或 另外，组合物可包含增强它的功能的作用剂，例如，细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂或生 长抑制剂。这类分子合适以对于意图目的有效的量组合存在。
[0101] 活性成分也可截留在微胶囊(例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备，分别例 如，羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚（异丁烯酸甲酯）微胶囊)中、胶质药物递送系统（例 如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米-颗粒和纳米胶囊）中或大乳剂（macroemulsions) 中。
[0102] 用于体内给予的制剂必须是无菌的。这通过穿过无菌过滤膜过滤容易地实现。
[0103] 可制备持续释放的制剂。持续释放的制剂的合适实例包括含抗体的固体疏水聚合 物的半透性基质，所述基质呈成形制品的形式，例如，薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例 包括多元酯、水凝胶（例如，聚（2-羟乙基-异丁烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚交酯（美国 专利号3, 773, 919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯 酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT ? (可注射微球体，其由乳酸-乙醇酸 共聚物和乙酸亮丙瑞林组成）和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物(例如乙烯乙酸乙烯 酯和乳酸-乙醇酸)使分子的释放能够持续超过100天，但某些水凝胶释放蛋白持续较短时 间。
[0104] 可将本发明的抗体用作在样品中检测PD-Ll (或蛋白或其蛋白片段）的存在的作 用剂。优选地，抗体含可检测的标记。抗体可为多克隆的或更优选为单克隆的。可使用完 整抗体或其片段（例如，Fab、scFv或F(ab)2)。关于探针或抗体的术语〃标记的〃，意图包括 通过偶联（即，物理连接）可检测的物质至探针或抗体直接标记探针或抗体，以及通过与另 一直接标记的试剂的反应性间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用突光标记的 第二抗体检测第一抗体和用生物素末端标记DNA探针使得它可用荧光标记的链霉亲和素 检测。术语"生物样品"意图包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及存在于受试 者中组织、细胞和流体。因此，血液和血液的流分或组分(其包含血清、血浆或淋巴）包含于 术语"生物样品"的使用中。即，本发明的检测方法可用于在体外的生物样品中或在体内检 测分析物mRNA、蛋白或基因组DNA。例如，用于检测分析物mRNA的体外技术包括Northern 杂交和原位杂交。用于检测分析物蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA)、蛋白 质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包括Southern杂 交。用于指导免疫测定的方法描述于例如"ELISA: Theory and Practice: methods in Molecular Biology (ELISA:理论与实践：分子生物学方法）"，Vol. 42，J. R. Crowther (主编）Human Press, Totowa, NJ, I995 ;"Immunoassay (免疫测定），'，E. Diamandis 和T. Christopoulus, Academic Press, Inc. , San Diego, CA, 1996 ;和"Practice and Theory of Enzyme Immunoassay(酶免疫测定的实践与理论）"，P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985。此外，用于检测分析物蛋白的体内技术包括向受 试者引入标记的抗-分析物蛋白抗体。例如，所述抗体可用放射性标记物标记，所述放射性 标记物在受试者中的存在和位置可通过标准成像技术检测。
[0105] 定向抗ro-Li蛋白的抗体(或其片段）可用于本领域已知的方法，其涉及ro-Li蛋 白的定位和/或定量（例如，用于测量在合适的生理学样品中ro-Li蛋白的水平、用于诊断 方法、用于蛋白成像等）。在给定的实施方案中，对ro-Li蛋白特异的抗体或其衍生物、片 段、类似物或同系物(其含抗体衍生的抗原结合结构域）被利用作为药理活性化合物（在下 文中被称为"治疗药?。
[0106] 本发明的对ro-Li蛋白特异的抗体可用于通过标准技术，例如免疫亲和、层析或 免疫沉淀分离ro-Li多肽。定向抗ro-Li蛋白的抗体(或其片段）可作为临床试验程序的 一部分诊断性地用于监测组织中蛋白的水平，例如，确定给定治疗方案的功效。检测可通过 将所述抗体偶联（即，物理连接）至可检测的物质而促进。可检测的物质的实例包括多种 酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧 化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉 亲和素/生物素和抗生物素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰 酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、氯化丹酰或藻红素；发光材料的实例包括鲁米诺； 生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母素；以及合适的放射性材料的实例包括 125i、131i、35s 或 3η。
[0107] 治疗纟目合物 本发明的抗体或作用剂（本文也称为"活性化合物"），及其衍生物、片段、类似物和同 系物可被掺入适合于给予的药物组合物。这类组合物通常包括抗体或作用剂和药学上可接 受的载体。本文使用的术语"药学上可接受的载体"意图包括任何和所有与药物给予相容 的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。合适的载体描述于最新 版的Remington' s Pharmaceutial Sciences,其为本领域中标准参考文本，其通过引用并 入本文。这类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和 5%人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介(例如固定油)。药物活性物质的这样的媒 介和作用剂的使用在本领域是周知的。除了任何常规媒介或作用剂与活性化合物不相容的 情况之外，其在组合物中的使用为预期的。补充活性化合物也可掺入该组合物。
[0108] 本发明的药物组合物被配制为与其意图的给予途径相容。给予途径的实例包括肠 胃外(例如，静脉内、皮内、皮下)、口服（例如，吸入）、透皮（即，表面）、透粘膜和直肠给予。 用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂（例如注射用 水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂）；抗细菌剂(例如苯甲醇 或对羟基苯甲酸甲酯）;抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠）;螯合剂(例如乙二胺四乙酸 (EDTA));缓冲液(例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)，以及用于调节张力的作用剂(例如氯化 钠或葡萄糖)。可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠）调节pH。可将肠胃外制剂封装在安瓿、 一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
[0109] 适合于可注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液（在水溶的情况下）或分散 液和用于无菌可注射溶液或分散液的临时配制的无菌粉末。对于静脉内给予，合适的载体 包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELtm (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。在所有情况下，组合物必须为无菌的且应该为流动性的，达到容易可注射性存在的 程度。它必须在制造和储存条件下稳定并且必须保持抗微生物(例如细菌和真菌）的污染 活动。载体可为溶剂或分散介质，其包含例如，水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液体 聚乙二醇等）及其合适的混合物。合适的流动性可例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过 在分散液的情况下保持所需粒度和通过使用表面活性剂而保持。预防微生物的活动可通过 多种抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳萊等）而实 现。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂(例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、 氯化钠)。可注射组合物的延长吸收可通过将延迟吸收的作用剂(例如，单硬脂酸铝和明胶） 包含入组合物而发生。
[0110] 无菌可注射溶液可通过将活性化合物以所需量掺入带有上面列举的一种成分或 成分的组合的合适溶剂，根据需要，随后过滤灭菌而制备。通常，分散液通过将活性化合物 掺入含有基础分散介质和来自上述列举的那些的所需其它成分的无菌媒介而制备。在用于 制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的方法为真空干燥和冻干，其产生来自其 先前无菌过滤溶液的活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
[0111] 口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以被封装于明胶胶囊中或 压制成片剂。为了 口服治疗给予的目的，活性化合物可与赋形剂掺合并以片剂、锭剂或胶 囊的形式使用。口服组合物也可使用流体载体制备以用作漱口剂，其中在流体载体中的化 合物被口腔施用和漱口并吐出或吞下。药学上相容的结合剂和/或佐药材料可被包括作 为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有任何以下成分或类似性质的化合物： 粘合剂(例如微晶纤维素、黄芪树胶或明胶）；赋形剂(例如淀粉或乳糖）；崩解剂(例如藻酸、 Primogel或玉米淀粉）；润滑剂(例如硬脂酸镁或Sterotes);助流剂(例如胶质二氧化娃）； 甜味剂(例如蔗糖或糖精）；或矫味剂(例如薄荷、水杨酸甲酯或桔子调味料)。
[0112] 对于通过吸入给予，化合物以来自压力容器或分配器(其含有合适的推进剂，例 如，诸如二氧化碳等气体）或喷雾器的气雾剂喷雾的形式递送。
[0113] 全身给予也可通过透粘膜的或透皮的方式。对于透粘膜的或透皮的给予，适合于 待渗透的屏障的渗透剂被用于制剂。这类渗透剂在本领域中为普遍已知的，并对于透粘膜 给予，包括例如去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜的给予可通过使用鼻喷雾或栓剂 完成。对于透皮的给予，活性化合物被配制成如本领域普遍已知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。
[0114] 化合物也可以栓剂（例如，用常规栓剂基例如可可脂和其它甘油酯）或用于直肠 递送的滞留型灌肠剂的形式制备。
[0115] 在一个实施方案中，活性化合物用保护化合物以防从体内快速消除的载体(例如 控释制剂，其包括植入物和微囊包封递送系统）制备。可使用生物可降解的、生物相容的聚 合物例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂 的方法对于本领域技术人员是显而易见的。所述材料也可从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc.商购获得。脂质体混悬液（其包括用针对病毒抗原的单克隆抗体革巴 向至被感染的细胞的脂质体）也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员 已知的方法(例如，描述于美国专利号4, 522, 811中的方法）而制备。
[0116] 特别有利的是，以容易给予和剂量均匀的剂量单位形式配制口服或肠胃外组 合物。本文使用的剂量单位形式是指适合作为待治疗的受试者的单一剂量（unitary dosages)的生理上分离单位；各单位含有预定量的活性化合物(其经计算以与所需的药物 载体联合产生所需治疗效果)。本发明的剂量单位形式的规格受控于并直接取决于活性化 合物的独特的特征和待达到的特定治疗效果，以及在配制这类活性化合物用于个体治疗的 领域中固有的限制。
[0117] 药物组合物可与用于给予的使用说明书一起包含于容器、包装或分配器中。
[0118] 诊断测丨定 本发明的huro-Li抗体，当连接至可检测的部分时，提供用于检测"癌性组织"或趋向 于异常的细胞增殖并由此处于癌风险中的组织的方法。除因原位新生物所致而变为癌性的 组织之外，例如，抗体-可检测部分缀合物还提供检测存在于远端器官和/或组织中的癌 性转移组织的方法。因此这类组织可通过如下检测：将怀疑为癌性的组织与抗体-可检测 部分在合适的条件下接触以引起可检测部分在癌性组织中被检测，由此检测癌性组织的存 在。
[0119] 本发明的huFO-Ll抗体，当连接至可检测部分时，提供在摧患癌症或慢性感染的 受试者中检测T细胞衰竭的方法。例如，huPD-Ll抗体可用于在受试者中检测I3D-Ll的水 平，其中与参考水平相比该水平可表明是否受试者正罹患T细胞衰竭。因此，此方法也可用 于确定是否治疗(其使用huro-Ll抗体通过逆转或抑制T细胞衰竭以提高免疫应答)会对受 试者有益。
[0120] 可检测部分可直接缀合至抗体或片段，或间接地通过使用例如荧光第二抗体而缀 合。直接缀合可通过例如荧光团至抗体或抗体片段的标准化学偶联或通过遗传工程改造完 成。可构建嵌合体或融合蛋白，其含有偶联至荧光或生物发光蛋白的抗体或抗体片段。例 如，Casadei等人描述了制备能够在哺乳动物细胞中表达水母素和抗体基因的融合蛋白的 载体构建体的方法。
[0121] 本文使用的关于探针或抗体的术语"标记的"，意图包括通过将可检测的物质偶 联（即，物理连接）至探针或抗体而直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂 的反应性而间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一 抗体和用生物素末端标记DNA探针使得它可用荧光标记的链霉亲和素检测。术语〃生物样 品〃意图包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体（例如活检样品），以及存在于受试者 中的组织、细胞和流体。即，本发明的检测方法可用于在体外的生物样品中和在体内检测癌 症、癌细胞或癌-相关细胞（例如与肿瘤或癌细胞相关的基质细胞）。例如，用于检测ro-Li 的体外技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。此外，用于 检测ro-Ll的体内技术包括向受试者引入标记的抗-PD-Ll抗体。例如，抗体可用放射性标 记物标记，所述放射性标记物在受试者中的存在和位置可通过标准成像技术检测。在实施 方案中，本发明提供在受试者中检测肿瘤或癌细胞的非侵入式方法。受试者被给予本发明 的抗体或scFv抗体，在将所述抗体连接至可检测部分（即，任何能够通过例如，荧光、化学、 化学发光、放射性或本领域已知的其它方法检测的部分）时，抗体被允许定位于肿瘤，随后 通过观察可检测部分而检测。
[0122] 在"靶向的"缀合物，即，含有靶向部分(设计用以在受试者或动物中在一个或多个 特定位点位点上定位缀合物的分子或特征）的缀合物的情况下，定位是指当在受试者内结 合的"定位的"实体和未结合的"自由"实体之间的平衡已经基本上达到时的状态。这类平 衡达到的速率取决于给予途径。例如，通过静脉内注射给予以定位血栓的缀合物在注射几 分钟内可实现定位或累积于血栓。另一方面，口服给予以定位肠内的感染的缀合物可花费 数小时以实现定位。备选地，定位可仅仅指在给予实体之后在选定的时间期限中该实体在 受试者或动物中的位置。通过另一实例的方式，当部分在给予之后变得分散时实现定位。
[0123] 在所有以上情况下，对实现定位的时间的合理估计可由本领域技术人员作出。此 外，作为时间函数的定位状态可根据本发明的方法(例如用光检测设备）通过对可检测部分 (例如，光-发射缀合物）成像而追踪（follow)。使用的"光检测设备"应该具有足够高的 灵敏性以能够在合理数量的时间内对来自哺乳动物内的微弱的光成像，并且使用来自这类 设备的信号构建图像。
[0124] 在其中有可能使用特别亮的光-产生部分和/或检测定位在被成像的受试者或 动物的表面附近的光-产生融合蛋白的情况下，可使用一副"夜视"护目镜或标准高灵敏 性视频照相机，例如Silicon Intensified Tube (SIT)照相机（例如，来自Hammamatsu Photonic Systems, Bridgewater, N.J·)。然而，更通常，需要更灵敏的光检测方法。
[0125] 在极低的光水平下，每单位面积的光子通量变得低，以至于成像得到的景物不再 表现为连续的。替代地，它表示为时间上和空间上都相距很远的单独的光子。在显示器上 观看，这类图像看起来和闪烁的光点一样，各自代表单个检测出的光子。通过这些检测出的 光子随时间推移在数字图像处理器中被积累，可获得和构建图像。与其中每一个像点的信 号都被赋予了强度值的传统相机相反，在光子计数成像中信号的振幅不带有任何意义。目 标在于仅检测信号(光子）的存在并计数随时间推移关于它的位置的信号的出现。
[0126] 至少两种类型的光检测设备（下面描述）可检测单独的光子并产生可由图像处理 器分析的信号。降噪光子检测设备通过降低光子检测器中的背景噪声，而不是放大光子信 号实现灵敏性。噪音主要通过冷却检测器阵列而降低。设备包括电荷耦合设备（CXD)照相 机，其被称为"后薄化的"、冷却的CCD照相机。在更灵敏的装置中，冷却使用例如，液氮(其 将CCD阵列的温度带到约-120°C)而实现。"后薄化的"是指超薄的后板，其缩短了路径长 度(光子沿其前进而被检测)，由此增强量子效率。特别灵敏的后薄化的低温CCD照相机为 "TECH 512"，从 Photometries, Ltd. (Tucson, Ariz.)可得的系列 200 照相机。
[0127] "光子放大设备"在光子撞击检测屏之前放大光子。这类包括带有增强仪的CCD照 相机，例如微通道增强仪。微通道增强仪通常含有与照相机检测屏垂直的和同延的金属通 道阵列。将微通道阵列放在待成像的样品、受试者或动物与照相机之间。进入该阵列的通 道的大多数光子在离开之前接触通道的一侧。横跨阵列施用的电压导致来自光子碰撞的许 多电子的释放。来自这类碰撞的电子以"散弹枪"的方式离开它们起点的通道，并通过照相 机检测。
[0128] 甚至更强的灵敏性可通过如下实现：增强型微通道阵列串联放置，使得在第一阶 段产生的电子依次在第二阶段中导致电子的放大信号。然而，灵敏性的增强以空间解析度 (其随着每一级额外放大而降低)为代价实现。范例性的基于微通道增强器的单光子检测设 备为从Hamamatsu可得的C2400系列。
[0129] 图像处理器处理由光检测设备产生的信号，所述光检测设备计数光子以构建图 像(其可例如在显示器上展示或在图像打印机上打印）。这类图像处理器通常作为系统(其 包括上面描述的灵敏光子计数照相机）的一部分出售，并因此从相同来源可得。所述图像 处理器通常连接至个人电脑（例如IBM-兼容PC或Apple Macintosh (Apple Computer, Cupertino，Calif.))，其可以或可以不被包括作为购买的成像系统的一部分。一旦图像呈 数字文件的形式，它们就可通过多种图像处理程序操作（例如"ADOBE PHOTOSHOP"，Adobe Systems, Adobe Systems, Mt. View, Calif.)和打印。
[0130] 在一个实施方案中，生物样品含有来自测试受试者的蛋白分子。一种优选的生物 样品是外周血白细胞样品，其通过常规方法从受试者分离。
[0131] 本发明还包括用于在生物样品中检测ro-Li或ro-Li-表达的细胞的存在的试剂 盒。例如，试剂盒可包括：能够在生物样品中检测癌或肿瘤细胞的标记的化合物或作用剂 (例如，抗-PD-Ll scFv或单克隆抗体）、用于在样品中检测H)-L1的量的工具和用于将样 品中F1D-Ll的量与标准作比较的方法。在一些实施方案中，所述标准是非癌细胞或其细胞 提取物。化合物或作用剂可包装在合适的容器中。试剂盒可进一步包括使用试剂盒以在样 品中检测癌症的说明书。
[0132] 双特异件抗体 双特异性抗体（bsAb)是抗体，其包含两个可变结构域或scFv单位使得所得抗体识别 两种不同抗原。本发明提供识别ro-Li和第二抗原的双特异性抗体。范例性的第二抗原包 括肿瘤相关抗原、细胞因子和细胞表面受体。在一些实施方案中，所述第二抗原可以是CAIX (碳酸酐酶IX或G250)、IL-10或CCR4。在一些实施方案中，所述第二抗原可以是细胞表面 受体，其中所述细胞表面受体是CCR4、IL21R、BTLA、HVEM或??Μ3。
[0133] 本发明的双特异性抗体包括本文公开的huro-Ll抗体的重链和轻链组合或scFv。
[0134] 双特异性抗体的构建 本发明的双特异性抗体可使用本领域已知方法构建。在一些实施方案中，所述双特异 性抗体是单个多肽，其中两个scFv片段通过长接头多肽(其长度足以允许两个scFv单位之 间的分子内缔合)连接以形成抗体。在其它实施方案中，双特异性抗体是通过共价或非共价 键连接的一个以上的多肽。
[0135] 在另一实施方案中，双特异性抗体使用"结进孔"法（Ridgway等人，Protein Eng 7:617-621 (1996))构建。在此方法中，将两个不同可变结构域的Ig重链还原以选择性地 破坏重链配对同时保留重链-轻链配对。将识别两个不同抗原的两个重链-轻链杂二聚体 混合以促进杂连接配对，所述杂连接配对通过CH3结构域的工程改造的"结进孔"介导（如 在图5