专利名称：一种抗猪圆环病病毒转移因子的制备方法
技术领域：
本发明涉及药物及其制剂领域，更具体地说，是涉及一种抗猪圆环病病毒转移因
子的制备方法。
背景技术：
近年来，猪圆环病病毒病作为一种新的病毒病在许多国家广泛流行。猪圆环病病 毒II型可引起断奶子猪多系统衰竭综合征、猪间质性肺炎、猪皮炎肾病综合征)以及母猪 繁殖障碍等，这些病总称为猪圆环病病毒病。 繁殖障碍猪圆环病病毒II型可导致母猪返情率增高，流产，产死胎、木乃伊胎和 弱子等，所产子猪断奶前死亡率上升。公猪感染圆环病毒II型后，可通过交配传染给与配 母猪，从而导致其繁殖障碍。 猪皮炎和肾病综合征本病通常发生于8 18周龄的猪，病猪食欲废绝，体温升高 至41.5t:，皮下水肿。皮肤出现紫红色病变斑块，在会阴部和四肢最为明显，这些斑块有时 会相互融合。在极少情况下皮肤病变会消失。也有的病变表现为猪的后躯部位出现紫红色 淤血、淤点或淤斑。可视的浅表淋巴结肿大，出现黄色胸水或心包积液。肾脏呈肾小球性肾 炎和间质性肾炎，表面可见淤血点。常见症状还有严重下痢和呼吸困难，以及被毛粗乱。
间质性肺炎间质性肺炎主要危害6 14周龄的猪，发病率为2% 30%，死亡率 为4% 10%。眼观病变为弥漫性间质性肺炎，颜色呈灰红色。有时可见肺部存在II型肺 细胞增生区和细支气管上皮坏死并含坏死细胞碎片的区域，肺泡腔内有时可见透明蛋白。
断奶子猪多系统衰竭综合征多发于6 8周龄子猪，发病率为20% 60%，死亡 率为5% 35% 。子猪断奶后2 3周出现以咳嗽、呼吸困难、逐渐消瘦、死亡率和淘汰率均
显著升高为特征的疾病。病猪发热(一般不超过4rc)，食欲减退，继而出现消瘦、被毛粗
乱、皮肤苍白或黄疸、呼吸困难等症状。个别猪眼睛有分泌物，腹泻，肘关节和膝关节肿胀。 其剖检特征为全身淋巴结肿大和发生心包炎、胸膜肺炎、腹膜炎等，使用多种抗生素治疗效 果不理想。 圆环病毒II型可致使感染猪的免疫力大大降低，从而为其他病毒或病菌的入侵 创造了条件。如圆环病毒与蓝耳病病毒协同作用，使猪继发感染金色葡萄球菌、链球菌时， 从而使病猪出现体温升高、充血性皮疹、呕吐、腹泻、呼吸困难等，由于这些细菌所产毒素在 本病发生中所起的关键作用，可引起猪多器官功能衰竭综合征。 尽管目前市场上有一些抗猪圆环病的临床用药，但是现有药剂的争对性不强，疗 效有限，而且，治疗性制剂多是发病后采用的，不能起到预防的作用。对于易感染猪圆环病 的猪群。每年定期的对猪接种猪圆环病病毒疫苗是预防猪圆环病的有效方法，其次应增强 营养或药物干预，提高自身免疫力，通过药物提高机体抵抗力或免疫力也是一种预防猪圆 环病的有效方法。 转移因子(TF， Transfer Factor)是从淋巴细胞中提取的一类低分子肽与核苷酸 复合物，具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、增强机体非特异性细胞免
3疫功能等作用，被誉为T细胞活性的触发剂，细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素 产生启动剂。转移因子分子量小、无毒、无抗原性、不起过敏反应，不产生对抗抗体且可超越 种系界限应用等优点。自美国著名的免疫学专家Lawrence发现和研究转移因子以来，世界 各国不但进行了许多理论研究，而且进行了大量的临床应用研究，使得转移因子成为目前 应用广泛的增强免疫制剂。 目前已报道的提取的转移因子大多数都是关于非特异性转移因子的制备方法。本 发明采用病毒免疫抗原的方法提取特异性的转移因子，提取方法在已报道的传统方法基础 上加以改进，縮短生产时间，简化生产工艺。 采用特殊的病毒株免疫抗原提取抗猪圆环病病毒的转移因子，具有重要的理论和 现实意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种天然高效的 抗猪圆环病病毒的转移因子。 本发明的第一个目的是提供一种简单有效的抗猪圆环病转移因子的制备方法，步 骤包括 (1)先用注射用水洗净用猪圆环病病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面的筋膜、脂 肪等组织，再用生理盐水冲洗； (2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入1 2倍冷的lOmmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎 机1000 3000rpm捣碎3 5次，每次3 5min，制得猪脾匀浆液；
(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5 10min ; (4)将步骤(3)中得到的匀浆液用HC1调pH5. 0 6. 0或者加入0. 1 0. 3%柠 檬酸，4°C ， 3000 8000rpm离心10 30min，收集上清液； (5)上清液用O. 2iim中空纤维柱微滤，滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中 空纤维柱超滤，收集滤出液； (6)将超滤得到的滤液用0. 22 ii m滤膜进行无菌过滤，即得到抗猪圆环病病毒转
移因子原液，4t:保存。 在具体实施方案中，实施上述步骤之前，步骤还包括制备病毒抗原、提取病毒抗 原、病毒抗原免疫猪的步骤。这些步骤，可选用常规技术实施。其中，所述的制备病毒抗原步 骤，优选将猪圆环病病毒接种于9 11日龄鸡胚尿囊液30 4(TC培养24 72h。取鸡 胚尿囊液，-2(TC反复冻融4 8次，3000 8000rpm离心10 30min，弃去沉淀收集上清 液。其中，猪圆环病病毒株选自本申请人保藏的PCV-II(Genbank accession NO. AF027217 或Genbank accession NO. AF201897)。 所述的提取病毒抗原步骤，优选上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖 浓度为10% 80%， 150000 200000rpm离心2 4小时，根据猪圆环病病毒分子量确定 猪圆环病病毒所在离心管的位置，吸出备用； 所述的病毒抗原免疫猪步骤，优选挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮下 多点注射免疫猪，共免疫3 5次。每次免疫间隔一周，最后一次免疫7 10天后取猪静 脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20°C保存，备用。 本发明的第二个目的在于提供通过上述方法所制备的转移因子。 在一个优选实施方案中，上述方法使用的猪圆环病病毒株选自本申请人保藏的
PCV-II(Genbank accession NO. AF027217或Genbank accession NO. AF201897)。 由于转移因子是从淋巴细胞中提取的一类低分子肽与核苷酸复合物，目前并没有
明确的组分或结构，制备方法或所用病毒株的不同，所得的转移因子也会差异，因此通常在
生产过程中是通过限定制备方法和所用病毒株来明确转移因子。在本发明中，由于限定了
具体的制备方法和特异的病毒株，因此所得到的转移因子具有组分稳定、纯度高、活性好等
特点，具有很好的应用前景。 技术效果 本发明的一种抗猪圆环病病毒转移因子的制备方法，具有以下优点
1、猪脾脏属于屠宰场的下脚料，原料来源容易； 2、组织经组织捣碎机捣碎后，采用大功率的超声波设备处理，縮短反复冻融时间，
而且也避免了因高压均质机破壁处理时由于筋膜的存在而堵塞高压均质机； 3、离心前用稀盐酸调节pH，使大部分蛋白絮凝，使得离心后的上清液的澄清度明
显好于以前的方法；而且有利用后续的微滤、超滤操作； 4、在匀浆液中加入0. 1 0. 3%柠檬酸也起到使蛋白絮凝的作用，简化后面的离 心处理； 5、本发明既可基于前期的常规病毒抗原免疫步骤，又可优选本发明的免疫步骤， 具有灵活高效的优点。 6、所述转移因子的提取方法，显著地縮短了生产时间，简化了生产工艺。 7、提取物经体外生物活性试验及药理、毒性试验等证明，具有纯度高、免疫活性起
效快而维持时间长、易吸收、无任何不良反应等特点，其疗效确切，安全可靠，既可治疗又可
增强抗病能力。该提取物可做成口服、注射、喷雾等剂型，便于使用。 8、本发明所用的病毒株，选自本申请人保藏的PCV-II(Genbank accession NO. AF027217或Genbank accession NO. AF201897)，与常规圆环病毒株相比，具有更高的 免疫原性，因而采用该病毒株免疫抗原的方法所提取的转移因子，包含特异性好和纯度高 的低分子肽与核苷酸复合物，其活性水平明显优于常规方法和常规病毒株所制备的转移因 子。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述。
实施例1 : 抗猪圆环病病毒转移因子的制备 1、将猪圆环病病毒接种于9 11日龄鸡胚尿囊液37t:培养48h。取鸡胚尿囊 液，-2(TC反复冻融5次，5000rpm离心30min，弃去沉淀收集上清液； 2、取上清液，上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为10%、20%、 30 % 、40 % 、50 % 、60 % 、70 % 、80 % ， 150000rpm离心4小时，根据猪圆环病病毒分子量确定 猪圆环病病毒所在离心管的位置，吸出备用；
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3、得到的猪圆环病病毒抗原免疫猪，挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮 下多点注射免疫猪，共免疫4次。每次免疫间隔一周，最后一次免疫7天后取猪静脉血，以 免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰 杀猪，取脾脏于-2(TC保存，备用； 4、从得到的猪脾脏提取抗猪圆环病病毒转移因子 (1)先用注射用水洗净脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；
(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入2倍冷的lOmmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎机 2000rpm捣碎3次，每次5min，制得猪脾匀桨液；
(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5min ; (4)将(3)中得到的匀浆液用HC1调pH5. 0， 4°C ， 5000rpm离心30min，收集上清 液； (5)上清液用0. 2 ii m中空纤维柱微滤，收集滤出液； (6)滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；
(7)将超滤得到的滤液用0. 22 m滤膜进行无菌过滤；
(8)分装，4t:保存，即得到抗猪圆环病病毒转移因子原液。
实施例2: 抗猪圆环病病毒转移因子的制备 1、将猪圆环病病毒接种于9 11日龄鸡胚尿囊液37t:培养72h。取鸡胚尿囊 液，-2(TC反复冻融5次，5000rpm离心30min，弃去沉淀收集上清液； 2、取上清液，上清液用蔗糖密度梯度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为15%、30%、 45%、60%、75%， 180000rpm离心3小时，根据猪圆环病病毒分子量确定猪圆环病病毒所在 离心管的位置，吸出备用； 3、得到的猪圆环病病毒抗原免疫猪，挑选健康免疫猪，将上述提取的病毒抗原皮 下多点注射免疫猪，共免疫4次。每次免疫间隔一周，最后一次免疫IO天后取猪静脉血，以 免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰 杀猪，取脾脏于-2(TC保存，备用； 4、从得到的猪脾脏提取抗猪圆环病病毒转移因子 (1)先用注射用水洗净脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；
(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入2倍冷的lOmmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎机 1500rpm捣碎3次，每次5min，制得猪脾匀桨液；
(3)猪脾匀桨液用超声波(4KW、3KHz)处理10min ; (4)将(3)中得到的匀桨液用加入O. lX柠檬酸，混匀，4。C，6000rpm离心30min， 收集上清液； (5)上清液用0. 2 ii m中空纤维柱微滤，收集滤出液； (6)滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；
(7)将超滤得到的滤液用0. 22 ii m滤膜进行无菌过滤；
(8)分装，4t:保存，即得到抗猪圆环病病毒转移因子原液。
实施例3 : 对本发明所述工艺制备的抗猪圆环病病毒转移因子的检测
对实施例1、2所述工艺制备的抗猪圆环病病毒转移因子进行以下检测 1、紫外分光光度测定上述所得样品在252±2nm处有一吸收峰，且ABS26。/ABS28。
> 2. 0。 2、标准液为淡黄色，pH值在6. 0 8. 0之间。 3、细菌学检验上述所得样品中无需氧、厌氧、腐生菌和真菌存在。 4、20%磺基水杨酸检测上述所得样品无浑浊及沉淀现象，说明蛋白反应均成阴
性，其不含大分子蛋白质。 5、核酸含量测定上述所得样品经地衣酚法测定核酸含量分别为603. 14 y g/mL、 594. 55 ii g/mL。 6、多肽含量测定上述所得样品经Lowry法测定多肽含量分别为7. 08mg/mL、 6. 88mg/mL。 7、转移因子活性测定根据转移因子可使脱E受体后的胸腺T细胞恢复其受体功 能，从而反应转移因子的生物活性。上述所得样品形成E玫瑰花结的百分率分别为30. 5% 、 28. 4%，比对照组分别增加18. 9%、16. 8% (P《0. 01)。 8、过敏性、毒性试验取健康小白鼠10只，雌雄各半，口服本品浓縮液，相当于正 常口服剂量的IOO倍，观察小白鼠的生存能力的变化，结果无任何过敏、毒性反应，也无任 何死亡出现，说明本品是安全的，无任何毒性和副作用。 9、用猪圆环病病毒抗原做皮试检测，有弱的阳性反应，说明本品具有良好的转移 活性和特异性。 通过上述实施例，我们发现所提取的抗猪圆环病转移因子可以全面抑制猪圆环病 病毒，能保护正常机体细胞免受猪圆环病病毒的感染。因此使用本发明的转移因子可以起 到预防猪圆环病、保护正常机体细胞免受猪圆环病病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时 对于遭受到猪圆环病病毒感染的猪使用该转移因子进行治疗，可以有效改善临床症状，提 高治愈率、降低死亡率。
权利要求
一种抗猪圆环病病毒的转移因子的制备方法，其步骤包括(1)先用注射用水洗净用猪圆环病病毒抗原免疫过的猪脾脏，去其表面的筋膜、脂肪等组织，再用生理盐水冲洗；(2)将洗净的猪脾脏剪碎，加入1～2倍冷的10mmol PBS缓冲液，用高速组织捣碎机1000～3000rpm捣碎3～5次，每次3～5min，制得猪脾匀浆液；(3)猪脾匀浆液用超声波(4KW、3KHz)处理5～10min；(4)将步骤(3)中得到的匀浆液用HCl调pH5.0～6.0或者加入0.1～0.3％柠檬酸，4℃，3000～8000rpm离心10～30min，收集上清液；(5)上清液用0.2μm中空纤维柱微滤，滤出液再用截留分子量为6000道尔顿的中空纤维柱超滤，收集滤出液；(6)将超滤得到的滤液用0.22μm滤膜进行无菌过滤，即得到抗猪圆环病病毒转移因子原液，4℃保存。
2. 权利要求1所述的方法，其中在实施上述步骤之前，还包括制备病毒抗原、提取病毒 抗原、病毒抗原免疫猪等步骤。
3. 权利要求2所述的方法，其中所述的制备病毒抗原步骤，包括将猪圆环病病毒接种 于9 11日龄鸡胚尿囊液30 4(TC培养24 72h。取鸡胚尿囊液，_201:反复冻融4 8次，3000 8000rpm离心10 30min，弃去沉淀收集上清液。
4. 权利要求2所述的方法，其中所述的提取病毒抗原步骤，包括上清液用蔗糖密度梯 度离心纯化提取病毒，蔗糖浓度为10 % 80%， 150000 200000rpm离心2 4小时，根据 猪圆环病病毒分子量确定猪圆环病病毒所在离心管的位置，吸出备用。
5. 权利要求2所述的方法，其中所述的病毒抗原免疫猪步骤，包括挑选健康免疫猪， 将上述提取的病毒抗原皮下多点注射免疫猪，共免疫3 5次。每次免疫间隔一周，最后一 次免疫7 10天后取猪静脉血，以免疫荧光法或ELISA法检测上述病毒的特异性抗体效 价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀猪，取脾脏于-20°C保存，备用。
6. 权利要求1或2所述的方法，其中猪圆环病病毒株选自本申请人保藏的 PCV-II(Genbankaccession NO. AF027217或Genbank accession NO. AF201897)。
7. 权利要求1至6的方法所制备的转移因子。
全文摘要
本发明公开了一种天然高效抗猪圆环病病毒转移因子的制备方法，包括制备病毒抗原、提取病毒抗原、病毒抗原免疫猪、从免疫猪的脾脏中提取抗猪圆环病转移因子等步骤。使用本发明的转移因子可以起到预防猪圆环病病毒、保护正常机体细胞免受猪圆环病病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时对于遭受到猪圆环病病毒感染的猪使用该转移因子进行治疗，可以有效改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。
文档编号C07K1/34GK101759774SQ20081015434
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者李旭东, 管于平, 苏建东 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司