专利名称：抗人gp39的人源化抗体、包含所述人源化抗体的组合物及其治疗用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人gp39特异性的人源化抗体、编码这种抗体的DNA、其生产方法、含其的药用组合物以及这种人源化抗体作为治疗剂的用途。这些抗体在治疗自身免疫病方面具有特殊应用，所述自身免疫病包括例如类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病和系统性红斑狼疮、以及非自身免疫病，包括例如移植物抗宿主病以及用于预防移植排斥。
背景技术：
免疫系统能够对外源抗原产生两种类型的抗原特异性应答。细胞介导的免疫是用来指由T淋巴细胞介导的免疫系统的效应子功能的术语。体液免疫是用来指B淋巴细胞产生抗原特异性抗体的术语。长期以来人们认识到，针对大多数抗原的体液免疫的发生不仅需要产生抗体的B淋巴细胞，而且需要辅助T(下文称为Th)淋巴细胞的参与。(Mitchison,Eur.J.Immunol.,1:18-25(1971)；Claman和Chaperon,Transplant Rev.,1:92-119(1969)；Katz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,70:2624-2629(1973)；Reff等,Nature,226:1257-1260(1970))。对依赖胸腺(下文称为TD)的抗原刺激应答时，Th细胞提供某些信号或“辅助”。尽管某些B淋巴细胞辅助由Th细胞释放的可溶性分子(例如诸如IL-4和IL-5的淋巴因子)介导，但B细胞的激活也需要B细胞和Th细胞之间依赖接触的相互作用。(Hirohata等，J.Immunol.,140:3736-3744(1988)；Bartlett等，J.Immunol.,143:1745-1765(1989))。这表明，B细胞激活涉及B细胞和Th细胞细胞表面分子之间的专性的相互作用。分离的活化T细胞的质膜可以提供B细胞激活必需的辅助功能，这一观察进一步支持这种相互作用。(Brian,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:564-568(1988)；Hodgkin等，J.Immunol.,145:2025-2034(1990)；Noelle等，J.Immunol.,146:1118-1124(1991))。
人们还知道，在称为“T细胞辅助功能”的依赖接触的过程中，CD4+T淋巴细胞指导B淋巴细胞的激活和分化，并由此通过调节抗体分子的特异性、分泌和同种型编码的功能，调节体液免疫应答。(Mitchell等，J.Exp.Med.,128:821(1968)；Mitchison,Eur.J.Immunol.,1:68(1971)；White等，J.Exp.Med.,14:664(1978)；Reinherz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:4061(1979)；Janeway等，Immumol.Rev.,101:39(1988)；O’Brien等，J.Immunol.,141:3335(1988)；Rahemtulla等，Nature,353:180(1991)；和Grusby等，Science,253:1417(1991))。
T细胞辅助B细胞进行分化的过程分为两个不同的阶段诱发期和效应期(Vitetta等，Adv.Immunol.,45:1(1989)；Noelle等，Immunol.Today,11:361(1990))。在诱发期中，静息T细胞接触接触过抗原的B细胞，这种连接使得克隆型(clonotypic)T细胞受体(TCR)-CD4复合物与B细胞上的Ia/Ag复合物相互作用(Janeway等，Immunol.Rev,101:39(1988)；Katz等，Proc.Natl.Acad.Sci.,70:2624(1973)；Zinkemagel,Adv.Exp.Med.,66:527(1976)；Sprent,J.Exp.Med.,147:1159(1978)；Sprent,Immnunol.Rev,42:158(1978)；Jones等，Nature,292:547(1981)；Julius等，Eur.J.Immunol.,18:375(1982)；Chestnut等，J.Immunol.,126:1575(1981)；和Rogozinski等，J.Immunol.,126:735(1984))。Ia/Ag的TCR/CD4识别导致形成稳定的T-B相关对和双向T和B细胞激活(Sanders等，J.Immunol.,137:2395(1986)；Snow等，J.Immunol.,130:614(1983)；Krusemeier等，J.Immunol.,140:367(1988)；Noelle等，J.Immunol.,143:1807(1989)；Bartlett等，J.Immunol.,143:1745(1989)；和Kupfer等，Annu.Rev.Immunol.,7:309(1987))。在效应期中，活化T细胞通过分泌淋巴因子(Thompson等，J.Immunol.,143:369(1985))和通过依赖接触的刺激(Noelle等，J.Immunol.,143:1807(1989)；Clement等，J.Immunol.,140:3736(1984)；Crow等，J.Exp.Med.,164:1760(1986)；Brian,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:564(1988)；Hirohata等，J.Immunol.,140:3736(1988)；Jover等，Clin.Immunol.Immun.,53:90(1989)；Whalen等，J.Immunol.,141:2230(1988)；Pollok等，J.Immunol.,146:1633(1991)；和Bartlett等，J.Immunol.,143:1745(1990))驱动B细胞分化，T细胞驱动小的静息B细胞终末分化为Ig分泌细胞需要分泌淋巴因子和通过依赖接触的刺激这两者(Clement等，J.Immunol.,132:740(1984)；Martinez等，Nature,290:60(1981)；和Andersson等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,77:1612(1980))。
尽管T细胞辅助的诱发期为Ag依赖性的并且是MHC限制性的(Janeway等，Immun.Rev.,101:34(1988)；Katz等，Proc.Natkl.Acad.Sci.,USA,10:2624(1973)；Zinkemagle,Adv.Exp.Med.Biol.,66:527(1976))；但T细胞辅助功能的效应期可以与Ag无关并且是非MHC限制性的(Clement等，J.Immunol.,132:740(1984)；Hirohata等，J.Immunol.,140:3736(1988)；Whalen等，J.Immunol.,143:1715(1988))。另一对比特征是T细胞辅助的诱发期通常需要CD4分子，并且被抗CD4 mAb抑制(Rogozinski等，J.Immunol.,126:735(1984))，而辅助效应功能不需要CD4分子(Friedman等，Cell Immunol.,103:105(1986))，并且不被抗CD4 mAb抑制(Brian,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:564(1988)；Hirohata等，J.Immunol.,140:3736(1988)；Whalen等，J.Immunol.,143:1745(1988)；和Tohma等，J.Immunol.,146:2547(1991))。根据T-B细胞相互作用与抗原特异性相关对的定位的性质，非特异性辅助效应功能据信集中在特定的B细胞靶(Bartlett等，J.Immunol.,143:1745(1989)；Kupfer等，J.Exp.Med.,165:1565和Poo等，Nature,332:378(1988))。
尽管终末B细胞分化需要来自T细胞的接触介导和淋巴因子介导的刺激，但在分泌因子缺乏的情况下B细胞分化的中期可以由活化T细胞表面诱导(Crow等，J.Exp.Med.,164:1760(1986)；Brian,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:564(1988)；Skita等，Eur.J.Immunol.,18:1405(1988)；Hodgkin等，J.Immunol.,145:2025(1990)；Noelle等，FASEB J,5:2770(1991))。B细胞上的这些中间效应包括表面CD23表达的诱导(Crow等，Cell Immunol.,121:94(1989))、与细胞周期进程相关的酶(Pollok等，J.Immunol.,146:1633(1991))和对淋巴因子的反应性(Noelle等，FASEBJ,5:2770(1989)；Pollok等，J.Immunol.,146:1633(1991))。最近，已经鉴定了指导B细胞激活的某些活化诱导的T细胞表面分子。另外，功能研究已经特征鉴定出指导B细胞激活的活化诱导的T细胞表面分子部分特征。首先，T细胞在活化后4-8小时获得刺激B细胞的能力(Bartlett等，J.Immunol.,145:3956(1990)和Tohma等，J.Immunol.,146:2544(1991))。其次，在低聚甲醛固定的细胞上(Noelle等，J.Immunol.,143:1807(1989)；Cros等，J.Exp.Med.,164:1760(1986)；Pollok等，J.Immunol.,146:1633(1991)；Tohma等，J.Immunol.,146:2544(1991)；和Kubota等，Immunol.,72:40(1991))和纯化的膜片段上(Hodgkin等，J.Immunol.,145:2025(1990)和Martinez等，Nature,290:60(1981))保留与活化T细胞表面相关的B细胞刺激活性。第三，B细胞刺激活性对蛋白酶处理敏感(Noelle等，J.Immunol.,143:1807(1989)；Sekita等，Eur.J.Immunol.,18:1405(1988)；和Hodgkin等，J.Immunol.,145:2025(1990)。第四，T细胞激活后获得需要这些表面活性结构的过程受环己酰亚胺抑制(Tohma等，J.Immunol.,196:2349(1991)和Hodgkin等，J.Immunol.,195:2025(1990))。
在未成熟的和成熟的B淋巴细胞上已经鉴定出细胞表面分子CD40，它被抗体交联时，诱导B细胞增殖。Valle等，Eur.J.Immunol.,19:1463-1467(1989)；Gordon等，J.Immunol.,140:1425-1430(1988)；Gruder等，J.Immunol.,142:4144-4152(1989)。
已经对CD40进行了分子克隆和特征鉴定(Stamenkovic等，EMBOJ.,8:1403-1410(1989))。
CD40在B细胞、交错突细胞、巨噬细胞、小结树突细胞和胸腺上皮细胞上表达(Clark,Tissue Antigens 36:33(1990)；Alderson等，J.Exp.Med.,178:669(1993)；Galy等，J.Immunol.,142:772(1992))。人CD40为50kDa的Ⅰ型膜蛋白，属于神经生长因子受体家族(Hollenbaugh等，Immunol.Rev.,138:23(1994))。在IL-10存在下通过CD40的信号，诱导IgA、IgM和IgG产生，表明同种型转换通过这些相互作用调节。CD40及其配体之间的相互作用导致B细胞接触过抗原的状态，使其可接受随后的信号。
此外，最近已经对CD40的配体gp39(也称为CD40配体或CD40L)进行了分子克隆和特征鉴定(Armitage等，Nature,357:80-82(1992)；Lederman等，J.Exp.Med.,175:1091-1101(1992)；Hollenbaugh等，EMBOJ.,11:4313-4319(1992))。gp39蛋白在活化的、但非静息的CD4+Th细胞上表达。Spriggs等，J.Exp.Med.,176:1543-1550(1992)；Lane等，Eur.J.Immunol.,22:2537-2578(1992)；和Roy等，J.Immunol.,151:1-14(1993)。用gp39基因转染并在其表面上表达gp39蛋白的细胞，可以触发B细胞增殖，并且与其它刺激信号一起可以诱导抗体产生。Armitage等，Nature,357:80-82(1992)；和Hollenbaugh等，EMBO J.,4313-4319(1992)。特别是，已经鉴定了小鼠(Noelle等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:6550(1992)；Armitage等，Nature,357:80(1992))和人类(Hollenbaugh等，EMBO J.11:4313(1992)；Spriggs等，J.Exp.Met.,176:1543(1992))的CD40的配体gp39。gp39为Ⅱ型膜蛋白，为新基因超家族的部分，该超家族包括TNF-α、TNF-β和FAS、CD27、CD30和4-1BB的配体。
用或者抗CD3抗体或者乙酸肉豆蔻佛波醇(PA)加离子霉素，可以容易地在CD44T细胞上体外诱导gp39的表达。表达是快速且瞬时的，于6-8小时达到峰值，在24-48小时之间回到接近静息水平(Roy等，J.Immunol.,151:2497(1993))。在体内，已经报道在人类中gp39存在于与CD40+B细胞相关的淋巴滤泡外膜和中心细胞区中和脾动脉周围淋巴鞘中的CD4+T细胞上(Lederman等，J.Immunol.,149:3807(1992))。gp39+T细胞产生IL-2、IL-4和IFN-γ(Van der Eetwegh等，J.Exp.Med.,178:1555(1993))。
对人类疾病X连锁高IgM综合征(HIM)的研究，提供了对gp39在体液免疫调节方面新作用的仅有的了解。HIM是极度的X连锁免疫缺陷，其典型特征为丧失依赖胸腺的体液免疫、不能产生IgG、IgA和IgE。gp39基因的突变导致表达非功能性gp39蛋白，并且HIM患者的辅助T细胞不能激活B细胞(Allen等，Science,259:990(1993)；Aruffo等，Cell,72:291(1993)；DiSanto等，Nature,361:541(1993)；Korthauer等，Nature,361:539(1993))。这些研究支持以下结论在所述肽/MHCⅡ型复合物占用T细胞受体后早期，在相关辅助T细胞上诱导gp39，并且gp39结合至B细胞上的CD40，诱导B细胞进入细胞周期并分化为分泌免疫球蛋白(Ig)和同种型转换。
功能研究表明，用抗gp39处理小鼠，完全消除了针对依赖胸腺的抗原的抗体应答(SRBC和TNP-KLH)，但未消除不依赖胸腺的抗原的抗体应答(TNP-菲可)(Foy等，J.Exp.Med.,178:1567(1993))。另外，用抗gp39处理在注射胶原蛋白的小鼠中防止发生胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)(Durie等，Science,261:1328(1993))。最后，抗gp39防止形成记忆B细胞和小鼠脾脏中的生发中心(Foy等，J.Exp.Med.,180:157(1994))。总之，这些数据提供了广泛的证据，表明T细胞上的gp39和B细胞上的CD40之间的相互作用是针对依赖胸腺的抗原的抗体应答所必需的。
最近，已经利用许多自身免疫病的鼠模型评估给予抗gp39对疾病发生的潜在治疗价值。以下提供了在这些模型中进行的研究结果的简单讨论胶原蛋白诱导的关节炎CIA是用于人自身免疫病类风湿性关节炎(RA)的动物模型(Trenthom等，J.Exp.Med.,146:857(1977))。通过给予异源Ⅱ型胶原蛋白，可以在许多物种中诱导该疾病(Courtenay等，Nature,283:665(1980)；Cathcart等，Lab.Invest.,54:26(1986))。
为了研究抗gp39对CIA诱导的影响(Durie等，Science,26:1328(1993))，给雄性DBA1/J小鼠尾部基部皮内注射在完全弗氏佐剂中乳化的鸡Ⅱ型胶原蛋白。21天后进行后续的攻击。然后用相关的对照抗体或抗gp39处理小鼠。与免疫的未处理对照小鼠相比，用抗gp39处理的小鼠组没有表现出抗胶原蛋白抗体的效价。组织学分析表明，用抗gp39抗体处理的小鼠没有表现出炎症或在免疫动物中观察到该疾病的任何典型病理组织学表现的迹象。这些结果表明，gp39-CD40相互作用在CIA诱导中是绝对必需的。如果没有获得T细胞和B细胞之间初始的相关相互作用，则不发生下游的过程，诸如自身抗体形成和产生的炎症应答。
最近已经表明，gp39在缺乏GM-CSF、IL-3和IFN-δ的情况下激活单核细胞产生TNF-α和IL-6中是重要的(Alderson等，J.Exp.Med.,178:669(1993))。已经表明TNF-α与CIA疾病过程(Thorbecke等，Eur.J.Immunol.,89:7375(1992)和RA(DiGiovane等，Ann.Rheum.Dis.,47:68(1988)；Chu等，Arthrit. Rheum.,39:1125(1991)；Brennan等，Eur.J.Immuno.,22:1907(1992))相关。因此，用抗gp39抑制TNF-α可能在关节炎小鼠的关节中具有极度的抗炎症效应。抗gp39对TNF-α和T细胞-B细胞相互作用的抑制可能有助于CIA的表现。实验性变应性脑脊髓炎(EAE)EAE是一种中枢神经系统(CNS)的实验性自身免疫病(Zamvil等，Ann.Rev.Immunol.,8:579(1990))，是用于人类自身免疫病症、多发性硬化(MS)的疾病模型(Alvord等，“多发性硬化的实验性变应性模型”，NY 511(1984))。通过用从CNS纯化的髓磷脂碱性蛋白或致脑炎的蛋白脂质(PLP)免疫，容易地在哺乳动物物种中诱导EAE。SJL/J小鼠是小鼠敏感株(H-2s)，在诱导EAE时，这些小鼠发生急性麻痹性疾病，并且在CNS中可鉴定出急性细胞浸润。
Classen及其同事(未发表的数据)已经研究了抗gp39对SJL/J小鼠中EAE诱导的影响。他们发现，EAE的发生在抗gp39处理的动物中被完全抑制。另外，与对照动物获得的抗PLP抗体应答相比，抗PLP抗体应答延迟并减小。
EAE是通过T细胞介导的细胞介导的自身免疫病的一个实例，没有直接的证据表明在疾病进程中对自身抗体的需求。干扰gp39和CD40之间的相互作用，防止疾病的诱导和疾病的继承性转移。慢性(c)和急性(a)移植物抗宿主病(GVHD)由供体细胞对宿主不相称的MHC等位基因应答导致慢性和急性GVHD。在cGVHD(H-2d-＞H-2bd)中，由于同种异体特异性(allospecific)辅助T细胞和宿主B细胞的相互作用，多克隆免疫球蛋白产生增加。体内给予抗gp39抗体，阻断cGVHD诱导的血清抗DNA自身抗体IgE的产生(即体外自发性免疫球蛋白产生)、相关的脾大和转移疾病的能力。Durie F.H.等，J.Clin.Invest.,94:133(1994)。在抗gp39给予结束后，抗体的产生仍被抑制较长时间。通过体内给予抗gp39，也防止在GVHD中诱导的抗同种异体特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。这些数据提示，CD40-gp39相互作用在两种形式的GVHD的产生中是关键性的。CTL应答被抑制并且用抗gp39短暂处理导致长期防止疾病的事实，提示通过共同给予同种异体细胞和抗gp39抗体导致的T细胞小室的永久性改变。
不同的研究小组已经报道了对gp39特异性的鼠抗体的产生，公开了所述抗体具有作为免疫抑制剂的治疗用途。例如1993年5月27日公开并转让给Columbia University的WO 93/09812；1993年8月18日公开的EP 0,555,880和Moelle等于1994年9月2日申请并转让给Dartmouth College的PCT US/94/09872，描述了对gp39特异性的鼠抗体及其作为治疗药物和免疫抑制剂的用途。
此外，Scaria等，Gene Therapy,4:611-617(1997)报道了使用抗gp39抗体抑制对DNA(腺病毒/载体)的体液免疫应答和细胞免疫应答。
然而，尽管鼠抗体在人类中具有作为治疗剂的应用性，但他们在某些方面有缺点。具体地说，因为鼠抗体来源于外源物种，所以它们在人类中可能具有免疫原性。这通常导致中和抗体应答，如果例如在治疗慢性或复发性疾病病症中需要重复给予所述抗体，这是特别麻烦的。而且，因为它们含有鼠恒定域，所以它们可能不表现出人类的效应子功能。
在消除或减小这类问题的努力中，已经公开了嵌合抗体。嵌合抗体含有两种不同抗体的部分，通常为两种不同物种的抗体部分。一般而言，这种抗体含有人恒定区和另一物种(通常为鼠)的可变区。例如，已经报道，某些鼠/人嵌合抗体表现出亲代鼠抗体的结合特征和与人恒定区相关的效应子功能。参见例如Cabilly等的美国专利4,816,567；Shoemaker等的美国专利4,978,745；Beavers等的美国专利4,975,369；和Boss等的美国专利4,816,397，特此通过引用结合到本文中。一般而言，通过从预存在的鼠杂交瘤中提取的DNA制造基因组基因文库，构建这些嵌合抗体(Nishimura等，Cancer Research,47:999(1987))。然后筛选该文库表现出正确的抗体片段重排模式的重链和轻链的可变区基因。或者，由所述杂交瘤提取的RNA制备cDNA文库并其进行筛选，或通过聚合酶链式反应获得可变区。然后，将克隆的可变区基因连接入含合适的重链或轻链人恒定区基因克隆盒的表达载体中。然后将所述嵌合基因在选择的细胞系、通常为鼠骨髓瘤系中表达。这种嵌合抗体已经用于人类治疗。
在通常指定申请系列第07/912,292号中，公开了“Primatized”TM抗体，它含有人恒定区和Old World猴可变区。这些PrimatizedTM抗体在人类中的耐受性好，产生低或弱的免疫原性。
此外，本领域已知人源化抗体。理想的是，“人源化”产生免疫原性低、完全保留原始分子抗原结合特性的抗体。为了保留原始抗体的所有抗原结合特性，其结合位点的结构必须在“人源化”形式中忠实地再现。这一点可以通过以下方法潜在地达到或者(a)通过将完整的非人类可变域移植到人恒定区上，产生嵌合嵌合抗体，(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81:6801(1984)；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65(1988)(它保留配体结合特性，但也保留非人类可变域的免疫原性)；(b)通过仅将非人类CDR移植到人构架和恒定区上，保留或不保留关键的构架残基(Jones等，Nature,321:522(1986)；Verhoeyen等，Sicence,239:1539(1988))；或(c)通过移植完整的非人类可变域(为了保留配体结合特性)，但也通过合理地取代暴露的残基用人样表面“遮掩”(为了降低免疫原性)(Padlan,Molec.Immunol.,28:489(1991))，将非人类抗体的结合位点移植至人的构架上。
本质上，通过CDR移植的人源化涉及仅将CDR移植到人构架的人片段和恒定区上。理论上说，这应该大致消除免疫原性(除非存在同种异型或独特型差异)。然而，已经报道，原始抗体的某些构架残基也需要保留(Riechmann等，Nature,332:323(1988)；Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10,029(1989))。
可以通过计算机模拟鉴定需要保留构架残基。或者，通过比较已知的抗体结合位点结构，可以潜在地鉴定关键的构架残基(Padlan,Molec.Immun.,3l(3):169-217(1994))。
潜在影响抗原结合的残基分为几组。第一组包括与结合位点表面相连因此可能直接与抗原接触的残基。它们包括氨基末端残基和与CDR相邻的那些残基。第二组包括或者通过接触CDR或者相反链而可能改CDR结构或相对排列的残基。第三组包括具有埋藏的、可能影响可变域结构完整性的侧链的氨基酸。根据采用的编号系统(参见Kabat等，“Sequencees of Proteins of immunological interest，第5版，Pub.No.91-3242,U.S.Dept.Health & Human Services,NIH,Bethesda,MD,1991)，这些组中的残基通常在相同的位置中发现(Padlan,1994(见上文))。
然而，尽管因为人源化抗体在人类的免疫原性潜在低而因此是理想的，但它们的产生是不可预测的。例如，抗体的序列修饰可能导致基本上或甚至全部丧失抗原结合功能，或丧失结合特异性。或者，“人源化抗体”可能在人类中仍存在免疫原性，而与序列修饰无关。
因此，本领域仍非常需要抗所需抗原的新人源化抗体。更具体地讲，本领域需要对gp39特异性的人源化抗体，因为它们具有作为免疫治疗剂的潜力。
本发明的目标为此，本发明的一个目的是提供对人gp39特异性的人源化抗体。
更具体地讲，本发明的一个目的是提供衍生自抗gp39鼠抗体、特别是24-31的人源化抗体，24-31为结合于人gp39的特异性鼠抗体。
本发明的另一个目的提供含对人gp39特异性人源化抗体的药用组合物。
本发明的一个更具体的目的是提供含衍生自24-31的人源化抗体的组合物，24-31为结合于人gp39的特异性鼠抗体。
本发明的另一具体目的是提供使用抗人gp39的人源化抗体治疗人类疾病病症的方法，所述疾病病症可通过调节gp39的表达和/或抑制gp39/CD40结合相互作用而得到治疗，包括自身免疫病，诸如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、特发性血小板减少性紫癜、糖尿病；和非自身免疫病，诸如移植物抗宿主病和移植。
本发明的再一目的是提供编码抗人gp39的人源化抗体的核酸序列。
本发明的一个更具体的目的是提供编码衍生自24-31的人源化抗体的核酸序列，24-31为结合于人gp39抗原的特异性鼠抗体。
本发明的另一目的是提供供表达抗人gp39的人源化抗体(特别是衍生自24-31的人源化抗体)表达用的载体，24-31为结合于人gp39抗原的特异性鼠抗体。
发明概述在其最广义的方面，本发明涉及人源化抗体，所述人源化抗体保留的鼠24-31抗体的gp39抗原结合亲和性不低于约1/10，更优选不低于1/3；和/或例如在测定T细胞依赖性抗体产生的B细胞测定中，保留的鼠抗体24-31的体外功能活性不低于约1/10，更优选不低于约1/3。更具体地讲，在B细胞测定中，在不高于24-31抗体浓度3倍的情况下，本发明的人源化抗体保留的体外功能活性至少为1/10、更优选为至少约1/3的半最大效价。
本发明还涉及结合于与鼠24-31抗体相同的表位和/或能够与鼠24-31抗体竞争以抑制CD40与gp39结合和/或含有24-31抗体的CDR的人源化抗体。
本发明更优选涉及这种人源化抗体，所述人源化抗体衍生自鼠24-31，具有以下提出的人源化可变轻链序列和/或人源化可变重链序列(1) DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA NYQQEPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(3) DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(4) DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK和选择以下的人源化可变重链序列(1) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(2) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；以及其变异体和相当物。在本发明中其变异体和相当物计划包括人源化免疫球蛋白序列，其中通过取代、添加和/或缺失修饰以上鉴定的人源化可变重链序列和/或可变轻链序列中的一个或多个氨基酸残基，其方式使得大致不影响gp39抗原结合亲和性。特别是，本发明包括含有保守取代突变的突变体和相当物，即用相似氨基酸取代一个或多个氨基酸。例如，保守取代是指在同一类中的氨基酸的取代，例如一个酸性氨基酸或碱性氨基酸、中性氨基酸被另一个相同类别中的另一氨基酸取代。本领域熟知保守氨基酸取代的计划。最好是，这种变异体和相当物保留的亲代鼠24-31抗体的gp39抗原结合亲和性将不低于约1/10，更优选保留的亲代鼠24-31抗体的gp39抗原结合亲和性不低于约1/3。另外，例如在测定T细胞依赖性抗体产生的B细胞测定中，这种变异体和相当物保留的鼠抗体24-31的体外功能活性优选至少不低于1/10，更优选至少为约1/3。更优选的是，例如在测定T细胞依赖性抗体产生的B细胞测定中，这种变异体和相当物保留的鼠抗体24-31的体外功能活性至少约1/3。更具体地讲，在B细胞测定中，于不高于亲代24-31抗体浓度的3倍浓度下，这些抗体将保留体外功能活性的半最大效价。
本发明还涉及编码用于表达这种人源化抗体的核酸序列、以及提供用于在重组宿主细胞中生产人源化抗体的表达载体。在最优选的实施方案中，这些DNA序列将编码以下提出的人源化可变重链序列和/或人源化可变轻链序列(1) DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA NYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(3) DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(4) DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK和选自以下的人源化可变重链序列(1) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(2) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS.
此外，本发明也包括上文定义的其相当物和变异体。
本发明还涉及以上鉴定的对gp39特异性的人源化抗体作为治疗药物的用途。本发明也涉及使用题述人源化抗gp39抗体，治疗通过调节gp39表达或抑制gp39/CD40相互作用可治疗的疾病。更具体地讲，本发明涉及使用以上鉴定的对gp39特异性的人源化抗体的人源化抗体，治疗自身免疫病，例如类风湿性关节炎、多发性硬化、糖尿病、系统性红斑狼疮和ITP。本发明还涉及使用题述抗gp39人源化抗体，治疗包括移植物抗宿主病的非自身免疫病以及用于抑制移植排斥。
此外，本发明还涉及题述人源化抗体作为免疫抑制剂的用途，特别是在基因或细胞治疗期间。题述人源化抗体应该通过抑制其中所用载体和细胞的不利免疫原性反应，增强基因治疗或细胞治疗的效力。例如，它们可以用来抑制对病毒载体(例如反转录病毒载体、腺病毒载体)的体液和细胞免疫应答。此外，使用这种抗体应该能够重复给予这种细胞或载体，这将有利于诸如癌症和自身免疫病的慢性疾病的治疗。
附图简述
图1描述了IDEC表达载体N5KG1，它用来表达衍生自24-31的人源化抗体和嵌合抗体。
图2a包含B细胞增殖测定的结果，所述测定使人PBL与可溶性gp39-CD8、重组人IL-4和鼠24-31抗体或对照鼠IgG1单克隆抗体接触，证明24-31抗体抑制gp39诱导的B细胞增殖。
图2b包含B细胞分化测定的结果，该测定采用在IGD+B细胞和不同浓度的24-31抗体存在下培养、用固定化抗CD3激活的、丝裂霉素处理的T细胞，证明24-31抗体抑制T细胞依赖性人B细胞的多克隆抗体的产生。
图3包含非转染CHO细胞和gp39转染子的FACS。
图4包含对应于称为VL#1的优选人源化可变轻链序列(包括互补决定区)或优选人源化可变轻链序列(1)的氨基酸序列和DNA序列。
图5包含对应于称为VL#2的优选人源化可变配体序列(包括互补决定区)或优选人源化可变轻链序列(2)的氨基酸序列和DNA序列。
图6包含对应于称为VH#1的优选人源化可变重链序列(包括互补决定区)或优选人源化可变重链序列(1)的氨基酸序列和DNA序列。
图7包含24-31可变轻链序列(非人源化)的氨基酸序列和DNA序列。
图8包含24-31可变重链序列(非人源化)的氨基酸序列和DNA序列。
图9比较了鼠24-31、嵌合24-31和人源化24-31抗体与gp39表达CHO细胞的结合。
图10包含比较24-31(生物素)和人源化24-31、嵌合24-31和24-31与gp39表达CHO细胞结合的竞争测定结果。
图11包含一个测定的结果，该测定测定鼠24-31和本发明人源化24-31抗体对在丝裂霉素C处理的T细胞存在下培养的B细胞产生人IgM的影响。
图12包含比较两种本发明人源化抗体与gp39表达CHO细胞结合的测定结果。
图13包含鼠24-31的Scatchard图。
图14包含人源化形式1的Scatchard图。
图15包含人源化形式2的Scatchard图。
发明详述在叙述本发明之前，用于本说明书中的某些术语的定义叙述如下人源化抗体抗体-这是指衍生自非人类抗体(通常为鼠)的抗体，它保留或大致保留亲代抗体的抗原结合特性，但在人类中的免疫原性较低。这可以通过包括以下的不同方法达到(a)将整个非人类可变域移植到人恒定区上，产生嵌合抗体，(b)仅将非人类CDR移植到人构架和恒定区上，保留或不保留关键性构架残基，或(c)移植整个非人类可变域，但通过取代表面残基用人样部分“遮掩”它们。这类方法公开于Jones等，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851-6855(1984)；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988)；Verhoeyen等，Science,239:1534-1536(1988)；Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991)；Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994)，特此通过引用结合到本文中。
互补决定区或CDR-本文所用的术语CDR是指如Kabat等(1991)描述的一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和性和特异性的氨基酸序列。
构架区-本文所用的术语FR是指CDR之间插入的氨基酸序列。抗体的这些部分用来保持CDR处于合适的取向(使CDR可以结合抗原)。
恒定区-抗体分子赋予效应子功能的部分。在本发明中，鼠恒定区被人恒定区取代。题述嵌合抗体或人源化抗体的恒定区衍生自人免疫球蛋白。重链恒定区可以选自5种同种型中的任何一种α、δ、ε、γ或μ。此外，不同亚类(诸如重链的IgG亚类)的重链负责不同效应子功能，因此，通过选择所需的重链恒定区，可以产生具有所需效应子功能的嵌合抗体。优选的恒定区为γ1(IgG1)、γ3(IgG3)和γ4(IgG4)。更优选γ1(IgG1)同种型的Fc区。轻链恒定区可以为κ或λ型轻链的恒定区，最好为κ型的恒定区。
嵌合抗体-这是含衍生自两种不同抗体的序列的抗体，所述不同抗体通常为不同物种的抗体。最常见的是，嵌合抗体包含人和鼠抗体片段，通常包含人恒定区和鼠可变区。
免疫原性-用来测定对导向蛋白或治疗部分给予受体时诱发免疫应答(体液或细胞)的能力。本发明涉及题述人源化抗体或其片段的免疫原性。
免疫原性降低的人源化或嵌合抗体-这是指相对于亲代抗体(例如24-31抗体)表现出免疫原性降低的抗体或人源化抗体。
大致保留亲代抗体结合特性的人源化抗体-这是指下述的人源化或嵌合抗体它保留特异性结合用来产生这种人源化或嵌合抗体的亲代抗体识别的抗原的能力。大致保留24-31的结合特性的人源化或嵌合抗体将结合至人gp39。所述人源化或嵌合抗体最好表现出与亲代抗体相同或大致相同的抗原结合亲和性和抗体亲抗原性。理想的是，所述抗体的亲和性不低于亲代抗体亲和性的10％，更优选不低于约30％，最优选所述亲和性不低于亲代抗体的50％。测定抗原结合亲和性的方法是本领域熟知的，包括半最大结合测定、竞争测定和Scatchard分析。合适的抗原结合测定描述于本申请中。
本发明涉及结合人gp39的新型人源化单克隆抗体及其作为治疗剂的用途。本发明还涉及编码所述人源化抗体的核酸序列及其在重组宿主细胞中的表达。
更具体地讲，本发明涉及衍生自特异性结合人gp39的鼠抗体24-31的人源化抗体。
鼠抗体24-31为针对人gp39产生的鼠抗体，它在体外和体内均功能性地失活gp39。因此，它具有的特性使得其可潜在用于治疗希望gp39失活和/或调节或抑制gp39/CD40相互作用的疾病。特别是，这类疾病包括自身免疫病，诸如类风湿性关节炎、多发性硬化、ITP、糖尿病和系统性红斑狼疮；以及非自身免疫病，诸如移植物抗宿主病和移植排斥。
然而，尽管鼠抗体24-31具有的功能特性使得其可潜在适合作治疗剂，但它有几个潜在的缺点。即因为它来源于鼠，所以它在人类潜在地具有免疫原性。此外，因为它含有鼠恒定区序列，所以如果将其给予人类，它可能不表现出全部的人效应子功能，并且可能被更快速清除。尽管这些缺点在治疗某些疾病病症或病人方面不成问题，但如果所治疗的疾病具有慢性或复发性性质，则它们会引起相当大的关注。复发性或慢性疾病的实例包括例如自身免疫病，其中宿主持续或长期表现出抗自身抗原的自身免疫反应。
因此，为了减轻与鼠抗体24-31有关的缺点，即在人类中有潜在的免疫原性且人效应子功能降低，本发明人希望产生改进的鼠24-31抗体的人源化抗体。尽管这是本发明的目标，但所需的结果不具有常规或可预测的性质。抗体的人源化需要小心选择待修饰的氨基酸残基和合理选择待取代的残基。这是因为抗体可变区的修饰，甚至涉及几个氨基酸残基的修饰，可能引起对抗原结合的相当大的有害作用。例如，人源化抗体可能大致表现出相对于亲代抗体的抗原亲和性和/或抗原特异性降低。
如上所述，文献中已经报道了包括鼠抗体的抗体人源化的不同方法。参见例如Padlan,Molec.Immunol.,31(3):169-217(1994)；Padlan,Molec.Immunol.,28:484-498(1991)；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988)，特此通过引用结合到本文中。这些方法具体包括通过CDR移植的人源化(Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Verhoeyen等，Science,239:1534-1539(1988)；和Padlan,Molec.Immunol.,28:489(1991)和Padlan,Molec.Immunol.,31:169(1994)的更简洁的方法，这包括选择非必需构架氨基酸残基以及通过合适的取代突变将其修饰。这些文献通过引用结合到本文中。
如上所述，CDR移植技术尽管在某些情况下获得成功，但可能对所得的人源化抗体的亲和性产生相当不利的影响。据信它的发生是因为某些构架残基影响抗原结合，或为抗原结合所必需的，和至少影响抗原结合。我们的技术；Padlan(1994)(见上文)是更精炼的，因为我们仅保留一些鼠构架残基，这些残基是我们认为对保留抗体所述抗体结合位点、同时保持所述分子尽可能与人分子一样的所述分子表面性质而言是关键性的残基。因此，该技术具有产生保留亲代抗体抗原结合特性的人源化抗体的潜力。因此，本发明人选择该技术作为潜在获得衍生自对人gp39特异性的鼠抗体24-31的人源化抗体的方法。
24-31可变区的克隆(详细描述于下文的实施例中)导致鉴定出24-31抗体利用的分别示于图7和图8的VL和VH序列。测序后，将所述可变区人源化。如上所述，这大致按照Padlan(1994)(见上文)的方法实现，该文献通过引用结合到本文中。
该方法一般包括用人构架残基取代非人类构架，同时仅保留相信对保留抗原结合特性关键性的那些构架残基。理想的是，该方法赋予异种抗体表面上的人样特征，由此使得其免疫原性较低，同时保留影响其抗原结合特性的内部残基和接触残基。
更具体地讲，通过与报道序列的人抗体(称为“模板”)比较，将图7和图8提出的24-31VK和VH序列人源化。
具体地说，采用以下模板，将24-31VK人源化(a)对于VL#1，人V-κ亚组Ⅰ序列，例如DEN等以及种系012(参见Cox等，Eur.J.Immunol.24:827-836(1994))；对于VL#2，人V-κ亚组Ⅳ序列，例如LEN。这种模板序列是已知的，并且在Kabat等(1991)(见上文)或GenBank中报道的。
采用以下模板将24-31VH#1人源化(a)人VH亚组Ⅳ序列、58p2和(b)(GenBank登记号)Z18320和种系3d75d(S.van der Maarel等，J.Immunol.,150:2858-2868(1993)。
这种模板可变的重链抗体序列也是已知的，并且在Kabat等，“有免疫学价值的蛋白序列”，第5版，NIH(1991)和在GenBank中有报道。
根据许多不同的标准，选择模板人可变重链和轻链序列，所述标准特别包括与全长24-31的高度序列相似性、以及在“重要”残基中的相似性，所述“重要”的残基是被认为在VL∶Vh界面中包含的残基；与互补决定区接触的残基或指向内部的残基。此外，选择模板以便潜在地尽可能多地保留24-31Fv的静电荷，以及以保留甘氨酸、脯氨酸和其它被认为影响抗原结合的特定氨基酸残基。
该方法导致以下优选衍生自24-31抗体的人源化VL和VH重链序列，所述序列在表1和表2中提出。如上所述，本发明还包括这些优选人源化序列的相当物和变异体，例如含有大致不影响gp39结合的一个或多个氨基酸保守取代的相当物和变异体。在图7和图8中鉴定了互补决定区，它们含有完整的亲代(非人源化)24-31抗体的可变重链和轻链CDR序列。
表1人源化24-31VL序列1020 4060 708024-31 DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISNMQSEDLADYFC QQYNSYPYT100FGGGTKLEIK(1)DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKRGKSPKLLIY SASNRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYTFGGGTKLEIK(2)DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYTFGGGTKLEIK(3)DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKRGKSPKLLIY SASNRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQYNSYPYTFGGGTKLEIK(4)DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYT GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYTFGGGTKLEIK
表2人源化24-31VH序列10 20 30 40 70 82abc 9024-31 EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSIT NGFWI WIRKFPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKS RISITRDTSQNQFYLQLNSVTTEDTGTYYCAC110RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS(1)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKS RISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCACRSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS(2)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKS RISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCACRSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS(3)EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKS RISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCACRSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS(4)EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKS RISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCACRSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS
人们可以从中看出，对于VH和VL链设计了四种优选的人源化构架序列。因此，采用以上鉴定的人源化VH和VL24-31序列，不包括含保守取代的变异体和相当物，可以合成16种不同的可能的人源化24-31抗体。
通过重组方法，可以获得含这些人源化可变重链和轻链序列的人源化24-31抗体。预期含有以上优选人源化可变序列的任何组合的人源化序列，将产生结合人g39的人源化抗体。此外，根据这些序列，预期采用表1和表2中提出的编号的优选顺序如下(1)#1VL与#1VH(形式1)(2)#2VL与#1VH(形式2)(3)#1VL与#2VH(形式3)(4)#2VL与#2VH(形式4)例如，通过引入一个或多个另外的取代修饰，以及也通过加入其它氨基酸，可以进一步修饰以上鉴定的人源化VL和VH序列。选择另外的不会不利影响抗原(gp39)结合的修饰。例如，本发明人设想，通过取代残基34、43、44和68(按照Kabat序号方案，Kabat等(1991)(见上文))中的一个或多个来进一步修饰。此外，本发明人设想修饰VL链的残基85。根据抗体结合位点的结构特征，人们认为，这种残基的修饰应该不会不利地影响抗原结合。此外，预期引入一个或多个保守氨基酸取代应该不会不利地影响g39的结合。
为了更好地描述题述人源化24-31VH和VL序列，在以下表3中也提出了优选的人源化构架序列，表3比较了这些序列与模板人可变重链和轻链构架序列，即人DEN VK1、人o12/V36种系、人LENVKIV、人58p2、人Z18320和人3d75d，以及与非人源化鼠24-31VH和VL构架序列相比。
表3VK构架区比较-人源化抗gp39FR1 FR2人012/V3b种系 DIQMTQSPSFISASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIY人DEN VKI ---------T------------- -------E---V---鼠24-31--V----QK-M-T------S--- -------QS------Padlan VL#1人源化 --V-------------------- --------S------FR3 FR4人012/V3b GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC人DEN VKI -------------E---------SD------- FGQGTKLEIK鼠24-31 ---D----------------NM-SE-L-D-F- --G-------Padlan Vl#1 ---D------------------------D-F- --G-------
表3(接上页)FR1 FR2人LEN VKIVDIVMTQSPDSLAVSLGERATINC WYQQKPGQPPKLLIY鼠24-31 -------QKFMST-V-D-VS-T- --------S------Padlan VL#2人源化 ----------------------- --------S------FR3 FR4人LEN VKIVGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCFGQGTKLEIK鼠24-31 --------------------NM-S--L-D-F---G-------Padlan VL#2 ----------------------------D-F---G-------FR1人58p2QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS鼠24-31 E---------S----Q------S-T-D--TPadlan VH#1人源化 E-------------------------D--T人Z18320 GenBank ---------------Q--------------人3d75d种系 ---------------Q--------------Padlan VH#2人源化 E--------------Q----------D--TFR2 FR3人58p2WIRQPPGKGLEWIGRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR鼠24-31 ---KF--NK--YM--IS-TR---Q---Y-Q-N---TE--GT----CPadlan VH#1 ---K---NK--YM--IS--R-------------------G-----C人Z18320 -----A----------------------------------------人3d75d ----H-----------------------------------------Padlan VH#2 ---KH--NK--YM--IS--R-------------------G-----C人58p2WGQGTMVTVSS鼠24-31 -----TL----Padlan VH#1 -----TL----人Z18320 -----------Padlan VH#2 -----TL----为了产生人源化抗体，合成编码以上鉴定的人源化VL和VH序列的DNA序列。如上所述，考虑这四种人源化VL序列和四种人源化VH序列，有16种可以合成的潜在的人源化抗原结合位点。此外，考虑到人源化VH序列残基34、43、44和68和人源化VL的残基85被其它氨基酸残基潜在取代和/或潜在地加入保守取代突变，甚至有更多的潜在人源化抗原结合位点。两种优选的人源化可变轻链序列(1)和(2)和优选的人源化可变重链序列(1)分别在图4、5和6中提出，包括互补决定区和相应的DNA序列。
合成编码已知序列的蛋白的DAN的方法是本领域熟知的。采用这种方法，合成编码题述人源化VL和VH序列的DNA序列，然后将其在适用于表达重组抗体的载体系统中表达。这可以在任何下述载体系统中实现所述载体系统提供题述人源化VL和VH序列，它们作为具有人恒定域序列的融合蛋白表达并与产生功能性(抗原结合)抗体有关。
具体适用于表达重组抗体和人源化抗体的表达载体和宿主细胞是本领域熟知的。
以下文献代表适用于表达重组免疫球蛋白的方法和载体，特此通过引用结合到本文中Weidle等，Gene,51:21-29(1987)；Dorai等，J.Immunol.,13(12):4232-4241(1987)；De Waele等，Eur.J.Biochem.,176:287-295(1988)；Colcher等，Cancer Res.,49:1738-1745(1989)；Wood等，J.Immunol.,145(a):3011-3016(1990)；Bulens等，Eur.J.Biochem.,195:235-242(1991)；Beggington等，Biol.Technology,10:169(1992)；King等，Biochem.J.,281:317-323(1992)；Page等，Biol.Technology,9:64(1991)；King等，Biochem.J.,290:723-729(1993)；Chaudary等，Nature,339:394-397(1989)；Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988)；Benhar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:12051-12055(1994)；Singer等，J.Immunol.,150:2844-2857(1993)；Cooto等，Hybridoma,13(3):215-219(1994)；Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)；Caron等，Cancer Res.,32:6761-6767(1992)；Cotoma等，J.Immunol.Meth.,152:89-109(1992)。此外，适用于表达重组抗体的载体是市售的。
已知能够表达功能性免疫球蛋白的宿主细胞包括例如哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞；细菌细胞，诸如大肠杆菌；酵母细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，和其它宿主细胞。其中，已知CHO细胞能够有效地表达并分泌免疫球蛋白，因此被许多研究者使用。
基本上讲，用两种通用方法中的一种实现人源化抗体的重组表达。在第一种方法中，用提供表达融合至选定恒定区的重链和轻链可变序列的单一载体，转染宿主细胞。在第二种方法中，用两种载体转染宿主细胞，所述两种载体分别提供表达融合至选定恒定区的或者可变重链序列或者可变轻链序列。
人恒定区序列是本领域熟知的，并且在文献中有报道。优选的人VL序列包括κ和λ恒定轻链序列。优选的人重链恒定序列包括人γ1、人γ2、人γ3、人γ4及其提供改变效应或功能的突变形式，例如体内半衰期延长和Fc受体结合减弱。
人γ4恒定域的优选修饰包括P和/或E修饰，它们分别是指236位的亮氨酸变为谷氨酸和/或229位的丝氨酸变为脯氨酸(Kabat编号)，诸如在1995年9月6日申请的共同转让的代理律师档案号012712-165中所述，该文献通过引用结合到本文中。
特别优选的载体系统包括以下文献中描述的表达载体1995年6月7日申请的共同转让的美国专利序列第08/476,237号、1995年1月25日申请的序列第08/397,072号和1992年7月10日申请的07/912,122、1992年3月23日申请的07/886,281和1991年7月25日申请的07/735,064，特此通过引用结合到本文中。
特别是，这些申请描述了用于生产重组抗体的载体系统，称为TCAE5.2和TCAE6，它们包括1)四种串联顺序的转录盒(a)人免疫球蛋白轻链恒定区。在TCAE5.2中，这是人免疫球蛋白κ轻链恒定区(Kabat编号氨基酸108-214，同种异型Km3)，而在TCAE6中，为人免疫球蛋白轻链λ恒定区(Kabat编号氨基酸108-215，基因型Oz-，Mcg-，Ke-同种异型)。
(b)人免疫球蛋白重链恒定区；在两种构成物中，所述人免疫球蛋白重链为γ/恒定区(Kaba编号氨基酸114-478，同种异型Gm1a,Gm12)。
(c)DHFR；含其自身的真核启动子和多腺甘酸化区；和(d)NEO；也含有其自身的真核启动子和多腺甘酸化区。
2)所述人免疫球蛋白轻链和重链盒含有用于分泌免疫球蛋白链的合成信号序列；和3)所述人免疫球蛋白轻链和重链盒含有特定的DNA连接，这使得可以插入维持翻译读框且不改变正常在免疫球蛋白链中发现的氨基酸的轻链和重链免疫球蛋白可变区。
这些载体最好是在CHO细胞中利用。题述抗体优选在上述载体系统中表达。
然而，衍生自编号为24-31抗体的题述人源化抗体序列可以在提供表达功能性抗体(即结合gp39抗原的抗体)的任何载体系统中表达。
特别是，本发明人选择采用含有人κ和人γ1恒定区的N5KG1表达载体，在CHO细胞中表达衍生自24-31的题述人源化VL和VH序列以及天然(未修饰)VL和VH序列。图1图示了N5KG1表达载体。正如所希望的，衍生自24-31的嵌合抗体当在CHO细胞中表达时，结合gp39(证明结合至CHO-gp39转染子)。而且，衍生自24-31的本发明几种人源化抗体当用该载体系统表达时，产生功能性(gp39结合)抗体。
本发明还通过提出以下实施例进行描述。提供这些实施例是为了说明，不是限制性的。
实施例1选择24-31抗体用于人源化在动物模型中积累的证据表明，给予抗gp39防止多种自身免疫过程并干扰同种异体移植排斥。这些结果提供了有力的证据，表明抗人gp39的抗体在处理人类自身免疫病和同种异体组织和器官移植方面可能具有显著的治疗价值。已经报道了对人gp39特异性的单克隆抗体(mAb)(Lederman等，J.Immunol.,199:3817(1992))，并已经评价了它在阻断gp39-CD40相互作用的体外功能活性。为了获得抗gp39抗体对人免疫系统功能影响的进一步了解，产生了一组抗人gp39mAb。由该组抗体来看，一种mAb似乎是优越的，对其广泛地测试了体外和体内的对gp39的功能性失活。
更具体地讲，通过用人gp39的可溶性融合蛋白(gp39-CD8)免疫，然后用活化人外周血T细胞攻击，产生一组6种鼠(均为IgG1)抗gp39抗体。人外周血T细胞的流式细胞仪分析证明，所述mAb识别活化(PMA/离子霉素)、而非静息的CD3+T细胞上表达的一种细胞表面分子，并且所述反应性方式类似于用重组CD40融合蛋白(CD40-Ig)获得的反应性方式(数据未显示)。[35S]代谢标记的活化人外周血T细胞的免疫沉淀表明，这6种mAb的每种所沉淀的分子的大小(33kDa)与CD40-Ig沉淀的分子大小类似。最后，在所述抗体存在下，CD40-Ig与gp39的结合被阻断，表明识别同一分子，进一步证明了其特异性。尽管所有6种mAb均能够阻断gp39功能，但选择一种mAb，即24-31用于广泛的分析。
实施例2T细胞依赖性B细胞增殖和分化(Ig产生)被抗gp39阻断许多研究提供的证据表明，由CD40的配体gp39通过CD40传递的信号，诱导B细胞激活、增殖、分化和同种型转换。为了确定抗gp3924-31mAb是否阻断gp39的功能，在存在或缺乏24-31的情况下，将B细胞与gp39的可溶性融合蛋白(gp39-CD8)一起培养，通过3H-胸苷掺入估计B细胞增殖应答。示于图2A的结果表明，gp39-CD8诱导B细胞剧烈的增殖。存在抗gp39 24-31mAb完全消除了由浓度低至2.5μg/ml的gp39-CD8诱导的B细胞增殖。为了确定24-31是否干扰T细胞诱导的B细胞分化，在存在或缺乏24-31的情况下将B细胞与抗CD3活化的T细胞一起协同培养。12天后，评估多克隆IgM、IgG和IgA的产生。如图2B所示，加入24-31抑制多克隆IgM、IgG和IgA抗体的产生(90-99％)。这些结果证实确立在T细胞依赖性B细胞分化中需要gp39-CD40相互作用的先前的报道(Nishioka等，J.Immunol.,153:1027(1994))，进一步证明新特征鉴定的抗人gp39 24-31 mAb在阻断gp39功能中的用途。
实施例3抗gp39在用人PBL重建的SCID小鼠中体内阻断破伤风类毒素特异性抗体的产生大量的研究已经确立，在实验条件下，通过使用移入人外周血淋巴细胞的严重联合免疫缺陷(Scid)小鼠，可以体内研究人免疫系统(Mosler等，Nature,335:256(1988)；McCune等，Science,241:1632(1988)。通过注射人PBL，在scid小鼠中达到长期嵌合，并在所用抗原体内攻击的hu-PBL-scid小鼠中检测抗原特异性第二抗体应答(Carlsson等，J.Immunol.,148:1065(1992)；Duchosal等，Cell Immunol.,139:468(1992))。利用该系统评价体内抗gp39给予对用人T和B细胞诱发的免疫应答的免疫移植效应。
图2B中包含的实验及其结果证明，24-31阻断gp39功能，抑制了T细胞依赖性人B细胞体外产生多克隆Ig。为了确定24-31是否也可以体内抑制抗原特异性B细胞抗体的产生，用24-31或PBS处理腹膜内注射人PBL并用破伤风类毒素免疫的C.B-17 scid/scid小鼠(hu-PBL-scid)，评估第二(IgG)抗TT抗体应答。用TT免疫hu-PBL-scid，在免疫后14天内，在大多数动物中产生可检测水平的IgG抗TT抗体(表4)。然而，用抗gp39处理(24-31；250μg/天，每周2次)，在检查的9/10小鼠中完全消除了第二抗TT抗体应答，证明体内阻断gp39功能也导致抑制抗原特异性体液应答。受体株*处理
抗破伤风抗体(O.D.±SE)§(含抗破伤风抗体的小鼠频率)免疫后的天数7d14d21d 28dC.B-17 PBS ＜0.02(0/10)2.30±.042.224±.040 .137±.007scid/scid(7/10)*(8/10)**(4/10)抗gp39 .162(1/10) ＜0.02(0/10) ＜0.02(0/10) ＜0.02(0/10)表4．在用破伤风类毒素免疫的C.B-17scid/scid小鼠中移入人PBL后，消除了第二抗破伤风抗体应答。*给4-6周龄的C.B-17scid/scid小鼠腹膜内注射20×106/人PBL和0.25ml破伤风类毒素。
在整个实验期间，每周腹膜内给予2次抗gp39 24-31或PBS(250μg/注射)。§通过ELISA每周测定血清中人抗破伤风类似物抗体的水平。在1∶10稀释度下人抗破伤风类毒素抗体血清水平＞0.100 O.D.的所有小鼠被认为是阳性的。仅阳性小鼠用于计算表中包括的平均值±SE值。未用破伤风类毒素免疫的免疫前小鼠血清中人抗破伤风类毒素水平＜0.02O.D.。数据以平均值±SE表示。*与抗gp39处理组相比有显著差异(p=0.222)。**与抗gp39处理组相比有显著差异(p＜0.001)。
实施例4抗gp39处理不抑制hu-PBL-scid脾细胞的抗原特异性T细胞增殖应答为了确定用抗gp39处理hu-PBL-scid小鼠在体内是否改变抗原特异性T细胞的应答性，在体外评价用TT免疫并用24-31处理的hu-PBL-scid小鼠脾细胞的增殖应答。来自对照或抗gp39处理的hu-PBL-scid小鼠的脾细胞与TT或单独的培养基一起培养，6天后通过3H胸苷掺入评估增殖应答。表5总结了一个这种实验的结果。用抗gp39处理的hu-PBL-Scid小鼠对用TT体外刺激的应答与未处理的hu-PBL-scid小鼠相似(5/10与3/10相应的小鼠)。采用NOD/LtSz-scid/scid小鼠作为受体的实验得到相似的结果，尽管在这些小鼠中未检测抗TT抗体(数据未显示)。这些数据证明，用抗gp39处理不导致hu-PBL-scid小鼠抗原特异性T细胞的缺乏或功能性激活，支持了抗gp39对TT特异性抗体应答的抑制是由于阻断gp39-CD40相互作用以及随后的B细胞应答引起的，而非由于使T细胞失活而引起的。受体株*处理
反应小鼠的频率§C.B-17scid/scidPBS 3/10抗gp395/10NOD/LtSz-scid/scid PBS 5/10抗gp396/10表5．抗gp39处理在用破伤风类毒素免疫的C.B-17-scid/scid或NOD/LtSz-scid/scid小鼠中在移入人PBL后不改变抗破伤风T细胞增殖应答。*给4-6周龄的C.B-17scid/scid或NOD/LtSz-scid/scid小鼠腹膜内注射20×1O6人PBL和0.25ml破伤风类毒素。
在整个实验期间，每周腹膜内给予2次抗gp39 24-31或PBS(250μg/注射)。§在存在单独的培养基或破伤风类毒素(2.5或5.0μg/ml)的情况下，以1×105细胞/ml的浓度培养注射人PBL且用破伤风类毒素免疫的小鼠的脾细胞。6天后，通过3H胸苷掺入评估增殖。通过以下公式计算刺激指数S.I.=cpm破伤风-cpm培养基/cpm培养基。S.I.＞2.0被认为是阳性。
实施例5gp39 CHO转染细胞系的产生最近，产生了组成型表达细胞表面gp39的CHO转染子，用作用于本申请中提出的人源化抗gp39 24-31结合研究的试剂。通过植物凝集素活化的人PBL的聚合酶链式反应(PCR)，扩增全长的gp39基因(Hollenbaugh等，Immunol.Rev.,138:23(1994))，并将其克隆入IDEC的INPEP4载体中，置于巨细胞病毒(CMV)启动子和增强子元件的转录控制之下。建立了CHO转染子，并在50nM氨甲蝶呤中扩增。ELISA(数据未显示)和FACS分析(图3)显示转染子50D4表达细胞表面gp39。
实施例6用CHO表达系统高水平表达抗体在CHO细胞中，使用IDEC的专卖N5KG1表达载体表达人源化抗g39 24-31抗体。图1图示了该载体。采用该载体和相似的载体，在CHO细胞中一致地获得了重组抗体的高水平表达。采用这些载体，发现高频率(5-10％)的G418抗性克隆表达显著量的重组蛋白(1-10mg/l的抗体)。这些通常是单质粒拷贝整合体，可以采用氨甲蝶呤容易地扩增，获得30-100pg/细胞/天的分泌免疫球蛋白。表6列出了利用该系统基因扩增在CHO细胞中表达的3种抗体的前后获得的抗体水平。
抗体扩增前在旋动烧瓶中在发酵罐中mg/l 扩增后 扩增后mg/l mg/l抗CD4γ1 1-2 100-110 950抗CD4γ4 3-4 125-150 N.D.抗CD20 5-10200-300 650表6．用IDEC的CHO表达技术的抗体产生水平。
实施例724-31VK和VHDNA序列的克隆对抗gp39 24-31VK和VH基因区段进行克隆和测序。分析其序列之后，设计V区基因区段的人源化形式。合成相应的DNA序列，并将其克隆入含人恒定区基因的高水平表达载体中。然后确立了产生人源化24-31抗体的CHO转染子。为了证明所述抗gp39抗体的人源化形式是否保留其gp39结合亲和性，在直接结合和竞争测定中比较了鼠抗体和人源化抗体的相对亲和性。另外，评估所述人源化24-31阻断CD40结合于gp39和抑制T细胞依赖性抗体产生的能力。
1．24-31VK和VH基因区段的克隆a．cDNA的制备．利用Invitrogen Corporation的MicroFastTrackTMmRNA分离试剂盒，按照生产商的方案，由2×106细胞的每种24-31杂交瘤和NS1细胞系(Carroll等，Mol.Immunol.,10:991(1988))制备PolyA+mRNA，所述NS1细胞系为用于产生24-31杂交瘤的融合伴侣。用50皮摩尔的oligo-dT和5单位M-MLV反转录酶(Promega)，合成第一链cDNA(Sambrook等，Molecular Clonging:A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，然后进行Sephadex G-25层析。
b．VK和VHcDNA的PCR扩增。用一组对VK或VH前导序列特异性的5’引物并结合3’恒定区引物，通过PCR扩增24-31和NS1 cDNA。5’VH引物组与Jones和Bendig所述那些引物(Bio/Technol.,9:88(1991)；Errata,Bio/Technol.,9:579(1991))相同。对5’VK引物组(Jones等，(见上文))进行修改，将SalⅠ克隆位点识别序列(GTCGAC)转化为BglⅡ识别序列(AGATCT)，以有利于将扩增基因区段克隆入IDEC的N5KG1表达载体中(参见图1)。3’VK和VH引物于氨基酸位置108-109(按照Kabat等，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版，NIH(1991)编号)含有Bsi WⅠ克隆位点序列，以及于114-115位含有一个NheⅠ克隆位点序列，具有以下序列TGCAGCATCCGTACGTTTGATTCCAGCTT(CK)和GGGGGTGTCGTGCTAGCTG(A/C)(G/A)GAGAC(G/A)GTGA(Cγ1)。转让人先前已经采用该引物组扩增并克隆了C2B8抗CD20抗体(Nishioka等，J.Immunol.,153:1027(1994))和许多其它小鼠VK和VH基因区段(数据未显示)。
为了确定正确的引物对，以用于扩增24-31VK和VH基因区段，在含11个5’VK引物之一和CK引物或12个5’VH引物之一和Cγ1引物的23种单独反应物中，扩增24-31cDNA。为了进行比较，用相同的引物组扩增NS1 cDNA。在含5单位TaqDNA聚合酶(Perkin Elmer)、10mM Tris-HCl,pH 8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、dCTP、dGTP、dATP和TTP各0.25mM、50pmole 3’恒定区引物和50pmoles5’引物的100μl终体积中，扩增1μlcDNA(1/50的cDNA样品)。扩增循环包括于95℃变性1分钟、于50℃退火2分钟和于72℃延伸2分钟，重复34次。通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。重复产生特有的VK和VH扩增产物的24-31PCR反应，克隆来自重复PCR反应的产物。将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶纯化(Sambrook等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第2版(1989))，并用BglⅡ和Bsi WⅠ(用于VK)或SalⅠ和NheⅠ(用于VH)消化。将产物顺序连接(Ausabel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，第2卷，Greene Publ.Assoc.(1992))入IDEC的载体N5KG1中。
在转化大肠杆菌XL1-blue细胞(Stratagene)后，制备质粒DNA，并从双份构成物获得VK和VH序列(由Scripps Research Institute CoreFacility(La Jolla,CA)进行的测序)。NS1融合伴侣的内源轻链和重链的序列是已知的(Carroll等，Mol.Immunol.,10:991(1988)；Kabat等(1991)(见上文))，将其用来区别由24-31对NS1融合伴侣V区扩增产生的PCR产物。
实施例8编码人源化24-31V区的基因区段的合成合成含表1和表2中鉴定为人源化VL和VH(1)的最优选人源化24-31VK和VH序列的人源化形式。具体地说，合成(Midland Chemicals)编码以上鉴定的人源化VK或VH区的4对重叠的互补寡核苷酸(oligos)，并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化(Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，第2卷，Greene Publ.Assoc.(1992))。每种oligo大约长100个碱基，相邻的互补寡核苷酸重叠20个碱基。VK和VH5’oligos含BglⅡ和SalⅠ克隆位点，而3’oligos具有BsiWⅠ和NheⅠ克隆位点。采用以下方法(在Watson等，Recombinant DNA，第2版，Scientif.Amer.Books,NY,NY(1992)中概述)，如下所示，由合成的oligos装配每种可变区基因区段。按照生产商的方案，用300pmole每种引物和T4多核苷酸激酶(Promega)对互补的oligos对(A+E、B+F、C+G、D+F)进行激酶处理。通过加热至95℃，并缓慢冷却至室温，将所述oligos退火。用6单位T4DNA连接酶(New England Biolabs)连接退火的oligo对(A/E与B/F以及C/G与D/H)。用合适的5’或3’克隆位点限制性内切核酸酶消化后，通过在聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行电洗脱，纯化约200个碱基对的DNA片段(Sambrook等，(见上文))。然后，将合成的基因片段插入IDEC的专卖的高水平表达载体N5KG1中，置于CMV启动子和增强子元件的转录控制之下。连接反应物含有2种凝胶纯化的片段(A/E/B/F和C/G/D/H)和N5KG1，摩尔比相应地为100∶100∶1。转化XL1-blue细胞后，制备质粒DNA，并证实合成的基因区段的序列。所得的构成物h24-31编码人源化24-31V区区段和人κ和γ1恒定区。正如所示的，该抗体含有表1和表2中鉴定为“(1)”序列的人源化可变重链和人源化可变轻链序列，预期提供具有最适gp39特性的人源化抗体。另外，产生一种构成物，该构成物含有VL#2与VH#1(人源化24-31的形式2)。利用IDEC的专卖载体的相似构成物已经用于高水平表达IDEC的抗CD20(Reff等，Blood,83:425(1994))和抗CD4(Newman等，Biol.Technology,10:1455(1992))抗体。
实施例92．人源化24-31的产生和特征鉴定a．产生人源化24-31(形式1和形式2)的CHO转染子的产生通过用线性化h24-31DNA(形式1或形式2)对4×106CHO细胞电穿孔，然后在G418中进行选择，产生表达人源化24-31(形式1或形式2)的CHO转染子。通过夹层ELISA，用山羊抗人κ捕获免疫球蛋白，分析G418抗性克隆的细胞培养上清液的免疫球蛋白产生。通过与人IgG特异性的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的山羊抗体一起孵育，然后与包含0.0175％H2O2的HRP底物0.4mg/ml邻苯二胺(OPD)的柠檬酸缓冲液(9-34g/l C6H8O7和14.2g/l Na2HPO4),pH5.0一起孵育，测定免疫球蛋白的结合。在Molecular DeviCes“Vmax,Kineticmicro-plate reader”分光光度计中，于490nm下对所述板读数。
实施例10b．人源化24-31(形式1)的特征鉴定初步评估人源化抗gp39 24-31抗体对50D4上表达的细胞表面g39的直接结合，50D4为实施例5中描述的gp39CHO转染子。对产生免疫球蛋白的G418抗性h24-31CHO转染子的上清液，测试与50D4细胞的结合，作为阴性对照，测试与CHO细胞的结合。在该测定中，将1×105/孔的50D4结合至96孔聚-L-赖氨酸包被聚苯乙烯板的底部。将细胞在0.5％戊二醛的磷酸缓冲盐水(PBS)中固定15分钟。以相似方式产生包被CHO细胞的板。加入细胞培养上清液，用HRP-缀合的山羊抗人IgG如上所述测定抗体的结合。
用两种测定确定与原始鼠24-31抗体相比，所述人源化24-31抗体是否保留对gp39的亲和性(ⅰ)半最大结合浓度和(ⅱ)采用50D4细胞的竞争测定。为此，在A蛋白上纯化所述抗体，并且通过与同种型匹配的对照相比，经ELISA测定每种抗体的浓度。通过将人源化24-31与50D4细胞以2μg/ml-0.1ng/ml的不同浓度孵育，测定半最大结合(ⅰ)。将如上所述产生半最大OD490读数的浓度与鼠24-31的半最大结合相比。在竞争测定(ⅱ)中，以100∶1至1∶100的不同摩尔比范围，混合所述人源化24-31抗体和鼠24-31抗体，并测定其竞争结合50D4细胞的能力。进行两组测定，一组用山羊抗人IgG(抗小鼠IgG耗尽的)-HRP测定所述人源化抗体的结合，一组用山羊抗小鼠IgG(抗人IgG耗尽的)-HRP测定鼠抗体的结合。产生根据摩尔比的鼠抗体和所述人源化抗体的结合曲线，计算其相对亲和性。这些测定将证实衍生自24-31的题述人源化抗体的抗gp39结合特性。
实施例11人源化24-31阻断CD40-Ig结合gp39在确立人源化抗gp39结合至gp39后，进行一个测定，以证明所述人源化抗gp39保留其阻断所述配体结合于其受体的能力。为此，于4℃，用分级浓度的鼠24-31或用人源化24-31对活化人外周血T细胞或gp39转染的CHO细胞50D4预处理15分钟。在该预孵育后，加入CD40-Ig-生物素，用PE-抗生物素蛋白，用流式细胞术测定结合。测定达到CD40-Ig结合降低50％的mAb浓度。
实施例12人源化24-31阻断B细胞增殖和分化为了证实人源化24-31阻断gp39功能，在存在或缺乏一定剂量范围的鼠24-31或人源化24-31的情况下，将B细胞与gp39的可溶性融合蛋白(gp39-CD8)一起孵育。如图2A所示，通过3H-胸苷掺入，评估B细胞的增殖应答。
抗gp39的mAb阻断T细胞依赖性B细胞分化(Ig产生)。为了证实题述人源化24-31有效阻断活化人T细胞上表达的天然gp39的功能，评估题述人源化24-31抗体抑制T细胞诱导的B细胞分化的能力。在存在或缺乏人源化24-31和鼠24-31的情况下，将B细胞与抗CD3活化的T细胞一起协同培养。12天后，评估多克隆IgM、IgG和IgA的产生(参见图2B)。这些结果将证实，人源化抗gp39可以阻断CD40的结合，并且干扰通过CD40的T细胞依赖性B细胞活化。
实施例13结合能力进行该实验以测定相对于抗体浓度的鼠、嵌合和人源化(形式1)24-31抗体对gp39抗原的反应性。方案板的制备1．将50聚-1-赖氨酸加入96孔板的各孔中。于室温下孵育30分钟。轻弹板以去除聚-1-赖氨酸。2．通过以1500gpm离心5分钟，用HBSS洗涤mgp39-CHO细胞(表达细胞表面膜gp39的中国仓鼠卵巢细胞)3次。细胞在HBSS中再悬浮至2×106细胞/ml。3．将50μl细胞悬浮液加至各孔中，将板以2000rpm离心5分钟。4．加入50μl/孔冰冷的0.5％戊二醛，并于室温下孵育15分钟。5．轻弹板并将其吸干，以去除过量的戊二醛。加入150μl/孔具有0.1％BSA的100mM甘氨酸，并于室温下孵育30分钟。将板立即使用，或于-20℃冷冻待用。结合测定1．将板解冻，并去除甘氨酸缓冲液。2．将测试抗体在稀释缓冲液中以1μg/ml开始、以1∶2连续稀释。以双份转移50μg/孔的每种稀释液。于室温下温育2小时。3．在流动的自来水中将板洗涤10次。4．加入50μl/孔的山羊抗人IgG HRP或山羊抗小鼠IgG HRP的1∶2000稀释液。于室温下孵育1小时。5．在流动的自来水中将板洗涤10次。6．加入50μl/孔的ABTS底物，并让板显色20-30分钟。在490nm的背景波长下，在405nm波长下对板读数。7．制作吸光度对抗体浓度的曲线图。结果和结论这三种抗gp39抗体(鼠、嵌合和人源化形式1的24-31)相对于抗体浓度的结合能力基本上可重叠(参见图9)。这很好地表明，这些抗体对人gp39具有相似的结合能力，表明所述人源化抗体已经保留了鼠24-31的gp39结合亲和性。
实施例14生物素标记的鼠24-31与嵌合的和人源化形式1的24-31之间的竞争评估嵌合24-31抗体和人源化(形式1)24-31抗体与鼠24-31竞争结合mgp39-CHO细胞基底(cell basis)的能力。人源化24-31与鼠24-31竞争结合mgp39-CHO的能力，用来评估在人源化抗体中，鼠构架残基与其人对应物交换是否导致亲和性的显著丧失(≥3x降低)。方案板的制备1．将50聚-1-赖氨酸加入96孔板的各孔中。于室温下孵育30分钟。轻弹板以去除聚-1-赖氨酸。2．通过以1500gpm离心5分钟，用HBSS洗涤mgp39-CHO细胞3次。细胞在HBSS中再悬浮至2×106细胞/ml。3．将50μl细胞悬浮液加至各孔中，将板以2000rpm离心5分钟。4．加入50μl/孔冰冷的0.5％戊二醛，并于室温下孵育15分钟。5．轻弹板并将其吸干，以去除过量的戊二醛。加入150μl/孔具有0.1％BSA的100mM甘氨酸，并于室温下孵育30分钟。将板立即使用，或于-20℃冷冻待用。竞争测定1．将板解冻，并去除甘氨酸缓冲液。2．用1％BSA将鼠抗gp39生物素在PBS中稀释至200ng/ml。3．将测试抗体(鼠、嵌合和人源化24-31)在稀释缓冲液中以1μg/ml开始、以1∶2连续稀释。4．以双份将50μl的稀释测试抗体和鼠抗gp39生物素转移入各孔中。几个孔应该含有50μl具有鼠抗gp39生物素的稀释缓冲液作为最大对照组。5．在流动的自来水中将板洗涤10次。6．加入50μl/孔的链霉抗生物素蛋白HRP的1∶2000稀释液，并于室温下孵育1小时。7．在流动的自来水中将板洗涤10次。8．加入50μl/孔的ABTS底物，并让板显色20-30分钟。在490nm的背景波长下，在405nm波长下对板读数。9．用对照孔的平均值计算抑制百分率。结果和结论所有三种抗体均同样好地与生物素标记的24-31竞争(参见图10)。在该测定的极限内，竞争分布图在所有浓度下基本上可重叠。这证明所测试的人源化抗体(形式1)保留其gp39结合亲和性。
实施例15T细胞依赖性B细胞分化的调节为了证实所述人源化24-31保留鼠24-31的体外功能活性，在“Lipsky”测定中将所述人源化24-31与鼠24-31比较。将供体外周血单核细胞分为两个部分-T细胞部分和B细胞部分。首先用丝裂霉素C处理T细胞部分，以防止有丝分裂，然后用抗CD3抗体激活。加入B细胞与或者鼠24-31抗体或者人源化(形式1)24-31抗体。在该实验中包括无抗体的阳性对照和无B细胞的阴性对照。10天温育后，测试上清液中人IgM的存在。方案1．于37℃下，用50μl/孔的无菌4μg/ml抗CD3抗体(在50mMTris,pH9中稀释)包被96孔板2小时。2．用Lympho-Kwik试剂，从血沉棕黄层中选择性纯化T和B细胞。于37℃下，每5×106细胞用50μg/ml丝裂霉素C激活T细胞30分钟。3．用无菌HBSS或培养基将板的各孔洗涤数次，以去除非粘附抗体。4．将1×105纯化的T细胞(2×106/ml)加至各孔中。5．将5×105纯化的B细胞(5×106/ml)加至各孔中。以四份将50μl抗gp39抗体(10-0.1μg/ml)加至各孔中。对照孔应该包括a)0抗体，b)0抗体，无T细胞，和c)0抗体，无B细胞。6．将板于37℃/5％CO2孵育12天。7．7天后，在双份孔上，用3H胸苷或任何其它可接受的方法，测定细胞生长。8．12天后，从双份孔中收集上清液，并进行ELISA测定，以测定Ig的产生(IgM)。结果和结论结果表明，人IgM的产生被浓度低于0.01μg/ml的人源化24-31抑制50％，与用鼠24-31获得的抑制水平相似(参见图11)。在该实验中，所述人源化抗体保留其抑制T细胞依赖性B细胞分化(IgM产生)的能力。
实施例16对人源化24-31形式2的评估进行该实验，以确定与形式1相比，人源化24-31形式2是否在直接结合测定中具有相似的gp39结合能力。方案
与以上实施例13相同。结果和结论结果表明，这两种24-31形式的结合能力基本可重叠(参见图12)。这表明，这两种形式具有相当的对gp39的结合活性。
实施例17进行该实验，测定24-31和两种人源化形式1和2的Kd。方案采用IODO-BEAD(Pierce，用125I标记预定量的三种抗体(鼠、形式1或形式2的24-31)中的每种。通过在Sephadex-G25/DEAE/Amberlite柱上经大小分离，将抗体结合-125I与游离125I分离。
在稀释系列中测试125I标记的抗体与鼠gp39-CHO细胞的直接结合，以测定计数/μg和合适的工作浓度(≈半最大结合浓度)。
在稀释系列中将125I标记的抗体与非标记抗体混合并温育。根据结合抗体的总量和游离抗体的量，从结合对结合-游离图中产生Scatchard图。总抗体浓度基于一个活性位点75kD的标准大小。
通过产生“最适”线，计算Kd。该曲线斜率的倒数为Kd。也计算相关系数r2。结果分析Scatchard图。该分析的Kd为形式2,Kd=14nM；鼠24-31,Kd=8.51nM；形式1,Kd=5.6。图13、14和15分别描述了所述结果。这些结果提供进一步的证据，表明与24-31相似，题述人源化抗体结合gp39抗原。用途在治疗其中gp39调节和/或gp39-CD40相互作用的抑制有治疗益处的任何疾病病症中，本发明的人源化抗gp39抗体具有潜力。此外，题述人源化抗p39抗体可以用来治疗其中希望抑制对抗原的抗体应答的疾病。这类病症包括自身免疫病和非自身免疫病。
将抗gp39抗体防止B细胞中CD40信号的能力在功能上转化为体内T细胞依赖性抗体应答的显著抑制。因此，可以预期，由自身抗体产生介导的自身免疫病将从抗gp39抗体疗法中收益。这类疾病包括系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力和具有抗胰岛素和抗胰岛素受体抗体的糖尿病患者亚群。另外，B细胞和树突细胞中的CD40信号是向上调节诸如B7.1和B7.2分子的共同信号受体所必需的。用抗gp39抗体阻断该CD40信号，干扰向T细胞的抗原提呈，导致抑制T细胞激活和T细胞介导的应答。抗gp39抗体在诸如CIA、EAE、NOD小鼠、GVHD和移植排斥的疾病模型中治疗效力，进一步证明抗体对T细胞介导的应答的抑制效应。根据由动物模型中效力支持的这种作用机制，题述人源化抗gp39抗体的治疗潜力扩展至诸如RA、糖尿病、牛皮癣、GVHD和移植排斥的疾病。
通过给予题述人源化抗体潜在可治疗的具体病症包括变应性支气管肺曲霉病；自身免疫性溶血性贫血；黑棘皮病；变应性接触性皮炎；阿狄森氏病；特应性皮炎；斑秃；全身脱毛；淀粉样变性；过敏性紫癜；过敏性反应；再生障碍性贫血；遗传性血管性水肿；特发性血管性水肿；关节强硬性脊椎炎；颅动脉炎；巨细胞性动脉炎；无动脉病；颞动脉炎；哮喘；毛细管扩张性运动失调；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性睾丸炎；自身免疫性多内分泌腺衰竭；Behcet病；Berger病；Buerger病；大疱性天疱疮；慢性粘膜皮肤念珠菌病；Caplan综合征；心肌梗塞后综合征；心包切开术后综合征；心炎；口炎性腹泻(Celiac sprue)；Chagas病；Chediak-Higashi综合征；Churg-Strauss病；Cogan综合征；冷凝集素病；CREST综合征；Crohn病；冷球蛋白血症；原因不明的纤维素肺泡炎；疱疹样皮炎；皮肤肌炎；糖尿病；Diamond-Blackfan综合征；DiGeorge综合征；盘状红斑狼疮；嗜酸性筋膜炎；巩膜外层炎；持久隆起性红斑；边缘性红斑；多形红斑；结节性红斑；家族性地中海热；Felty综合征；肺纤维化；过敏性肾小球性肾炎；自身免疫性肾小球性肾炎；链球菌后肾小球性肾炎；移植后肾小球性肾炎；膜性肾小球病；Goodpasture综合征；移植物抗宿主病；免疫介导的粒细胞减少；环形肉芽肿；变应性肉芽肿病；肉芽肿性肌炎；Grave病；桥本氏甲状腺炎；新生儿溶血性贫血；特发性血色素沉着症；Henoch-Schoenlein紫癜；慢性活动性和慢性进行性肝炎；组织细胞增多病X；嗜酸性细胞增多综合征；特发性血小板减少性紫癜；Job综合征；少年皮肤肌炎；少年性类风湿性关节炎(少年慢性关节炎)；Kawasaki病；角膜炎；干性角膜结膜炎；Landry-Guillain-Barre-Strohl综合征；瘤型麻风；Loeffler综合征；Lyell综合征；莱姆病；淋巴瘤样肉芽肿病；全身性肥大细胞增多症；混合性结缔组织病；多发性单神经炎；Muckle-Wells综合征；粘膜皮肤淋巴结综合征；粘膜皮肤淋巴结综合征；多中心性网状组织细胞瘤病；多发性硬化；重症肌无力；蕈样真菌病；全身性坏死性脉管炎；肾变病综合征；重叠综合征(overlap syndrome)；脂膜炎；阵发性寒冷性血红蛋白尿；阵发性夜间血红蛋白尿；类天疱疮；天疱疮；红斑性天疱疮；落叶性天疱疮；寻常性天疱疮；养鸽者病；过敏性肺炎；结节性多动脉炎；类风湿性多肌痛；多肌炎；特发性多神经炎；葡萄牙家族性多神经病；子痫前期/子痫；原发性胆汁性肝硬变；进行性全身性硬化(硬皮病)；牛皮癣；牛皮癣性关节炎；肺泡蛋白沉积；肺纤维化Raynaud现象/综合征；Reidel甲状腺炎；Reiter综合征，复发性多软骨炎；风湿热；类风湿性关节炎；肉样瘤病；巩膜炎；硬化性胆管炎；血清病；Sezary综合征；Sjogren综合征；Stevens-Johnson综合征；Still病；亚急性硬化性全脑炎；交感性眼炎；系统性红斑狼疮；移植排斥；溃疡性结肠炎；未分化性结缔组织病；慢性荨麻疹；寒冷性荨麻疹；色素层炎；白斑；Weber-Christian病；Wegener肉芽肿病；Wiskott-Aldrich综合征。
其中，通过给予抗gp39抗体可治疗或可推荐使用的优选适应征包括自身免疫性溶血性贫血；再生障碍性贫血；颞动脉炎；糖尿病；Felty综合征；Goodpasture综合征；移植物抗宿主病；特发性血小板减少性紫癜；重症肌元力；多发性硬化；结节性多动脉炎；牛皮癣；牛皮癣性关节炎；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮；哮喘；变应性病症；和移植排斥。
通过本领域技术人员熟知的标准技术，可以确定可用来产生治疗效应的抗体量。所述抗体一般可用标准技术，在药学上可接受的缓冲液中提供，并且可以通过任何所需途径给予。因为本发明要求保护的抗体的效力及其人的耐受性，重复给予这些抗体以对抗人类各种疾病或疾病状态是可能的。
本发明的题述抗gp39人源化抗体(或其片段)也可用来诱导免疫调节，例如诱导人或动物免疫系统的抑制。本发明因此涉及一种方法，通过给予这类人或其它动物有效无毒量的本发明这种抗体，预防性或治疗性诱导有需要的人或其它动物免疫调节。
本发明的抗体在诱导免疫抑制方面有实用性，这一事实意味着它们可用于治疗或预防对移植器官或组织(例如肾、心脏、肺、骨髓、皮肤、角膜等)的抗性或排斥；治疗或预防自身免疫病、炎症、增生病或过度增生病(hyperproliferative disease)和免疫介导疾病的皮肤表现(例如类风湿性关节炎；红斑狼疮、全身性红斑狼疮、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化、重症肌无力、1型糖尿病、色素层炎、肾变病综合征、牛皮癣、特应性皮炎、接触性皮炎和其它的湿疹性皮炎、皮脂溢性皮炎、扁平苔藓、天疱疮、大泡性无疱疮、大疱性表皮松解、荨麻疹、血管性水肿、脉管炎、红斑、皮肤嗜酸性细胞增多、斑秃等)；治疗可逆阻塞性气道病、肠炎和变应性(例如腹腔疾病、直肠炎、嗜酸性细胞增多性胃肠炎、肥大细胞增多症、Crohn病和溃疡性结肠炎)和食品相关的变应性(例如偏头痛、鼻炎和湿疹)。此外，题述抗体在治疗希望免疫调节的非自身免疫病症方面具有潜在的实用性，所述非自身免疫病症例如为移植物抗宿主病(GVHD)、移植排斥、哮喘、白血病、淋巴瘤和其它病症。
此外，题述抗体可以用作细胞治疗或基因治疗期间的免疫抑制药。这潜在地使得这类细胞或基因治疗构成物能够重复给予，或以较高剂量给予而没有不利的免疫原性反应。
本领域技术人员能够通过常规实验，确定诱导免疫抑制目的的抗体的有效无毒量。然而，一般而言，有效剂量范围为约0.05-100毫克/公斤体重/天。
本发明的抗体可以按照上述治疗方法，给予人类或其它动物，给予量足以产生治疗或预防程度的这种效应。本发明的这类抗体可以以常规剂型给予这类人或其它动物，所述剂型的制备方法为按照已知技术，将本发明的抗体与常规的药学上可接受的载体或稀释剂混合。本领域技术人员会认识到，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特性由该混合的活性组分的量、给药途径和其它熟知的变量决定。
本发明抗体(或其片段)的给药途径包括经口、胃肠外、吸入或局部途径。本文所用的术语胃肠外包括经静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道、或腹膜内给予。一般优选皮下或肌内形式的胃肠外给予。
使用本发明化合物以预防性或治疗性诱导免疫抑制的每日胃肠外和口服给药剂量方案的范围一般为约0.05-100、但优选约0.5-10毫免/公斤体重/天。
本发明的抗体也可以通过吸入给予。“吸入”是指鼻内和经口吸入给予。这种给予的合适剂型诸如气溶胶制剂或计量吸入剂，可以通过常规技术制备。本发明化合物的优选使用剂量范围一般为约10-100毫克。
本发明的抗体也可以局部给予。局部给予是指非系统性给予，包括将本发明的抗体化合物(或其片段)外部应用于表皮、口腔前庭和将这种抗体滴注到耳、眼和鼻中，其中它不会大量进入血流中。系统性给予是指经口、静脉内、腹膜内和肌内给予。当然，治疗或预防效应所需的抗体量随选定的抗体、待治疗的病症的性质和严重程度和正进行治疗的动物而不同，最终由医师决定。本发明抗体的合适局部剂量的范围一般为约1-100毫克/公斤体重/天。制剂尽管抗体或其片段可以单独给予，但最好将其作为药用制剂给予。对于局部给药，活性组分可以包含0.001％-10％w/w、例如1％-2％(重量)的所述制剂，尽管它可以包含多达10％w/w，但优选不超过5％w/w，更优选为0.1％-1％w/w的所述制剂。
本发明的局部制剂包含一种活性组分和一种或多种可接受的其载体和可任选的任何其它治疗组分。所述载体在与所述制剂其它组分相容并且对其受体无害的意义上，必须是“可接受的”。
适用于局部给予的制剂包括适用于通过皮肤渗透到需要治疗的部位的液体或半液体制剂，诸如搽剂、洗剂、乳膏、软膏或糊剂；以及适用于给予眼、耳和鼻的滴剂。
按照本发明的滴剂可以包含无菌水性或油状溶液或悬浮液，其制备方法可以将所述活性组分溶于合适的杀细菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其它合适的防腐剂的水溶液中，最好包括表面活性剂。然后，所得溶液可以通过过滤澄清，转移至合适的容器中，然后将其密封，并通过高压灭菌或于90-100℃维持半小时灭菌。或者，该溶液可以通过过滤灭菌，并采用无菌技术转移至容器中。适于包含于滴剂中的杀细菌剂和杀真菌剂的实例为硝酸或醋酸苯汞(0.002％)、洁尔灭(0.01％)和醋酸氯己定(0.01％)。用于制备油状溶液的合适溶剂包括甘油、稀乙醇或丙二醇。
按照本发明的洗剂包括适用于应用于皮肤或眼用洗剂。眼用洗剂可以包含无菌水溶液，可任选地含有杀细菌剂，并可以用制备滴剂的类似方法制备。应用于皮肤的洗剂或搽剂也可以包括加快干燥并冷却皮肤的试剂，诸如乙醇或丙酮，和/或湿润剂，诸如甘油或油，诸如蓖麻油或花生油。
按照本发明的乳膏、软膏或糊剂为用于外用的所述活性组分的半固体制剂。通过在合适的机器辅助下，将单独的或在水性或非水流体中的溶液或悬浮液中的细碎或粉状形式的所述活性组分、与滑润脂或非滑润脂基质混合，可以制备这些制剂。所述基质可以包含碳水化合物，诸如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂；植物粘胶；天然来源的油，诸如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或与诸如丙二醇的醇或大粒凝胶一起的诸如硬脂酸或油酸的脂肪酸。所述制剂可以掺入任何合适的表面活性剂，诸如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，诸如脱水山梨醇酯或其聚氧乙烯衍生物。也可以包括悬浮剂，诸如天然胶、纤维素衍生物或无机物质，诸如silicaceous二氧化硅，和其它组分，诸如羊毛脂。
本领域技术人员会认识到，本发明抗体或其片段的最适量和各次给药的间隔由待治疗病症的性质和程度、剂型、给予途径和部位以及待治疗的特定动物决定，并且这种最适调节可以通过常规技术确定。本领域技术人员也将认识到，治疗的最适过程，即给予限定天数的本发明抗体或其片段的每日给药次数，可以由本领域技术人员用治疗测定实验的常规过程来确定。
不用进一步详细描述，相信本领域技术人员可以用上述描述，在最大可能的范围内利用本发明。因此，以下将解释为仅仅是说明性的实施例，不是以任何方式限制本发明的范围。胶囊组合物通过向标准两节硬明胶胶囊中填充50mg粉状的本发明抗体或其片段、100mg乳糖、32mg滑石粉和8mg硬脂酸镁，制备本发明胶囊形式的药用制剂。胃肠外注射组合物通过在10k(体积)丙二醇和水中搅拌1.5k(重量)的本发明抗体或其片段，制备适用于注射给予形式的本发明的药用制剂。该溶液通过过滤除菌。软膏组合物本发明抗体和或其片段1.0g。
白软石蜡至100.0g。
将本发明抗体或其片段分散于小体积的溶媒中，产生平滑的均相产物。然后用该分散剂填充可收缩金属管。局部乳膏组合物本发明抗体或其片段1.0g。
PolawaxGP200 20.0g。
无水羊毛脂2.0g。
白蜂蜡2.5g。
羟基苯甲酸甲酯0.1g。
蒸馏水至100.0g。
将polawax、蜂蜡和羊毛脂一起于60℃加热。加入羟基苯甲酸甲酯溶液，用高度搅拌达到均化。然后让温度降至SOOC。然后加入本发明抗体或其片段，将其完全分散，在慢速搅拌下让该组合物冷却。局部洗剂组合物本发明抗体或其片段1.0g。
脱水山梨醇单月桂酸酯0.6g。聚山梨醇酯200.6g。
硬脂酸鲸蜡醇(cetostearyl alcoho1)1.2g。甘油6.0g。
羟基苯甲酸甲酯0.2g。
B.P.净化水至100.00ml。(B.P.=英国药典)将羟基苯甲酸甲酯和甘油于75℃溶于70ml水中。将脱水山梨醇单月桂酸酯、聚山梨醇酯20和硬脂酸鲸蜡醇一起于75℃融化，并加入所述水溶液中。将所得的乳液均化，在持续搅拌下让其冷却，加入作为在残留水中的悬浮液的本发明抗体或其片段。搅拌整个悬浮液直至均化。眼用滴剂组合物本发明抗体或其片段0.5g。
羟基苯甲酸甲酯0.01g。
羟基苯甲酸丙酯0.04g。
B.P.净化水至100.00ml。
将羟基苯甲酸甲酯和丙酯于75℃溶于70ml净化水中，让所得溶液冷却。然后加入本发明抗体或其片段，该溶液通过薄膜滤器(0.022Am孔径)过滤除菌，并无菌包装入合适的无菌容器中。通过吸入给予的组合物对于容量为15-20ml的气溶胶容器将10mg本发明抗体或其片段与0.2-0.5k润滑剂(诸如聚山梨醇酯85或油酸)混合，将这种混合物分散于抛射剂(诸如氟利昂)中，优选分散于(1,2二氯四氟乙烷)和二氟一氯甲烷的组合物中，放入适用于鼻内或经口吸入给药的合适的气溶胶容器中。对于容量为15-20ml的气溶胶容器而言，通过吸入给药的组合物将10mg本发明抗体或其片段溶于乙醇(6-8ml)中，加入0.1-0.2k润滑剂(诸如聚山梨醇酯85或油酸)；将其分散于抛射剂(诸如氟利昂)中，优选分散于(1-2二氯四氟乙烷)和二氟一氯甲烷的组合物中，并放入适用于鼻内或经口吸入给药的合适的气溶胶容器中。
本发明的抗体和药用组合物特别可用于胃肠外给予，即皮下、肌内或静脉内给予。用于胃肠外给予的组合物通常包括本发明抗体或其片段的溶液或其溶于可接受溶媒(最好是水性溶媒)中的混合液。可以利用许多水性溶媒，例如水、缓冲水、0.4k盐水、0.3％甘油等。这些溶液是无菌的，一般无颗粒状物质。这些溶液可以通过常规熟知的灭菌技术灭菌。所述组合物根据需要可以含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，所述辅助物质诸如pH调节剂或缓冲剂等。在这种药用制剂中本发明抗体或其片段的浓度的变化范围很宽，为低于约0.5k(通常为约1％或至少约1％)至高达15或20％(重量)，根据选定的具体给药模式，主要根据流体体积、粘度等进行选择。
因此，可以制备本发明肌内注射用药用组合物，使其含1ml无菌缓冲水和50mg本发明抗体或其片段。同样，可以制备本发明静脉内输注用的药用组合物，使其含250ml无菌Ringer溶液和150mg本发明抗体或其片段。制备胃肠外可给予组合物的实际方法是本领域技术人员熟知的或是显而易见的，并且更详细地描述于例如Remington’sPharmaceutical Science，第15版，Mack Publishing Company,Easton,PA,特此通过引用结合到本文中。
可以将本发明的抗体(或其片段)冻干，用于贮存和在使用前在合适溶媒中重建。已经表明该技术对于常规的免疫球蛋白是有效的，可以使用本领域已知的冻干和重建技术。
根据计划的结果，可以给予本发明的药用组合物，用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗应用中，将组合物给予已经患有疾病的患者，其给予量足以治愈所述疾病及其并发症，或至少部分控制所述疾病或其并发症。在预防应用中，将含本发明抗体的组合物或其混合液给予尚未处于疾病状态的患者，以增强所述患者的抗性。
可以以由主治医师选定的剂量水平和模式，进行药用组合物的单次或多次给予。在任何事件中，本发明的药用组合物均应该提供足以有效治疗所述患者的本发明的改变抗体(或其片段)量。
也应该注意到，本发明的抗体可以用于设计或合成可用于与抗体相同的疗法的或者肽、或者非肽化合物(模拟物)。参见例如Saragovi等，Science,253:792-795(1991)。
根据以上说明，人们会认识到，尽管本文为了进行说明，已经描述了本发明具体的实施方案，但在未偏离本发明的范围下，可以进行各种修改。因此，本发明不受所附的权利要求书限制。
权利要求
1．人源化抗体，它能够与鼠24-31抗体竞争而抑制CD40与gp39的结合。
2．权利要求1的抗体，它含有如图4-8中提出的所述24-31抗体的互补决定区、或含有一个或多个氨基酸取代的变异体或相当物。
3．衍生自鼠单克隆抗体24-31的人源化抗体．
4．衍生自鼠单克隆抗体24-31的人源化抗体，它保留的gp39结合亲和性至少约为鼠24-3l抗体的1/3。
5．衍生自鼠单克隆抗体24-31的人源化抗体，在B细胞测定中，它于不超过亲代鼠24-31抗体浓度3倍的浓度下，保留半最大效价的体外功能活性。
6．权利要求5的方法，其中所述B细胞测定测量T细胞依赖性抗体产生。
7．权利要求1的人源化抗体，其中所述抗体含有选自以下的人源化可变轻链序列(1) DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGESPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLLEIK；(2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(3) DIVMTQSPSFMSTSVGDHVTITC KASQNVZTAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQXNSYPYT FGGGTKLEIK；(4) DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK,及其含有大致不影响所得人源化抗体结合gp39抗原的能力的一个或多个保守氨基酸取代的变异体和相当物。
8．权利要求1的人源化抗体，其中所述抗体含有选自以下的人源化可变重链序列(1) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(2) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRRHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS.及其含有大致不影响所得人源化抗体结合gp39抗原的能力的一个或多个保守氨基酸取代的变异体和相当物。
9．权利要求1的人源化抗体，它含有选自以下的人源化可变轻链序列(1) DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(3) DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(4) DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK和选自以下的人源化可变重链序列(1) KVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIPKPPGNKLBYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(2) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLBYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS,and及其含有大致不影响所得人源化抗体结合gp39抗原的能力的一个或多个保守氨基酸取代的变异体和相当物。
10．权利要求5的人源化抗体，它含有人源化可变轻链序列(1)和人源化可变重链序列(1)。
11．权利要求5的人源化抗体，它含有人源化可变轻链序列(2)和人源化可变重链序列(1)。
12．权利要求5的人源化抗体，它含有人源化可变轻链序列(1)和人源化可变重链序列(2)。
13．权利要求5的人源化抗体，它含有人源化可变轻链序列(2)和人源化可变重链序列(2)。
14．权利要求1的人源化抗体，它含有人κ或λ轻链恒定区和或者人γ1或γ4重链恒定区。
15．编码根据权利要求1的人源化抗体的DNA序列。
16．含有根据权利要求10的DNA序列的表达载体。
17．药用组合物，它含有衍生自鼠单克隆抗体24-31的人源化抗体。
18．权利要求17的药用组合物，其中所述人源化抗体含有选自以下的人源化可变轻链序列(1) DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPRDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(3) DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPRDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(4) DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK.及其含有大致不影响所得人源化抗体结合gp39抗原的能力的一个或多个保守氨基酸取代的变异体和相当物。
19．权利要求18的药用组合物，其中所述人源化抗体含有选自以下的人源化可变重链序列(1) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(2) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGDSIT NGFWI WIRKEPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSNNQFSLNLNSVTRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS,及其含有大致不影响所得人源化抗体结合gp39抗原的能力的一个或多个保守氨基酸取代的变异体和相当物。
20．权利要求17的药用组合物，其中所述人源化抗体含有选自以下的人源化可变轻链序列(1) DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITC KASQNVITAVA NYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTKTISSLQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(3) DIVMTQSPSFMSTSVGDRVTITC KASQNVITAVA WYQQKPGKSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDFADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK；(4) DIVMTQSPDSMATSLGERVTINC KASQNVITAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSMQAEDVADYFC QQYNSYPYT FGGGTKLEIK和选自以下的人源化可变重链序列(1) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(2) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(3) EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIT NGFWI WIRKHPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFSLNLNSVTRADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；(4) EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVYGDSIT NGFWI WIRKPPGNKLEYMG YISYSGSTYYNPSLKSRISISRDTSKNQFYLKLSSVTAADTGVYYCAC RSYGRTPYYFDF WGQGTTLTVSS；及其含有大致不影响所得人源化抗体结合gp39抗原的能力的一个或多个保守氨基酸取代的变异体和相当物。
21．权利要求20的药用组合物，其中所述人源化抗体含有人源化可变轻链序列(1)和人源化可变重链序列(1)。
22．权利要求20的药用组合物，其中所述抗体含有人源化可变轻链序列(2)和人源化可变重链序列(1)。
23．权利要求20的药用组合物，它含有人源化可变轻链序列(1)和人源化可变重链序列(2)。
24．权利要求20的药用组合物，它含有人源化可变轻链序列(2)和人源化可变重链序列(2)。
25．通过调节gp39表达或抑制gp39/CD40相互作用可治疗的疾病的治疗方法，包括给予治疗有效量的根据权利要求1的人源化抗体。
26．权利要求25的方法，其中所述疾病为自身免疫病。
27．权利要求21的方法，其中所述自身免疫病选自类风湿性关节炎、牛皮癣、多发性硬化、糖尿病、系统性红斑狼疮和ITP。
28．权利要求25的方法，其中所述疾病为非自身免疫病。
29．权利要求27的方法，其中所述疾病为移植物抗宿主病或移植排斥。
30．在细胞治疗或基因治疗期间抑制对所给予细胞或载体的体液和/或细胞免疫应答的方法，包括在基因治疗之前、期间或之后还给予一定量的衍生自鼠抗体24-31的人源化抗体，所述给予量足以在细胞治疗或基因治疗期间抑制对所用细胞或载体的体液和/或细胞免疫应答。
31．权利要求30的方法，其中所述载体为病毒载体、DNA或反义RNA。
32．权利要求31的方法，其中所述病毒载体为腺病毒或反转录病毒。
33．权利要求30的方法，其中所述人源化抗体含有图5-8中至少一个图中提出的序列。
34．涉及相同或不同物种的细胞、组织或器官移植到需要这种治疗的受治疗者中的改进治疗方法，其中所述改进包括在移植之前、期间或之后，给予衍生自鼠抗体24-31的人源化抗人gp39抗体；其给予量足以抑制对所移植细胞、组织或器官的免疫应答，或抑制由所述移植细胞、组织或器官引发的抗所述宿主的免疫应答。
全文摘要
本发明涉及结合人gp39的人源化抗体及其作为治疗剂的用途。这些人源化抗体尤其可用于治疗自身免疫病;并且为异源细胞、组织或器官移植、细胞治疗和基因治疗期间的免疫抑制剂。
文档编号A61K48/00GK1278736SQ98810897
公开日2001年1月3日 申请日期1998年9月8日 优先权日1997年9月8日
发明者A·布拉克, N·汉纳, E·A·帕德兰, R·A·纽曼 申请人:艾德药品公司