和6A中所示)。
[0136] 在另一实施方案中，双特异性抗体可通过如下构建：交换来自两个或更多个不同 抗体的重链-轻链二聚体以产生杂交抗体，其中第一重链-轻链二聚体识别ro-Li和第二 重链-轻链二聚体识别第二抗原。重链-轻链二聚体的机制与人IgG4 (其也发挥双特异 性分子的功能）的形成类似。IgG重链的二聚化受分子内的力（例如配对每条重链的CH3 结构域和二硫桥的分子内的力）的驱动。在CH3结构域中特定氨基酸的存在（R409)已经 表现出促进IgG4分子的构建和二聚体交换。重链配对也通过在抗体的铰链区中的重链间 的二硫桥而进一步稳定。具体地，在IgG4中，铰链区在氨基酸226-230含有氨基酸序列 Cys-Pro-Ser-Cys (与含有序列Cys-Pro-Pro-Cys的稳定的IgGl铰链区相比）。此229 位的丝氨酸的序列差异已经与IgG4在铰链区形成新链内二硫键的倾向关联起来（Van der Neut Kolfschoten, Μ·等人，2007，Science 317:1554-1557 和 Labrijn, A. F.等人， 2011, Journal of immunol 187:3238-3246)。
[0137] 因此，本发明的双特异性抗体可通过如下产生：在识别ro-Li或第二抗原的抗体 的CH3结构域中引入R409残基和铰链区中引入Cys-Pro-Ser-Cys序列，使得重链-轻链二 聚体交换以产生抗体分子，所述抗体分子具有识别ro-Li的一个重链-轻链二聚体和识别 第二抗原的第二重链-轻链二聚体，其中所述第二抗原是本文公开的任何抗原。优选地， 双特异性抗体含有与一个抗-CAIX (碳酸酐酶IX或250)重链-轻链二聚体缀合的一个 抗-PD-Ll重链-轻链二聚体，如实施例3和4中讨论。重链-轻链二聚体交换也可用还原 剂 (例如还原型谷胱甘肽)的加入而增强，以促进。还可改变已知的IgG4分子使得重链和轻 链如本文公开识别ro-Li或第二抗原。将此方法用于构建本发明的双特异性抗体可为有利 的，原因是IgG4分子的内在特性，其中Fc区与其它IgG亚型不同之处在于：它与免疫应答 的效应子系统(例如由某种白血细胞所表达的Fc受体和补体）相互作用差。此特性使得这 些基于IgG4的双特异性抗体对于治疗应用（其中需要抗体结合靶并功能上改变与靶相关 的信号转导通路，但不触发效应子的活性）而言为吸引人的。
[0138] 在一些实施方案中，将突变引入bsAb的恒定区以便改变bsAb的抗体依赖性细 胞-介导的细胞毒性（ADCC)活性。这类实例描述于图6B中。例如，突变是在CH2结构域 中的LALA突变。在一方面中，bsAb含有在杂二聚体型bsAb的一个scFv单位上的突变，其 降低ADCC活性。在另一方面中，bsAb在杂二聚体型bsAb的两条链上都含有突变，其完全 消除ADCC活性。例如，bsAb的一个或两个scFv单位引入的突变是在CH2结构域中的LALA 突变。可将具有可变ADCC活性的这些bsAb优化使得所述bsAb对表达被bsAb识别的一个 抗原的细胞展示出最大的选择性杀伤，但对被bsAb识别的第二抗原展示出最小的杀伤。
[0139] 范例性的第二抗原 本发明提供识别ro-Li和第二抗原的双特异性抗体。
[0140] 在一些实施方案中，第二抗原为肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原 是碳酸酐酶IX (CAIX)。例如，可构建CAIX/PD-L1双特异性抗体，其包含本文描述的huH)-Ll 抗体的一条重链和一条轻链的组合和识别CAIX的一条重链和一条轻链的组合（图5A)。 CAIX已经被描述为针对疾病进展的预后标志物和使用IL-2的免疫疗法的靶。CAIX为在癌 症(例如肾细胞癌)中高表达的肿瘤-相关抗原。在一些情况下，通过肿瘤细胞的roi/ro-Li 轴的活化可诱导针对某些肿瘤-特异性抗原(例如CAIX)的T细胞衰竭，由此表达CAIX的肿 瘤细胞逃避通过免疫系统的识别。靶向CAIX和ro-Ll两者的bsAb作为新的癌治疗剂。使 用CAIX/PD-L1 bsAb的治疗会抑制或逆转针对CAIX的ro-1/PD-Ll-介导的T-细胞衰竭， 并促进肿瘤监测和抗CAIX-表达肿瘤细胞的免疫应答。例如，用CAIX/PD-L1 bsAb的治疗 会促进抗肿瘤细胞的抗原-特异性免疫应答，其中所靶向的抗原是CAIX。
[0141] 在一些实例中，可将突变引入至CAIX或ro-Ll链恒定区中（例如，CH2结构域）以 降低ADCC活性（图5B)。在一些实例中，可将突变同时引入至CAIX和H)-L1链恒定区中以 完全消除ADCC活性。具有可变ADCC活性的突变的bsAb可针对它们杀伤肿瘤细胞的特异 性通过本领域已知的方法测定。优选地，CAIX/PD-L1 bsAb展现出对CAIX-表达肿瘤细胞 的最大选择性杀伤，但仅展现出对I3D-Ll-表达内源外周血单核细胞（PBMC)的最小杀伤。
[0142] 在一些实施方案中，第二抗原是细胞表面受体，其中所述细胞表面受体是白介素 21受体（IL21R)。例如，可构建IL21R/TO-L1双特异性抗体，其包括本文描述的huro-Ll抗 体的一条重链和一条轻链的组合和以竞争的方式结合IL21R的一条重链和一条轻链的组 合。细胞因子IL21由⑶4+ T辅助细胞分泌并结合至IL21R以促进多种免疫活化通路，特 别是，促进CTL的抗原-特异性细胞毒性和NK细胞的成熟、增殖和细胞毒性（Sondergaard， H 等人，2009 Tissue antigens 74:467-479 ;Kasaian, Μ· Τ·等人，2002 Immunity 16:559-569 ;和 Coquet, J. Μ·等人，2008 J Immunol 178:2827-2834)。特别地，IL21 已被显示促进抗黑色素瘤抗原的活化和细胞毒性能力（Li, Y.等人，2005，J Immunol 175:2261-2269)。全身给予IL21已被探究用于治疗癌症并已经显示一些功效（Schmidt, Η·等人，2010 Clinical cancer research, 16: 5312-5319)，但是，一些数据也已显不 有害的和不期望的副作用（Grunwald, V.等人，2011，Acta Oncol 50:121-126)。
[0143] 本发明的IL21R/TO-L1 bsAb以竞争的方式结合至IL21R，由此作为细胞因子IL21 的模拟物或替代物起作用。通过IL21R/TO-L1 bsAb的结合可导致IL21R-介导的通路的活 化和随后的对抗肿瘤细胞(其已诱导I3D-Ll-介导的T-细胞衰竭)的抗原-特异性细胞毒性 免疫应答的促进。用本发明的双特异性抗体治疗的一个具体的益处是将IL21R活化定位至 其中已经发生ro-1/PD-L1 -介导的T细胞衰竭的区域(例如，在肿瘤微环境中，例如在已经 诱导T细胞衰竭以逃避抗-肿瘤免疫应答的肿瘤附近或之内）。以此方式，ILR/ro-Ll bsAb 以以下双重机制促进抗-肿瘤免疫应答：1)通过逆转或抑制ro-1/PD-Ll-介导的T细胞衰 竭，和2)通过促进IL21/IL21R-介导的细胞毒性免疫应答的活化，由此诱导抗原-特异性 或抗-肿瘤免疫应答和细胞毒性。
[0144] IL21R/TO-L1双特异性抗体也可用于对受试者免疫接种的疫苗中，或用作疫苗佐 剂。在生发中心反应（GCR)(其中产生高-亲和性抗体-分泌浆细胞和记忆B细胞，其确 保持续的免疫保护和抗先前遇到的外来抗原的快速记忆应答）中，PDl由滤泡T辅助细胞 (TFH)表达同时F1DLl由生发中心B细胞表达（Crotty, S.等人，2011，Annual review of Immunology, 29:621-623)。PDl或PD-Ll的过量表达抑制抗体-产生B细胞的扩充。 iL2iR/ro-Li双特异性抗体(其中所述抗体的ro-Li部分抑制roi/ro-Li轴）的使用会导致 仅高亲和性抗体的优先扩充。由于IL-21强烈地促进抗原-特异性B细胞至抗体-分泌 楽细胞的转变，和TFH活性的形成和持续（Crotty, S.等人，2011，Annual review of Immunology, 29:621-623)，抗TOLl具有IL21替代或竞争活性的bsAb可充当关于促进抗 特定抗原(例如通过疫苗给予的抗原或感染物质的抗原）的高亲和性抗体产生的GCR-特异 性佐剂。
[0145] 在一些实施方案中，第二抗原是BTLA (B和T淋巴细胞弱化子蛋白）或HVEM (疱 疹病毒进入中介体，也称为TNFRSF14)。例如，可构建BTLA/PD-L1双特异性抗体，其包括本 文描述的huro-Ll抗体的一条重链和一条轻链的组合和结合BTLA的一条重链和一条轻链 的组合。例如，可构建HVEM/PD-L1双特异性抗体，其包括本文描述的huro-Ll抗体的一条重 链和一条轻链的组合和结合HVEM (优选地，结合至介导与BTLA的结合的HVEM的那些区域） 的一条重链和一条轻链的组合。BTLA至HVEM的结合导致T细胞抑制，这类似于H)l/ro-Ll 相互作用。本发明的BTLA/PD-L1或HVEM/PD-L1双特异性抗体会抑制或阻止BTLA与HVEM 之间的缔合，和阻止BTLA/HVE-介导的T细胞抑制。BTLA抑制促进肿瘤-特异性T细胞应 答。因此，使用本发明的双特异性抗体的治疗导致限制T细胞活性的两条不同的抑制因子 通路的同时阻断。
[0146] 在一些实例中，HVEM/PD-L1 bsAb抗体还阻止HVEM与另一 HVEM配体，CD160 (其 已被表明是针对B细胞慢性淋巴细胞白血病（BCLL)细胞的存活的激动剂，并且强烈地抑制 ⑶4+ T-细胞活化和功能）之间的缔合。使用本发明的HVEM/PD-L1双特异性抗体(其也阻 止HVEM/⑶160结合)的治疗导致两条抑制因子通路(其限制T细胞活性和抑制⑶160-介导 的肿瘤存活通路）的同时阻断。
[0147] 在一些实施方案中，第二抗原为TIM3(T-细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3)。例 如，可构建HM3/PD-L1双特异性抗体，其包括本文描述的huH)-Ll抗体的一条重链和一条 轻链的组合和结合TIM3的一条重链和一条轻链的组合。在一方面中，本发明的抗体阻止 或抑制??Μ3与半乳凝素-9 (GAL9)的结合。??Μ3与GAL9之间的相互作用导致巨噬细胞 的活化和 T 细胞功能的抑制（Sakuishi, K.等人，2010，The Journal of experimental medicine, 207:2187-2194 和 Zhang, Y.等人，2012，Journal of leukocyte biology, 91: 189-196)。??Μ3也已被表明促进骨髓衍生的抑制因子细胞（MDSC)的活性（Dardalhon， V.等人，2012 Journal of leukocyte biology, 185:1383-1392)。因此，使用本发明的 双特异性抗体(例如HM3/PD-L1 bsAb)的治疗会逆转和阻止T-细胞衰竭，促进肿瘤监测和 抑制MDSC的生成。HM3/PD-L1 bsAb的使用可特别有益于罹患具有??Μ3多态性的癌症(例 如肾细胞癌和转移性肾细胞癌）的受试者的治疗。
[0148] 本文公开的双特异性抗体可在疾病或医学病况(例如，癌症）的治疗中是有用的。 本发明的双特异性抗体可在与T细胞衰竭相关的疾病或医学病况中是特别有用的。在一些 情况下，可将本文公开的双特异性抗体用作用于促进抗原-特异性免疫应答的疫苗。本发 明的双特异性抗体靶向抑制T-细胞衰竭的肿瘤。
[0149] 治疗方法 本发明提供治疗处于(或易感于)癌症或其它细胞增殖-相关疾病或病症的风险中的受 试者的预防和治疗方法。这类疾病或病症包括但不限于，例如，与ro-Li的异常表达相关的 那些疾病或病症。例如，所述方法被用于治疗、预防或缓解肾细胞癌或乳腺癌的症状。备选 地，所述方法被用于治疗、预防或缓解癌症(其中ro-Li在τ细胞应答中发挥负调节作用)的 症状。备选地，所述方法被用于治疗、预防或缓解实体肿瘤(例如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列 腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌或胃癌)的症状。备选地，所述方法被用于治疗、预 防或缓解已转移的癌症的症状。
[0150] 本发明提供治疗处于(或易感于）慢性病毒感染、细菌感染或寄生虫感染风险中的 受试者的预防和治疗方法。特别是，本发明提供治疗处于(或易感于)HIV感染或AIDS的风 险中的受试者的预防和治疗方法。
[0151] 本发明还提供用于治疗处于与T-细胞衰竭相关的疾病或病症或病况的风险中的 或发展T-细胞衰竭的风险中的受试者的预防和治疗方法的治疗方法。本发明还提供用于 治疗处于与T-细胞衰竭相关的疾病或病症或病况的风险中或发展T-细胞衰竭的风险中 的受试者的预防和治疗方法的治疗方法。这类疾病或病症包括但不限于HIV、AIDS和慢性 的细菌感染、病毒感染或寄生虫感染。其它这类慢性感染包括由例如，乙肝病毒（HBV)、丙 肝病毒（HCV)、单纯疱疹病毒I (HSV-I)、幽门螺杆菌（汉或弓形虫（ goWii)弓丨起的那些。
[0152] 因此，在一方面中，本发明提供通过将本发明的单克隆抗体或scFv抗体给予受试 者用于在受试者中预防、治疗或缓解癌症或细胞增殖性疾病或病症的症状的方法。例如， huPD-Ll抗体可以治疗上有效的量给予。
[0153] 处于癌症或细胞增殖-相关疾病或病症风险中的受试者包括具有癌症家族史的 患者或暴露于已知或怀疑致癌的物质的受试者。预防药物的给予可发生在癌症的表现之 前，使得疾病被预防或，备选地，在其进展中被延缓。
[0154] 在另一方面中，通过将细胞与本发明的ro-Ll抗体接触而抑制肿瘤细胞的生长或 减弱抑制因子T细胞活性。所述细胞是表达ro-Li的任何细胞。例如所述细胞是τ细胞。
[0155] 增加或增强对抗原的免疫应答的方法也包含在本发明中。免疫应答通过对受试者 给予本发明的单克隆抗体或SCFv抗体而增加或增强。免疫应答例如通过提高抗原特异性 T效应子功能而被提高。抗原是病毒（例如HIV)抗原、细菌抗原、寄生虫抗原或肿瘤抗原。 免疫应答是天然免疫应答。天然免疫应答是指其为感染的结果的免疫应答。感染是慢性感 染。增加或增强对抗原的免疫应答可通过本领域已知的多种方法测量。例如，免疫应答可 通过测量以下任一项而测量：T细胞活性、T细胞增殖、T细胞活化、效应子细胞因子的产生 和T细胞转录特征。
[0156] 备选地，免疫应答是由于接种疫苗诱导的应答。因此，在另一方面中，本发明提供 通过对受试者给予本发明的单克隆抗体或scFv抗体和疫苗而增加疫苗功效的方法。所述 抗体和所述疫苗被序贯或同时给予。所述疫苗是肿瘤疫苗、细菌疫苗或病毒疫苗。
[0157] 鉬合方法 本发明提供通过给予两种抗体在患者中治疗癌症，所述两种抗体结合至ro-Li蛋白的 相同表位或，备选地，PD-Ll蛋白的两个不同表位。备选地，癌症通过给予结合至ro-Ll的 第一抗体和结合至除ro-Li之外的蛋白的第二抗体而治疗。例如，除ro-Li之外的其它蛋 白可包括但不限于CAIX、CCR4和IL-10。例如，所述除ro-Ll之外的其它蛋白是肿瘤-相 关抗原。
[0158] 在一些实施方案中，本发明提供huro-L 1抗体单独或与另外的抗体(其识别除 PD-Ll之外的另一蛋白）一起给予，其中细胞能够实现或提高免疫应答。例如，这些细胞可 为外周血单核细胞（PBMC)或存在于PBMC中的任何细胞类型，例如，细胞毒性T细胞、巨噬 细胞和天然杀伤（NK)细胞。
[0159] 另外，本发明提供结合至ro-Li蛋白的抗体和抗-肿瘤剂，例如小分子、生长因子、 细胞因子或其它治疗剂(其包括生物分子例如肽、肽模拟物、类肽、聚核苷酸、脂质-衍生的 介质、小生物来源的胺、激素、神经肽和蛋白酶)的给予。小分子包括但不限于无机分子和小 有机分子。合适的生长因子或细胞因子包括IL-2、GM-CSF、IL-12和TNF-α。小分子文库 是本领域已知的。（参见 Lam, Anticancer Drug Des.，12:145，1997·)。
[0160] 本发明将在以下实施例中进一步描述，所述实施例不限制描述于权利要求中的本 发明的范围。 实施例
[0161] 实施例1 :抗PD-Ll的人mAb的产生 抗人ro-Ll的人mAb通过对270亿个成分的人ScFv噬菌体展示文库淘选而产生。使 用呈顺磁性的脂蛋白体（PMPL)形式的全长ro-Li(这确保用于展示于文库的ro-Li的细胞 外结构域的正确定向)，鉴定出14个独特的结合ro-Ll的ScFv-噬菌体。针对这些14个独 特的 scFv-噬菌体构建人 IgG 构建体：Ab-14、Ab-16、Ab-22、Ab-30、Ab-31、Ab-32、Ab-38、 Ab-42、Ab-46、Ab-50、Ab-52、Ab-5、Ab-56 和 Ab-65。
[0162] 实施例2:结合至F1D-Ll的huFO-LI mAb的表征 huPD-Ll抗体的结合分析使用表达细胞进行。测试了四种类型的细胞，其包括 亲本细胞系300. 19和经转染表达人H)-L1 (hPD-Ll)、人TO-L2 (HPD-L2)和人C-型凝集素 结构域家族2成员（hCLEC2D)的细胞系。结合测定一式两份进行，结果概述在下表16-19和 图2中。通过使用四种抗体浓度：10 μg/ml、l μg/ml、0.1 μg/ml和0. 01 μg/ml测试抗 体亲和力。将GF1538和GF1757抗体用作对照：GF1538是抗hPD-Ll的人源化Ab和GF1757 是抗hPD-L2的人源化Ab。使用的第二抗体是PE-山羊抗-人IgG。所有值显示平均荧光 强度（GMFI)(如通过FAC分析所检测)。
[0163] 来自结合测定的结果表明受测试的huro-Li抗体表现出对于结合ro-Ll的高亲和 性和特异性。使用亲本细胞系300. 19 (其不表达人ro-Ll)作为对照，建立了基础的或非 特异性的荧光（表16和图2,左上）。通过用huro-Li抗体转染对表达人ro-Ll的300. 19 细胞的染色显示出明显较高的平均荧光强度（MFI)，这证明该抗体可结合至ro-Ll。明显的 FMI值(甚至在抗体的0. 01 μ g/ml的最低稀释度下)证明huro-Ll对结合ro-Ll蛋白的高 亲和力（表17A、17B和图2,右上）。当Huro-Ll抗体当在300. 19细胞中表达时展示出一 些结合人ro-L2或CLEC2D的能力（如由表18A、18B、19A、19B和图2,下部两张图所展示）。 不过，染色H)-L2和CLE2D所得的MFI值不如H)-L1获得的值高。此外，在较低稀释度下， 所述MFI值并不明显高于基础水平，这表明huro-Ll抗体不具有对ro-L2或CLE2D的高亲 和力或特异性。尽管少数huro-Ll抗体(例如Ab-42)展示了和TO-L2的一些交叉反应性， 但是该抗体具有明显更高的对ro-Li的亲和力和特异性。
[0164] 表16.使用huPD-Ll在未转染的300. 19细胞上染色
[0165] 表17B.使用huro-Ll在hPD-Ll-转染的300. 19细胞上染色，测定2结果。
[0167] 表18B.使用huro-Ll在hPD-L2-转染的300. 19细胞上染色，测定2结果。
[0169] 表19B.使用huH)-Ll在hCLEC2-转染的300. 19细胞上染色，测定2。
[0170] 实施例2:阻断HVPD-Ll结合的抗-PD-Ll的噬菌体-抗体的表征 进行竞争性FACS分析以表征通过抗-PD-Ll的噬菌体抗体对hPDl结合至hPD-Ll的抑 制。所有抗-M3D-Ll抗体呈噬菌体-scFv形式。用编码融合至人Fc区的人H)-L1的载体 (用于hPD-Ll-Fc的表达)转染293T细胞。在此测定中，将IO 12个噬斑形成单位（pfu)的噬 菌体-scFv与大约0. 25 mg/ml的可溶性hPD-1-hFc融合蛋白混合并随后加入至hPD-Ll-表 达的293T细胞。在洗涤之后，将细胞与FITC-抗-人IgG抗体一起孵育并通过FACS分析 以测量在细胞表面上hPDl-hFc与hPD-Ll的结合。
[0171] 荧光值通过FACS分析获得并用于生成对hPD-Ι结合至hPD-Ll+细胞的抑制百分 t匕。这些值展示于图3中。几乎所有的抗-PD-Ll噬菌体scFvs都表现出一些对hPD-Ι至 hPD-Ll 的结合的抑制能力。尤其，八13-14、413-16、413-30、413-31、413-42、413-50、41