专利名称：一种降低胆固醇的基因工程菌和激活因子的发现及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种降低胆固醇的基因工程菌(Comamonas testosteroni)和激活因子的发现，该有效的工程菌株和激活因子可作为降低胆固醇的药物，饲料添加剂和非类固 醇的醛类和酮类杀虫剂的农药残留的清除剂应用。属于生物领域。
背景技术：
甾体类化合物水解酶(3aHSD)是Comamonas testosteroni菌体内关键酶，此酶主要的功能是有效地分解雌(留)稀二酮，5a 二氢睾丸酮，雄留酮，胆汁酸，类固醇等物 质，这些雌(留)稀二酮，5a二氢睾丸酮，雄留酮，胆汁酸，类固醇等物质，均来自于胆 固醇的代谢。
胆固醇的形成和代谢共有如下途径1.胆固醇作为细胞的结构成分。2.胆固醇 的生理转变在肾上腺皮质一皮质醇、皮质酮，醛固酮等调节糖盐代谢。在睾丸和卵巢 可转变雌(留)稀二酮，5a 二氢睾丸酮，雄留酮等类固醇。在肝脏胆固醇转化为胆汁 酸。人体胆固醇小部分来自食物，大部分由体内自行合成。正常情况下体内合成量可 自动调节，以保持一定的水平，过多过少都不利健康。但对中老年人，由于内分泌水平 的改变，或因精神过度紧张，体力活动减少，或患高血压、肥胖等病，脂质代谢失调， 使血清胆固醇增多，临床实践证明，当血浆总胆固醇高于200mg%时，随着胆固醇的升 高，动脉粥样硬化程度显著增加，冠心病发病率呈直线上升。许多资料表明，血浆总胆 固醇达时，冠心病的发病率比血浆总胆固醇为200mg%时高7倍，死亡率高2 倍。每降低的血浆总胆固醇浓度，就可相对降低2%的心脑血管病的危险性(包括发 病率、恶化率和死亡率)；每增加的血浆总胆固醇浓度，心脑血管病的危险性就会升 高约2%。人类天然缺欠是胆固醇的代谢中小肠黏膜缺乏调节机制，使得食物中大量的 胆固醇和类胆固醇淤积于血浆中，而这些类胆固醇代谢缓慢，大约20-30年才能代谢完 成，由此并发了血脂升高或动脉粥样硬化的后果。
本发明在Comamonas testosteroni染色质DNA中克隆出的一段DNA片段560bp编码了一种提高细菌活性片段蛋白，可以促进留体类化合物水解酶的基因表达，作为降低 胆固醇的药物，将3aHSD提取纯化制备肠溶型制剂，增加人类小肠对类胆固醇的调节， 将大量的β胆固醇等类固醇分解为C02和水，达到治疗高胆固醇血症的目的，预防动 脉硬化和心脏病。同时采用留体类化合物水解酶作为饲料添加剂和农药残留的清除剂应用。发明内容
C.testosterone, 3a HSD酶是一种可降解多种类固醇化合物的关键酶，能催化类胆固醇类化合物分解及非类固醇的醛类和酮类杀虫剂，分解杀虫剂的毒副作用.但是由于 3aHSD酶表达量甚微，很难达到应用的目的，本发明通过提高3aHSD酶基因的强启动子 重组，获得高3a HSD酶表达的菌株，具有明显的降低胆固醇和分解醛类和酮类杀虫剂作用，使本菌株得到生产应用.
首先将tac启动子基因克隆到克隆到质粒pK18的BamHI酶切位点中，再将激活 子基因克隆到tac启动子的下游构成PK^artw质粒。将此质粒整合到C.testosterone中， 得到变异株C.T.从而构建成为具有留体类化合物水解酶高表达基因得工程菌。
上述工程菌.主要特征为
(1)本工程菌具有独特的分解类固醇类化合物和脂肪的功能，用其表达产物可以 降低胆固醇类化合物，用于制备低胆固醇饲料添加剂和降低胆固醇药物.
( 在自然环境中，有许多的化学农药污染，本工程菌具有可以降低胆固醇类化 合物和非但固醇类醛类和酮类杀虫剂，净化环境.
实施方案
实施例1:
(1)用LB培养基培养工程菌，在培养基中加入20-30ug/ml卡那霉素，即可维持 3aHSD酶的高表达，从 而提高基因表达产物的水平。
(2)用本工程菌(Comamonas testosterone)0.1mlOD600nm = 1.0 时，提取的表达产物连续喂养小鼠2周，小鼠血液中胆固醇和甘油三酯含量与正常对照小鼠比较有降低 趋势.
图1.降低胆固醇的基因工程菌Comamonas testosteroni和激活因子基因重组原理图。将tac启动子基因克隆到克隆到质粒pK18的BamHI酶切位点中，再将激活子基因 克隆到tac启动子的下游构成质粒
图2.重组工程菌表达3aHSD酶电泳图片。
工程菌提高酶活性的菌
野生型菌未具有提高酶活性的菌
3 α-HSD:纯化的甾体类化合物水解酶
M 分子量标准条带
kDa 分子量
图3.重组工程菌表达3aHSD酶对市售牛奶胆固醇分解功能的检测图。
1，为未加3aHSD酶作用组，
2，3分别为3aHSD酶作用组，图中结果可以看出，牛奶中为加入3aHSD酶或具 有明显的分解胆固醇的作用，两个试验组和对照组结果，经统计学分析差具有显著性差 异(P < 0.01)。
权利要求
1.本发明是通过基因筛选和重组得到一种留体类化合物水解酶高表达工程菌株。
2.通过研究的得到高表达激活子变异株。
3.该工程菌株有效的提高微生物分解化学有害物质的能力。
4.使用工程菌表达产物具有特异性降低动物或人类血液中胆固醇含量的能力，因 此，用其表达产物可以制备降低固醇类化合物和脂肪的药物，也可以制备降低固醇类化 合物和脂肪的饲料添加剂和农药的污染清除。
全文摘要
本发明涉及一种降低胆固醇的基因工程菌的发现及应用，该菌株是通过高表达的3α-羟基固醇脱氢酶(甾体类化合物水解酶)(3a-Hydroxysteroiddehydrogenase，3a-HSD具有特异性降低动物或人类血液中β胆固醇含量的能力，用其表达产物可以制备降低固醇类化合物的药物，也可以制备分解非类固醇的醛类和酮类杀虫剂固醇类化合物清楚农药残留和低β胆固醇的饲料添加剂。属于生物领域。本研究采用基因工程方法和高效液相色谱等手段得到高表达的3α-羟基胆固醇脱氢酶菌株，可提高胆固醇的分解，应用于药物研究和动物饲料添加剂。
文档编号A62D101/04GK102021136SQ20091019218
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者任政华, 霍泽仁 申请人:任政华, 霍泽仁