和Iab(分化的抗原呈递细胞)。此方法的实例可参见，如，Inaba(1992)同上。
对于人优选的是从髂骨嵴吸取骨髓，如，在手术室内全身麻醉下进行。骨髓吸取的数量大约为1000ml，从后髂骨和嵴中收集。如果收集的细胞总数小于2×108/kg，则在后髂骨嵴之外进行胸骨和前髂骨嵴的第二次吸取。手术中施用照射的包装的红细胞以替代吸取的骨髓体积。人的造血前体和干细胞通过CD34表面膜抗原的存在来鉴定。该抗原可用于纯化，如，在结合CD34的亲和柱上。收集了骨髓之后，通过ficol梯度离心将单核细胞与其他成份分开。这可以利用细胞分离器(Baxter Fenwal CS3000+或者Terumo仪器)通过半自动的方法来进行。收集的低密度的细胞大多由单核细胞组成，将细胞置于塑料瓶内于约37℃温育大约1.5小时。弃去贴壁细胞(单核细胞、巨噬细胞和B细胞)。然后收集非贴壁细胞并与单克隆抗CD34的抗体(如，鼠抗体9C5)于4℃轻摇温育30分钟。抗CD34的抗体的终浓度优选地为10μg/m1。洗涤两次之后，按照大约2个细胞/微球的比例加入包被有羊抗鼠IgG(Fc)的顺磁性微球(如，Dyna Beads，Baxter免疫治疗小组，Santa Ana，California提供)。进一步在4℃温育约30分钟后，用磁体收集带有磁珠的莲座细胞。加入200U/ml终浓度的Chymopapain(Baxter免疫治疗小组)，以释放磁珠上的CD34+细胞。
另外，更为优选的，可以使用亲和柱分离步骤，其结合CD34或结合与CD34结合的抗体(见，如，Ho(1995)干细胞，13(增3)100-105和Brenner(1993)血液治疗27-17)。
在另一个实施方案，可以从胎儿脐带血中分离造血干细胞。Yu(1995)美国科学院研究进展，92699-703中描述了优选利用逆转录病毒载体转导来自人胎儿脐带血CD3+细胞的方法。
3.表达肿瘤抑制因子的核酸的施用载体和表达盒给药途径含有本发明的治疗用表达肿瘤抑制因子的核酸的表达盒和载体(如，逆转录病毒，腺病毒，脂质体等等)，可以直接对生物体施用以进行体内细胞转导。给药可以通过如前文所详细描述的任何辅助抗癌剂通常使用的给药途径，如系统地、区域地、或局部地，导入分子使之最终接触血液或组织细胞。“包装的”核酸(至少是带有启动子的肿瘤抑制因子编码序列)的给药可以任何适当的形式，优选的是与药学可接受的载体一起，如前文所述。这种包装的核酸的适当的给药方法是已建立的并为本领域熟练技术人员所熟知的，而且，虽然可以有多种途径来施用某一特定组合物，但是某特定的途径通常可以比其他途径提供更为直接和更为有效的作用。
例如，施用表达肿瘤抑制基因的重组腺病毒载体可以诱发抗腺病毒载体的免疫应答，特别是抗体应答。一些患者可能具有已经存在的抗腺病毒反应的抗体。因而，在某些情况下，表达肿瘤抑制因子的腺病毒载体的区域或局部的给药比系统给药更为优越更为有效。例如，如下文所讨论的，对临床病情限于腹腔的卵巢癌的区域性p53基因治疗，如，腹膜内(IP)给药，应作为优选的治疗方案。重组腺病毒的IP给药还可导致腹膜衬的感染以及腺病毒载体吸收进入系统循环内(区域给药的其它方式也会导致腺病毒载体进入系统循环中)。此效应的程度取决于IP给药的病毒颗粒的浓度和/或总量。如果需要系统效应，那么在连续的几天内可以优选地施用较高的浓度。
本发明的表达肿瘤抑制因子的腺病毒载体的局部给药在某些情况下也是优选的，如，当患者已经具有抗腺病毒反应的抗体时。这种“局部给药”可以是，如，内部的肿瘤内注射或者是外部的粘膜应用。另外，“局部给药”的效力可以通过使腺病毒载体靶向肿瘤而得到提高，如，利用脂质体上或腺病毒载体自身上的肿瘤特异抗原识别剂(如抗体)。
配方药学可接受的载体根据情况依据所施用的特定的组合物以及施用该组合物的特定的方法来确定。因此，存在着各种各样的本发明的药物组合物的合适配方。
适于口服施用含有表达肿瘤抑制因子的核酸的药物组合物的配方可以组成有(a)液体溶液，诸如悬于水、盐水或PEG400中的有效量的包装的核酸；(b)胶囊、锭剂或片剂，各自含有定量的液体，固体，粒状或胶体的活性成份；(c)适当液体中的悬液；和(4)适当的乳剂。片剂形式可包括一种或多种的乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇，磷酸钙，玉米淀粉，土豆淀粉，西黄蓍胶，微晶纤维素，阿拉伯胶，明胶，胶体二氧化硅，滑石粉，硬脂酸镁，硬脂酸，和其他的赋型剂，着色剂，填充剂，结合剂，稀释剂，缓冲剂，湿润剂，保存剂，调味剂，染料，分解剂，和具有药学相容性的载体。锭剂形式可以包括在调味剂中通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶中的活性成份，而含片形式是在惰性基质中含有活性成份，这些基质是诸如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯乳胶，凝胶等等，除了活性成份之外还含有本领域所知的载体。
可将包装的核酸，单独或者联合其他适当的成份，制成气雾剂配方(如，它们可以用来“喷雾”)以通过吸入给药。可将气雾剂配方置于加压的可接受的挥发剂中，诸如二氯二氟甲烷，丙烷，氮气等等。
直肠给药的合适配方包括，例如，栓剂，它由包装的核酸栓剂基质组成。合适的栓剂基质包括天然的或合成的甘油三酯或石蜡碳氢化合物。此外，还可以用明胶直肠胶囊，它由包装的核酸与包括，例如液态甘油三酯、聚乙烯乙二醇和石蜡碳氢化合物的基质联合组成。
肠道外给药的，诸如关节内(在关节处)，静脉内，肌肉内，真皮内，腹膜内，和皮下途径，合适配方包括水相的和非水相的等渗无菌注射溶液，它可以含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂，和可使该配方与患者血液等渗的溶质，以及水相的和非水相的无菌悬浮液，包括悬浮剂，稳定剂，增稠剂，助溶剂，和保持剂。在本发明的实践中，组合物的给药可以通过，例如，静脉灌输，口服，局部给药，腹膜内，膀胱内和鞘内给药。肠道外给药和静脉内给药是给药的优选方法。包装的核酸的配方可以以单位剂量或者多次剂量的封装容器形式提供，诸如安瓿和管瓶。
作为注射溶液或悬液的本发明的配方可以从前面所述的无菌粉剂、颗粒和片剂来制备。配方中准确的组合物，配方中试剂和核酸的浓度，其pH值，以及其他参数将依据给药的方式和位点(如，采用系统、区域还是局部给药)以及特定的药物组合物的储存、操作、运输和保存期的要求而变化。基于特定要求的这些配方参数的最佳值可以通过常规的方法确定；可以利用任何已知的注射用配方的成份和参数。合适的配方的实例是，如，浓度约为7.5×1011至7.5×1010颗粒/ml的本发明的重组野生型表达p53的腺病毒载体，0.42mg/ml的磷酸钠一水化合物，2.48mg/ml的磷酸钠二酸酐，5.8mg/ml氯化钠，20.0mg/ml蔗糖，0.4mg/ml氯化镁六水化合物，通常以1.0ml的剂量储存。
前文中所描述的回体治疗中的包装核酸的转导细胞也可以通过如上所述的静脉内或肠道外给药。
本发明中所述的对患者的给药剂量，应当足够在一定时间内在患者体内产生有效的治疗反映。剂量的确定应当根据所用的特定的载体的效力和患者的病况，以及受治疗患者的体重和表面积。剂量的大小还应根据特定的载体或转导的细胞类型对特定的患者给药所伴随的不利副作用的存在、特点、和范围。
为了确定治疗中载体给药的有效剂量，医生应当对载体的循环血浆水平、载体的毒性、疾病的进程、和抗载体抗体的产生进行评估。核酸的典型剂量在很高程度上是基于给药途径和基因输送系统的。根据输送方法剂量可以很容易的确定为约1μg至100mg或更高的范围内。通常，相当于载体上裸露的核酸的剂量对于70公斤的患者来说从约1μg至100μg，从而可以计算出包括有病毒颗粒的载体的剂量，它应能产生相当数量的治疗核酸。
在给药时，大规模应用和患者总体健康的情况下，可根据载体或转导细胞类型的LD50值，和不同浓度下载体或细胞类型的副作用，确定出本发明的转导细胞的给药水平。可以通过下文所述的单一剂量或分开的剂量完成给药。
在优选的实施方案，在灌输之前，应当获取并保存血样进行分析。利用脉冲血氧计精确监测生命指征和氧饱和度。优选地在灌输后5分钟和1小时获取血样并保存以进一步分析。在回体治疗中，白细胞提取法，转导和再灌输可以每2至3个月重复一次。第一次治疗后，灌输可以在临床医生的指导下以门诊病人的形式进行。如果以门诊病人的形式进行再灌输，那么在治疗后病人应当至少监测4小时，优选的是8小时。
如上所述，腺病毒结构可以系统给药(如静脉内)，区域给药(如，腹膜内)或局部给药(如，肿瘤内或肿瘤周围或胞囊内注射，如治疗膀胱癌)。特别优选的给药方法包括动脉内注射，更为优选的是肝动脉内注射(如，对肝肿瘤的治疗)，或者，当需要向脑肿瘤输送组合物时，优选的是颈动脉或者颈动脉系统的动脉(如，枕动脉，耳动脉，颞动脉，脑动脉，上颌动脉，等等)。对于治疗肺癌的输送可以通过，例如，支气管镜来完成。通常这种给药以如上所述的水相药学可接受的缓冲液进行。然而，在特别优选的实施方案，腺病毒结构或者肿瘤抑制因子的表达盒以脂类配方，更为优选地与脂质体构成脂类/核酸复合物(如，Debs和Zhu(1993)WO93/24640；Mannino(1988)同上；Rose，美国专利5,279,833；Brigham(1991)WO91/06309；和Felgner(1987)同上中所述)或者包被于脂质体胶囊中，更为优选地存在于导向特异的肿瘤标记的免疫脂质体中。能够理解的是，这种脂类配方也可以局部、系统、或通过气雾剂给药。
4.增强肿瘤抑制因子的输送肿瘤抑制因子的输送可以通过利用一种或多种“输送增强剂”而得到增强。“输送增强剂”是指，可以增强治疗基因诸如肿瘤抑制因子输送至癌组织或器官的制剂。这种被增强的输送可通过各种机制获得。一种机制涉及到器官或组织(如膀胱)上皮表面的保护性粘多糖层的破坏。这种输送增强剂的实例有去污剂，醇类，乙二醇类，表面活性剂，胆盐，肝素拮抗剂，环氧合酶抑制剂，高渗盐溶液，和醋酸盐。醇类包括例如脂肪醇诸如乙醇，N-丙醇，异丙醇，丁醇，乙酰醇。乙二醇类包括甘油，丙二醇，聚乙二醇和其他的低分子量乙二醇类诸如甘油和硫代甘油。醋酸盐诸如醋酸，葡糖醋酸，和醋酸钠也是输送增强剂的实例。如1M NaCl的高渗盐溶液也是输送增强剂的实例。表面活性剂的实例有十二烷基磺酸钠(SDS)和溶血卵磷脂，聚山梨酸酯80，壬基苯氧基聚氧乙烯，溶血磷脂酰胆碱，聚乙二醇400，聚氧化乙烯醚，聚乙二醇醚表面活性剂和DMSO。胆盐诸如牛磺胆酸盐，脱氧牛磺胆酸钠，脱氧胆酸盐，鹅脱氧胆酸盐，甘氨胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，以及其他收敛剂诸如硝酸银也可以使用。肝素拮抗剂例如季胺如硫酸谷醇溶蛋白也可以使用。环氧合酶抑制剂诸如水杨酸钠，水杨酸，和非甾族的抗炎药物(NSAIDS)诸如消炎痛，萘普生，双氯芬酸钠也可以使用。
去污剂包括阴离子，阳离子，两性离子，和非离子型的去污剂。例举的去污剂包括但不限于牛磺胆酸盐，脱氧胆酸盐，牛磺脱氧胆酸盐，鲸蜡基吡啶鎓，benalkonium chloride，ZWITTERGENT3-14去污剂，CHAPS(3-[(3-胆酰氨丙基)二甲氨]-1丙烷磺酸氢氧化物，Aldrich)，Big CHAP(如USSN 08/889,355，1997年7月8日申请；和国际申请WO97/25072，1997年7月17日，所述)，Deoxy Big CHAP(同前)，TRITON-X-100去污剂，C12E8，辛基-B-D-葡糖吡喃糖苷，PLURONIC-F68去污剂，TWEEN20去污剂，和TWEEN80去污剂(CALBIOCHEMBiochemicals)。
在一个实施方案中，输送增强剂包括在构成重组腺病毒载体输送系统的缓冲液之中。输送增强剂的给药可以在重组病毒之前或和病毒随同给药。在一些实施方案，输送增强剂和病毒一起提供，在对患者给药之前才将病毒制备物和输送增强剂配方混合。在另外的实施方案，将输送增强剂和病毒在一个单管内提供给患者施用。
当药物组合物包括在含有输送增强剂的缓冲液中配制的重组腺病毒载体输送系统中带有肿瘤抑制基因的情况下，该药物组合物应优选地在5分钟至3小时内给药，更为优选地在10分钟至120分钟内，最为优选地在15至90分钟内。在另一个实施方案，输送增强剂的给药可以在带有肿瘤抑制基因的重组腺病毒载体输送系统给药之前进行。输送增强剂的先期给药可以在带有肿瘤抑制基因的重组腺病毒载体输送系统给药之前的30秒钟至1小时，优选的为1分钟至10分钟，最为优选的在1分钟至5分钟范围内进行。
输送增强剂的浓度可根据许多本领域普通人员所知道的因素来确定，诸如所使用的特定的输送增强剂，缓冲液，pH，靶组织或器官以及给药方式。输送增强剂的浓度范围是1％至50％(v/v)，优选的为10％至40％(v/v)最为优选的为15％至30％(v/v)。优选地，向患者给药的最终配方中去污剂的浓度约为0.5-2倍的临界微粉化浓度(CMC)。Big CHAP的优选浓度是约2-20mM，更为优选的是3.5-7mM。
含有输送增强剂的缓冲液可以是任何药学缓冲液，诸如磷酸盐缓冲液，磷酸钠/硫酸钠，Tris缓冲液，甘氨酸缓冲液，无菌水以及其他一般熟练技术人员所知道的缓冲液，诸如Good等(1996)生物化学5467中所描述的那些。带有肿瘤抑制基因的重组腺病毒载体输送系统的缓冲液的pH值可以在6.4-8.4的范围之内，优选的是7-7.5，更为优选的是7.2-7.4。
优选的施用重组腺病毒的配方为约109-1011PN/ml病毒，约2-10mM Big CHAP或约0.1-1.0mM TRITON-X-100去污剂，在磷酸缓冲盐(PBS)，加上约2-3％蔗糖(w/v)和约1-3mM MgCl2，pH6.4-8.4。输送增强剂的应用在USSN 08/779,627，1997年1月7日申请，中有详细描述。
为了促进含有市售Big-CHAP制剂的核酸配方的基因转移，BigCHAP的浓度可根据其商业来源而变化。当Big CHAP来自CALBICHEM，其优选的浓度是2-10mmol，更优选的是4至8mmol，最优选的是约7mmol。
当Big CHAP来自Sigma时，其优选的浓度是15-35mmol，更优选的是20至30mmol，最优选的是约25mmol。
在本发明的另一个实施方案，具有式I结构的输送增强剂如下所示
其中n是2-8的整数，X1是胆酸基团或脱氧胆酸基团，X2和X3是各自独立选自下列之一的基团胆酸基团、脱氧胆酸基团、和糖基团。至少X2和X3中的一个是糖基团。该糖基团可选自下列一组中戊糖单糖基团，己糖单糖基团，戊糖-戊糖二糖基团，己糖-己糖二糖基团，戊糖-己糖二糖基团，己糖-戊糖二糖基团。在优选的实施方案，本发明的该化合物具有式II的结构
其中X1和X2是胆酸基团或脱氧胆酸基团，X3是糖基团。
这些化合物优选地在本发明的配方中以约0.002至2mg/ml的浓度范围使用，优选的是0.02至2mg/ml，更为优选的是0.2至2mg/ml，最优选的是大约2mg/ml。
磷酸缓冲盐水是这些化合物优选的溶剂。然而，本领域的普通技术人员能够认识到，在各种配方中为了获得这些药剂的溶解特性，需要某些另外的赋形剂和添加剂。例如，添加适当浓度的周知的增溶剂诸如去污剂，脂肪酸酯，表面活性剂，以利于这些化合物在所应用的不同溶液中的溶解性。当溶液是PBS时，优选的增溶剂是大约0.15％浓度的Tween80。
5.肿瘤抑制蛋白的施用肿瘤抑制蛋白(多肽)可以通过如上所述的注射或系统给药直接输送至肿瘤位点。在优选的实施方案，肿瘤抑制蛋白联合药学可接受的载体(赋形剂)，构成如前文所述的药物组合物。肿瘤抑制蛋白以足以治疗或者至少可以限制病情和/或其并发症的剂量给药。这种应用的有效剂量是基于病情的严重程度和患者的总体的健康状态而决定的。
应能认识到，肿瘤抑制多肽，在口服给药时，必须防止被消化。这通常是通过将多肽与能提供对酸或酶水解抗性的组合物相复合，或者通过将多肽包装在合适的抗性载体中诸如上述的脂质体而达到的。在口服输送中保护多肽的方法是本领域所熟知的(见，如，美国专利5,391,377中描述的用于治疗药剂口服输送的脂类组合物)。
III.联合药剂肿瘤抑制因子和辅助抗癌剂可以分别给药，可以是在辅助抗癌剂的给药之前进行肿瘤抑制因子给药(肿瘤抑制因子的预治疗)，也可以是在肿瘤抑制因子给药之前进行辅助抗癌剂的给药(癌症药物的预治疗)。当然肿瘤抑制核酸和/或多肽与辅助抗癌剂可以同时给药。
在一个实施方案中，肿瘤抑制核酸和/或多肽与辅助抗癌剂作为单一的药物组合物给药。在此情况下，肿瘤抑制核酸和/或多肽与辅助抗癌剂悬浮或者溶解于同质的输送载体之中。或者，肿瘤抑制核酸和/或多肽与辅助抗癌剂各自悬浮或者溶解于不同的输送载体之中，然后再给药时或者连续地再悬浮于(打散于)单一的赋形剂中。因而，例如，可将辅助抗癌剂溶于极性溶液(如，乙醇中的紫杉醇)，将肿瘤抑制核酸与脂类复合，然后将它们一起储存于悬浮液中或者在给药时再将它们相混合。各种合适输送载体如前文所述。
IV.治疗方案联合的和单独的治疗A)肿瘤抑制因子治疗方案本发明发现，肿瘤抑制核酸或多肽，特别是肿瘤抑制核酸在抑制肿瘤生长上，以多次剂量比以单次剂量给药表现出更高的效力。因而本发明提供了肿瘤抑制基因或多肽的治疗方案，它包括肿瘤抑制核酸或多肽多次给药。
肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸(连同或不连同辅助抗癌剂)可以以范围约1×109至约1×1014，约1×109至约7.5×1015，优选的为约1×1011至约7.5×1013的腺病毒颗粒总剂量给药，其方案可以选自下列几种以总剂量一次给药，总剂量分作5次5天内每日给药，和总剂量分作30次30天内每日给药。该方法可以重复2或更多次循环(更优选的时3个循环)，而2或更多次循环可以间隔3至4周。治疗可以有一次单一的剂量循环组成，也可以是2至约12个剂量循环，更为优选的是2至约6个循环。
特别优选的治疗方案包括总剂量分作5次5天内每日给药，和总剂量分作30次30天内每日给药。
在一些优选的实施方案，每日剂量的范围是7.5×109至约7.5×1015，优选的是约1×1012至约7.5×1013腺病毒颗粒，在上至30天内(如，以相同剂量每日给药2天，2至5天，7天，14天，或30天的方案)每日给药。多个方案可以以21天至28天的循环重复。
在一些实施方案，不同的给药途径会使用不同的优选剂量范围。例如，肝动脉内输送的优选范围通常是在5至14天内，每日7.5×109至约7.5×1015，优选的是约1×1011至约7.5×1013腺病毒颗粒。这些方案进一步包括辅助抗癌剂的给药，FUDR或5′-脱氧-5-氟代尿苷(5′-FUDR)，或irinotecan hydrochloride(CPT-11；7-乙基-10-[4-(1-哌啶)-1-哌啶]羰基氧基喜树碱)。对于瘤内输送，优选范围通常是每日7.5×109至约7.5×1013，优选的是约1×1011至约7.5×1012腺病毒颗粒。对于腹膜内输送，优选范围通常是在5至10天内，每日7.5×109至约7.5×1015，优选的是约1×1011至约7.5×1013腺病毒颗粒。
B)联合治疗方案当肿瘤抑制因子与辅助抗癌剂联合使用时，肿瘤抑制核酸以上述的总剂量给药。联合的情况下，辅助抗癌剂的给药总剂量是基于所用药剂的。例如，紫杉醇或紫杉醇的衍生物以范围在75-350mg/m2的总剂量，在1小时，3小时，6小时，或24小时内给药，治疗方案可以选自一次单一剂量给药，在第1天和第2天以剂量每日给药，在第1天、第2天和第3天以剂量每日给药，以每日剂量给药15天，以每日剂量给药30天，以每日连续灌输给药15天，以每日连续灌输给药30天。优选的剂量是24小时内100-250mg/m2。
在肿瘤抑制核酸治疗之前，用辅助抗癌剂(如紫杉醇)的预处理能够增强肿瘤抑制因子的效力。因此在特别优选的实施方案，细胞、组织、或生物体在肿瘤抑制核酸之前，用辅助抗癌剂来治疗。辅助抗癌剂的治疗优选地在肿瘤抑制核酸治疗之前的大约24小时，当然更长或更短的时间也是可以的。
当辅助抗癌剂是紫杉醇类化合物，优选的是紫杉醇或紫杉醇的衍生物(如，Taxol或Taxotere)时，预处理特别有效。特别优选的肿瘤抑制因子是RB和p53，最为优选的是p53，特别是在腺病毒载体中的p53(如，A/C/N/53)。
V.转移的治疗和预防如实施例2和3中所阐明的，肿瘤抑制因子(如p53)基因的替代治疗对于体外人肿瘤细胞、无免疫应答的宿主中人肿瘤异体移植、和人肺部肿瘤(体内)等方面都显示出效力。患者原位肿瘤的外科消肿常常导致原发位点的肿瘤再生长以及从外科医生未能察觉的肿瘤细胞微“巢”处发生肿瘤转移。另外，为了确保从初级位点切除全部肿瘤，患者需进行有损外观的外科手术以从原位肿瘤位点周围切除大量的正常组织。
在另一个实施方案，本发明提供了抑制转移(转移细胞)生长和/或增殖的方法。该方法一般包括肿瘤抑制因子系统的或者局部的给药，更为优选的是p53或RB的局部给药。
A)系统治疗如实施例2和3种所揭示的，肿瘤抑制因子载体(如，A/C/N/53)的系统治疗(如，静脉注射)可以体内抑制转移的进程。因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过对生物体进行如上所述的肿瘤抑制核酸和/或肿瘤抑制多肽的给药从而抑制转移性疾病的进程的方法。肿瘤抑制因子优选地是肿瘤抑制核酸，更为优选的是p53肿瘤抑制核酸，最为优选的是位于腺病毒载体上的p53核酸(如，A/C/N/53)。在另一个优选的实施方案，肿瘤抑制核酸以包装于脂质体中或者和脂类复合的形式提供(见，如，Debs和Zhu(1993)WO93/24640；Mannino和Gould-Fogerite(1988)生物技术，6(7)682-691；Rose美国专利5,279,833；Brigham(1991)WO91/06309；和Felger等(1987)美国科学院研究进展847413-7414)。
B)局部治疗在另一个实施方案，与外科相配合时，优选的是肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸的局部应用。在此实施方案，肿瘤抑制因子，优选地以感染性载体的形式，在肿瘤切除后应用于伤口腔的表面。感染颗粒携带p53进入伤口处残存的肿瘤细胞中，诱导其凋亡(细胞程序化死亡)。这种治疗能延长患者存活期和/或降低外科手术所需的肿瘤位点周围切除的正常组织的量。
肿瘤抑制因子优选地以本领域熟练技术人员所知道的适合于局部应用的配方形式构成。因此，例如，可以将人p53肿瘤抑制基因(如，A/C/N/53)感染型制剂悬浮于一种合适的载体中(如石油冻或其他霜剂或膏剂)，该载体剂适于延创腔表面分散。在另一个实施方案，肿瘤抑制因子可以制备于可降解的(可再吸收的)材料中，如，可再吸收的海棉，它可以放于创腔中，按时释放肿瘤抑制蛋白或载体。
在一些实施方案，在某个特定的局部区域，如角膜、胃肠道、肿瘤切除位点上重组腺病毒载体的应用中，使用固体载体以支持较长的温育时间促进病毒的感染。该载体可以是渗有重组腺病毒溶液的纱布或药膏。可将病毒通过纱布支持物应用于角膜以达到转基因效果。渗药纱布也可以预防性地应用于肿瘤切除位点以防止肿瘤再生。药膏可以局部应用于胃肠道区域，或局部应用于胰腺区域，以获得肿瘤抑制基因治疗。
药膏载体的实例包括油性的Puralube或水溶性的KJ-Jelly。在例举的方法中，将无菌的纱布垫(5×5cm)或者流泪测试带浸于腺病毒载体溶液(如，1×109PN/ml)中直到完全湿润。将此垫或条置于靶组织的上部于37℃温育30分钟。熟练的技术人员能够认识到，其他的织物、凝胶或药膏也可以吸收或互溶于水。另外，和可以添加其他的赋形剂以增强上述的基因转移。
VI.与其他化学疗法一起的联合治疗A)与多种的联合化疗一起的肿瘤抑制因子的联合给药应当理解的是，本发明的方法不限于肿瘤抑制因子与单一的一种辅助抗癌剂联合应用。既然方法通常包括将细胞与肿瘤抑制因子(如，p53)和辅助抗癌剂诸如紫杉醇相接触，那么本发明的方法也当然包括将细胞与肿瘤抑制基因或多肽和两个、三个或多个辅助抗癌剂以及其他的任选的化疗药物相接触。而且，熟练的技术人员能够认识到，化疗药物也可以在没有辅助抗癌剂的情况下和肿瘤抑制蛋白或基因一起使用。
许多化疗药物在科学或专利文献中是众所周知的；所例举的可用于本发明的药物包括但不限于DNA损伤剂(包括DNA烷基化试剂)诸如顺铂，卡铂(见，如，Duffull(1997)临床药物，33161-183)；Droz(1996)肿瘤学年鉴，7997-1003)，navelbine(vinorelbine)，亮氨酸溶肉瘤素，AZQ，BCNU，白消安，羧邻苯二甲酰铂，CBDCA，CCNU，CHIP，苯丁酸氮芥，吡葡亚硝脲，顺铂，clomesone，氰基吗啉代-阿霉素，cyclodisone，环磷酰胺，二脱水半乳糖酐，氟多潘，hepsulfam，羟胺硫蒽酮，苯丙氨酸氮芥，甲基CCNU，丝裂霉素C，mitozolamide，氮芥，PCNU，哌嗪烷基化物，哌嗪二酮，双溴丙基哌嗪，甲基丝裂霉素，spirohydantoin芥子气，环氧三嗪酮，tetraplatin，硫代涕巴，三乙烯三氰胺，尿嘧啶氮芥，Yoshi-864)；拓扑异构酶I抑制因子(如，topotecan盐酸盐，irinotecan盐酸盐(CPT11)，喜树碱，喜树碱钠盐，氨基喜树碱，CPT-11和其他喜树碱衍生物)；拓扑异构酶II抑制因子(阿霉素，包括脂质体胶囊包装的阿霉素(见，美国专利5,013,556和5,213,804)，amonafide，m-AMSA，蒽吡唑衍生物，吡唑吖啶，蒽双咪腙HCL，道诺红菌素，脱氧阿霉素，mitoxantrone，menogaril，N，N-二苯基-道诺霉素，氧蒽唑，苯甲酰腙柔红霉素，VM-26，和VP-16)；RNA/DNA抗代谢物(如，L-亚硝基羟基丙氨酸，5-氮胞苷，5-氟尿嘧啶，阿雪维霉素，氨基蝶呤，氨基蝶呤衍生物，叶酸抗代谢物，Baker氏溶液叶酸抗代谢物，二氯烯丙基散沫花素，brequinar，呋氟尿嘧啶(前体药物)，5，6-二羟基-5-氮胞苷，氨甲蝶呤，氨甲蝶呤衍生物，N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸(PALA)，吡唑呋喃菌素，和三氨甲蝶呤)；以及，DNA抗代谢物(如，3-HP，2′-脱氧-5-氟尿苷，5-HP，α-TGDR，蚜栖霉素甘氨酸酯，ara-C，5-氮杂-2′-脱氧胞嘧啶，β-TGDR，环胞嘧啶，guanazole，羟基尿素，次黄嘌呤核苷，甘油二醛，麦克菌素II，吡唑咪唑，硫代鸟嘌呤，和硫代嘌呤)。肿瘤抑制核酸和/或多肽还可以与化疗药剂诸如长春新碱，temozolomide(见，如，美国专利5,260,291)和托瑞米芬(见，美国专利5,696,949中的关于托瑞米芬的信息)一起联合给药。
相关动物模型的临床前研究表明，p53腺病毒与顺铂，卡铂，navelbine，喜树碱，5-氟尿嘧啶，氨甲蝶呤，或者鬼臼乙苷一起联合应用，治疗SSC-9头颈、SSC-15头颈、SSC-25头颈、SK-OV-3卵巢、DU-145前列腺、MDA-MB-468乳腺和MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞时，可以比单独的化疗能够更为有效地抑制细胞增殖。在另一个实施方案，p53基因(在如腺病毒载体上表达)、辅助抗癌剂(如，紫杉醇)和DNA损伤剂(如，顺铂)三种药物的联合应用表现出了增强的抗肿瘤效力。p53基因、紫杉醇和顺铂的联合应用在卵巢肿瘤模型中显示出了效果。这些数据在临床试验中支持了p53基因治疗与化学治疗的联合应用。
这些其他的化疗药物可以与肿瘤抑制核酸和/或肿瘤抑制多肽，连同或者不连同辅助抗癌剂一起联合使用。本发明还涉及放射治疗与任何上述的肿瘤抑制因子的联合应用，或者连同辅助抗癌剂一起与任何上述的肿瘤抑制因子的联合应用。
还应当理解的是，任何这些化学治疗都可以单独地与肿瘤抑制核酸或多肽按照本发明的方法联合应用。
当肿瘤抑制核酸(如，p53)在腺病毒载体上，与辅助抗癌剂(如，紫杉醇)和DNA损伤剂(如，顺铂，卡铂，navelbine)一起给药时，腺病毒载体通常在5至14天内以每日约7.5×1012至7.5×1013腺病毒颗粒给药。例如，可以每日剂量约为7.5×1013腺病毒颗粒与卡铂联合给药。在一个实施方案中，可以用每日剂量约为7.5×1012腺病毒颗粒对肺给药。在另一个实施方案，p53与topotecan一起给药。
通常，DNA损伤剂以推荐的剂量给药，见，如“医生桌面参考”第52版，(Medical Economics，Montvale，NJ 1997)。例如，可以以约6-7.5mg/ml/分钟进行卡铂的给药以达到AUC(曲线下区域)。
蛋白酶抑制剂在另一个实施方案，本发明提供了肿瘤抑制核酸和/或多肽与蛋白酶抑制剂的联合应用。特别优选的蛋白酶抑制剂包括，但不局限于胶原蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(见，如，Chambers(1997)国家癌症研究所杂志，891260-1270)。在优选的实施方案，该方法包括同时或顺序地施用有效量的蛋白酶抑制剂和有效量的肿瘤抑制核酸和/或多肽。作为蛋白酶抑制剂的化合物的实例是在科学和专利文献中周知的。
免疫调节剂本发明的肿瘤抑制蛋白和核酸可以与免疫调节剂和/或联合化疗联合应用，免疫调节剂可以正调一种导致抗过度增殖或癌症细胞的免疫应答(如，指导抗肿瘤特异抗原的免疫应答)，也可以负调一种导致抗肿瘤抑制蛋白、肿瘤抑制核酸、肿瘤抑制因子载体的免疫应答(如，抗腺病毒反应)。
因此，例如，本发明提供了有效量的蛋白酶抑制剂和有效量的肿瘤抑制核酸和/或多肽与有效量的免疫调节剂顺序地或者同时地联合给药的应用。免疫调节剂包括，但不限于细胞因子诸如IL-2，IL-4，IL-10(US 5,231,021；Lalani(1997)过敏哮喘免疫学年鉴，79469-483；Geissler(1996)血液学现代评论，3203-208)，IL-12(见，如，Branson(1996)人类基因治疗，11995-2002)，和γ干扰素。
以免疫抑制剂作为免疫调节剂可以用于减轻对抗治疗剂(如，肿瘤抑制蛋白或核酸或辅助抗癌剂等)的免疫应答。免疫抑制剂是本领域熟练技术人员所熟知的。合适的免疫抑制剂包括，但不限于环化磷酸胺，地塞米松，环孢菌素，FK506(tacrolimus)(Lochmuller(1996)基因治疗，3706-716)，IL-10，和诸如此类的。抗细胞表面受体的抗体也可以使用，这种受体可以调节免疫应答。例如，能够阻断配体结合B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、和肿瘤细胞上的细胞受体的抗体可以用于此目的。这种策略的实例可见，如，Yang(1996)基因治疗，3412-420；Lei(1996)人类基因治疗，72273-2279；Yang(1996)科学，2751862-1867。
VII.治疗用试剂盒在另一个实施方案，本发明提供了治疗用试剂盒。该试剂盒包括，但不局限于，肿瘤抑制核酸或多肽，或它的药物组合物。此试剂盒还可以包括辅助抗癌剂，或它的药物组合物。各种成份可分别装在不同的容器中，既可单独给药，也可在给药前将不同成份混合一并给予。或者，各种不同的药物组合物也可装在同一容器中。此试剂盒也包括一些小配件，缓冲液，分析试剂以及本发明的使用方法。此外，它还包括了一些说明书，指导如何使用本发明涉及的各种方法(如，肿瘤的治疗，转移的预防和/或治疗等)。
该试剂盒可任选地包括一种或更多的免疫调节剂(如，免疫抑制剂)。特别优选的免疫调节剂包括本文所描述的任何一种免疫调节剂。
VIII含有异源肿瘤抑制核酸或多肽，以及其它药物的细胞本发明进一步提供了转染的或其它方式处理过的原核或真核宿主细胞，如含有异源肿瘤抑制核酸和/或肿瘤抑制多肽的动物细胞(如，哺乳动物细胞)。此细胞可任选地含有一种辅助抗癌剂，如紫杉醇或其它作用于微管的药物。
合适的原核细胞包括，但不局限于细菌细胞，如E.coli细胞。合适的动物细胞首推哺乳动物细胞，尤其是人的细胞。宿主细胞包括，但不局限于任何一种哺乳动物细胞，特别优选的是赘生性细胞或肿瘤细胞，如本文中所描述的任何一种此类细胞。
本文所述的转染的宿主细胞可用作诊断或治疗的组成部分。药用时，它们可与其它一些已被认可的药学可接受的载体联合使用，如上文所述的用于回体基因治疗的各种载体。这些细胞可按照上文详细描述的有效量给予，以达到治疗或预防的目的。在诊断的前后，这些细胞可被用于教学或其它参考的目的，并为确认那些已转染的和/或处理的细胞提供合适的模型。
IX.p53腺病毒基因治疗的临床前期和临床期的效果腺病毒介导的p53基因治疗目前正在几个国家进行临床I/II期试验。在这些临床试验中使用的药物组份包括例举的野生型表达p53的腺病毒(＂rAd/p53＂)，它是由复制缺陷型的，能表达由巨细胞病毒启动子控制的人肿瘤抑制基因的5型腺病毒载体(＂rAd/p53＂)(见Wills(1994)，同上)。
区域给药局限于腹腔的卵巢癌是区域采用p53基因治疗的临床适应症，腹膜内给药应被考虑作为优选的治疗计划。
实施例以下实施例用于阐明，而非限制本发明。
实施例1p53和Taxol的联合疗法本发明提供了一种联合给药的方法，即将表达肿瘤抑制多肽的核酸与紫杉醇一同给药，用于赘生瘤的治疗。下面的实施例详细叙述了本发明表达p53的腺病毒与Taxol联合用于治疗肿瘤，这种结合疗法比单独使用其中一种药能更有效地杀死肿瘤细胞。
体外的联合疗法用下面三种治疗方案处理细胞方案1，在接触p53腺病毒构建体A/C/N/53前，先用Taxol预处理细胞24小时。方案2，先用p53腺病毒构建体预处理细胞，再用Taxol处理。方案3，同时用Taxol和p53腺病毒处理细胞。即p53腺病毒和Taxol可在24小时内或同一时刻一起给予。
将培养基中约1.5×104个细胞(头颈细胞系SCC-9，SCC-15和SCC-25培养在1∶1混合的DMEM+Ham′s F12培养基中，含0.4μg/ml皮质醇和10％FBS和1％非必需氨基酸，前列腺DU-145和卵巢SK-OV-3培养在Eagles必需培养基中，含10％FBS)加至96孔板的各孔中，37℃，5％CO2培养4hr。随后，将药物(Taxol)，p53腺病毒或合适的载体/缓冲液加至各孔中。由于紫杉醇不溶于水，因此在给药前应先用乙醇将之溶解。再将细胞置于37℃，5％CO2的条件下，温育过夜。p53腺病毒以磷酸盐缓冲液的形式给予(20mM NaH2PO4，PH8.0，13mM NaCl，2mM MgCl2，2％蔗糖)。
然后，按照Mosmann(1983)免疫学方法杂志6555-63提供的方法计数死亡的细胞。简而言之，将大约25μl 5mg/ml的MTT活体染料[3-(4，5二甲基噻唑-2-基)-2.5-二苯四氮唑溴]加至各孔中，37℃，5％CO2温育3-4小时。之后，加100μl 10％的SDS去污剂至各孔中，37℃，5％CO2温育过夜。孔中的信号用微量滴定板读数仪测定。实验中所用的细胞系和实验结果均列在表l中。
表1.对辅助抗癌剂Taxol与肿瘤抑制核酸联合应用的体外评估
<p>总之，当p53腺病毒后于Taxol加入，或与Taxol同时加入时，比先加p53腺病毒更为有效。这些结果提示，A/C/N/53和Taxol之间存有一协同作用。
均等兴奋(Isobologram)分析确认协同作用如表2所示，采用Taxol和p53/腺病毒(A/C/N/53)联合法对SK-OV-3(无p53)卵巢肿瘤细胞进行治疗，给药剂量见上文。第3天，用上文介绍的MTT法计算死亡的细胞数。此外，根据上表列出的给药剂量绘出了(接触药物2天后)p53腺病毒单独给药的剂量反应曲线和单独给予Taxol(接触药3天后)的剂量反应曲线。
表2.Taxol和p53Ad(A/C/N/53)联合治疗的治疗组
图1说明了治疗的作用能够抑制细胞的增殖(与对照缓冲液相比)。一般来说，单独增加Taxol或p53的给药剂量都能降低细胞的增殖速度，p53和Taxol联合给药比单独给药有更强的抑制作用。
图2反映了应用均等兴奋(Isobole)法，见Berenbaum(1989)药物学综述93-141，对这些数据进行均等分析的结果。当细胞先用Taxol预处理24小时后再给予p53(A/C/N/53)时，可发现二者之间存有协同作用。图2中，直线(ED30均等兴奋)代表了如果用这二种药物进行治疗是加性的预期将出现的对细胞增殖的效应。实际上，观察到的效应在均等兴奋线的左下方，表明只需要比预计浓度低的药物，且在这二种药物之间出现了协同作用。
实施例2对转移的p53腺病毒介导的基因疗法本发明提供了用表达肿瘤抑制多肽的核酸治疗转移的方案。下面的实施例详细叙述了本发明表达p53的腺病毒对体内各种组织的感染作用及对转移的治疗作用。
将5×106个MDM-MB-231乳腺癌细胞注射至雌性的重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠(纯系的SCID小鼠，因V(D)J重排障碍导致T细胞和B细胞缺乏)的乳腺脂垫中。在原发瘤形成后并有足够时间转移至肺组织之中时，外科手术切除原发肿瘤(第11天)。在第23，30，37和44天(1qW)，给小鼠静脉内注射对照缓冲液或A/C/N/53(整合至腺病毒的p53)，剂量为4×108C.I.U./次。第49天，取出小鼠肺脏，固定，染色并进行显微镜检查。
结果参见下面的表3。
表3.A/C/N/53抑制MDM-MB-231肺组织转移<
A/C/N/53的治疗减少了小鼠转移的数量。
在第二个试验中，SCID或SCID-beige小鼠乳腺脂垫中的231个肿瘤接受了瘤周注射A/C/N/53。10次共注射了总量为2-4×109C.I.U.的A/C/N/53后，SCID小鼠和SCID-beige小鼠的肺转移数目分别减少了80％和60％。并且，原携带有肺肿瘤的小鼠的转移数目也明显减少。同上，静脉内注射A/C/N/53也被证实可有效地治疗SCID小鼠的肺脏转移。这些结果表明，利用A/C/N/53进行的癌症基因治疗除了适用于原发性肿瘤外，也能阻止转移的发生。
在另一项试验中，5×106个MDM-MB-231乳腺癌细胞被注入到雌性SCID小鼠的乳腺脂垫中。第18天，手术切除原发性(乳房)肿瘤。第21，24，32，39和36天，静脉内分别注射了缓冲液，β-galAd，或p53腺病毒(A/C/N/53)。每次注射的病毒剂量为4×108C.I.U(A/C/N/53)(PN/C.I.U.＝23.3)和9.3×109颗粒(β-gal AD)(PN/C.I.U.＝55.6；1.7×108C.I.U)。
第51天取出肺和肝脏，福尔马林固定。对组织部分进行肺和肝脏的受损检查。将2个注射缓冲液的小鼠和2个注射β-gal Ad的小鼠的主要器官进行瞬间冻结，做β-半乳糖苷酶活性分析。
表4用A/C/N/53抑制MDA-MB-231肺转移
*转移灶数被低估，在这些肺中多个肿瘤长在一起。
注射缓冲液组和注射β-gal Ad组的肺转移数目无显著性差异(p＝0.268，见表4)。
与缓冲液对照组和β-gal Ad组相比，p53 Ad治疗组肺中转移的数目明显减少(P＜0.001和p＜0.002)。并且，p53 Ad治疗组肺中转移的直径也明显减小。在对照组中，大多数的肺组织有50％以上是肿瘤组织，且界限清楚的单个肿瘤不再多见。与此相反，p53 Ad治疗组中肺部的转移所占面积较小，且容易见到单个肿瘤。
腺病毒的组织分布肝脏组织中受感染的细胞数目最多(约50％)，且β-半乳糖苷酶的活性也最高。散布的感染细胞团块均匀地分布在整个肺脏组织。小肠和胃的外周平滑肌中也有周期性的细胞感染。腔壁上分散的微绒毛中也能检测到β-半乳糖苷酶的活性。环绕子宫的平滑肌外层也有类似于小肠中所见的周期性细胞感染。脾脏的平滑肌组分中有可测的散在的β-半乳糖苷酶。大多数的心脏横纹肌中仅有数目非常少的感染细胞(小于1％)。在乳腺脂垫的原发性肿瘤和横纹肌下层几乎没有感染的细胞。肾脏中无感染的细胞。
肝脏病理学尸检时发现所有的肝脏基本正常。全部肝脏均没有明显的坏死。但经腺病毒治疗的小鼠确实存在异常的肝细胞(对照组中则无)，包括有些分裂的细胞数目增多，细胞内含物和肝细胞大小与形态的改变。
实施例3p53腺病毒介导的基因治疗法治疗人乳腺癌异种移植物。
本发明通过给予表达一种肿瘤抑制多肽的核酸，治疗多种不同的癌症。下面的实施例详尽描述了本发明表达p53的腺病毒用于治疗人乳腺瘤。
利用无效的或突变的p53将野生型p53导入肿瘤细胞为控制肿瘤的生长提供了一种全新的策略。Casey(1991)肿瘤基因61791-1797，利用质粒DNA载体在体外将野生型p53导入乳腺癌细胞中。在质粒转染后出现的MDM-MB-468(p53mut)和T47D(p53mut)的克隆数目由于野生型p53而减少了50％。并且，没有长出的克隆表达有野生型p53的转染子。相反，MCF-7(p53wt)的克隆数目没有改变。Negrini(1994)癌症研究541818-1824，用MDA-MB-231细胞进行了一项类似的研究。转染带有野生型p53的质粒可使克隆的形成减少50％，且没有克隆表达野生型p53。令人困惑的是MCF-7细胞在这项研究中也出现了类似的结果。
在本实施例描述的这项研究中，复制缺陷的，重组的，E1区缺失的p53腺病毒(p53 Ad；A/C/N/53)Wills(1994)同上)被用来检测抗3种表达突变的p53的人乳腺癌细胞系的效率，这三种细胞系分别为MDA-MB-231，MDA-MB418和MDA-MB-435。MDA-MB-231细胞中p53基因的第280个密码子由精氨酸突变为赖氨酸(Bartek(1990)肿瘤基因5893-899)。MDA-MB-468细胞的p53基因在第273个密码子处由精氨酸突变为组氨酸(Id)。MDA-MB-435细胞携带第266个密码子由甘氨酸突变为谷氨酰胺的p53基因(Lesoon-Wood(1995)人类基因治疗6395-405)。
以往的研究表明，体外感染p53 Ad后，人乳腺、卵巢、肺、结肠、肝、脑和膀胱的肿瘤细胞中会出现高水平野生型p53的表达(Wills(1994)同上，Harris等(1996)癌症基因治疗3121-130)。腺病毒介导p53最终将引起细胞形态学的改变，并诱导带有无效p53或突变p53的肿瘤细胞的凋亡。用p53 Ad 10m.o.i(反复多次感染)感染468乳腺癌细胞，在感染后72小时内将使DNA合成受到100％的抑制。并且，p53 Ad感染可体外抑制MDM-MB-568和MDA-MB-231细胞的增殖，二者的ED50值分别为3±2和12±10m.o.i.。其它三种p53突变的乳腺癌细胞系的增殖也会受到低浓度的p53 Ad的抑制。SK-BR-3细胞的ED50值为16±4m.o.i.，T-47D细胞的ED50值为33m.o.i.，BT-549细胞的ED50值为2±2m.o.i.。用表达E.coli β-半乳糖苷酶(β-gal)的等效重组腺病毒30m.o.i.感染MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞，导致大于67％的MDA-MB-468细胞和34-66％的MDA-MB-231细胞呈β-gal阳性。通过比较β-gal阳性细胞的百分数和带有改变的p53的大量肿瘤细胞中所表现出的p53的抗增殖作用的关系，Harris et al(同上)指出，p53所诱导的抑制作用的程度与腺病毒转染的多少呈正向关联。相反，表达正常水平的野生型p53的细胞系受p53转染的影响极小，与腺病毒的转染率无关。
MCF7和HBL-100细胞，两种含有野生型p53的人乳房细胞系的体外增殖，相对而言不受浓度大于或等于99m.o.i.的p53 Ad的影响。换句话说，抑制MCF-7和HBL-100细胞增殖至少要求p53 Ad的浓度分别是-231和-368细胞的ED50值得8倍和33倍。利用类似的重组p53 Ad，Katayose(1995)临床癌症研究1889-897，在体外证明-231细胞中p53蛋白表达增加，细胞增殖速度下降，以及凋亡细胞数目增加。该研究还发现这些体外研究结果同样适用于扩大至体内的乳腺癌异种移植的-468和-231细胞。腺病毒介导的p53基因治疗的效率也受到另一乳腺癌细胞系(MDA-MB-435)的评价，该细胞在体外表现出对腺病毒转染的抗性。
材料和方法细胞系和腺病毒体外感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，-468和-435由ATCC(Rockville，马里兰，美国)提供。-231细胞用含10％胎牛血清(FCS，Hyclone，Logan，犹他)的DMEM培养基(生命技术公司，Grand岛，纽约)在37C，5％CO2的条件下培养。-468细胞含10％FCS的Leibovitz′s L-15培养基于37C培养。-435细胞在含15％FCS和10μg/ml的牛胰岛素的Leibovitz′s-15培养基中(Sigma，Chem.Co，圣路易斯，密苏里州)，于37℃培养。
表达人野生型p53和E.coliβ-半乳糖苷酶(β-gal)的重组腺病毒(rAd)由人巨细胞病毒的启动子控制其转基因的表达，它们的构建和增殖参见前文所述(Wills(1994)同上)。腺病毒以磷酸缓冲液的形式给予(20mM NaH2PO4，pH8，0，130mM NaCl，2mM MgCl2，2％蔗糖)。C.I.U.定义为细胞的感染单位。感染48小时后，通过检测阳性293细胞中病毒六聚体蛋白质，可判定感染的病毒颗粒的浓度(huyghe(1995)同上)。
为了研究p53 Ad的体外感染情况，细胞以1-5×104个/孔的浓度铺至12孔的组织培养皿中(Becton Dickinson，林肯公园，新泽西，美国)。用0，10，或50m.o.i.(感染次数＝C.I.U./细胞)的p53 Ad转染细胞，培养72小时，如前文所述(Wills(1994))同上)。为了研究β-gal Ad的体外感染，细胞铺板浓度约为1×105个/孔。细胞用0，10，50或100m.o.i.的β-gal Ad转染。48小时后，细胞先用0.2％戊二醛(Sigma Chemical Co.)固定，用PBS(Life Technologies)洗涤3次，然后，细胞再用1ml的X-Gal溶液分析[1.2mM MgCl2，15mM NaCl，44mM Hepes buffer，pH7.4，3mM高铁氰化钾，和1mg/ml溶于二甲酰胺的X-Gal(终浓度10％)]。X-Gal购自宝灵曼有限公司，印第安纳州。所有其它化学试剂购自Sigma。
为确定转化细胞的百分数，每个培养孔选取5个不同的显微镜视野进行计数，每个m.o.i.计算3孔，求出表达β-半乳糖苷酶的平均百分数。
体内腺病毒治疗无胸腺雌性裸鼠购自Charles River实验室(Wilmington，马萨诸塞州，美国)。所用的小鼠均在VAF-封闭设施中喂养，处理动物的全部过程按照NIH制定的有关实验动物的养护及使用守则进行。肿瘤细胞经皮下注射或直接注射至乳腺脂垫内。
细胞的接种量为5×106-231细胞/小鼠，1×107MDM-MB468细胞/小鼠，或1×107MDA-MB-435细胞/小鼠。给药前，允许肿瘤在小鼠体内生长10-11天，但在一项-468细胞的试验中，允许肿瘤在治疗前生长了33天。肿瘤的大小以三维的形式计算。同一天不同治疗组的肿瘤大小用Statvievo II软件(Abacus Concepts，伯克利，加州)进行Student氏比较。利用显著性值(p＜0.05)比较在0-7天和7-11天期间的治疗组与14天后到研究结束期间的治疗组的平均抑制百分数。p53 Ad引起的平均肿瘤生长抑制率减去β-gal Ad引起的肿瘤生长抑制率，就是不含腺病毒载体的p53对肿瘤生长的特异作用。病毒的注射方式全部采用瘤周或瘤体内的直接注射。通常，每只小鼠接受连续2个5天的肿瘤治疗疗程(5次注射)后，有2天的“休息期”。在某些情况下，这一方案延长至2周以上，或者用缓冲液替代病毒来进行注射。肿瘤生长曲线显示了平均肿瘤体积±标准差。
组织学和凋亡标记物的免疫组化组织标本以10％的福尔马林缓冲液固定，放置Miles VIP组织处理器处理过夜。石蜡包埋。然后用Leitz切片机将标本切成5微米大小。切片用常规的Hams苏木素和伊红染色(Luna等人(1968)，军队病理研究所的组织学染色方法手册，细胞，McGraw Hill Book出版)。
凋亡标记物原位凋亡检测系列试剂盒购自Oncor公司(Gaithersburg，马里兰，美国)。各标本的处理均按试剂盒提示的说明进行。简而言之，以Oncor的蛋白消化酶处理的组织标本，加TdT温育，最后用抗生物素蛋白-过氧化物试剂盒(兔IgG-Sigma化学公司)#E×TRA-3)和DAB(Vector Lab#SK4100)对标本进行分析。切片用甲基绿反向染色。
β-半乳糖苷酶分析肿瘤组织包埋于TBS中，(Triangle，Biomedical Sciences，Durham，北卡，美国)，并用2甲基丁烷/干冰瞬间速冻。冰冻组织切片(8μm厚)在4℃用戊二醛固定5分钟。随后按照上述方法进行β-gal表达分析。
整联蛋白FACS分析细胞悬浮于0.02％EDTA中，离心，PBS洗涤2次。再重悬细胞至浓度为1×106细胞/ml，加一抗(终浓度1∶250/ml)，4℃温育1hr。用PBS洗涤细胞悬液2次以除去多余的一抗。加入FITC-标记的兔抗鼠标记抗体(终浓度1∶250/ml，Zymed)，4℃温育1hr。如前法用PBS洗涤细胞，立即分析。利用FACS Vantage流式细胞仪(BectonDickinson，Mountain View，加州，美国)检测荧光。侧面散射和前方散射同时检测，所有细胞用与FACS研究软件(Becton Dickenson)配套的Hewlett packard计算机收集。用于检测整联蛋白受体的抗体来源如下anti-αv，(12084-018，Gibco BRL)；anti-β3(550036，BectonDickenson)；anti-ovβ3(MAP 1976，Chemicon)；anti-β1(550034，BectonDickenson)；和anti-αvβ5(1961，Chemicon)。
结果腺病毒的转染效率与p53体外抑制生长的作用-231和-468细胞在体外以10m.o.i.高效转染。相反，-435细胞转染效率低，即使在100m.o.i.条件下。对于-231细胞，8％(10m.o.i.)，46％(50m.o.i.)，62％(100m.o.i.)的细胞被β-gal Ad转染。而468细胞则有78％(10m.o.i.)，84％(50m.o.i.)和97％(50m.o.i.)被β-gal Ad转染。435细胞仅有0.5％(10m.o.i.)，1(50m.o.i.)1.3(50m.o.i.)被β-gal Ad转染。
50m.o.i.β-gal Ad的感染几乎导致231和468细胞培养物中的细胞全部死亡。相反，β-gal Ad对435细胞的生长无可检测到的效果。
p53 Ad治疗人乳腺癌移植物的效果腺病毒介导的p53基因治疗能高效抗-231和-458移植(图3a.&amp;3b)。在231实验中，β-gal Ad组中1只小鼠和p53 Ad组中3只小鼠在研究结束时未发生肿瘤，并且在p53 Ad处理期间，所有肿瘤消退。对-231肿瘤生长的抑制平均为86％(p≤0.01)。对-468肿瘤生长的抑制平均为74％(p≤0.001)。一只p53组的小鼠在研究结束时未发生肿瘤，所用肿瘤在p53 Ad治疗期间消退。由p53引起的生长抑制平均占45％(p＜0.001)，而腺病毒的特异抑制占28％(p≤0.05)。两组实验均未观察到副作用。-231和-468肿瘤生长抑制的ED50值分别为3×108C.I.U.(细胞感染单位)和2×108C.I.U.(图4)。-435肿瘤几乎完全抗p53 Ad治疗(图3c)。用腺病毒处理的435肿瘤组未观察到明显的生长抑制。
图5显示了两种抗-231肿瘤的p53剂量方案的效果。所有小鼠均每周瘤周注射5次。所有接受治疗剂(p53 Ad)的小鼠每周接受总量为2.2×109C.I.U.。一组接受一次含一周剂量的大剂量注射，另外4次注射缓冲载体(1X组)。其它治疗组每周分5次注射同样接受剂量的Ad(5X组)。该剂量方案在第1和第3周(0-4天，14-18天)给药。5X组的平均生长抑制为73％(p-＜0.01)，而1X组只有44％(前三周p＜0.05，21天后无显著性)。p53基因治疗的第一个疗程比第二个疗程更有效。p53基因治疗的第一个疗程后，1X组的4只小鼠，5X组的5只小鼠和载体对照组中的1只小鼠未发生肿瘤。5X组中1只小鼠在第21天出现很小的肿瘤。第二个疗程后未观察到进一步的“治愈”。
图6显示利用低于10倍的腺病毒剂量对比图3b所示的468肿瘤大4倍的468肿瘤进行的治疗。每只小鼠每周给药总剂量为2.2×108C.I.U.p53 Ad。一组每周接受一次大剂量的病毒注射，接着4次缓冲注射(1X组)。其它治疗组同样剂量每周分5次注射(5X组)。该给药安排6周。6周后所给病毒总剂量大约为图3所用的一半。该剂量方案对接受p53 Ad的小鼠从肿瘤体积上看产生了抑制细胞生长效果(p≤0.05)。该研究在治疗早期显得比后几个星期更有效。5X组中的一只小鼠在第21天肿瘤消失。然而比较所有小鼠的肿瘤抑制情况，1X剂量方案(60％)比5X方案(55％)的效果好略差。给药结束后一周，5X组的肿瘤生长率开始增加。该研究开始后一个月，载体对照的肿瘤开始坏死并达到生长平台期。
反复接触腺病毒后的体内感染图5和图6所示研究结束时，用β-gal Ad对一些肿瘤进行注射。24小时后收集肿瘤，对冰冻组织切片进行β-gal Ad表达分析。尽管每周用p53 Ad处理5次后的468肿瘤的转染效率最低，用p53 Ad治疗2周或6周的肿瘤仍用p53 Ad转染。3个5X组中接受注射的468肿瘤中的肿瘤切片显示细胞表达β-半乳糖苷酶。
p53 Ad诱导的体内凋亡用1-5×108C.I.U.p53 Ad或缓冲液注射裸鼠中的MDA-MB-231和MDA-MB-468乳腺癌移植物，72小时后收集。利用Apoptag免疫组化通过组织切片对p53 Ad诱导的凋亡进行分析。注射了p53 Ad的肿瘤沿肿瘤内的注射针道和肿瘤外围出现大面积的凋亡。相反，如预期的结果一致，注射缓冲液的肿瘤仅出现一些零星的凋亡细胞。
MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞整联蛋白表达的比较FACS分析MDA-MB-231和MDA-MB-435细胞整联蛋白的表达，以确定MDA-MB-435细胞中低水平的Ad转染是否是由于2、3、4型Ad内化所需的αv整联蛋白缺乏引起的。(Wickham et al.(1993)细胞，73309-319；Wickham et a1.(1994)细胞生物学杂志.，127257-264；和Mathias等人，病毒学杂志686811-6814).
两种类型的细胞所表达的αv、αvβ3、αvβ5、和β整联蛋白有丝分裂素的水平基本接近。但MDA-MB-435细胞表达的αvβ3及β3整联蛋白水平明显高于MDA-MB-231细胞。
讨论当10次共注射剂量为2.2×109C.I.U.的p53 Ad时，MDA-MB-468和MDA-MB-231肿瘤的生长抑制率分别达到74％和86％，但对MDA-MB-435肿瘤则没有明显的影响。在MDA-MB-468肿瘤中，61％的抑制是p53转染的，而在MDA-MB-231肿瘤中，仅有43％的总反应针对p53。β-gal Ad体外转染MDA-MB-231，MDA-MB-468和MDA-MB-435细胞的能力通常被认作是体内结果的预测指标。在病毒浓度相同的条件下，-468细胞较MDA-MB-231细胞有稍高的转染率，而MDA-MB-435细胞则对腺病毒的转染有抵制作用。MDA-MB-435体外转染的结果与其体内的应答情况吻合。
利用p53-脂质体载体对携带MDA-MB-435肿瘤的裸鼠进行的综合治疗显示出了抑制肿瘤生长的作用，甚至在某些情况下，可引起肿瘤的退化(Lesoon-Wood等人(1995)人类基因治疗，6395-405)。p53-脂质体治疗也能减少肺部转移的数目。上述结果表明，本研究中缺少应答并不是因为p53不能抑制MDA-MB-435肿瘤的生长的转移。相反，这些结果提示，正是因为腺病毒转染MDA-MB-435细胞的效率十分低，才引起它对p53 Ad治疗的无应答。
αv整联蛋白作为细胞内的元件，有助于细胞高效地吸收2、3和4型的腺病毒(Wickhan(1993)同上)。αv整联蛋白很可能对5型Ad也具有同样的作用。Wickham等人(1994)同上，发现转染有αvβ5的细胞与缺少αv表达或转染有αvβ3的细胞相比较，对重组的5型腺病毒的吸收能力高5-10倍。因此，用作合成p53 Ad的人胚肾-293细胞也表达αvβ1整联蛋白但不表达αvβ3整联蛋白(Bodary(1990)，生物化学杂志2655938-5947)。故测量-435细胞的αv、β1、β3和α5整联蛋白的表达水平似乎是必要和明智之举。MDA-MB-231与MDA-MB-435细胞都能表达水平相近的整联蛋白家族分子。因此，Ad转染MDA-MB-435细胞的效率低下并不是因为α5整联蛋白表达缺陷。现今尚无文献报道靶细胞上与Ad结合的细胞受体。或许，MDA-MB-435细胞缺乏这种受体，也可能是某些其它与病毒的结合内吞或基因表达有关的成份缺陷。
利用MDA-MB-231和MDA-MB-18肿瘤模型检查了p53 Ad各个疗程后的持续效应。连续给药后。疗效似乎有所下降，但这现象没有得到进一步的研究。过去的理论认为，腺病毒的感染能引起快速的炎症应答，并能在免疫系统功能健全的宿主体内引发由细胞T细胞介导的溶细胞应答(Wilson综述，(1995)自然医学，4887-889)。这一T细胞应答是由宿主细胞产生的腺病毒抗原刺激并由细胞表面的MHC分子提呈的。在免疫应答后期，针对腺病毒转染的宿主细胞的特异中和抗体开始产生，它能减弱腺病毒初次接种宿主细胞后对其进行再次感染的能力。这些研究中使用的无胸腺裸鼠不能对外源性抗原进行有效的T细胞应答(Boven(1991)肿瘤学研究中的裸鼠。波士顿，CRC出版社)。具有中和作用的抗腺病毒抗体的产生或许能解释长期采用p53腺病毒(p53 Ad)疗法后疗效下降这一现象。裸鼠的免疫功能受体以及肿瘤异源移植物内的血液供应不足，或许能解释给药6周以后p53 Ad能具有部分的效用，以及其它在p53 Ad重复注射多次后β-gal Ad仍可感染一些类型的肿瘤细胞。
实施例4进一步研究针对肿瘤抑制的治疗方案本发明利用各种剂量的能表达肿瘤抑制多肽的核酸进行癌症治疗，为许多种癌症提供了新的治疗方案。下面的实施例详细描述了通过给予本发明部分剂量的表达p53的腺病毒，以达到增加疗效的目的。
为了比较在一段时间内，给予全部剂量和给予部分剂量的疗效，将注射有MDA-MB-468和MDA-MB-231肿瘤的SCID小鼠分别给予一次性注射1×109C.I.U./小鼠的p53 Ad(A/C/N/53)或分3-5次注射总量相同的p53 Ad。治疗周期为十周，每天注射1次(如图7箭头所示)。
从MDA-MB-468肿瘤中得到的结果与从MDA-MB-231肿瘤中得到的结果相似，如图7a、7b和7c所示。总之，部分剂量多次注射的方式比一次性大量注射更能有效地抑制肿瘤的生长，而且，将总剂量相同的p53 Ad分5次注射比分3次注射效果更加明显。
实施例5地塞米松消除与NK细胞介导的抗腺病毒免疫应答相关的肿瘤生长的抑制作用已证实反复给予腺病毒载体能诱导抗腺病毒的免疫应答。为了弄清低剂量的地塞米松(DCX)所具有的免疫抑制特性是否能抑制抗腺病毒的免疫应答(如NK细胞应答)，SCID小鼠的MDA-MB-231肿瘤在有和无地塞米松存在的条件下，分别接受本发明重组腺病毒的治疗。
将大约5×106MDA-MB-231细胞/小鼠注射至雌性SCID小鼠的乳腺脂垫中。第11天，经皮下植入地塞米松或安慰剂丸。5mg的药丸被设计成连续60天每天释放83.3微克的地塞米松(Innovative Researchof America，Sarasota，FL)。第14-18天和第21-25天，所有的小鼠每天均接受1次，共10次的瘤周注射(0.1ml/次)。注射病毒注射的总量为2×109C.I.U/小鼠(p53 Ad(A/C/N/53或β-gal Ad)。治疗措施如表5所列。
表5治疗SCID小鼠的MDA-MB-231肿瘤
低剂量的地塞米松治疗对SCID小鼠中的MDA-MB-231肿瘤的生长速度无明显的影响(p＞0.005)。未观察到地塞米松有任何副作用。用β-gal Ad治疗可引起安慰剂对照组的肿瘤生长受到明显的抑制(p≤0.001，第21-30天)，但在地塞米松治疗的肿瘤中则未观察到这一抑制作用(p＞0.005，见图8)。以安慰剂和β-gal Ad治疗的肿瘤的生长要明显慢于用安慰剂和地塞米松处理的肿瘤(p≤0.01，第23-30天)。
从安慰剂对照肿瘤组中没有发现p53对肿瘤生长的特异抑制作用(p＞0.005)。相反，以地塞米松和p53 Ad处理的肿瘤的生长确实明显慢于用地塞米松和β-gal Ad(p≤0.02，第21-30天)，或安慰剂和p53 Ad(p≤0.04，第21-30天)，处理的肿瘤。
因此，在SCID小鼠中，低剂量的地塞米松治疗能解除抗腺病毒的免疫应答(如NK细胞应答)引发的抑制肿瘤生长的抑制作用，且无任何副作用。结果亦提示，低剂量的地塞米松治疗也能刺激重组腺病毒的CMV启动子控制的转基因(如p53)表达。反过来，地塞米松还能增加腺病毒的转染效率，进而促进肿瘤细胞的死亡。
随后，又用MDA-MB-231的乳腺癌模型评估了Ad在有和无p53存在的条件下的抗肿瘤作用，研究用的小鼠对外来抗原产生应答的能力略有差异。无功能性T细胞的裸鼠，无功能性T和B细胞但NK细胞水平较高的SCID鼠，以及无功能性T、B和NK细胞的SCID-Beige鼠都被用来进行了研究。
为了研究rAD5/p53(见上述)抗MDA-MB-231异源移植物的作用，裸鼠在第0-4天和7-11天，分别接受了总剂量为2.2×109C.I.U./小鼠的Ad注射，注射分10次完成。SCID小鼠于第0-4天和7-11天接受了总病毒量＝4×109C.I.U.，分10次完成的Ad注射。SCID-Begie小鼠也于第0-4天和7-11天接受了总量为1.6×109C.I.U.，分10次完成的注射。所有的小鼠都接受了p53 Ad、β-gal Ad或单独Ad的处理。
对于裸鼠(无功能性T细胞)或SCID小鼠(无功能性T和B细胞，NK细胞水平高)，瘤体内接种对照的Ad载体(无p53插入)可引起肿瘤生长抑制。与对照的Ad相比较，能表达p53的Ad(rAd5/p53)的抗肿瘤作用均是由p53表达引起的，而Ad载体成份未表现出任何抑制肿瘤生长的作用。这些结果证明了以往未曾发现的作用，即NK细胞参与了由Ad介导的肿瘤抑制生长过程。结果也暗示，免疫系统若受到抑制，可能会消除某些载体特异的NK细胞介导的副作用。
实施例6p53腺病毒和化学疗法的联合应用本发明提供了联合治疗方案，即将表达肿瘤抑制多肽的核酸与化疗药物一同用于肿瘤的治疗。下述的实施例详尽描述了本发明表达p53的腺病毒与各种抗癌剂结合，如顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氨甲喋呤及吡喃葡糖苷等，结合用于治疗肿瘤，以及联合疗法较任何一种单独的方法更为有效，即在杀死瘤细胞时具有协同作用。
p53与化疗药物的体外联合用药顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氨甲喋呤及吡喃葡糖苷等与p53联合对临床相关的抗癌剂顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氨甲喋呤及吡喃葡糖苷等与本发明肿瘤抑制载体(A/C/N/53)联合治疗肿瘤进行了体外研究。SCC-9头颈鳞状细胞癌，SCC-15头颈鳞状细胞癌，SCC25头颈鳞状细胞癌及Du-145前列腺癌细胞按照下述三种方式之一进行了处理处理1，细胞接触p53腺病毒构建体A/C/N/53前先与抗癌化疗药物温育24小时。处理2，细胞先用p53腺病毒构建体预处理，再接触抗癌的化疗药物。处理3，细胞同时接触抗癌的化疗药物和p53腺病毒。
所有的细胞系来自ATCC(RockVille，MD)。SCC-9，SSC-15和SCC-25头颈鳞状细胞癌(p53null)在37C和5％CO2的条件下于1∶1混合的DMEM和Ham′s F-12培养基(GIBCO/Life Technologies，GrandLand，NY)中培养，培养基含有10％胎牛血清(FCSi Huclone，Logan，Utach)，0.4μg/ml氰化可的松(Sigma Chem Co.St.Louis，MO)和1％非必需氨基酸(GIBCO)。SK-OV-3人卵巢肿瘤细胞(p53null)和DU-145人前列腺癌细胞(p53mut)培养基于Eagle′s MEM中，外加10％FCS，37C和5％CO2。MDA-MB-231人乳腺肿瘤细胞(p53 mut)培养于含10％胎牛血清的DMEM(GE3Co)，37℃和5％CO2。MDA-MB-468人乳腺肿瘤细胞(p53 mut)培养于含10％FCS的Leibovitz′s L-15培养基中，37℃无CO2。
MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞携带着表达p53突变体的p53基因，其280位密码子发生了Arg→Lys的突变(Bartek(1990)同上)。DU-145前列腺肿瘤细胞在不同的染色体上带有2个p53的突变，即第223位的Pro→Leu和第274位的Val→Phe突变(Isaacs(1991)癌症研究514716-4720)，也表达1个突变的p53。SK-OV-3卵巢癌细胞不携带p53基因(Yaginuma(1992)癌症研究524196-4199)。SCC-9细胞的p53基因在274-285处密码子之间有一段缺失，导致移码突变；从SCC-9细胞中可检测出无免疫反应性的p53蛋白(Jung(1992)癌症研究526390-6393；Caamano(1993)美国病理学杂志1421131-1139；Min(1994)欧洲癌症学杂志30B338-345)。SCC-15细胞的p53基因于224和225位密码子间插入了1个大小为5bp的碱基顺序；该种细胞能转录出少量低水平的p53 mRNA，但未曾测到p53蛋白的合成(Min(1994)同上)。SCC-25细胞17号染色体丧失了杂和性(LOH)，余下的等位基因在第209位密码子处有2bp的碱基缺失；SCC-25细胞中未发现有可测的p53 mRNA，其胞核内也未观察到具有免疫反应性的p53蛋白(Caamano(1993)同上)。将培养基中约1.5×104细胞加至96孔微量滴定板上的小孔里，37℃，5％CO2温育4小时。
构建和扩增人野生型p53和E.coli半乳糖苷酶(β-gal)腺病毒(Ad)的方法已在前文中描述过(Wills(1994)同上)。通过检测病毒感染48小时后病毒六聚体蛋白阳性的293细胞浓度，可确定感染的病毒颗粒浓度(Huyghe(1995)同上)。C.I.U.定义为1个细胞感染单位。表达p53的腺病毒以磷酸盐缓冲液的形式给予(20mM NaH2PO4，pH8.0，130mM NaCl，2mM MgCl2，2％蔗糖)。药物、腺病毒或相应的载体/缓冲液被加至各个孔中。用p53 Ad作载体研究时，细胞以1.5×104个/孔的浓度铺至96孔板上，37℃和5％CO2温育4小时。再将药物，p53 Ad或适当的载体加至各孔中，继续培养过夜。最后，加药物，p53 Ad或适当的载体至各孔中。细胞继续再培养2天。
死亡细胞的计数方法参照Mosmann(1983)免疫学方法杂志6555-63，所介绍的MTT法进行。简单地说，将大约25μl 5mg/ml的MTT活体染料[3-(4，5二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯四氮唑溴]加至各孔中，37℃和5％CO2温育3-4小时。然后，加100μl 10％SDS去污剂至各孔中，37℃和5％CO2温育过夜。孔中的信号用分子设施微量滴定板读数仪来检测。
在多数情况下，当使用顺铂(见表6的总结的结果)、阿霉素(见表7总结的结果)、5-FU、氨甲喋呤和吡喃葡糖苷时，联合疗法均较单一疗法能更有效地杀死肿瘤细胞。氨甲喋呤和p53 Ad的联合疗法仅在1个细胞系中进行了测试。SCC-15细胞在接种5m.o.i.p53 Ad前，先用0.7μM的氨甲喋呤对细胞进行预处理，结果这二种药物的联合抗增殖作用仅较单独用p53 Ad高5％，但这种差异具有统计学显著性意义(p≤0.003)。若以2.6μM吡喃葡糖苷先处理DU-145细胞24小时后，再用5或10m.o.i.的p53 Ad接种细胞，能得到较单独用药明显增强的疗效(p≤0.0001)。SCC-15细胞以0.3μM吡喃葡糖苷处理24小时后再用5m.o.i.p53 Ad接种，联合抗增殖的作用较单独用药仅高5％。尽管这一差别也具有统计学意义(p≤0.003)。本研究未发现肿瘤抑制基因治疗和抗瘤因子的联合运用具有拮抗作用。
在第二项实验中，将治疗正常细胞(MRC-9细胞)的疗效与肿瘤细胞进行了比较(图9)。此实验采用3H-胸腺嘧啶掺入法，而不是MTT法，进行了细胞生长情况的分析。联合疗法在正常细胞中(二倍体成纤维细胞MRC-9)并未表现出更多的疗效。与预料的结果一致，单独肿瘤抑制因子的作用在正常细胞中几乎可以忽略，而在瘤细胞中却有十分明显的作用。与此相反，单独的抗癌化疗药物(如顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氨甲喋呤及吡喃葡糖苷)在正常细胞中的作用明显强于其在癌细胞的作用(见图9)。
表6 p53 Ad与顺铂联合的抗增殖作用联合的作用是否增大？细胞系p53蛋白 组织类型 先用顺铂 先用p53Ad 同时SK-OV-3 无效卵巢 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001)SCC-9 无效头颈 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001)SCC-15无效头颈 是(p≤0.0001) ND NDSCC-25无效头颈 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001)MDA-MB-468突变乳腺 是(p≤0.0001) ND 是(p≤0.0001)MDA-MB-231突变乳腺 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001)ND＝未做表7 p53 Ad与阿霉素联合的抗增殖作用联合的作用是否增大？细胞系 p53蛋白 组织类型 先用阿霉素 先用p53Ad 同时SK-OV-3无效 卵巢 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001)SCC-9 无效 头颈 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001)SCC-15 无效 头颈 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001)SCC-25 无效 头颈 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001)DU-145 突变 前列腺是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001)MB-231 突变 乳腺 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001) 是(p≤0.0001)阿霉素和p53对人肝细胞癌的作用下面的实施例详述了本发明表达p53的腺病毒与阿霉素结合治疗肿瘤以及结合疗法比任何一种单独方法具有更强的，即协同作用，杀死癌细胞的作用。结果证明了表达p53的本发明载体(ACN53)与阿霉素之间存有协同的相互作用。
将阿霉素和p53(ACN53，表达人野生型p53转基因的重组腺病毒构建体)给予下列细胞系HLE，一种人肝细胞癌细胞系(Hsu(1993)癌症发生14987-992；Farshid(1992)医学病毒学杂志38235-239；Dor(1975)Gann 66385-392)，携带突变的p53；HLF，一种携带突变p53(ibid)的人肝细胞癌细胞系；Hep3B，不带p53基因的人肝细胞癌细胞系(Hasegawa(1995)体外细胞发育生物学3155-61)；HepG2，一种携带野生型p53(ibid)的人肝细胞癌细胞系；和SK-HEP-1，一种携带野生型p53的肝脏腺癌细胞(Lee(1995)FEBS Lett 368348-352)。细胞的存活力用肝细胞探针AM(分子探针)进行测定(见Poole(1993)细胞科学杂志106685-691)。底物AM能被细胞内的酯酶降解，生成一种荧光物质。
细胞以5×103个/孔的浓度铺在96孔板中，粘附过夜后，第10天，加入A/C/N/53和阿霉素的稀释液，每种剂量各加3孔，以便利用ACN53的每种剂量绘出阿霉素治疗的剂量反应曲线。第3天，吸出培养介质，将溶解在PBS中的AM加入细胞中。各孔的荧光强度用荧光板读数仪计量。减去未加细胞的孔的荧光值后，将实际值除以未接受处理的对照孔的荧光值，得到存活率(荧光强度)。ED50值被用来绘制均等线图，籍此评估A/C/N/53和阿霉素之间的相互作用。
均等线图分析每种细胞系后发现表达p53的本发明载体(ACN53)和阿霉素之间存在协同的相互作用；这一协同作用与细胞系中是否有p53存在无关。但值得注意的是，在无阿霉素存在的情况下，p53野生型细胞系比p53基因突变的细胞系的ACN53的ED50高许多。
在另一类似的实验里，HLE细胞被加至96孔板中(5×103个/孔)；粘附过夜后，一式三份地加入ACN53和阿霉素的稀释液以便利用ACN53的每种剂量绘出阿霉素的剂量反应曲线。3个小组被用来测验给药的先后顺序对ACN53和阿霉素间相互作用的影响。组别第0天 第1天第2天第3天同时ACN53，阿霉素收获先用ACN53 ACN53 阿霉素收获先用阿霉素 阿霉素 ACN53 收获第1次处理完毕后细胞温育3天。吸出培养介质后，将溶在PBS中的AM加至细胞孔中。各孔的荧光强度用荧光板读数仪测定。扣除无细胞孔的荧光值后，结果以相对于未受处理的对照孔的存活率(荧光强度)来表示。ED50值被用于绘制均等线图。均等分析各种给药方案的结果表明，HLE细胞中存在相似的相互作用，即ACN53和阿霉素之间存有不依赖治疗过程中给药顺序先后的协同作用。
p53和化疗药物的体内联合用药对与临床有关的抗癌剂顺铂、阿霉素和5-氟尿嘧啶(5-FU)和本发明肿瘤抑制因子载体(A/C/N53)的联合运用，做了进一步的体内研究。
C.B.17/ICR-SCID小鼠购自Taconic Farms(Germantown，NY)或Charlec River实验室(Wilmington，MA)。无胸腺nu/nu小鼠购自CharlesRiver实验室。全部小鼠均在VAF-屏障的设施中养护，处理小鼠的全部过程均按NIH制定的实验动物养护和使用规则进行。不同治疗组每一天的肿瘤体积大小用Statview II软件做Student′s检验；进行比较(Abacus Concepts，Berkeley，CA)。给出肿瘤生长曲线并注明平均肿瘤体积±标准差。通常每组有10只小鼠。
SK-OV-3卵巢肿瘤模型已建立的腹膜内SK-OV-3肿瘤采用腹膜内给予P53 Ad，顺铂或二者结合的方式进行处理。2周内小鼠接种了36次p53 Ad。总病毒接种量为1.5×109C.I.U.(3.1×1010病毒颗粒)。
顺铂的药效
第10天，雌性SCID小鼠经腹膜下注射5×106SK-OV-3卵巢肿瘤细胞。第6、8、10、13、15和17天，小鼠经腹膜下给药(p53 Ad仅在第17天给予)。小鼠接受6.2ml的总量(0.1ml的顺铂载体或p53Ad的给药剂量为2.5×108C.I.U./小鼠/天(5.2×109病毒颗粒)。顺铂的剂量为2mg/kg/天。第20天收获肿瘤并称重。
治疗组的小鼠接受了5次顺铂的注射，同时还有第1个5次p53 Ad注射。这种腹膜内注射p53 Ad的治疗在第20天时仅减少17％小鼠肿瘤负荷(p≤0.01)。但当和顺铂结合给药时，p53 Ad可较单独给予顺铂减少38％肿瘤负荷(P≤0.0008)。单独用药物载体或p53 Ad能引起血性腹水，并在胳肌中形成侵犯性的肿瘤小结。而在单用顺铂或顺铂联合p53 Ad治疗的小鼠则没有这些症状出现。
顺铂/紫杉醇的疗效第10天，雌SCID小鼠被经腹膜内注射了2.5×106SK-OV-3卵巢癌细胞。第7、9、11、16和18天小鼠接受药物注射。给药总体积为0.3ml(0.1ml顺铂或顺铂载体或加0.1ml紫杉醇或紫杉醇载体加0.1ml Ad缓冲液或p53 Ad)。p53 Ad给药的剂量为2.5×108C.I.U./小鼠/天(5.2×109病毒颗粒)。顺铂的剂量是0.5mg/kg/天。紫杉醇的剂量是1mg/kg/天。第30天收获肿瘤，称重。每组小鼠数目为7或10只。
在这第二项研究里，SK-OV-3卵巢癌利用腹膜下给药的方式，即分别给与p53 Ad，顺铂加紫杉醇，或3种药物同时给予。全部三种药物同时给予比联合给予顺铂加紫杉醇能多减少34％肿瘤负荷，说明三种药物联合运用，具有更高的疗效(p≤0.006)。
DU-145前列腺肿瘤模型顺铂疗效腹膜内的DU-145肿瘤接受腹膜内药物注射；p53 Ad，顺铂或此2种药物联用。雄性SCID小鼠于第0天经腹膜下注射2.5×106DU-145细胞。第7、9、11、14和16天，小鼠接受经腹膜内注射的药物治疗。给药总体积0.2ml(0.1ml顺铂载体或顺铂加0.1ml Ad缓冲液或p53Ad)。p53 Ad的给药剂量为8.3×108C.I.U./小鼠/天(2.9×1010病毒颗粒)。顺铂的给药剂量为1mg/kg/天。第22天收获肿瘤，称重。与任何一种单独给药相比，p53 Ad和顺铂联合给药具有更明显的抗肿瘤作用(p≤0.0004)。
MDA-MB-468乳腺癌肿瘤模型顺铂疗效已建立的MDA-MB-468肿瘤接受给药治疗，p53 Ad，顺铂或二种药物联用。在第0天开始治疗前的11天，雌性SCID小鼠的乳腺脂垫被注入了1×107MDA-MB-468细胞。经腹膜内给予顺铂的剂量为1mg/kg/天。第0-4天，经瘤体内注射p53 Ad，剂量是8.3×108C.I.U./小鼠/天(2.9×1010病毒颗粒)。当p53 Ad与顺铂联合给药时，疗效明显增强(第8-31天，p≤0.0004)。
阿霉素疗效在第二个实验里，MDA-MB-468肿瘤接受了药物治疗，p53 Ad，阿霉素或二种药物联用。在第0天给药前的12天，经皮下注射1×107MDA-MB-468细胞至雌性裸鼠的体内。第0、2、7和9天，经注射阿霉素的剂量为5×108C.I.U/小鼠/天。当与阿霉素联用时，p53 Ad的疗效加强(第14-24天，p≤0.05)。
SSC-15头颈肿瘤模型5-氟尿嘧啶的疗效皮下SCC-15肿瘤用p53 Ad，5-氟尿嘧啶(5-FU)或二种药物联用，第0天开始治疗的前7天，SCID小鼠经皮下注射5×106SCC-15细胞。腹膜内注射浓度为50mg/kg/天的溶在40％羧脯氨酸-β-环糊精(Cerestar Inc Hammond，IN)的5-氟尿嘧啶，给药时间为第0、7和14天(一周1次，共3周)。第0、1、7、8、14和15天(3周内6次瘤体内注射)，注射浓度为2×108C.I.U./小鼠/天的p53 Ad。5-FU的给药浓度为50mg/kg。p53 Ad和5-FU的联合给药比任何一种单独给药产生了更大抗肿瘤活性(P≤0.04)。
p53和FPT抑制剂对蛋白法尼基转移酶抑制剂与名为A/C/N/53的肿瘤抑制因子载体的联合作用进行了体内研究。下面的实施例详述了表达p53的本发明腺病毒与名为＂FPT39＂的FPT抑制剂联合用于肿瘤的治疗(如国际申请WO/97/23478，1996年12月19日公开的文件所述，FPT39被称为化合物＂39.0＂，见WO97/23478第95页)，并且采用联合疗法治疗前列腺肿瘤细胞和乳腺肿瘤细胞，比单独使用一种疗法具有更强的杀死瘤细胞的作用。
RAd5/p53和FPT39对SK-OV-3卵巢肿瘤的抗增殖效用方法将SK-OV-3人卵巢瘤细胞(p53null)等份地加入96孔板中，250个细包/孔，培养基为含10％胎牛血清的Eagle′s MEM。然后，在37℃和5％CO2的条件下温育细胞4小时。加FPT39或药物载体至各孔中，继续温育3天。3天后，对某些孔中未受处理的细胞进行计数，以便计算需要加入的rAd5/p53的量。随后，将rAd5/p53或药物载体加入各孔中，细胞再继续培养3天。MTT法测定细胞的增殖情况。简而言之，加25μl 5mg/mlA的MTT活体染料(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯四氮唑溴)至各孔中，温育3-4小时，37℃和5％CO2。随后加100μl 1％SDS去污剂至各孔中，继续温育过夜。各孔中的荧光用分子设施微量滴定板读数仪进行定量。细胞增殖的数据用＂Thin Plate Spline统计法(见O′Connell和Wolfinger(1997))JComp Graph.Stat.6224-241)进行分析。
结果rAd5/p53和FPT 39对细胞生长的抑制作用具有叠加性。此实验既未发现二者有协同作用(p＞0.05)，也未发现有拮抗作用(p＞0.05)。
rAd5/p53和FPT39(FPT抑制剂)对DU-145前列腺瘤细胞的抗增殖作用及协同疗效方法DU-145人前列腺瘤细胞(p53mut)接受了FPT39或药物载体，及rAd5/p53的联合处理，随后进行细胞培养的分析，步骤同上述的SK-OV-3人卵巢肿瘤细胞一样。该实验重复了2次。
结果实验1rAd5/p53和FPT39具有累加抑制细胞生长的作用。协同作用(p＞0.05)和拮抗作用(P＞0.05)均未在本实验中得到证实。
实验2rAd5/p53和FPT39有一协同疗效(p＝0.0192)。这些结果证明rAd5/p53和FPT39能相互作用，并对前列腺瘤细胞的增殖有一协同的抑制作用。
RAd5/p53和FPT39(FPT抑制剂)对MDA-MB-231乳腺癌细胞的抗增殖作用及协同疗效方法MDA-MB-231人乳腺癌细胞(p53mut)用FPT39或药物载体和rAd5/p53进行处理，随后分析细胞培养物，方法见上述SK-OV-3人卵巢瘤细胞。该实验重复2次。
结果实验1rAd5/p53和FPT39具有累加疗效。本实验未证实二者有协同疗效(P＞0.05)。
实验2rAd5/p53和FPT39在多数应答表面具有累加疗效。，但由于等干值大于或等于70(即小于30％的细胞被杀死，P＝0.0001)，可见二者之间存有一明显的协同作用。这些结果证明，rAd5/p53和FPT39能相互作用，并对人乳腺癌细胞的增殖具有协同的抑制作用。
实施例7携带p53的腺病毒载体治疗转移肝癌病人的免疫应答本发明提供了体内治疗肿瘤的方案，即将表达p53的核酸及化疗药物联合给药。下面的实施例详述了表达p53的本发明腺病毒能增加存在于人肝癌中的肿瘤杀伤淋巴细胞的水平。
本研究的目的在于确认肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的基因型和表型，这些带有p53突变的TILs存在于源自结肠的转移肝癌(有关TILs的文献见Wang(1997)分子医学3716-731；Marrogi(1997)国际癌症学杂志74492-501)。共有16个病人借助肝动脉造管术，接受了带有野生型p53基因的腺病毒治疗，病毒以剂量(109-1011颗粒)渐增的方式给予。病毒接种后3-7天内，每个病人都需做共4次的活组织检查。随后对来自正常肝脏和肿瘤-宿主的组织界面处的冻存组织进行了免疫组化分析。为了测定宿主对以下单克隆抗体的免疫反应性，又进行了计算机支持的成像分析，这些单抗包括CD3，CD4，CD8，CD25，CD28，CD56，HIL-DR，INF-γ，INF-α和IL-2。结果观察到TILs(CD3+和CD4+)的水平明显增高，其最高值达到7.5×1010个颗粒。若病毒剂量较高，则发现CD3+和CD4+的细胞数目减低，而CD8+细胞正好与CD3+和CD4+细胞相反。当病毒剂量最高(2.5×1011)时，与正常组织相比，肿瘤组织中的CD3+，CD4+和CD8+的细胞普遍增高。这些结果表明，给予高剂量的腺病毒颗粒能使CD4+和CD8+TILs的数目增加。
应当理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，据此的各种修正和更改能为本领域的熟练技术的人员所接受，将被包括在本申请的精神和范围之内，也属于后面的权利要求之内。在此引用的所有出版物，专利和专利申请一并参见参考文献。
权利要求
1. 一种治疗哺乳动物癌症或过度增殖细胞的方法，所说的方法包括将所说的细胞与肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸相接触并且还与至少一种辅助抗癌剂相接触。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所说的辅助抗癌剂是微管影响剂。
3. 如权利要求2所述的方法，其中所说的微管影响剂是紫杉醇。
4. 如权利要求1所述的方法，其中所说的方法进一步包括将细胞与化疗药剂相接触。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所说的化疗药剂是顺铂，卡铂，或者navelbine。
6. 如权利要求1所述的方法，其中所说的肿瘤抑制核酸是编码肿瘤抑制蛋白的核酸，其中肿瘤抑制蛋白选自野生型p53蛋白或者视网膜母细胞瘤(RB)蛋白。
7. 如权利要求6所述的方法，其中所说的肿瘤抑制核酸编码野生型p53蛋白。
8. 如权利要求6所述的方法，其中所说的视网膜母细胞瘤蛋白是p110RB或者p56RB。
9. 如权利要求1所述的方法，其中所说的核酸通过选自裸露的DNA质粒、在脂质体中的质粒、与脂类相复合的质粒、病毒载体、AAV载体和重组腺病毒载体的载体来输送。
10. 如权利要求1所述的方法，其中所说的核酸通过重组腺病毒载体来输送。
11. 如权利要求10所述的方法，其中所说的核酸通过包括部分或者完全缺失的蛋白IX DNA并且包括编码野生型p53蛋白的重组腺病毒载体来输送。
12. 如权利要求11所述的方法，其中所说的蛋白IX基因序列的缺失范围从5′病毒末端大约3500bp至5′病毒末端大约4000bp。
13. 如权利要求12所述的方法，进一步包括病毒早期区域3中的非必需DNA序列的缺失。
14. 如权利要求11所述的方法，进一步包括病毒早期区域4中的非必需DNA序列的缺失。
15. 如权利要求11所述的方法，进一步包括记作E1a和E1b的DNA序列的缺失。
16. 如权利要求10所述的方法，其中所说的重组腺病毒载体含有腺病毒2型主要晚期启动子或者人CMV启动子、腺病毒2型三联前导cDNA和人p53 cDNA。
17. 如权利要求16所述的方法，其中所说的载体是A/C/N/53。
18. 如权利要求2所述的方法，其中所说的微管影响剂选自紫杉醇和Taxotere。
19. 如权利要求18所述的方法，其中所说的微管影响剂是Taxol。
20. 如权利要求3所述的方法，其中所说的细胞首先与所说的肿瘤抑制核酸或肿瘤抑制蛋白相接触并且然后再与所说的紫杉醇或者紫杉醇衍生物相接触。
21. 如权利要求3所述的方法，其中所说的细胞首先与所说的紫杉醇或者紫杉醇衍生物相接触并且然后再与所说的肿瘤抑制核酸或肿瘤抑制蛋白相接触。
22. 如权利要求2所述的方法，其中所说的细胞同时与所说的紫杉醇或者紫杉醇衍生物及所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸相接触。
23. 如权利要求1所述的方法，其中所说的细胞是肿瘤细胞。
24. 如权利要求23所述的方法，其中所说的肿瘤细胞包括选自卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、乳房瘤、结肠癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、肾癌、和头颈癌的一种癌。
25. 如权利要求1所述的方法，其中所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸分散于药物学可接受的赋形剂中。
26. 如权利要求3所述的方法，其中所说的紫杉醇或者紫杉醇衍生物分散于药物学可接受的赋形剂中。
27. 如权利要求2所述的方法，其中所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸以及所说的紫杉醇或者紫杉醇衍生物分散于单一组合物之中。
28. 如权利要求1所述的方法，其中所说的接触包括将所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸注射进入肿瘤中。
29. 如权利要求1所述的方法，其中所说的接触包括动脉内注射所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸。
30. 如权利要求29所述的方法，其中所说的接触是肝动脉内注射所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸以治疗肝癌，或者是腹膜内注射所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸以治疗卵巢癌。
31. 如权利要求3所述的方法，其中所说的接触包括将所说的紫杉醇或者紫杉醇衍生物注射进入肿瘤中。
32. 如权利要求3所述的方法，其中所说的接触包括静脉注射所说的紫杉醇或者紫杉醇衍生物。
33. 如权利要求1所述的方法，其中所说的接触包括系统的、区域的、定点的、局部的、腹膜内的、胸膜腔内的、口服的、口腔的、舌下的、气管内的、跨粘膜的、膀胱的、阴道的、子宫的、直肠的、或者鼻内的给药。
34. 如权利要求2所述的方法，包括将所说的细胞与A/C/N/53和紫杉醇相接触。
35. 如权利要求1所述的方法，其中所说的将细胞与所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸相接触包括在相互间隔至少大约6小时的多次治疗中将所说的细胞与所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸相接触。
36. 如权利要求1所述的方法，其中所说的方法包括间隔大约24小时的至少3次治疗。
37. 如权利要求1所述的方法，其中所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸以范围从大约1×109至大约7.5×1015腺病毒颗粒总剂量，按照从下列一组中选出的方案给药以总剂量一次给药、总剂量分作5天内每日给药、总剂量分作15天内每日给药、和总剂量分作30天内每日给药；并且所说的紫杉醇或紫杉醇的衍生物以24小时内范围大约75至大约350mg/m2的总剂量，按照从下列一组中选出的方案给药一次单一剂量给药，在第1天和第2天以剂量每日给药，在第1天、第2天和第3天以剂量每日给药，以每日剂量给药15天，以每日剂量给药30天，以每日连续灌输给药15天，以每日连续灌输给药30天。
38. 如权利要求37所述的方法，其中所说的方法重复两个或更多个循环。
39. 如权利要求38所述的方法，其中所说的两个或更多个循环间隔三或四周。
40. 如权利要求38所述的方法，其中所说的方法重复三个循环。
41. 治疗哺乳动物癌症或过度增殖细胞的试剂盒，所说的试剂盒包括含有选自野生型p53蛋白或者视网膜母细胞瘤(RB)蛋白的肿瘤抑制蛋白或核酸的第一个容器；和含有至少一种辅助抗癌剂的第二个容器。
42. 如权利要求41所述的试剂盒，其中所说的肿瘤抑制核酸编码野生型p53蛋白。
43. 如权利要求41所述的试剂盒，其中所说的辅助抗癌剂是紫杉醇或紫杉醇的衍生物。
44. 如权利要求41所述的试剂盒，进一步含有说明书，描述所说的肿瘤抑制蛋白或核酸以及所说的辅助抗癌剂的给药以用于抑制所说的细胞的生长或增殖。
45. 如权利要求41所述的试剂盒，其中所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸选自p53、p110RB、和p56RB。
46. 如权利要求41所述的试剂盒，其中所说的第一个容器含有在重组腺病毒载体上的核酸。
47. 如权利要求46所述的试剂盒，其中所说的在重组腺病毒载体上的核酸包括部分或者完全缺失的蛋白IX DNA并且包括编码野生型p53蛋白的核酸。
48. 如权利要求47所述的试剂盒，其中所说的蛋白IX基因序列的缺失范围从5′病毒末端大约3500bp至5′病毒末端大约4000bp。
49. 如权利要求48所述的试剂盒，进一步包括记作E1a和E1b的DNA序列的缺失。
50. 如权利要求46所述的试剂盒，其中所说的重组腺病毒载体含有腺病毒2型主要晚期启动子或者人CMV启动子、腺病毒2型三联前导cDNA和人p53 cDNA。
51. 如权利要求46所述的试剂盒，其中所说的载体是A/C/N/53。
52. 含有肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸以及至少一种辅助抗癌剂的药物组合物。
53. 如权利要求52所述的组合物，其中所说的辅助抗癌剂是紫杉醇或紫杉醇的衍生物。
54. 如权利要求52所述的组合物，其中所说的肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸选自编码野生型p53蛋白的核酸、编码视网膜母细胞瘤(RB)蛋白的核酸、野生型p53蛋白、和视网膜母细胞瘤(RB)蛋白。
55. 如权利要求52所述的组合物，其中所说的核酸编码野生型p53蛋白。
56. 如权利要求52所述的组合物，其中所说的核酸编码视网膜母细胞瘤p110RB或p56RB。
57. 如权利要求52所述的组合物，其中所说的核酸位于重组腺病毒载体上。
58. 如权利要求57所述的组合物，其中所说的位于重组腺病毒载体上的核酸包括部分或者完全缺失的蛋白IX DNA并且包括编码野生型p53蛋白的核酸。
59. 如权利要求58所述的组合物，其中所说的蛋白IX基因序列的缺失范围从5′病毒末端大约3500bp至5′病毒末端大约4000bp。
60. 如权利要求59所述的组合物，进一步包括记作E1a和E1b的DNA序列的缺失。
61. 如权利要求57所述的组合物，其中所说的重组腺病毒载体含有腺病毒2型主要晚期启动子或者人CMV启动子、腺病毒2型三联前导cDNA和人p53 cDNA。
62. 如权利要求57所述的组合物，其中所说的载体是A/C/N/53。
63. 如权利要求53所述的组合物，其中所说的紫杉醇或紫杉醇的衍生物是紫杉醇。
64. 包括哺乳动物癌症或过度增殖细胞的组合物，其中所说的细胞含有外源性的肿瘤抑制核酸或肿瘤抑制蛋白以及紫杉醇或紫杉醇的衍生物。
65. 如权利要求64所述的组合物，其中所说的肿瘤抑制核酸是编码选自野生型p53蛋白和视网膜母细胞瘤(RB)蛋白的肿瘤抑制蛋白编码的核酸。
66. 如权利要求64所述的组合物，其中所说的肿瘤抑制核酸编码野生型p53蛋白。
67. 如权利要求65所述的组合物，其中所说的视网膜母细胞瘤蛋白是p110RB或p56RB。
68. 如权利要求64所述的组合物，其中所说的细胞存在于哺乳动物中。
69. 如权利要求64所述的组合物，其中所说的细胞是肿瘤细胞。
70. 如权利要求69所述的组合物，其中所说的肿瘤细胞包括选自卵巢癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肝癌、黑素瘤、视网膜母细胞瘤、乳房瘤、结肠癌、白血病、淋巴瘤、脑瘤、子宫颈癌、肉瘤、前列腺瘤、膀胱瘤、网状内皮组织瘤、Wilm氏瘤、星细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、肾癌、和头颈癌的一种癌。
71. 一种治疗转移细胞的方法，所说的方法包括将所说的细胞与肿瘤抑制核酸或肿瘤抑制多肽相接触。
72. 如权利要求71所述的方法，其中所说的接触包括将肿瘤抑制核酸对外科伤口进行局部给药。
73. 如权利要求71所述的方法，其中所说的细胞进一步与至少一种辅助抗癌剂相接触。
74. 如权利要求73所述的方法，其中所说的辅助抗癌剂是紫杉醇。
75. 如权利要求73所述的方法，其中所说的辅助抗癌剂是微管影响剂。
76. 如权利要求71所述的方法，其中所说的方法进一步包括将细胞与化疗药剂相接触。
77. 如权利要求71所述的方法，其中所说的化疗药剂是顺铂，卡铂，或者navelbine。
全文摘要
在一个实施方案中,本发明提供了治疗哺乳动物癌症或过度增殖的细胞的方法,该方法包括将所说的细胞与肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸相接触,并且将所说的细胞与至少一种辅助抗癌剂相接触。本发明还提供了含有肿瘤抑制蛋白或肿瘤抑制核酸以及至少一种辅助抗癌剂的药物组合物,以及用于治疗哺乳动物的癌症或过度增殖的细胞的试剂盒。
文档编号A61K45/06GK1252689SQ98804254
公开日2000年5月10日 申请日期1998年2月17日 优先权日1997年2月18日
发明者洛蕾塔·尼尔森, 乔·安·霍罗威茨, 丹尼尔·C·马内瓦尔, G·威廉·德默斯, 玛丽·埃伦·雷巴克, 吉恩·雷斯尼克 申请人:坎吉公司