，同时凸显出本发明所制备得到的多孔复合支架的品质，以下通过具体的实施 例进行举例说明。
[0032] 实施例1
[0033] S10,分别称取S10中所购买的A型聚乳酸微球10g、B型聚乳酸微球20g、C型聚乳 酸微球40g ;
[0034] 此实施例中采用的聚乳酸微球购买自西安瑞捷生物科技有限公司，分别包括三 种：孔径为200 y m、孔隙率为93%的A型聚乳酸微球；孔径为160 y m、孔隙率为81 %的B型 聚乳酸微球；孔径为100 ym、孔隙率为68%的C型聚乳酸微球；
[0035] S21，将步骤S10中所称取的聚乳酸微球全部置于大烧杯中，并向大烧杯中加入质 量体积分数为12%的己二胺/正丙醇溶液中；
[0036] S22,然后将步骤S21的烧杯置于在55°C水浴中反应15min后，去除反应残夜并用 去离子水充分洗涤聚乳酸微球以除去未反应的己二胺残留，之后再于_20°C下冻干备用；
[0037] S31，将步骤S22氨解完成之后的聚乳酸微球浸入1 %戊二醛水溶液中，常温中孵 育或者保持4h，然后用去离子水冲洗3~5次后，备用；
[0038] S32,制备纤维蛋白原（纤维蛋白原凝结固化之后即形成纤维蛋白凝胶）溶液：
[0039] 将新鲜的冰冻人血浆30h放置于-20°C的冰箱中冻存48小时，取出后放置于4°C 冰箱中18~24h ;当血浆中出现较多冰渣时，将此化冻的血浆转移至入50ml离心管中， 4°C、8000g的条件下离心30分钟；
[0040] 离心后，弃去上清液，用生理盐水溶解离心管底部的白色沉淀物，得到胶原蛋白原 溶液；其中，生理盐水的量添加按照沉淀物估算质量配制成10~40mg/ml浓度的纤维蛋白 原溶液；
[0041] S33,将步骤S31处理后表面醛基化的聚乳酸微球浸入步骤S32制备的纤维蛋白原 溶液中，然后4°C下放置24h，隔2h振荡一次。
[0042] 完成后，用超纯水对聚乳酸微球进行反复冲洗，洗涤干净后冻干备用；
[0043] S40,将步骤S33制备的接枝完成后的聚乳酸微球称重，大概按照聚乳酸微球：纤 维蛋白原质量比为1 :2的比例，用上述制备的纤维蛋白原在振荡器上震荡使聚乳酸微球均 匀分散在纤维蛋白原溶液中，然后加入适量的凝血酶并分散均匀后，放入37°C恒温烘箱中 孵育10分钟，使纤维蛋白原交联，形成凝胶后即获得微载体与纤维蛋白凝胶的复合支架。
[0044] 为了查看并验证本发明方法制备得到的复合支架的品质，采用冷冻-冻干的方法 处理复合支架，然后采用场发射扫描电镜进行观测；观测到的图像如图1所示，从图1中可 以看出，不同尺寸的微球随机地联系或者分布在凝胶内，相互之间有较大的孔隙。
[0045] 并且进一步为了与普通支架对比本发明的上述复合支架是否在一些要求高的细 胞3D培养中的效果，以下进行CIK的对比培养验证。
[0046] S50,制备通常的纤维蛋白凝胶支架：
[0047] 配制2000KIU/mL抑肽酶，取配制好的抑肽酶lmL溶解冻干纤维蛋白原，即得溶液 A；
[0048] 将凝血酶加入40mmol/LCaC12溶液中，配制出凝血酶浓度为250~400u/mL的溶 液B ;
[0049] 将溶液A和溶液B混合，在底面积为100mm2模具中制作成为圆柱形的复合物， 置37 °C保温lh，即得到通常的圆柱形的纤维蛋白凝胶支架（规格根据磨具的形状为 10*10*10mm3)，4°C冰箱保存备用。
[0050] S60,从血液中分离单个核细胞：
[0051] a.取100ml抗凝处理后的血液，将血液分别加入到4个50ml无菌离心管中，300g 离心10min，将所有的上层血楽;转移到2个新的无菌离心管中，56°C水浴灭活30min，再于 400g离心10min后，收集上层黄色液体即低血小板血衆（Poor Platelet Plasma，PPP)，4°C 储存备用；
[0052] b.向该4个下层含血细胞的离心管中加入注射用生理盐水，直到每管30ml混合 液，用移液器混匀，再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将血细胞混合 液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层，400g离心20min ;吸取中间白膜层（即单个核细 胞）至新的50ml离心管中，用生理盐水补液到45ml后，离心洗涤单个核细胞2次。
[0053] S70,采用步骤S50制备的普通纤维蛋白凝胶支架和本发明步骤S40制备的纤维蛋 白凝胶-聚乳酸微球复合支架用步骤S60获得的单个核细胞进行CIK培养，具体按照如下 步骤进行：
[0054] S71，将步骤S60中的细胞悬液进行离心，收集单个核细胞；然后将单个核细胞与 支架以lxl0 4:l的比例混合置于抗⑶3单克隆抗体（50ng/ml)和RetroNectin(10_50iig/ ml)预包被的培养瓶中，加入含1% PPP和50 y 1 1000IU/ml IFN-y的GTT551培养基；
[0055] S72,第2天，添加IL-1 a、IL_2,以上生长因子在培养基中的终浓度分别为100IU/ ml、300IU/ml ;
[0056] S73,第3天，补充培养基至总体积为100mL，同时添加IL-2,使其在培养基中的终 浓度维持在300IU/ml。以后每隔2-3天根据细胞生长情况进行扩增；
[0057] S74,第21天收获细胞。
[0058] 在该步骤S70中，分步骤S71中采用的支架分别用步骤S50制备的通常纤维蛋白 凝胶支架（命名为对照组）和本发明步骤S40制备的复合支架（命名为实验组）相互作为 对照，同时进行；然后分别在S74的培养结束之后，收获细胞，并进行如下测试：
[0059] 1、用ELISA试剂盒分析CIK细胞的细胞因子（TNF- a细胞因子和IFN- y细胞因 子），结果如下：
[0060]
[0061] 2、MTT(噻唑蓝，活细胞的线粒体可以产生琥珀酸脱氢酶，该酶可以使MTT还原为 不溶于水，却溶于DMS0的甲簪，死细胞则不能）检测活细胞数量：
[0062] 分别取21天的全部培养细胞（本发明中支架中填充有微球，需要将微球砸碎分离 细胞），分别分装在EP管中，加入40 y L 5mg/mLMTT和200 y L新鲜的培养基，并轻轻吹打， 使微球悬浮于染液中。避光于37°C、5% C02动物细胞培养箱中孵育4h反应结束后去上清， 加入300 y LDMS0振荡，lOOOOrpm高速离心5min。吸取200 y L上清，转移至96孔板，使用 酶标仪在490nm处测吸光值（0D值）。
[0063]
[0064] 从上述两项测试的结果中，在本发明实施例的培养要求或者生长条件要求非常苛 刻的免疫细胞CIK进行3D环境培养中，最终培养得到的细胞的数量和代谢量都远远要好于 常规的支架，本发明的支架具有显著的进步性，当然，本发明还可应用于干细胞的3D环境 中培养。
[0065] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 获取聚乳酸微球； 对所述聚乳酸微球进行表面氨解处理，获取氨解聚乳酸微球； 在所述氨解聚乳酸微球上接枝纤维蛋白原，获取接枝聚乳酸微球； 将所述接枝聚乳酸微球于纤维蛋白原溶液中固化凝结。2. 如权利要求1所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在于，获 取所述聚乳酸微球的步骤中，所述聚乳酸微球的粒径为60~250 y m。3. 如权利要求1或2所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在 于，获取所述聚乳酸微球的步骤中，所述聚乳酸微球包括三种粒径依次递增的第一粒径微 球、第二粒径微球和第三粒径微球。4. 如权利要求3所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在于，所 述聚乳酸微球中第一粒径微球：第二粒径微球：第三粒径微球为4~6 :2~3 :1。5. 如权利要求1或2所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在 于，对所述聚乳酸微球进行表面氨解处理的步骤为，将所述聚乳酸微球用己二胺进行表面 氨解处理。6. 如权利要求5所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在于，将 所述聚乳酸微球用己二胺进行表面氨解处理的过程中，所述己二胺的浓度为12~15% mg/ ITlL； 和/或，将所述聚乳酸微球用己二胺进行表面氨解处理的过程中，反应温度为50~ 60 0C ； 和/或，将所述聚乳酸微球用己二胺进行表面氨解处理的过程中，反应时间为10~ 15min〇7. 如权利要求1或2所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备方法，其特征在 于，在所述氨解聚乳酸微球上接枝纤维蛋白原的步骤包括： 将所述氨解聚乳酸微球用戊二醛溶液进行醛基化处理； 将醛基化后的所述氨解聚乳酸微球与纤维蛋白原反应。8. -种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架，其特征在于，所述纤维蛋白凝胶-聚乳酸 微球复合支架根据权利要求1至7任一项所述的纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架制备 方法制备。
【专利摘要】本发明提供了一种纤维蛋白凝胶-聚乳酸微球复合支架及其制备方法，方法包括：获取聚乳酸微球；对聚乳酸微球进行表面氨解处理；在氨解后的聚乳酸微球上接枝纤维蛋白原；将接枝有纤维蛋白原的聚乳酸微球于纤维蛋白原溶液中固化凝结。本发明的上述方法步骤，采用将聚乳酸微球作为共价内部基质对纤维蛋白凝胶支架进行填充，制备得到具有微球载体内填充的凝胶复合支架；通过微粒的填充一方面可以大大提高蛋白凝胶的强度，另一方面微球通过接枝之后，微球之间的凝胶孔隙、微球表面的相容亲和性也能相应大大提升；能够稳定地构成细胞生长的环境，以及便于营养和代谢产物的交换。
【IPC分类】A61L27/48, A61L27/50, A61L27/58
【公开号】CN105107026
【申请号】CN201510423060
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年7月17日