海参胶原、胶原蛋白的提取方法

专利名称：海参胶原、胶原蛋白的提取方法
技术领域：
本发明涉及食用动物蛋白质领域，同时还涉及使用酶获得胶原和胶原蛋白 的方法。
背景技术：
研究表明，胶原、胶原蛋白有着多种生理功能，如保护胃粘膜及抗溃疡作 用，抗过敏，降血压，降胆固醇，抗衰老，促进伤口愈合，增强骨强度和预防 骨质疏松，预防关节炎，促进角膜上皮损伤的修复和促进角膜上皮细胞的生长 等多种生理活性功能，因此，其在医药、化工、食品等领域有着广泛的应用， 目前对其的关注越来越多。刺参体壁蛋白含量的40%以上为胶原蛋白，其可食 部位的主要成分来自胶原蛋白，胶原蛋白中含有多种微量元素，多种生物活性 物质，具有抗凝血、免疫调节、降血脂、抗病毒、抗肿瘤等多种药理作用。海 参体壁的胶原蛋白除了具有胶原蛋白的共性之外，还具备了一定的特性，即在 一般条件下的不溶解性，因此人们极少涉及它的提取。

发明内容
本发明利用海参，提供一种制备海参胶原、胶原蛋白的方法，保持制备的 胶原、胶原蛋白的结构及生理功能，对海参体壁胶原蛋白的提取制备旨在为海 参的加工利用及废弃物附加值的提高，特别是优化现有的加工方法，提供更为 详尽的基础理论依据。本发明的技术方案是分为原料的处理、提取和纯化三步骤。原料处理中是在低温下用水、Tris-HCl溶液、氢氧化钠溶液处理海参以除去水溶性、盐溶性 的蛋白以及色素；提取则是利用乙酸和胃蛋白酶提取，通过盐析得粗品；提纯 是将粗品用乙酸复溶，而后分别用磷酸氢二钠溶液、乙酸和水透析而完成。 本发明的技术方案按如下所述实现 (1).原料处理新鲜海参去内脏，冲洗干净，剪成碎块后，加入5 10倍水用组织捣碎机破 壁、匀浆，之后0 5。C下搅拌30 60min，离心，取沉淀继续加水搅拌30 120min，离心取沉淀，加入5 10倍0.1mol/LTris-HCl溶液搅拌12 24h，离心取沉淀搅拌 水洗至中性，之后再加入4 8倍水搅拌2 4天，离心取沉淀再次加入2 4倍水 搅拌2 4天，10000 12000rpm离心2 5min，去除水，得到沉淀，即粗胶原纤维 冷冻或储存待用；将上述粗胶原纤维加入10~30倍0.05 0.20 mol/L的NaOH溶液中搅拌2~4 天，中途换溶液2 3次，13500rpm离心15 20min，沉淀得到的胶原纤维用水洗 至中性后冷冻储存或冻干储存待用；由于胶原不溶于水及碱性溶液，因此，此步骤中加水、Tris-HCl溶液及碱溶 液搅拌的作用是去除一些水溶性、盐溶性的蛋白以及海参体内的色素，处理能 力为蛋白总量的50%，同时使胶原蛋白不受到破坏。(2) .提取胶原纤维加入5 15pPH 2.0 3.0的乙酸及1 15%的胃蛋白酶0 25。C下进行 提取2~3天，13500rpm离心lh，取上清液用终浓度为0.6 lmol/L NaCl盐析， 离心得到粗品；因为海参胶原纤维具有广泛的交链作用,因此海参中的胶原是胶原分子高度 交联的聚合体。在没有对其肽键处理时只有很少的胶原能够溶解。胃蛋白酶促 溶法能够使胶原肽链末端氨基酸断裂，从而使胶原纤维大量溶于酸中，比单独 用酸促溶法提取得率高70%以上，因此所用酶促溶法能够最大限度的提取胶原 及胶原蛋白，原料的利用率达到最大。(3) 纯化粗品用pH 2.0 3.0的乙酸复溶，用0.02mol/L pH 8.0的Na2HP04透析灭酶， 之后用pH 2.0 3.0的乙酸透析，再用水透析后离心取沉淀即成，冷冻或冻干储 存。上述(2)提取和(3)纯化的两工艺步骤中温度在0 5。C条件下进行是提 取活性胶原的工艺歩骤，这是避免了高温对胶原结构的破坏，使胶原保持了原 有的三螺旋结构，同时使其活性保持在80%以上；温度在0 25。C条件下进行是 提取胶原蛋白工艺歩骤。本发明中所提取的两种物质的区别如下胶原属于结构蛋白质，在海参体内以胶原纤维的形式存在。在低温下提取 得到的胶原，仍然保持三股螺旋结构，具有较好的柔韧性、弹性和强度，复水性好，具有生物活性。胶原蛋白是多肽混合物，相对分子质量为几千到几万， 相对分子质量分布很宽，能够被人体更好的吸收利用。胶原蛋白不能再度形成 纤维，不具有生物活性。与现有技术相比，本发明的突出优点是1. 在原料处理过程所使用的处理方法能够最大限度的去除非胶原蛋白的杂 蛋白。2. 制取活性胶原采用低温，保证了胶原的活性及结构的完整性。3. 所用酶促溶法能够最大限度的提取胶原及胶原蛋白，原料的利用率达到最 大值。4.制备胶原蛋白所用的原料可以是新鲜海参，也可是提取完海参中活性物质 后剩余的海参，使原料得到了充分的利用。5.首次用海参制取胶原、胶原蛋白。
具体实施方式
实例一1. 活性胶原的提取取新鲜海参或提取完海参中活性物质后剩余的海参，去内脏，体壁冲洗干 净，剪成碎块后，加入5倍水用组织捣碎机破壁、匀浆，之后4'C下搅拌30min， 离心，取沉淀继续加水搅拌60min，离心取沉淀，加入IO倍O.I mol/LTris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/LNaCl， pH8.0)溶液搅拌12h，离心取沉淀搅拌水 洗至中性，之后再加入6倍水搅拌3天，离心取沉淀再次加入3倍水搅拌3天， 10000rpm离心2min，去除水，得到沉淀，即粗胶原纤维冷冻储存或冻干储存待 用。将卜.述粗胶原纤维加入20倍0.1 mol/L的NaOH溶液中4。C搅拌3天，中 途换溶液3次，13500rpm离心20min，沉淀用水洗至屮性后加入10倍pH 2.0 的乙酸及15%的胃蛋白酶4匸下进行提取，时间为2天，13500rpm离心lh，之 后取上清液用终浓度0.8mol/LNaCl盐析，离心取沉淀后用pH 2.0的乙酸复溶， 用0.02mol/LpH 8.0的Na2HP04透析灭酶，之后用pH 2.0的乙酸透析，再用水 透析，以达到除盐的目的，离心取沉淀，即活性胶原，冷冻或冻干储存。2. 胶原蛋白的提取取新鲜海参或提取完海参中活性物质后剩余的海参，去内脏，体壁冲洗干 净，剪成碎块后，加入5倍水用组织捣碎机破壁、匀浆，之后4。C下搅拌30min，离心，取沉淀继续加水搅拌60min，离心取沉淀，加入10倍0.1 mol/L Tris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/LNaCl， pH8.0)溶液搅拌12h，离心取沉淀搅拌水 洗至中性，之后再加入6倍水搅拌3天，离心取沉淀再次加入3倍水搅拌3天， 10000rpm离心2min，去除水，得到沉淀，即粗胶原纤维冷冻储存或冻干储存待 用。将上述粗胶原纤维加入20倍0.1 mol/L的NaOH溶液中4。C搅拌3天，中途 换溶液3次，13500rpm离心20min，沉淀用水洗至中性后加入10倍pH 2.0的乙 酸及10。/。的胃蛋白酶常温(10。C)下进行提取，时间为2天，13500rpm离心lh， 之后取上清液用终浓度0.8mol/LNaCl盐析，离心取沉淀后用pH2.0的乙酸复溶， 用0.02mol/LpH8.0的Na2HPO4透析灭酶，之后用pH 2.0的乙酸透析，再用水 透析，以达到除盐的目的，离心取沉淀，冷冻或冻干储存。1. 活性胶原的提取取新鲜海参或提取完海参中活性物质后剩余的海参，去内脏，体壁冲洗干 净，剪成碎块后，加入8倍水用组织捣碎机破壁、匀浆，之后5"C下搅拌40min， 离心，取沉淀继续加水搅拌90min，离心取沉淀，加入8倍0.1 mol/L Tris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/LNaCl， pH8.0)溶液搅拌18h，离心取沉淀搅拌水 洗至中性，之后再加入8倍水搅拌2天，离心取沉淀再次加入4倍水搅拌2天， 11000rpm离心3min，去除水，得到沉淀，即粗胶原纤维冷冻储存或冻干储存待 用。将上述粗胶原纤维再加入30倍0.05 mol/L的NaOH溶液中4。C搅拌3天， 中途换溶液2次，13500rpm离心20min，沉淀用水洗至中性后加入5倍pH 3.0 的乙酸及12%的胃蛋白酶5"下进行提取，时间为2天，13500rpm离心lh，之 后取上清液用终浓度0.7mol/LNaCl盐析，离心取沉淀后用pH 3.0的乙酸复溶， 用0.02mol/LPH8.0的Na2HPO4透析灭酶，之后用pH 3.0的乙酸透析，再用水 透析，以达到除盐的目的，离心取沉淀，冷冻或冻干储存。2. 胶原蛋白的提取取新鲜海参或提取完海参中活性物质后剩余的海参，去内脏，体壁冲洗干 净，剪成碎块后，加入8倍水用组织捣碎机破壁、匀浆，之后5"C下搅拌40min， 离心，取沉淀继续加水搅拌90min，离心取沉淀，加入8倍0.1 mol/L Tris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/LNaCl， pH8.0)溶液搅拌18h，离心取沉淀搅拌水 洗至中性，之后再加入8倍水搅拌2天，离心取沉淀再次加入4倍水搅拌2天，11000rpm离心3min，去除水，得到沉淀，即粗胶原纤维冷冻储存或冻干储存待 用。将上述粗胶原纤维再加入30倍0.05 mol/L的NaOH溶液中4。C搅拌3天， 中途换溶液2次，13500rpm离心20min，沉淀用水洗至中性后加入5倍pH 3.0 的乙酸及8%的胃蛋白酶常温(15°C)下进行提取，时间为2天，13500rpm离 心lh，之后取上清液用终浓度0.7mol/L NaCl盐析，离心取沉淀后用pH 3.0的 乙酸复溶，用0.02mol/LpH8.0的Na2HPO4透析灭酶，之后用pH3.0的乙酸透 析，再用水透析，以达到除盐的目的，离心取沉淀，冷冻或冻干储存。1. 活性胶原的提取取新鲜海参或提取完海参中活性物质后剩余的海参，去内脏，体壁冲洗干 净，剪成碎块后，加入10倍水用组织捣碎机破壁、匀浆，之后0'C下搅拌60min， 离心，取沉淀继续加水搅拌120min，离心取沉淀，加入5倍0.1mol/L Tris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/LNaCl， pH8.0)溶液搅拌24h，离心取沉淀搅拌水 洗至中性，之后再加入4倍水搅拌4天，离心取沉淀再次加入2倍水搅拌4天， 12000rpm离心5min，得到沉淀，即粗胶原纤维冷冻储存或冻干储存待用。将上 述粗胶原纤维加入10倍0.2 mol/L的NaOH溶液中0。C搅拌4天，中途换溶液2 次，13500rpm离心20min，沉淀用水洗至中性后加入15倍pH2.0的乙酸及10% 的胃蛋白酶0'C下进行提取，时间为3天，13500rpm离心lh，之后取上清液用 终浓度0.9mol/LNaCl盐析，离心取沉淀后用pH 2.0的乙酸复溶，用0.02mol/LpH 8.0的Na2HP04透析灭酶，之后用pH 2.0的乙酸透析，再用水透析，以达到除 盐的目的，离心取沉淀，冷冻或冻干储存。2. 胶原蛋白的提取取新鲜海参或提取完海参中活性物质后剩余的海参，去内脏，体壁冲洗干 净，剪成碎块后，加入10倍水用组织捣碎机破壁、匀浆，之后0。C下搅拌60min， 离心，取沉淀继续加水搅拌120min，离心取沉淀，加入5倍O.lmol/L Tris-HCl (50mmol/LEDTA、 0.5mol/L NaCl， pH8.0)溶液搅拌24h，离心取沉淀搅拌水 洗至中性，之后再加入4倍水搅拌4天，离心取沉淀再次加入2倍水搅拌4天， 12000rpm离心5min，得到沉淀，即粗胶原纤维冷冻储存或冻干储存待用。将上 述粗胶原纤维加入10倍0.2 mol/L的NaOH溶液中0。C搅拌4天，中途换溶液2 次，13500rpm离心20min，沉淀用水洗至中性后加入8倍pH 2.0的乙酸及10%的胃蛋白酶常温(20°C)下进行提取，时间为2天，13500rpm离心lh，之后取 上清液用终浓度0.9mol/L NaCl盐析，离心取沉淀后用pH 2.0的乙酸复溶，用 0.02mol/LpH 8.0的Na2HP04透析灭酶，之后用pH 2.0的乙酸透析，再用水透析， 以达到除盐的目的，离心取沉淀，冷冻或冻干储存。
权利要求
1.海参胶原、胶原蛋白的提取方法，其特征在于工艺过程为(1).原料处理新鲜海参去内脏，冲洗干净，剪成碎块后，加入5～10倍水用组织捣碎机破壁、匀浆，之后0～25℃下搅拌30～60min，离心，取沉淀继续加水搅拌30～120min，离心取沉淀，加入5～10倍0.1mol/L Tris-HCl溶液搅拌12～24h，离心取沉淀搅拌水洗至中性，之后再加入4～8倍水搅拌2～4天，离心取沉淀再次加入2～4倍水搅拌2～4天，10000～12000rpm离心2～5min，去除水，得到沉淀，即粗胶原纤维冷冻或储存待用；将上述粗胶原纤维加入10～30倍0.05～0.20mol/L的NaOH溶液中0～5℃搅拌2～4天，中途换溶液2～3次，13500rpm离心15～20min，沉淀得到的胶原纤维用水洗至中性后冷冻储存或冻干储存待用；(2).提取胶原纤维加入5～15倍pH2.0～3.0的乙酸及1～15％的胃蛋白酶0～25℃下进行提取2～3天，13500rpm离心1h，取上清液用终浓度为0.6～1mol/L NaCl盐析，离心得到粗活性胶原；(3)纯化粗活性胶原用pH2.0～3.0的乙酸复溶，用0.02mol/L pH8.0的Na2HPO4透析灭酶，之后用pH2.0～3.0的乙酸透析，再用水透析后离心取沉淀即成，冷冻或冻干储存。
2. 如权利要求1所述海参胶原、胶原蛋白的提取方法，其特征在于活性胶 原的提取方法，工艺过程中(2).提取和(3).纯化步骤是在0 5'C下进行。
3. 如权利要求1所述海参胶原、胶原蛋白的提取方法，其特征在于胶原蛋 白的提取方法，工艺过程中(2)提取和(3)纯化步骤是在6 25t:下进行。
4. 如权利要求l、 2或3所述海参胶原、胶原蛋白的提取方法，其特征在于 (1).原料预处理中所述的Tris-HCl溶液为EDTA、 NaCl，其pH值为8.0。
5. 如权利要求1所述海参胶原、胶原蛋白的提取方法，其特征在于所述原 料处理中的原料是提取完海参中活性物质后剩余的海参。
全文摘要
一种海参海参胶原、胶原蛋白的制备方法，是将海参经过水溶液、Tris-HCl溶液、NaOH溶液处理后冷冻或冻干，得到海参粗胶原纤维。得到的粗胶原纤维，加入乙酸溶液及胃蛋白酶，在0～5℃的条件下搅拌酶解，冷冻离心后进行盐析纯化，之后用Na₂HPO₄、乙酸、水除盐后得到活性胶原。得到的粗胶原纤维，加入乙酸溶液及蛋白酶，在6～25℃的条件下搅拌酶解，离心后进行盐析纯化，之后用Na₂HPO₄、乙酸、水除盐后得到胶原蛋白。
文档编号C07K1/14GK101215315SQ20071015924
公开日2008年7月9日 申请日期2007年12月26日 优先权日2007年12月26日
发明者杰 丁, 丹 姜, 朱蓓薇, 李翠翠, 军 王, 董秀萍, 静 陈, 杨 高 申请人:大连工业大学