是PAMAM最外端氨基(N)与siRNA的磷酸基团(P)的数量之比:N/P。根据该PAMAM最外端氨基(N)与siRNA的磷酸基团(P)的数量之比的比值，就可计算出加入的PAMAM的量。
[0031]实施例3含有21个碱基对的双链siRNA的连接的PAMAM分子进一步与透明质酸连接，形成PAMAM/HA/s iRNA复合物体系。
[0032]为了达到siRNA药物的靶向性的目的，将透明质酸设计到药物载体。透明质酸是一种大分子粘多糖。透明质酸基本结构单元由两部分构成，N-乙酰-D氨基葡萄糖和D葡萄糖醛酸构成，是细胞外基质的主要组成成分。
[0033]配制溶液，使得透明质酸的负电荷和PAMAM的正电荷的物质的量之比分别为0.5，利用C/N表示HA的负电荷与PAMAM的正电荷的比例，其中，透明质酸(HA)用DPBS溶解，配制的浓度分别为0.4mg/ml，根据示HA的负电荷与PAMAM的正电荷的比例可进行PAMAM/HA/siRNA复合物体系的制备。
[0034]PAMAM/HA/siRNA复合物体系的具体制备过程如下:加入样品的顺序以及样品的制备过程如下:
[0035]步骤一:取I个Tube管，取8μΜ的siRNA 5μ1到Tube管中，使其C/N=l.0，其中C/N表示HA的负电荷与PAMAM的正电荷的比例；
[0036]步骤二:加入PAMAM，加入lml/mg的PAMAM的体积分别为3.73μ1。净置15min。
[0037]步骤三:加入HA，加入浓度为0.lmg/ml的HA量为6.8μ1。净置15min。
[0038]步骤四:向管中加入DPBS，使管中的体积相同为40μ1，最终形成PAMAM/HA/siRNA复合体系。
[0039]实施例4量子点与PAMAM/HA/siRNA复合体系中的透明质酸的连接
[0040 ] 将PAMAM/HA/s i RNA复合体系中透明质酸的羧基被DCC和NHS活化后与PEG- (NH2)2的一个氨基结合，得到(PAMAM/HA/siRNA)-PEG-NH2。具体方法如下:取一定量的PAMAM/HA/siRNA复合体系溶于ImL DMSO，搅拌下加入一定量的DCC和NHS^AlOOmg PEG-(NH2)2，室温反应2h。加入8mL水，过滤除去不溶物，上清液冷冻干燥，乙醚洗涤干燥物，得到(PAMAM/HA/siRNA)-PEG-NH2<XdSe量子点溶液经纯化后稀释于5 X 10—2磷酸纳缓冲液中，取适量(PAMAM/HA/siRNA)-PEG-NH2加入CdSe溶液中，室温下搅拌反应0.2h，形成量子点标记的PAMAM/HA/siRNA复合体系，即本发明的量子点标记的生物体siRNA药物载体系统，请配合参阅图1所示本发明的量子点标记的生物体siRNA药物载体系统的电镜照片图。
[0041 ]本发明将制备的带羧基的水溶性量子点与PAMAM/HA/siRNA复合体系中的透明质酸分子连接，而透明质分子又与PAMAM分子结合连接，PAMAM分子与含有21个碱基对的双链s i RNA的连接。这样，可以通过量子点的标记，追踪并显示标记的双链s i RNA的输送路径以及其作用的位置和靶点，更好的揭示双链siRNA作为药物靶标的干扰机理。
[0042]本发明是将荧光探针标记的药物载体系统与细胞(Hela)于无菌的条件下在培养基中共培养，每隔一段时间用焚光显微镜观察细胞内量子点的分布情况。
[0043]本发明可以根据不同的siRNA标记不同的量子点，由于量子点的尺寸、光谱特性各异，只需选用一种激发光源，就可以实现对不同性质的区域进行检测，从而大大简化了实际检测的过程，降低了对激光发射源的要求。同样的原理，量子点可以成为筛选siRNA、发现siRNA靶点在细胞位置的有力工具，并为药物作用机制的研究提供非常有价值的信息。通常，药物发生药效时，除了同靶分子结合外，还会与体内其他的一些分子结合，产生副作用，利用不同颜色荧光的量子点(或光谱编码微粒)，就可以高通量地、并行地研究与药物作用，包括革E分子在内的所有分子，省时、高效、灵敏度高。
[0044]以上仅为本发明的较佳实施例，当不得以此限定本发明实施的技术范围，因此凡参考本发明的说明书内容所作的简单等效变化与修饰，皆应仍属本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种量子点标记的生物体S i R N A药物载体系统，其特征在于包括一分子的P A M A M分子，该PAMAM分子上结合有一个含有21个碱基对的双链siRNA以及透明质酸分子形成PAMAM/HA/siRNA复合体系； 所述PAMAM/HA/siRNA复合体系中的透明质酸分子还连接PEG(NH2)2分子，该PEG(NH2)2与量子点连接形成量子点标记的生物体siRNA药物载体系统。2.根据权利要求1所述的量子点标记的生物体siRNA药物载体系统，其特征在于， 所述量子点为CdSe量子点，所述CdSe量子点上带有羧基，所述CdSe量子点通过该羧基与PEG(NH2)2上的氨基连接。3.根据权利要求1所述的量子点标记的生物体siRNA药物载体系统，其特征在于， 所述透明质酸通过静电吸引的作用与所述PAMAM分子结合。4.根据权利要求3所述的量子点标记的生物体siRNA药物载体系统，其特征在于， 所述透明质酸的电荷与所述PAMAM分子电荷比为0.4-0.6。5.根据权利要求1所述的量子点标记的生物体siRNA药物载体系统，其特征在于， 所述PAMAM溶解在pH为7的缓冲液中通过正负电荷之间的作用与双链s i RNA连接。6.根据权利要求1所述的量子点标记的生物体siRNA药物载体系统，其特征在于， 所述PAMAM/HA/siRNA复合体系中，透明质酸的羧基被DCC和NHS活化后与PEG-(NH2)2的一个氨基结合，得到(PAMAM/HA/s iRNA) -PEG-NH2。7.根据权利要求6所述的量子点标记的生物体siRNA药物载体系统，其特征在于， 所述量子点溶液经纯化后稀释于5 X 10—2磷酸纳缓冲液中，取适量(PAMAM/HA/siRNA)-PEG-NH2加入量子点溶液中，室温下搅拌反应0.2h，形成量子点标记的PAMAM/HA/siRNA复合体系。
【专利摘要】本发明公开了一种量子点标记的生物体siRNA药物载体系统，其特征在于包括一分子的PAMAM分子，该PAMAM分子上结合有一个含有21个碱基对的双链siRNA以及透明质酸分子形成PAMAM/HA/siRNA复合体系；所述PAMAM/HA/siRNA复合体系中的透明质酸分子还连接PEG(NH2)2分子，该PEG(NH2)2与量子点连接形成量子点标记的生物体siRNA药物载体系统。本发明开创性的将量子点PAMAM/HA/siRNA复合体系连接，增加了药物靶向位点的新方法，跟踪药物作用途径的新方法，其根据不同的siRNA标记不同的量子点，由于量子点的尺寸、光谱特性各异，只需选用一种激发光源，就可以实现对不同性质的区域进行检测，从而大大简化了实际检测的过程，降低了对激光发射源的要求。
【IPC分类】G01N21/64, A61K47/48, A61K31/713
【公开号】CN105477643
【申请号】CN201510961956
【发明人】杜文红
【申请人】杜文红
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月19日