专利名称：SEA突变基因及其与ScFv基因的融合蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于制药领域，具体地说是超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的突变基因及该突变基因seam与抗黑色素瘤单链抗体(ScFv)融合基因在大肠杆菌中的表达和应用。
背景技术：
超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)作为一种有效的免疫调节剂和增效剂，能够通过激活肿瘤特异性T淋巴细胞，达到排斥肿瘤的目的。天然的SEA编码基因存在较多的稀有密码子，在大肠杆菌中表达时表达量低；并且，其对肿瘤细胞的杀伤缺乏选择性，不仅能够杀伤MHCII类分子阳性的肿瘤细胞，对正常的机体细胞也会产生一定的杀伤作用。因此，对SEA基因[蛋白]进行改造提高其表达量，赋予SEA靶向性，把活化的T细胞限定在肿瘤局部，降低对机体的毒副作用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种高表达的SEA突变基因及其与ScFv基因的融合蛋白的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为SEA的突变基因具有序列表SEQ ID NO1中的碱基序列。
序列表SEQ ID NO1中的基因可与抗肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段基因融合，构建重组免疫毒素；所述的抗肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段基因为HB8759，其具有序列表SEQ ID NO2中的碱基序列；所述融合基因具有序列表SEQ ID NO3中的碱基序列。
突变SEA前体蛋白基因的694-714碱基之间的稀有密码子，实现sea基因的高表达，并将突变后的seam基因与基因工程技术改造的不同抗体或抗体片断基因融合，开展抗体导向的SEA抗肿瘤研究；例如抗黑色素瘤单链抗体HB8759，抗VEGF受体抗体，抗HER-2抗体等。
本发明具有如下优点1.sea的突变的位点较少，限定在694-714碱基之间、两个相邻的AGG及其附近的稀有密码子，没有改变天然蛋白的氨基酸序列，实现了较高的蛋白表达。
2.构建了抗黑色素瘤单链抗体噬菌体库，用固相抗原筛选出了具有较高亲和活性的单链抗体，完成抗体的小型化，为开展抗黑色素瘤靶向治疗研究提供了有效载体。单链抗体与完整的抗体分子相比具有分子量小，免疫原性低，穿透性强，在癌组织中分布均匀，易和毒素及其它效应分子连接等多种优点，因此应用前景更广泛。
3.抗体片断-SEA融合蛋白将抗体的导向作用和SEA激活大量T细胞的功能合二为一。既能提高SEA定向结合到肿瘤细胞的能力[靶向性强]，又可以克服大分子单抗不易渗透到肿瘤组织的不足，比单纯的SEA抗肿瘤效果更明显、更稳定。
图1为sea突变基因在工程菌中的细胞全蛋白电泳图谱。其中M为中分子量蛋白marker，1为E.Coli JM109(DE3)空菌落，2为工程菌全蛋白电泳。
图2为复性纯化后的ScFv-SEA融合蛋白电泳图谱。其中1为中分子量蛋白marker，2为包涵体中的ScFv-SEA融合蛋白，3为纯化、复性后的ScFv-SEA融合蛋白。
具体实施例方式
实施例1一种sea的突变基因，具有序列表SEQ ID NO1所示的碱基序列(其中SEA的信号肽基因用下划线标出)atgaaaaaaa cagcatttac attactttta ttcattgccc taacgttgac aacaagtcca60cttgtaaatg gtagcgagaa aagcgaagaa ataaatgaaa aagatttgcg aaaaaagtct 120gaattgcagg gaacagcttt aggcaatctt aaacaaatct attattacaa tgaaaaagct180aaaactgaaa ataaagagag tcacgatcaa tttttacagc atactatatt gtttaaaggc240ttttttacag atcattcgtg gtataacgat ttattagtag attttgattc aaaggatatt300gttgataaat ataaagggaa aaaagtagac ttgtatggtg cttattatgg ttatcaatgt360gcgggtggta caccaaacaa aacagcttgt atgtatggtg gtgtaacgtt acatgataat420aatcgattga ccgaagagaa aaaagtgccg atcaatttat ggctagacgg taaacaaaat480acagtacctt tggaaacggt taaaacgaat aagaaaaatg taactgttca ggagttggat540cttcaagcaa gacgttattt acaggaaaaa tataatttat ataactctga tgtttttgat600gggaaggttc agaggggatt aatcgtgttt catacttcta cagaaccttc ggttaattac660gatttatttg gtgctcaagg acagtattca aataccctgt tacgtatcta tcgtgataat720aaaacgatta actctgaaaa catgcatatt gatatatatt tatatacaag ttaa 774(1)SEQ ID NO1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度774碱基对*类型核酸*链型双链*拓朴结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌肠毒素A(拉丁文名称Staphylococcusaureus)(2)sea基因全序列的扩增从金黄色葡萄球菌肠毒素A标准菌株STS基因组中通过PCR扩增sea基因全序列。扩增引物为SEA F5′TAGAGGAGGGCAAAATGAAAA3′和SEA R 5′TGTTTAACTTGTATATAATA3′。
扩增条件为第一阶段97℃，1分钟；第二阶段95℃，40s；40℃，30s；72℃，30s；共30个循环；第三阶段72℃，5分钟。PCR产物与pUC19-T载体连接，连接物转化E.coli DH5α，重组质粒命名为pUC19-sea。感受态的制备，电击转化方法，质粒DNA的提取鉴定按《分子克隆试验指南》[J.萨姆布鲁克，1998]中的方法操作。
(3)sea基因突变位点的引入拟突变的sea位点是232，233，235，236，238位。232ACA→ACC；233CTA→CTG；235AGA→CGT；236ATA→ATC；238AGA→CGT。设计两组PCR引物，每组含一条带突变碱基的引物。
第一组SEA F5′ATGAATCCATATGAAAAAAACAGCATTTAC 3′Mu R5′ACGATAGATACGTAACAGGGTATTTGAATAC 3′第二组Mu F5′ACCCTGTTACGTATCTATCGTGATTAATAAAAC 3′SEA R5′GGAAGCTTCTATTAACTGGTATAT 3′以pUC19-sea为模板，以第一组引物扩增出715bp，第二组引物扩增出94bp小片断。第一组引物扩增的条件为97℃ 1分钟；95℃ 40s，45℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃延伸5分钟。第二组引物扩增条件为97℃ 1分钟；95℃ 40s，24℃ 30s，72℃ 15s，30个循环；72℃延伸5分钟。将两片断混合加入dNTP，pfu酶，pfu buffer，97℃ 1分钟；95℃ 40s，50℃ 30s，72℃ 1分钟，3个循环，再加入SEA F和SEA R引物，按sea扩增条件进行30个循环，电泳回收PCR产物。
(4)seam基因工程菌的构建seam基因的PCR产物用NdeI和HindIII双酶切、连到同样双酶切的7ZTS载体(参见中国专利申请02109681.3)上，转化E.coli JM109(DE3)，重组质粒命名为7ZTS-seam。
工程菌中seam的表达参见附图1所示；工程菌的细胞全蛋白电泳图谱中有一明显表达带，分子量约29000dalton；OD560薄层扫描显示此表达蛋白占菌体总蛋白的40％。
seam基因测序(采用双脱氧末端终止法)结果证实，seam的突变位点完全正确。
实施例2抗黑色素瘤单链抗体的构建与筛选，具有序列表SEQ ID NO2所示的碱基序列caggtgaagc tgcaggagtc aggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aattactgga tgaactgggt ccgccagtct120ccagagaagg ggcttgagtg gattgcagaa attagattga aatccaataa ttttgcaaga180tattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt240gtctacctgc aaatgatcaa cctaagagct gaagatactg gcatttatta ctgtaccagt300tatggtaact acgttgggca ctattttgac cactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc360tcctcatgtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacattgag420ctcacccagt ctccaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc480aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcctggtatc aacaaaaacc agggcaatct540
cctgaaccac tgcttttctc ggcatcctac cgttacactg gagtccctga tcgcttcaca600ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca atgtgcagtc tgaagacttg660gcagagtatt tctgtcagca atataacagc tatcctctga cgttcggtgg aggcaccaag720ctggaaatca aacgg 735SEQ ID NO2的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度735碱基对*类型核酸*链型双链*拓朴结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源杂交瘤细胞株HB8759(英文名称hybridoma cell)根据已发表的小鼠可变区序列的保守性，参照最新分子克隆实验手册，合成了可变区的通用引物。(B＝C/T D＝A/G/T H＝A/C/T V＝A/C/G K＝G/TM＝A/C R＝A/G S＝C/G W＝A/T X＝C/T)VHfor 5’ TGA GGA GAC GGT GAC GGT GGT CCC 3’VHBack5’ CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG 3’VLfor 5’ CCG TTA GAT CTC CAR BTT KGT SCS 3’VLBack5’ GAC ATT CAG CTG ACC CAG WCT SMH 3’Linkerfor 5’TGG AGA CTG GGT GAG CTC AAT GTC 3’LinkerBack5’GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 3’加SfiI酶切位点引物5’GTC CTC GCA ACTGCG GCC CAG CCG GCCATG GCCSfiICAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG 3’加NotI酶切位点引物5’GAG TCA TTC TGC GGC CGC CCGTTT GAT TTC CAGNotICTT GGT GCC 3’(1)提取杂交瘤细胞的总RNA。
(2)反转录成cDNA第一链。
(3)以cDNA为模板，分别用轻、重链可变区引物扩增抗体轻、重链可变区(VH、VL)基因。PCR扩增条件为95℃ 1分钟；94℃30s，57℃30s，72℃ 30s，30循环；72延伸10min。回收VH，VL扩增产物。
(4)按[Expression Module/Recombinant Phage Antibody System]说明，将VH、VL DNA和linker-Primer等摩尔混合，按94℃ 1min，63℃ 4min，7个循环进行重叠PCR反应，将全套的VH、VL拼接为ScFv cDNA；加入带SfiI和NotI限制性酶切位点引物，按94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，30循环，72℃保温10min进行聚合酶联反应，在ScFv DNA的两端分别引入SfiI位点和NotI位点。
(5)单链抗体基因用用SfiI及NotI两步酶切，并与相同酶切的pCANTAB5E载体连接，连接产物转化感受态的E.coliTGI；(6)噬菌体单链抗体文库的制备和筛选；用LB收集全部转化菌落，1∶100接种于10ml的2×YT-G(2％G)中，37℃摇1h，加入氨苄青霉素(100ug/ml)和4×1010pfu的辅助噬菌体M13K07，37℃摇1h，离心弃上清。沉淀用2×YT-AK(氨苄青霉素100ug/ml，卡那霉素70ug/ml)重悬，37℃培养过夜，离心取上清。0.2倍体积20％的PEG8000/2.5mol/LNaCl沉淀噬菌体。适量的2×YT培养基溶解沉淀，过滤除菌。
(7)抗原的亲和富集向长满LiBr黑色素瘤细胞(表达相关抗原)的平皿中加入含10％脱脂奶粉的PBS封闭缓冲液，37℃封闭30分钟。加入上面制备的重组噬菌体6ml，37℃孵育90分钟。PBS充分洗涤10次，每次3min。再用0.1％Tween20-PBS洗涤10次，每次3min。加入4ml对数生长期的大肠杆菌TG1，37℃感染1小时。取100ul铺SOBAG平板(1∶1、1∶10)，37℃培养过夜，待长出菌落后酶切鉴定，并用2×YT-AG培养基从SOBAG平板上洗下菌液，然后按f步骤重新制备重组噬菌体，再进行“吸附-洗脱-扩增”，重复3轮。
(8)细胞ELISA筛选从三轮筛选后涂布的平板上随机挑取30个单克隆，加入5ml的2×YT-GA中摇至OD600＝0.8(3-4h)，加入4×1010pfu的M13K07辅助噬菌体，37℃摇2小时，离心弃上清，2×YT-AK重悬，培养过夜，离心取上清用10％的脱脂奶粉封阻后，取100ul加入包被有LiBr细胞并被封闭的96孔酶标板中，37℃反应1小时，用PBS充分洗涤，加入100ulHRP标记的抗M13K07噬菌体VIII蛋白的抗体，反应1小时，充分洗涤后加入ABTS显色，监测OD410的A值，以M13K07为阴性对照。
结果获得两株具有较高亲和活力的单链抗体分别命名为pCAS1、pCAS2。pCAS1测序结果具有SEQ ID NO2的序列；VH基因366bp，编码122个氨基酸残基，位于单链抗体基因的5’端；VL基因324bp，编码108个氨基酸残基，位于单链抗体的3’端，在VH、VL之间是编码(Gly4Ser)3连接肽的DNA序列；VH、VL基因的氨基酸序列均为开放读框，有明确的4个框架区和三个互补决定区，含有2个抗体可变区特征性的半胱氨酸，符合小鼠抗体可变区特征。
实施例3超抗原SEA与抗黑色素瘤ScFv重组免疫毒素的构建，具有序列表SEQ IDNO3所示的碱基序列(其中酶切连接位点用下划线标出)caggtgaagc tgcaggagtc aggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc60tcctgtgttg tctctggatt cactttcagt aattactgga tgaactgggt ccgccagtct120ccagagaagg ggcttgagtg gattgcagaa attagattga aatccaataa ttttgcaaga180tattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt240gtctacctgc aaatgatcaa cctaagagct gaagatactg gcatttatta ctgtaccagt300tatggtaact acgttgggca ctattttgac cactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc360tcctcatgtg gaggcggttc aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc ggacattgag420ctcacccagt ctccaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc480aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcctggtatc aacaaaaacc agggcaatct540
cctgaaccac tgcttttctc ggcatcctac cgttacactg gagtccctga tcgcttcaca600ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca atgtgcagtc tgaagacttg660gcagagtatt tctgtcagca atataacagc tatcctctga cgttcggtgg aggcaccaag720ctggaaatca aacgggaatt cagcgagaaa agcgaagaaa taaatgaaaa agatttgcga 780aaaaagtctg aattgcaggg aacagcttta ggcaatctta aacaaatcta ttattacaat840gaaaaagcta aaactgaaaa taaagagagt cacgatcaat ttttacagca tactatattg900tttaaaggct tttttacaga tcattcgtgg tataacgatt tattagtaga ttttgattca960aaggatattg ttgataaata taaagggaaa aaagtagact tgtatggtgc ttattatggt1020tatcaatgtg cgggtggtac accaaacaaa acagcttgta tgtatggtgg tgtaacgtta1080catgataata atcgattgac cgaagagaaa aaagtgccga tcaatttatg gctagacggt1140aaacaaaata cagtaccttt ggaaacggtt aaaacgaata agaaaaatgt aactgttcag1200gagttggatc ttcaagcaag acgttattta caggaaaaat ataatttata taactctgat1260gtttttgatg ggaaggttca gaggggatta atcgtgtttc atacttctac agaaccttcg1320gttaattacg atttatttgg tgctcaagga cagtattcaa ataccctgtt acgtatctat1380cgtgataata aaacgattaa ctctgaaaac atgcatattg atatatattt atatacaagt1440taa 1443SEQ ID NO3的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度1443碱基对*类型核酸*链型双链*拓朴结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源seam工程菌和抗黑色素瘤单链抗体重组质粒pCAS1根据单链抗体和sea基因的已知序列，遵循引物设计原则设计两组引物，采用酶切连接方法构建ScFv-SEA融合基因。
第一组ScFv F5’CATATGCAGGTGAAGCTGCAGCAGTC 3’NdeIScFv R5’GAATTCCCGTTTGATTTCCAGCTT 3’EcoRI第二组SEA F5’AAGCTTTTAACTTGTATATAAATATATATC 3’EcoRISEA R 5’GAATTCAGCGAGAAAAGCGAAGAAATA 3’HindIII(1)ScFv基因的扩增以重组质粒pCAS1为模板，用第一组引物扩增ScFv DNA。PCR条件为95℃ 1分钟；94℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 40s，30个循环；72℃延伸5min。ScFv两端被引入NdeI、EcoRI酶切位点。
(2)seam基因的扩增以7ZTS-seam为模板，用第二组引物扩增seam基因，扩增条件为95℃ 1分钟；94℃ 30s，45℃ 30s，72℃ 40s，30个循环；72℃延伸5min。seam两端分别被引入EcoRI、HindIII酶切位点。
(3)pGEMT-ScFv、pGEMT-SEA、pET28ScFv-SEA重组质粒的构建将ScFv和seamPCR产物克隆到pGEM T-easy载体中，筛选阳性克隆。pGEMT-ScFv质粒DNA用NdeI、EcoRI双酶切，分离约750bp DNA片段；pGEMT-SEA质粒DNA用EcoRI、HindIII酶切，分离约750bp DNA片段；pET28a载体用NdeI、HindIII酶切，分离约5000bp的DNA片段；将三者按5∶5∶1的摩尔比混合，用T4 DNA连接酶16℃连接16-18h。连接产物转化E.col BL21(DE3)感受态细胞，采用酶切鉴定和PCR鉴定两种方法筛选阳性克隆。
(4)质粒和菌株的保存质粒冰冻保存于-20℃，菌株在含10％ DMSO的培养液中保存于-70℃(5)ScFv-SEA融合蛋白的表达挑取含ScFv-SEA重组质粒的单菌落，接种于含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养至OD600为0.61时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃、200r/min继续培养4h，离心收集菌体，SDS-PAGE分析。
结果工程菌全蛋白电泳图谱在50kD处出现明显诱导条带，与预期的目的蛋白分子量相符。凝胶灰度扫描显示融合蛋白占总蛋白的30％。抗黑色素瘤ScFv基因和seam基因的融合基因测序(采用双脱氧末端终止法)结果表明，ScFv-SEA融合基因与设计的完全一致。
实施例4 超抗原SEA与ScFv重组免疫毒素的分离、纯化盐酸胍裂解液、变性结合缓冲液、不同pH值变性清洗缓冲液及变性洗脱缓冲液按照Invitrogen公司[ProBond.Purification System]操作手册配制。
(1)细菌的裂解取50mL细菌培养液，6000g离心15min，弃净上清，收集菌体。加入8mL的盐酸胍裂解液，室温缓慢震荡5-10min。将菌液置于冰上，超声探头深入液面3厘米，中等功率超声破菌，每次5秒，间隔10秒，3-5次，至菌液变澄清。5000g离心15min，保留沉淀。
(2)包涵体的洗涤沉淀用9倍体积的洗涤缓冲液(含4mol/L尿素、20mmol/L Tris、2mmol/L EDTA、1％Triton X100)重悬，室温静置5min，5000g离心15min，重复洗涤4遍。
(3)Ni-NTA亲合柱的预处理取一支预装好的Ni-NTA金属螯合柱，缓慢颠倒数次使树脂重新悬浮混匀，静置或800g低速离心2分钟，让树脂均匀下沉。倒去柱内酒精，以6mL的蒸馏水清洗两次。6mL变性结合缓冲液洗涤3次。
(4)包涵体的纯化与复性①洗涤后的包涵体，用8mL的裂解缓冲液重新悬浮，加入预处理好Ni-NTA金属亲合柱。室温缓慢震荡15至30分钟，800g离心1分钟，弃上清。
②加入4mL变性结合缓冲液(pH7.8)重悬树脂，震荡2分钟，800g离心1分钟，去上清，重复1次。
③加入4mL变性清洗缓冲液(pH6.0)重悬树脂，震荡2分钟，800g离心1分钟，弃上清，重复一次。
④加入4mL变性清洗缓冲液(pH5.3)重悬树脂，震荡2分钟，800g离心1分钟，弃上清，重复一次。
⑤将Ni-NTA柱垂直固定，剪去下端的封闭口，用4mL变性洗脱缓冲液(pH4.0)洗柱，每管收集1mL洗脱液，检测洗脱液中蛋白含量。
⑥用含8M尿素的PBS缓冲液将蛋白稀释到100mg/ml，对含0.5mmol/L L-精氨酸，0.1mmol/L Triton-100，1.0mmol/L还原型谷胱甘肽，0.1mmol/L氧化性谷胱甘肽，10mM Tris的复性缓冲液，4℃透析24h，更换缓冲液3次。
⑦将蛋白溶液4℃ 8000r/min，离心20min，去除聚集物；聚乙二醇20000浓缩，蛋白定量。
实验结果和结论工程菌中ScFv-SEA融合蛋白的表达及目的蛋白纯化、复性后的SDS-PAGE如图2所示。复性后的融合蛋白经SDS-PAGE鉴定呈现了单一条带，凝胶成像系统分析纯度达90％以上，蛋白定量达0.47mg/ml。
实施例5 超抗原SEA与ScFv重组免疫毒素对黑色素瘤细胞株的抑制作用(1)细胞系黑色素瘤细胞株LiBr购自美国细胞菌种库(Americar Type CultureCollection，ATCC)，表达神经节苷脂(GD2)抗原。乳腺癌细胞株MCF7为天津肿瘤医院免疫室提供，无GD2表达。
(2)方法LDH释放法测定融合蛋白的细胞毒效应①将对数生长期的LiBr黑色素瘤细胞浓度调整到4×105/ml。
②取100μl LiBr黑色素瘤细胞加入U型、96孔板中，加入ScFv-SEA融合蛋白使药物终浓度分0.10、1.0、2.0、5.0、10.0μg/ml几个等级。37℃温育30min后，加入外周血单个核细胞100μl(效靶比为10∶1)。效应细胞自发释放孔加单个核细胞、RPMI1640各100μl，同样方法加入ScFv-SEA融合蛋白；PBMC对照孔加PMBC和LiBr细胞各100μl；靶细胞最大释放孔和靶细胞最小释放孔加入LiBr细胞和RPMI1640各100μl，不加ScFv-SEA，以上各项均设三个复孔，并设立乳腺癌MCF7+外周血单个核细胞+ScFv-SEA对照组。37℃，5％ CO2培养箱中培养36h。
③将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应3min，每孔加入1mol/LHCl 30μL，在酶标仪490nm测定光密度值(OD)。
④用方差分析进行数据统计，按下式计算细胞毒性T细胞的杀伤率，受试组的死亡率显著高于对照组(显著性水平选择为0.05)，即可判定该项试验结果为阳性。
杀伤效应(％)＝(实验组OD值-效应细胞自发释放OD值-靶细胞最小释放OD值)/(靶细胞最大释放OD值-靶细胞最小释放OD值)×100(3)实验结果和结论当效靶比为10∶1时，随着融合蛋白浓度的增大，对黑色素瘤细胞LiBr的抑制率逐渐增大，当融合蛋白浓度为2μg/mL时，抑制率最高达58％-69％，大于2μg/mL抑制率不再增加。单加PBMC，单加融合蛋白对LiBr无明显影响。
结论对表达相关抗原的黑色素瘤细胞LiBr的抑制效应明显优于对乳腺癌细胞MCF7抑制(抑制率见表1)，说明融合蛋白赋予了SEA抗肿瘤特异性。
表1 抗黑色素瘤ScFv-SEA融合蛋白对LiBr和MCF7细胞的抑制率
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院沈阳应用生态研究所<120>sea突变基因及其与ScFv基因的融合蛋白的应用<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>774<212>DNA<213>金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)<220>
<221>old_sequence<222>(1)..(774)<223>
<400>1atgaaaaaaa cagcatttac attactttta ttcattgccc taacgttgac aacaagtcca 60cttgtaaatg gtagcgagaa aagcgaagaa ataaatgaaa aagatttgcg aaaaaagtct 120gaattgcagg gaacagcttt aggcaatctt aaacaaatct attattacaa tgaaaaagct 180aaaactgaaa ataaagagag tcacgatcaa tttttacagc atactatatt gtttaaaggc 240ttttttacag atcattcgtg gtataacgat ttattagtag attttgattc aaaggatatt 300gttgataaat ataaagggaa aaaagtagac ttgtatggtg cttattatgg ttatcaatgt 360gcgggtggta caccaaacaa aacagcttgt atgtatggtg gtgtaacgtt acatgataat 420aatcgattga ccgaagagaa aaaagtgccg atcaatttat ggctagacgg taaacaaaat 480acagtacctt tggaaacggt taaaacgaat aagaaaaatg taactgttca ggagttggat 540cttcaagcaa gacgttattt acaggaaaaa tataatttat ataactctga tgtttttgat 600
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1.一种SEA的突变基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO1中的碱基序列。
2.一种SEA的突变基因的应用，其特征在于将序列表SEQ ID NO1中的基因与抗肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段基因融合，构建重组免疫毒素。
3.按照权利要求2所述SEA的突变基因的应用，其特征在于所述的抗肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段基因为HB8759，其具有序列表SEQ IDNO2中的碱基序列。
4.按照权利要求2所述SEA的突变基因的应用，其特征在于所述融合基因具有序列表SEQ ID NO3中的碱基序列。
全文摘要
本发明属于制药领域，具体地说是SEA突变基因及其与ScFv基因融合蛋白的应用，采用基因工程手段突变了超抗原SEA基因，其具有序列表1的碱基序列；将其与通过噬菌体展示技术获得的抗黑色素瘤单链抗体(ScFv)基因融合构建了ScFv－SEA重组免疫毒素；体外细胞实验证实该融合蛋白对黑色素瘤细胞的抑制作用明显优于其它肿瘤，该融合蛋白对黑色素瘤细胞具有明确的靶向杀伤效应，在治疗黑色素瘤的药物开发中具有较好的应用前景。超抗原SEA作为一种有效的免疫调节剂和增效剂，为肿瘤的免疫治疗提供了新途径。
文档编号C07H21/04GK1569880SQ0313379
公开日2005年1月26日 申请日期2003年7月25日 优先权日2003年7月25日
发明者吴文芳, 孙静, 时成波, 吕安国 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所, 屹昌科技集团有限公司