，0. 45ym微孔滤膜过滤，即得质量浓度为lmg/mL的对照品储备液。
[0021] 精密称取苹果渣三萜粗提物25mg，纯化物12. 5mg，分别置于25mL容量瓶中用色谱 甲醇溶解后定容，〇. 45ym微孔滤膜过滤，即得质量浓度分别为lmg/mL和0. 5mg/mL的供试 品储备液。
[0022] 色谱条件：色谱柱为AgilentTC-C18 (250_X4. 6mm，5iim);柱温为 35°C;流动 相为甲醇：水：磷酸=88:11. 95:0. 05 ;流速为0. 6mL/min;检测波长为210nm;进样量为 10yL。在上述色谱条件下，对照品及样品色谱图见图1、图2和图3,经计算得到粗提物中 熊果酸和齐墩果酸的总含量为（39. 85±0. 53) %，纯化物中熊果酸和齐墩果酸的总含量为 (69. 61 ±1. 17)%。
[0023] 实施例2苹果渣三萜粗提物及纯化物清除自由基及总抗氧化能力测定 1苹果渣三萜粗提物和纯化物的制备 苹果渣三萜粗提物和纯化物的制备同实施例1。
[0024] 2清除DPPH自由基能力测定 (1)粗提物/纯化物样品溶液的配制 精密称取苹果渣三萜粗提物和纯化物各l〇〇mg，分别置于50mL容量瓶中，用95%乙醇 溶解后定容，即得质量浓度为2.Omg/mL样品储备液，分别取储备液1. 25、2. 50、3. 75、5. 00、 6. 25、7. 50、8. 75、10.00mL于10mL容量瓶中，用95%乙醇溶液定容后，即得质量浓度为 0. 25、0. 50、0. 75、1. 00、1. 25、1. 50、1. 75、2. 00mg/mL的总三萜粗提物 / 纯化物样品溶液。
[0025] (2)测定方法 将DPPH用95%乙醇配制成0.lmmol/L的溶液，取2.OmL样品溶液与2.OmLDPPH溶液 混合均匀后，室温下避光静置30min，于517nm下测定吸光度（AY)。以DPPH溶液与95%乙醇 的混合液为空白（AD)，计算样品对DPPH自由基的清除率及/6#值。试验重复3次，取平均 值作图。
[0026] DPPH自由基清除率 /%=(AD- A Y) /AD X 100 (3)试验结果 图4可见，相同质量浓度下，苹果渣三萜粗提物清除DPPH自由基的能力比纯化物强； 随着粗提物质量浓度的增加，其清除DPPH自由基的能力逐渐增强，由（40. 56±1. 30)% 增至（81. 39 ± 0. 47 ) % ;随着纯化物浓度的增加，其清除DPPH自由基的能力逐渐增强，由 (20.13±0.06)%增加到（65.19±0.01)%。
[0027] 3清除ABTS自由基能力测定 (1)粗提物/纯化物样品溶液的配制 苹果渣三萜粗提物和纯化物样品溶液的配制同实施例2的清除DPPH自由基能力测定。
[0028] (2)测定方法 精密称取38. 5?38. 7mg固体ABTS于10mL棕色容量瓶中，用去离子水定容后即得 7mmol/LABTS溶液；精密称取189. 2?189. 5mg过硫酸钾于5mL棕色容量瓶中，用去离子 水定容后即得140mmol/L过硫酸钾溶液；将5mLABTS溶液和88yL过硫酸钾溶液混合避光 反应，置于室温黑暗条件下12?16h后备用。使用前用95%乙醇稀释到吸光值在734nm处 为 0? 70±0. 02。
[0029] 准确吸取上述粗提物/纯化物样品溶液1.OmL，加入ABTS+溶液2.OmL混匀，室温 下避光静置5min，734nm下测定吸光度（AY)，以ABTS+溶液与95%乙醇的混合液为空白（AD)， 计算样品对ABTS自由基的清除率及/^^值。试验重复3次，取平均值作图。
[0030] ABTS自由基清除率 /%=(AD- A Y) /AD X 100 (3)试验结果 图5可见，相同质量浓度下，苹果渣三萜粗提物清除ABTS自由基的能力比纯化物强； 随着粗提物质量浓度的增加，其清除ABTS自由基的能力逐渐增强，由（27. 92±3. 76) %增 加到（97. 25±0. 32)% ;随着纯化物浓度的增加，其清除ABTS自由基的能力逐渐增强，由 (12.12±0.77)%增加到（59.51±1.17)%。
[0031] 4清除羟自由基能力测定 (1)粗提物/纯化物样品溶液的配制 苹果渣三萜粗提物和纯化物样品溶液的配制同实施例2的清除DPPH自由基能力测定。
[0032] (2)测定方法 精密称取166.8mg的FeS04 ? 7H20,用去离子水定容至100mL容量瓶中，即得6mmol/L FeS04溶液；吸取61. 28iiLH202，用去离子水定容至100mL容量瓶中，即得6mmol/LH202溶 液；精密称取82. 8mg水杨酸，用去离子水定容至100mL容量瓶中，即得6mmol/L水杨酸溶 液。
[0033] 准确吸取上述粗提物/纯化物样品溶液1.OmL，依次加入1. 0mLFeS04溶液、1.OmL 水杨酸溶液及1.OmLH202溶液，混合均匀，37°C下避光加热30min，4000rpm下离心5min，取 上清液于510nm下测定吸光度（AY)。以95%乙醇溶液代替样品溶液为空白（AD)，以等体积 蒸馏水代替H202为样品本底吸光度（AB)，计算样品对羟自由基的清除率及/^^值。试验重 复3次，取平均值作图。
[0034]羟自由基清除率 /%= [1 - (AY-AB) /AD]X100 (3)试验结果 图6可见，相同质量浓度下，苹果渣三萜粗提物清除羟自由基的能力与纯化物相当；二 者均随着质量浓度的增加，清除羟自由基的能力逐渐增强，粗提物由（11. 26±3. 19) %增加 到（60. 47 ± 3. 86) %，纯化物由（13. 32 ± 2. 02) % 增加到（59. 54±0? 27) %。
[0035] ( 4 )清除自由基的/心值比较 表1可见，苹果渣三萜纯化物清除DPPH自由基的/^^是粗提物的4. 3倍，纯化物清除ABTS自由基的/心是粗提物的3. 0倍，说明苹果渣三萜粗提物清除DPPH自由基和ABTS自 由基的能力显著强于纯化物；纯化物和粗提物清除羟自由基的目似，说明二者清除羟 自由基的能力相近。结果表明，苹果渣三萜粗提物和纯化物均具有一定的清除自由基的能 力。
【主权项】
1. 一种苹果渣中提取三萜类物质的提取纯化方法，其特征在于：所述的方法的步骤 为： (1)粗提：将料液比为1:18的100?120目干燥苹果渣粉和乙醇溶液混合，乙醇溶液 体积分数为95%，置于超声波设备中重复提取3次，每次提取的温度为40°C，提取时间为 20min，然后进行过滤，合并三次提取的滤液，然后在4000rpm下离心lOmin，上清液经60°C 减压浓缩后得到苹果渣三萜的浸膏； (2)除杂：将苹果渣的浸膏按照料液比1:30?1:40与石油醚混合，置于超声波设备中 重复洗涤，过滤，将得到的滤渣在55°C真空干燥箱中干燥12h，得到苹果渣三萜粗提物； (3) 吸附：将苹果渣三萜粗提物用体积分数为60%的乙醇溶液溶解，配制成质量浓度为 1. Omg/mL的上样液，采用D101大孔树脂对苹果渣中的总三萜进行吸附，吸附过程中上样液 的上样流速为1 BV/h，上样液体积为5BV ; (4) 洗脱：采用体积分数为90%的乙醇溶液对吸附饱和的大孔树脂进行洗脱，依次用 8BV的水，3BV的体积分数为20%、40%、50%、60%的乙醇溶液进行过渡与除杂，洗脱液乙醇体 积分数为90%，洗脱液体积为5BV，洗脱流速为lBV/h，洗脱液经60°C减压浓缩得到苹果渣三 萜纯化物。
2. 根据权利要求1所述的一种苹果渣中提取三萜类物质的提取纯化方法，其特征在 于，步骤（2)中，超声波洗涤的温度为40?60°C，洗涤4?6次，每次洗涤时间为40? 60min〇
3. 根据权利要求1 一种苹果渣中提取三萜类物质的提取纯化方法，其特征在于：所述 的苹果渣中三萜类物质富含熊果酸和齐墩果酸，具有较强的抗氧化作用。
4. 根据权利要求1 一种苹果渣中提取三萜类物质的提取纯化方法，其特征在于：所得 苹果渣中三萜类物质具有清除DPPH自由基、清除ABTS自由基、羟自由基的能力，并具有较 强的总抗氧化能力。
5. 权利要求1所得的苹果渣中三萜类物质使肝脏指数、ALT、AST、IL-6、MDA显著下降， 同时使SOD、GSH-Px明显上升，能对四氯化碳导致的急性肝损伤起到保护作用。
【专利摘要】本发明涉及三萜类物质提纯、医药及保健食品技术领域，具体涉及一种苹果渣中提取三萜类物质的提取纯化方法及其应用。其以干燥的100～120目苹果渣为原料，按照料液比1:18和95%乙醇溶液混合，超声提取，滤液干燥后得到苹果渣三萜的浸膏；再将浸膏按照料液比1:30～1:40与石油醚混合，40～60℃下超声波重复洗涤4～6次，每次40～60min，将滤渣进行干燥，得到苹果渣三萜粗提物；最后经大孔树脂对苹果渣中的三萜进行吸附、洗脱，洗脱液经浓缩、干燥，得到苹果渣三萜纯化物。本发明进一步公开苹果渣三萜粗提物和纯化物中主要有效成分为熊果酸和齐墩果酸，两种提取物均具有清除自由基、抗氧化能力，对急性肝损伤具有显著的改善和保护作用。
【IPC分类】A23L1-29, A61P1-16, A61P39-06, A61Q19-08, A61K8-97, A61K36-73
【公开号】CN104523881
【申请号】CN201410791931
【发明人】任亚梅, 张爽
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月19日