)，210.6(C，22-C)，45.9(CH2,23-C)，37.1 (CH，24-C)，148.1(C，25-C)，109.4(CH 2,26-C)，19.3(CH3,27-C)，17.7(CH3,28-C)，24.4 (CH 3，29-C)，24 · 7(CH3，30-C)，16 · 3(CH3，31-C);碳原子标记参见图 1。咕 NMR谱显示五个甲 基单峰（δΗΟ · 93，Me-18; 1 · 68，Me-27;0 · 85，Me-28; 1 · 32，Me-29; 1 · 21，Me-30)，两个甲基双峰 (SH1.01，J = 6.6Hz，Me-21;0.93，J = 7.0Hz，Me-31)，一对顺式二取代的双键氢质子（δ 册.81，(1，了 = 9.8!^，!1-2;6.26，(1，了 = 9.8泡，!1-3)，一个末端双键（3邢.01，8，!1-26;4.79,8， 11-26)，以及一个含氧次甲基0!13.27，(1，1 = 6.3抱，!1-11)。13〇匪1?谱显示31个碳信号，分别 为七个甲基，八个亚甲基(一个为烯烃碳），七个次甲基(两个烯烃碳，一个含氧次甲基)和九 个季碳(一个酮羰基，三个烯烃碳，一个含氧季碳）。HMBC谱中，CH 3-29 (CH3-30)与C-3，C-4和 C-5，以及Η-2与C-l，C-4和C-10的相关性表明环Α为4，4-二甲基-2，5-二烯酮部分。HMBC谱 中，H2-19与C-l，C-10，C-5，C-9和C-8，H2-6与C-4，C-5，C-7，C-8和C-10的相关性，以及CH 2 (6) -CH2 (7) -CH⑶自旋系统，表明B环为取代的环庚烷。通过HMBC谱中CH3-31与C-23，C-24和 C-25的相关性，可知C-24位连有一个甲基。此外，CH3-27与C-24，C-25和C-26的相关性表明 C-25和C-26之间存在双键。C-9(SC62.7)和C-11(SC60.9)的化学位移表明两者各连有一个 羟基基团。综合氢谱，碳谱，HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确 定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致（图 2) 〇
[0025]实施例2:化合物（I)药理作用试验
[0026] -、材料和仪器
[0027] HL7702肝细胞株由中国科学院上海生命科学研究所提供。化合物（I)自制，方法见 实施例1，HPLC归一化纯度大于98%。高糖DMEM培养基、高糖DMEM/F12 = 1:1培养基、胎牛血 清均购于HycLoneJDTA购于上海试剂一厂。台盼蓝购于北京化工厂。无糖DMEM培养基购于 Gibco。胰酶、MTT、DMS0均购于Amresco。LDH释放法检测试剂盒购于GENMDE。ALT生化检测试 剂盒、AST生化检测试剂盒、LDH生化检测试剂盒均购于美国贝克曼试剂有限公司。Western 及IP细胞裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、MDA检测试剂盒均购于碧云天生物技术研 究所。
[0028] C02培养箱（SheL-Lab 2300)，电热恒温孵育箱（上海跃进医疗器械厂），缺氧培养 盒(长沙长锦科技有限公司），GasALert Extreme氧气检测仪(加拿大BW TechnoLogies)，酶 标仪（美国BioTek Epoch)，全自动生化仪（Beckman LX20)，离心机（德国Eppendorf centrifyge5415D)，孔板离心机（德国Eppendorf centrifyge 5430R)，电子微量天平 (METTLER TOLEDO AL104)，PH仪（Thermo ORION 3STAR)〇
[0029] 二、试验方法
[0030] 1、细胞分组
[0031] 将细胞分为6组，每组6个复孔：
[0032] (1)正常培养组(N组）：完全培养基，正常条件下培养；
[0033] (2)缺血再灌注组（IR组）：完全培养基正常条件培养lh后，模拟缺氧8h，再灌注4h;
[0034] (3)化合物（I)组：
[0035] RE 1 组：化合物（I) 0 · 5ng/mL预处理 1 h;
[0036] RE2 组：化合物（I) 5ng/mL 预处理 lh;
[0037] RE3组:化合物（I )50ng/mL预处理lh;模拟缺氧8h，再灌注4h;
[0038] (4)生理盐水组(NS组）：以与化合物（I)同等体积的生理盐水预处理1 h，模拟缺氧 8h，再灌注4h。
[0039] 2、化合物（I)的预处理
[0040] (1)化合物（I)的配制：将lmg化合物（I)溶解于500mL生理盐水中。移液枪吸取 2.5mL于第一支离心管中，用生理盐水稀释至10mL配制成浓度为500ng/mL的化合物（I)溶 液。从第一支离心管中吸取lmL至第二支离心管中，用生理盐水稀释至10mL配制成浓度为 50ng/mL的化合物（I)溶液。从第二支离心管中吸取lmL至第三支离心管中，用生理盐水稀释 至1 OmL配制成浓度为5ng/mL的化合物（I)溶液。作好标记。
[0041] (2)化合物（I)预处理：正常培养组和缺血再灌注组以每孔lOOyL新鲜的完全培养 基更换。RE1组每孔加入5ng/mL的化合物（I)溶液10yL和新鲜的完全培养基90yL，RE2组每孔 加入50ng/mL的化合物（I)溶液10yL和新鲜的完全培养基90yL，RE3组每孔加入500ng/mL的 化合物（I)溶液l〇yL和新鲜的完全培养基90yL。生理盐水组每孔加入生理盐水10yL和新鲜 的完全培养基90yL。轻轻摇动96孔板，使药液充分混混匀，放入C0 2培养箱中孵育lh。
[0042] 3、肝细胞体外模拟缺血再灌注损伤模型的建立：
[0043] (1)体外模拟缺血过程:预处理时间结束后，从细胞培养箱中取出第一块96孔板， 正常培养组每孔用1 OOyL完全培养基更换，放入C02培养箱中继续培养8h。从C02培养箱中取 出第二块96孔板，缺血再灌注组、化合物（I)预处理组和生理盐水组每孔用100yL无糖DMEM 培养基置换完全培养基，放入缺氧培养盒中，培养盒中放入盛有50mL灭菌水的无菌小瓶保 持饱和湿度。将缺氧培养盒放入37°C恒温孵育箱中，进气口连接94%N 2-5 %⑶2-1 %02混合 气体，出气口连接氧气检测仪。以2L/min的气体流量通入混合气体，当氧气检测仪显示出气 口氧气浓度〈1 %时，调节混合气体流量300mL/min维持出气口氧气浓度〈1 %。以此模拟缺血 过程8h。
[0044] (2)体外模拟再灌注过程:从C02培养箱中取出第一块96孔板，正常培养组每孔更 换100yL新鲜的完全培养基，放入C0 2培养箱中继续培养4h。从缺氧培养盒中取出第二块96 孔板，缺血再灌注组、化合物（I)预处理组和生理盐水组每孔用1〇〇此新鲜的完全培养基置 换无糖DMEM培养基，放入C0 2培养箱中正常条件下(37 °C、5 % C02、95 %空气、饱和湿度)培养 4h，模拟再灌注过程。
[0045] 3、指标检测
[0046] 3 · 1MTT法检测肝细胞活力
[0047] (l)MTT溶液配制：用电子微量天平称取250mg MTT，放入小烧杯中，加入50mL PBS 搅拌30min，使之充分溶解，即为浓度为5mg/mL的MTT溶液。在超净工作台中用0.22μπι的微孔 滤器除菌，分装为每支lmL，4 °C避光保存备用。
[0048] (2)细胞准备：按上述方法进行细胞分组，并另设调零孔。并按上述方法进行化合 物(I)预处理和体外模拟缺血再灌注过程。
[0049] (3)呈色：终末时间点每孔加入5mg/mL的MTT溶液20yL，放入37°C、5 %⑶2、95 %空 气、饱和湿度的C02培养箱中继续培养4h。终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入100yL DMS0溶液，微量振荡器上振荡1 Omin，使结晶物充分溶解。
[0050] (4)比色:选择570nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收度(A)，记录结果。实验重复 2次。
[0051 ] 3.2乳酸脱氢酶释放法细胞繁殖与毒性检测
[0052]按GENMED乳酸脱氢酶释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒说明书操作，重复2 次。
[0053] (1)按上述方法准备待测细胞，并另设无细胞的培养液（背景空对照孔)和未处理 的后续裂解的细胞(样品最大酶活性对照孔），作好标记。
[0054] (2)到规定的检测时间点前1小时，从C02培养箱中取出待测的96孔细胞培养板，加 入10yL GENMED裂解液到未处理的后续裂解的细胞孔里，同时加入10yL GENMED补充液到其 余所有检测孔里。放回C02培养箱中继续培养1小时即规定检测时间。
[0055] (3)从⑶2培养箱取出待测96孔细胞培养板，放入孔板离心机离心10min，速度为 250g〇
[0056] (4)分别小心移取50yL上清液到新的96孔板的相应孔里，同时作好