一种苹果渣中提取三萜类物质的提取纯化方法及其应用
【专利说明】一种苹果渣中提取三萜类物质的提取纯化方法及其应用
[0001] 一、技术领域： 本发明涉及三萜类物质提纯、医药及保健食品技术领域，具体涉及一种苹果渣中提取 三萜类物质的提取纯化方法及其应用。
[0002] 二、【背景技术】： 苹果渣是苹果生产浓缩果汁、罐头、果酱等剩下的下脚料，主要由果皮和果肉、果籽、果 梗组成。一般每加工1000吨苹果，可排出约300吨鲜果渣，烘干后得75吨左右的干果渣。 目前苹果渣除少量用于饲料及深加工外，绝大部分被遗弃。
[0003]CC14在肝微粒体细胞色素P45(|酶激活下产生活性自由基CC13%CC13?进一步与氧 反应，形成活性更强的自由基CC13C00?，这些自由基可与肝细胞内的蛋白质等大分子进行 共价结合，干扰蛋白质的合成，也可与肝细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，导致肝细胞 肿胀坏死。ALT和AST属胞内酶，当肝细胞受到破坏时，分布在胞浆中的ALT、AST便大量释 放到血液中，使血清中这两种酶的活性增高。S0D是机体内重要的抗氧化酶，能有效清除生 物氧化产生的氧自由基，防止自由基对细胞结构的损伤，其活力的大小反映了机体抗氧化、 清除自由基的能力。GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它能 催化还原性GSH对过氧化氢的还原反应，从而减少自由基，保护细胞膜结构与功能的完整。 由于机体内存在着大量多不饱和脂肪酸，极易受到氧化作用的损伤，产生有细胞毒性的脂 质过氧化物，如MDA。因此MDA水平的变化能反映脂质过氧化损伤的程度，进而反映出肝脏 的损伤程度。NF-kB是一种调控炎症和免疫反应转录激活剂，CC14导致急性肝损伤时，会 产生大量自由基，激活NF-kB的表达，诱导和调控白细胞介素类细胞因子，如IL-6的释放， 促使肝脏炎症损伤加大。CC14所致急性肝损伤在形态学、病理生理学的某些方面与人的肝 病较为相似，且CC14致急性肝损伤的机制与自由基的传导密切相关，由于三萜类化合物具 有保肝、抗肿瘤、抗菌消炎、抗病毒、提高机体免疫、降血糖和降血脂等功效，被广泛用作保 健食品、医药和化妆品的原料，三萜类物质中的齐墩果酸、熊果酸等已被证明具有明显的保 肝作用，且目前关于苹果渣中三萜的研究较少。因此开展苹果渣中三萜的提取、纯化及生物 活性研究，为苹果渣中三萜的进一步开发利用具有重要意义。
[0004] 三、
【发明内容】
： 本发明为了解决上述【背景技术】中的不足之处，提供一种苹果渣中提取三萜类物质的提 取纯化方法及其应用，其适用于工业化生产。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种苹果渣中提取三萜类物质的提 取纯化方法，其特征在于：所述的方法的步骤为： (1) 粗提：将料液比为1:18的100?120目干燥苹果渣粉和乙醇溶液混合，乙醇溶液 体积分数为95%，置于超声波设备中重复提取3次，每次提取的温度为40°C，提取时间为 20min，然后进行过滤，合并三次提取的滤液，然后在4000rpm下离心lOmin，上清液经60°C 减压浓缩后得到苹果渣三萜的浸膏； (2) 除杂：将苹果渣的浸膏按照料液比1:30?1:40与石油醚混合，置于超声波设备中 重复洗涤，过滤，将得到的滤渣在55°C真空干燥箱中干燥12h，得到苹果渣三萜粗提物； (3) 吸附：将苹果渣三萜粗提物用体积分数为60%的乙醇溶液溶解，配制成质量浓度为 1.Omg/mL的上样液，采用D101大孔树脂对苹果渣中的总三萜进行吸附，吸附过程中上样液 的上样流速为1BV/h，上样液体积为5BV; (4) 洗脱：采用体积分数为90%的乙醇溶液对吸附饱和的大孔树脂进行洗脱，依次用 8BV的水，3BV的体积分数为20%、40%、50%、60%的乙醇溶液进行过渡与除杂，洗脱液乙醇体 积分数为90%，洗脱液体积为5BV，洗脱流速为lBV/h，洗脱液经60°C减压浓缩得到苹果渣三 萜纯化物。
[0006] 步骤（2)中，超声波洗涤的温度为40?60°C，洗涤4?6次，每次洗涤时间为40? 60min〇
[0007] 所述的苹果渣中三萜类物质富含熊果酸和齐墩果酸，具有较强的抗氧化作用。
[0008] 所得苹果渣中三萜类物质具有清除DPPH自由基、清除ABTS自由基、羟自由基的能 力，并具有较强的总抗氧化能力。
[0009] 所得的苹果渣中三萜类物质使肝脏指数、ALT、AST、IL-6、MDA显著下降，同时使 SOD、GSH-Px明显上升，能对四氯化碳导致的急性肝损伤起到保护作用。
[0010] 与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：本发明苹果渣三萜具有保肝作 用，是以熊果酸和齐墩果酸为主要有效成分制成的。本发明中，测定了苹果渣三萜清除自由 基能力及体内对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤的保护作用。结果表明，苹果渣三萜在体外具 有较强的清除自由基的能力及总抗氧化能力。在体内，三种给药剂量（15、30、60mg/mL)对四 氯化碳诱导的小鼠肝损伤均具有较好的保护作用。苹果渣三萜的这种活性可能归结于其内 的熊果酸和齐墩果酸，其保护机制可能与清除自由基，减轻脂质过氧化，降低肝细胞内MDA 水平和IL-6含量，提高S0D活性和GSH含量，降低肝细胞内ALT、AST含量有关。
[0011] 本发明以苹果渣为原料，以三萜类物质为分离纯化对象，采用有机溶剂提取法制 备苹果渣三萜，研究最佳提取纯化条件，经本发明优化后得到粗提物和纯化物中三萜类物 质的质量分数分别为（57. 27±1. 25)%和（87. 46±3. 54)%，其提纯效果得到质的提高，为苹 果渣深加工和综合利用提供参考，同时为寻找高纯度苹果三萜的制备原料开辟一条新的途 径。同时本发明提供的苹果渣三萜对急性肝损伤有保护作用，可应用于肝脏保护和保健治 疗中。
[0012]为进一步说明本发明的苹果渣三萜粗提物和纯化物清除自由基的能力、总抗氧化 能力及对急性肝损伤的保护作用，下面提供苹果渣三萜粗提物和纯化物中三萜含量及相关 物质的含量测定及清除自由基能力、总抗氧化能力及急性肝损伤药理试验结果。
[0013]四、【附图说明】： 图1为相同条件下熊果酸和齐墩果酸混标的HPLC图谱； 图2为苹果渣三萜粗提物的HPLC图谱； 图3为苹果渣三萜纯化物的HPLC图谱； 图4为苹果渣三萜粗提物和纯化物的清除DPPH自由基结果图； 图5为苹果渣三萜粗提物和纯化物的清除ABTS自由基结果图； 图6为苹果渣三萜粗提物和纯化物的清除羟自由基结果图； 图7为苹果渣三萜粗提物和纯化物的总抗氧化能力结果图； 五、【具体实施方式】： 为了便于理解本发明，特列举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对 本发明的任何形式的限制。
[0014] 实施例1苹果渣三萜粗提物和纯化物的制备及含量测定 1、苹果渣三萜粗提物和纯化物的制备 (1) 粗提：将料液比（m:v)为1:18的100?120目干燥苹果渣粉和乙醇溶液混合，乙醇 溶液体积分数为95%，置于超声波设备中重复提取3次，温度为40°C，提取时间为20min，然 后进行过滤，合并三次提取的滤液，4000rpm下离心lOmin，上清液经60°C减压浓缩后得到 苹果渣三萜的浸膏； (2) 除杂：将苹果渣的浸膏按照料液比（m:v) 1:35与石油醚混合，置于超声波设备中重 复洗涤6次，超声波洗涤的温度为50°C，每次洗涤时间为50min，过滤，将得到的滤渣在55°C 真空干燥箱中干燥12h，得到苹果渣三萜粗提物。
[0015] (3)吸附：将苹果渣三萜粗提物用体积分数为60%的乙醇溶液溶解，配制成质量浓 度为1.Omg/mL的上样液，采用D101大孔树脂对苹果渣中的总三萜进行吸附，吸附过程中上 样液的上样流速为1BV/h，上样液体积为5BV。
[0016] (4)洗脱：采用体积分数为90%的乙醇溶液对吸附饱和的大孔树脂进行洗脱，依次 用8BV的水，3BV的体积分数为20%、40%、50%、60%的乙醇溶液进行过渡与除杂，洗脱液乙醇 体积分数为90%，洗脱液体积为5BV，洗脱流速为lBV/h，洗脱液经浓缩、干燥，得到苹果渣三 萜纯化物。
[0017] 步骤（1)中，影响苹果渣中三萜类物质提取率各因素的大小关系为：乙醇浓度> 料液比 > 粉碎粒度 > 超声温度 > 超声时间，其中乙醇浓度、液固比对苹果渣总三萜提取率 影响极显著，粉碎粒度对苹果渣总三萜提取率影响显著。
[0018] 2、苹果渣三萜粗提物和纯化物含量测定 (1)三萜含量测定： 标准曲线的制作：由于苹果渣粗提物和纯化物中总三萜主要成分为熊果酸，因此以熊 果酸为标品，用体积分数为60%的乙醇溶液配制质量浓度为0.lmg/mL的标准溶液,精确取 0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7mL熊果酸标准溶液于具塞试管中，放入90°C水浴锅，将乙 醇溶剂挥发后，分别加入〇. 3mL5%香草醛-冰醋酸溶液和0. 7mL高氯酸，摇匀后置于60°C 水浴锅加热20min，取出后迅速用流水冷却至室温，加入4.OmL冰醋酸摇匀，于550nm下测定 吸光度，绘制标准曲线。
[0019] 总三萜质量分数的测定与计算：称取苹果渣三萜粗提物/纯化物10mg至100mL容 量瓶中定容，制成〇.lmg/mL样品溶液，取适量待测样品溶液于具塞试管中，按标准曲线样 品处理及测定方法测定。根据标准曲线，计算得到苹果渣三萜粗提物中三萜的质量分数为 (57. 27 ±1. 25)%，纯化物中三萜的质量分数为（87. 46 ±3. 54)%。
[0020] (2)主要成分熊果酸和齐墩果酸含量测定 精密称取熊果酸和齐墩果酸对照品各l〇mg，分别置于10mL容量瓶中用色谱甲醇溶解 后定容