本发明涉及一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法。
背景技术：
现有技术中，碳纳米粒子，是一种可发光的纳米级物质，与有机染料和量子点相比，具有表面效应、尺寸效应，而且具有较高的荧光稳定性，和良好的生物相容性以及低毒性等优点，因此，在抗氧化领域拥有广阔的应用前景，碳纳米粒子基团的差异性，导致碳纳米粒子的多样性。
目前，碳纳米粒子的制备方法总结起来化学合成和生物制备，化学合成方法主要为自上而下和自下而上方法为自上而下的制备法往往需要严格的反应条件，实验材料、仪器要求均高，导致材料的成本高，不能生产化，应用范围窄；自下而上的合成方法则需要热解或碳化适合的前驱物直接合成碳纳米粒子，原料本身易获得，且无毒无害，反应条件简单，设备要求低，产品得率高，粒径大小统一，量子产率高；1954年，harman博士提出了著名的“自由基理论”，认为许多严重疾病的根源是氧化应激引起的自由基和氧化损伤，自由基和活性氧（ros）是通过在生物有氧呼吸过程中身体正常反应产生的，其可以发挥诸如信号作用的多种功能并提供针对感染的防御，然而，许多疾病包括癌症、心脑血管疾病已经被证实是自由基对脂质，蛋白质和核酸造成损伤的后果，抗氧化剂由于可以保护生物系统免受氧化应激等慢性疾病，因此，可发挥重要保健作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法，包括以下具体步骤：
a、将动物肉组织切成薄片放入预热好的烤箱内，烤制一定时间；
b、冷却后，用有机溶剂浸泡，并通过搅拌得到溶有纳米粒子的溶液；
c、通过过滤，去除溶液里的可见杂质；
d、去除溶剂后向残余物中加入蒸馏水，充分溶解后加入有机溶剂萃取，取水层，得到较高纯度的纳米粒子水溶液；
e、将上一步中的纳米粒子水溶液放入透析袋中，室温下在蒸馏水环境下透析，或体积排阻凝胶层析纯化，纯化后的纳米粒子溶液经过冷冻干燥后即得纳米粒子粉末。
所述步骤a中的动物肉组织包括并不限于羊肉、牛肉、鸡肉、猪肉、鱼肉或鸭肉家禽畜牧类动物。
所述步骤a中的烤箱温度控制在100-400℃，烤制时间控制在10-60min。
所述步骤b中的有机溶剂为乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯中的一种或几种，有机溶剂使用量为原料重量的10-20倍，在搅拌下浸泡时间为12-36h。
所述步骤d中除去溶剂的方法包括并不限于常压蒸馏、减压蒸馏或薄膜蒸发，至溶剂完全除净，残余物使用其10-100倍重量的蒸馏水溶解。
所述步骤d中萃取使用的有机溶剂包括并不限于三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸乙酯，有机溶剂与水溶液萃取比例为2-10:1，萃取次数在2-8次。
所述有机溶剂与水溶液萃取比例优选为4-5:1。
所述步骤e中的透析袋规格为500da-3500da。
所述透析袋规格优选为3500da。
所述体积排阻凝胶包括交联葡聚糖、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种或几种。
本发明一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法，制备的纳米粒子有清除自由基的能力，使用的纳米粒子是用动物肉组织烤制形成的，原料易得，其制备过程简易，使用的仪器操作简单，易于大规模应用。
附图说明
图1是本发明一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法实施例一制备的纳米粒子的透射电镜照片。
图2是本发明一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法实施例一制备纳米粒子的粒径分布图。
图3是本发明一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法实施例一制备纳米粒子的紫外荧光光谱图。
图4是本发明一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法实施例一制备纳米粒子的荧光寿命图谱。
图5是本发明一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法实施例二羟基自由基与dmpo加成产物的esr图谱。
图6是本发明一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法实施例二制备纳米粒子对羟基自由基清除情况图。
图7是本发明一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法实施例三中dpph的esr图谱。
图8是本发明一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法施例三制备纳米粒子对dpph自由基清除情况。
图9是本发明一种具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法实施例四制备纳米粒子对hepg2细胞的保护作用。
具体实施方式
如图1至图9所示，具有清除自由基能力的纳米粒子的制备方法，包括以下具体步骤：a、将动物肉组织切成薄片放入预热好的烤箱内，烤制一定时间，动物肉组织包括并不限于羊肉、牛肉、鸡肉、猪肉、鱼肉、鸭肉等家禽畜牧类动物，烤箱温度控制在100-400℃，烤制时间控制在10-60min；b、冷却后，用有机溶剂浸泡，并通过搅拌得到溶有纳米粒子的溶液，有机溶剂为乙醇、甲醇、乙醚、乙酸乙酯中的一种或几种，有机溶剂使用量为原料重量的10-20倍，在搅拌下浸泡时间为12-36h；c、通过过滤，去除溶液里的可见杂质；d、去除溶剂后向残余物中加入蒸馏水，充分溶解后加入有机溶剂萃取，取水层，得到较高纯度的纳米粒子水溶液，除去溶剂的方法包括并不限于常压蒸馏、减压蒸馏、薄膜蒸发等。至溶剂完全除净，残余物使用其10-100倍重量的蒸馏水溶解，萃取使用的有机溶剂包括并不限于三氯甲烷，二氯甲烷，乙酸乙酯等，有机溶剂与水溶液萃取比例为2-10:1，更好在3-6:1，最佳在4-5:1，萃取次数在2-8次；e、将上一步中的纳米粒子水溶液放入透析袋中，室温下在蒸馏水环境下透析，或体积排阻凝胶层析纯化，纯化后的纳米粒子溶液经过冷冻干燥后即得纳米粒子粉末，透析袋规格为500da-3500da，最佳为3500da，体积排阻凝胶柱包括sephadex交联葡聚糖、sepharose琼脂糖凝胶、bio-gelp聚丙烯酰胺凝胶中的一种或几种。
实施例一，制备纳米粒子：以羊肉为原材料，放入预热好的200℃烤箱内烤制30min，待肉冷却后，将肉取下用无水乙醇（肉：无水乙醇=1:20）浸泡24h，同时通过磁力搅拌使纳米粒子充分被提取出来，得到具有纳米粒子的醇溶液，用布式漏斗过滤，去除溶液里的固体杂质，使用旋转蒸发仪除净乙醇，残余物用蒸馏水复溶，用二氯甲烷萃取（上述溶液：二氯甲烷=1:4），取上清液，得到较高纯度的纳米粒子水溶液，将纳米粒子溶液放入截留分子量为3500da的透析袋中，室温下在2000ml蒸馏水环境下透析3天，取透析袋外环境溶液，经真空冷冻干燥后，得到高纯度的纳米粒子粉末，将少量所得的纳米粒子溶于蒸馏水后，在可见光下为无色，在365nm激发紫外灯照射下产生强烈的蓝色荧光，通过透射电镜（tem）观察到（如图1），经200℃烤制的羊肉所提取的纳米粒子，具有良好的分散性和类球形结构，这些纳米粒子的尺寸分布相对较窄，基于100个颗粒的统计分析，大部分在1.2-5.7nm范围内，平均尺寸约为2.78nm（如图2），检测紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，表征从200℃烤羊肉中提取的纳米粒子的光学性质，在紫外-可见吸收光谱中观察到约260nm处的吸收带，其与c=c的n-π*跃迁有关（如图3），当在300-400nm的范围内激发时，纳米颗粒发射约400-450nm的荧光，如图3所示，纳米粒子的最大荧光激发波长和发射波长为330nm和494nm，在室温下分散在水溶液中的纳米粒子的荧光衰减曲线平均寿命为8.2ns（如图4）。
实施例二，纳米粒子清除羟基自由基的能力：依次将ph7.4,pb缓冲液(0.15moll-1)38μl，39μl不同浓度的200oc样品溶液，dmpo(1moll-1)5μl，edtana2-feso4(6mmoll-1)10μl，及h2o2(6%)8μl，混合均匀，至于40oc水浴30min后立即吸入毛细管中，将毛细管放入核磁管，在电子自旋共振波谱仪的谐振腔内进行扫描，用蒸馏水代替样品溶液作为空白对照，且图谱中第二个峰的峰值表示自由基的相对强度，并用下列公式计算清除率：清除率=(a0-a)/a0×100%其中a0：空白的峰值，a：样品的峰值，不同浓度的纳米粒子溶液对羟基自由基的清除作用的esr图谱及清除率如图5和图6所示，从图中可以看出随纳米粒子浓度的增加，峰值在逐渐降低，体现了清除能力与浓度有直接的关系，当纳米粒子浓度达8mgml-1时，羟基自由基清除率达21%。
实施例三，纳米粒子清除dpph自由基的能力：依次加入20μlpb缓冲液(ph6.0，0.1moll-1)，10μl不同浓度300oc样品溶液，20μldpph(200μmoll-1)，混合均匀，避光保存30min，2000×g条件下离心10min，用毛细管吸取上清液并放入核磁管，在电子自旋共振波谱仪的谐振腔内进行扫描，用无水乙醇代替样品溶液作为空白对照，且图谱中第三个峰的峰值表示自由基的相对强度，并用下列公式计算清除率：清除率=(a'0-a')/a'0×100%其中a'0：空白的峰值，a'：样品的峰值，不同浓度的纳米粒子溶液对dpph的清除作用的esr图谱及清除率如图9所示，从图中可以看出随纳米粒子浓度的增加，峰值在逐渐降低，体现了清除能力与浓度有直接的关系，当纳米粒子浓度达8mgml-1时，dpph清除率达100%。
实施例四，纳米粒子对细胞内氧化胁迫损伤的保护：取350oc纳米粒子干样品，用mem完全培养基配制成5mgml-1的溶液；取30%过氧化氢溶液，用mem完全培养基配制成1400mm的溶液，用mem完全培养基将细胞密度调整至105个ml-1，将调整好密度的细胞液置于96孔细胞培养板中，在37oc下培养24小时，在所述96孔培养板中加入适量1400mm过氧化氢溶液，使其浓度为700mm，同时向96孔培养板中加入适量纳米粒子溶液，使不同孔中纳米粒子浓度分别为0，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0mg·ml-1，将上述96孔培养板再置于原培养箱中继续培养2小时，加入20μl的mtt溶液(5mgml-1)，继续培养3小时后取出96孔培养板，吸去孔内所有溶液，加入150μl的dmso，立即振荡15分钟，使用酶标仪于570nm激发光下检测各孔内溶液的吸光度，h2o2已经被广泛作为氧化应激诱导剂应用于细胞模型中，这是由于它易穿过细胞膜，并产生大量的高活性的羟基自由基，与大分子发生反应，例如dna，蛋白质，脂质等，最终导致细胞死亡，分别以不同浓度的纳米粒子处理经h2o2氧化损伤的细胞，并对细胞存活率进行测定，结果如图所示，与空白对照相比，采用0.70mm的h2o2处理时，细胞存活率显著降低至40%，以不同纳米粒子处理氧化损伤细胞后，细胞存活率随纳米粒子浓度的增加而提高，最高升至50%，说明纳米粒子可以有效改善细胞的氧化损伤，具有良好的抗氧化性能。