聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，组织 切片经脱蜡水化，抗原修复，封闭内源性过氧化氢酶，抗体杂交（CD45、CD68、CD3及dsRNA抗 体），DAB显色，复染，脱水、透明和封片后镜检。
[0042]6.H&E及Masson染色方法
[0043] 小鼠心脏组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，苏木 素伊红染色（hematoxylin_eosine，H&E)及Masson三色法染色后镜检。光学显微镜下观察 组织切片心肌组织炎性细胞浸润、细胞损伤程度，以及心肌纤维化程度。
[0044] 7.qRT-PCR检测方法
[0045] 具体步骤包括：设计并合成VPl和GAPDH引物；Trizol试剂提取RNA，核酸仪检测 RNA浓度和纯度，逆转录试剂盒合成cDNA;以cDNA为模板，采用SYBRGreen试剂盒进行实 时定量PCR。
[0046] 8.Westernblot检测
[0047] 药物处理后的细胞进行总蛋白提取；BCA法进行蛋白浓度测定；然后进行SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，一抗稀释液孵育过夜，相应二抗孵育2h(室温），化学发光 显影。应用ImageJ软件测定灰度值。
[0048] 9?心肌酶谱检测方法
[0049] 将小鼠血清用自动生物化学分析仪（公司：日立，型号：7170S)进行检测，测定天 冬氨酸转氨酶（AST)、肌酸激酶（CK)、肌酸激酶同工酶（CK-MB)、乳酸脱氢酶（LDH)和a-羟 丁酸脱氢酶（a-HBDH)的活性。
[0050] 10.HeLa细胞感染及药物处理
[0051] 以含10%FBS的高糖DMEM培养基调整HeLa细胞密度，以5XIO5/孔接种于六孔 板中，37°C、5%CO2的条件培养24小时。用CVB3(MOI= 3)感染1小时，弃去病毒液，PBS 洗绦两次，加药处理。提取RNA和总蛋白进行定量PCR及Westernblot检测。
[0052] 三、结果
[0053] 1.二甲双胍显著改善CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率
[0054] 在小鼠感染CVB3后，灌胃二甲双胍（50mg/kg)，灌胃28天（连续灌胃7天，7天后 每周灌胃3次），二甲双胍干预组小鼠生存率明显得到提高。结果显示二甲双胍可显著改善 CVB3所致病毒性心肌炎小鼠生存率（参见图1)。
[0055] 2.二甲双胍具有保护心肌功能的作用
[0056] 将二甲双胍治疗21天的小鼠进行心功能检测，结果表明二甲双胍治疗组具有保 护心肌功能的作用（参见图2)。
[0057] 3.二甲双胍抑制炎症细胞浸润
[0058] 小鼠心肌组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，经 ⑶45、⑶68及⑶3抗体进行免疫组化染色后镜下观察。结果表明二甲双胍治疗组可明显抑 制炎症细胞浸润（见图3)。
[0059] 4.二甲双胍抑制炎症细胞浸润和组织损伤
[0060] 小鼠心肌组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，苏木 素伊红染色（hematoxylin_eosine，H&E)后镜下观察。结果表明二甲双胍治疗组明显的抑 制炎症细胞浸润和组织坏死（见图4)。
[0061] 5.二甲双胍抑制心肌组织纤维化
[0062] 小鼠心脏组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym， Masson三色法染色后镜检。光学显微镜下观察心肌纤维化程度。结果表明二甲双胍治疗组 明显抑制心肌组织的纤维化（见图5)。
[0063] 6.二甲双胍具有抑制心肌酶活性的作用
[0064] 小鼠血清样本进行心肌酶活性检测，结果表明二甲双胍治疗组中天冬氨酸转氨酶 (AST)、肌酸激酶（CK)、肌酸激酶同工酶（CK-MB)、乳酸脱氢酶（LDH)和a-羟丁酸脱氢酶 (a-HBDH)的活性相对于病毒感染组明显被抑制，见表1。
[0065] 表1?小鼠血清心肌酶谱结果（平均值土标准误）
[0066]
[0067] a.p< 0? 05CVB3感染组与正常对照组比较；
[0068] b.p< 0? 05二甲双胍治疗组与CVB3感染组比较。
[0069] 7?二甲双胍具有抗CVB3作用
[0070] 小鼠心脏组织用4%多聚甲醛固定后，常规脱水，石蜡包埋，切片，片厚5ym，组织 切片经脱蜡水化，抗原修复，封闭内源性过氧化氢酶，抗体杂交（dsRNA抗体），DAB显色，复 染，脱水、透明和封片后镜检。结果表明二甲双胍治疗组具有明显的抗CVB3作用和抑制其 复制的作用（见图6)。
[0071] qRT-PCR方法检测小鼠心肌组织中CVB3衣壳蛋白VPl的RNA水平，结果表明二甲 双胍治疗组明显降低其RNA水平（见图7)。
[0072] 8.二甲双胍体外抗CVB3活性作用
[0073] 将HeLa细胞经药物处理12小时后，提取总蛋白，Westernblot检测CVB3衣壳蛋 白VPl的表达水平，结果表明，二甲双胍具有显著的抑制VPl蛋白表达水平的作用（见图 8)。提取总RNA，实时定量PCR检测CVB3衣壳蛋白VPl的RNA水平，结果表明，二甲双胍具 有显著的抑制VPl的RNA水平的作用（见图9)。
【主权项】
1. 一种二甲双胍在制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病药物中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物以口服给药。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述药物用药量为每公斤体重每天5~ IOmg0
【专利摘要】本发明涉及一种二甲双胍用于制备治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病药物的用途。采用本发明所述药物治疗柯萨奇病毒B3所致病毒性心肌炎疾病，具有抗CVB3病毒复制的作用，改善心肌功能，抑制心肌炎症及纤维化效果明显，可用于制备治疗病毒性心肌炎的药物，该药物副作用小，疗效高，在目前临床上治疗CVB3所致病毒性心肌炎尤其是在感染后期，治疗的疗效不够满意的情况下，其应用前景良好。
【IPC分类】A61P9/04, A61P31/14, A61K31/155
【公开号】CN104906080
【申请号】CN201510337052
【发明人】张克斌, 谢玮, 王蕾, 周小波, 代黔, 钱桂生, 周世文, 余华, 何晓梅, 熊浚智, 辛榕
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第二附属医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月17日