瘦蛋白融合蛋白的制作方法

专利名称：瘦蛋白融合蛋白的制作方法
瘦蛋白融合蛋白本发明涉及瘦蛋白融合多肽和二聚体；所述多肽编码的核酸分子和使用所述多肽或二聚体的治疗方法。细胞因子受体可分为三个单独的组。1类(称为造血生成素(haemotopoietin)或 生长激素家族)受体特征在于其胞外结构域的氨基末端部分有四个保守的半胱氨酸残基， 并且在C末端部分存在保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序。受体由两个多肽链组成。1类 受体可被再分为GM-CSF亚家族(该亚家族包括IL-3、IL-5、GM-CSF、GCSF)和IL-6亚家族 (该亚家族包括IL-6、IL-Il和IL-12)。在IL-6亚家族中，存在与一个或两个不同的细胞 因子亚基缔合的共同的转导(tranduscing)亚基(gpl30)。还存在称为IL-2亚家族(包括 IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15)的亚家族。重复的半胱氨酸基序也存在于2类(干扰素 受体家族)中，其配体为α、β和Y干扰素，但是缺少保守的Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser基序。人类瘦蛋白是由人类的1印基因和小鼠的ob基因编码的16kD蛋白激素。瘦蛋白 通过瘦蛋白受体发挥作用，该受体是细胞因子家族中的单跨膜受体。在人类中，存在编码瘦 蛋白的单一基因，其包括三个外显子和两个内含子，并横跨大约18kb的基因组DNA。瘦蛋 白把营养状态和免疫系统联系在一起来控制尤其是食欲和免疫功能。瘦蛋白或其受体出现 突变可导致肥胖的表型，并伴有肥胖相关的次级症状(例如心脏病、II型糖尿病)。瘦蛋白 主要由与体重指数(BMI)成比例的脂肪组织产生，而由器官如胃和胎盘产生的瘦蛋白水平 较低。瘦蛋白通过抑制食物的摄取和刺激能量消耗来调节体重。此外，瘦蛋白影响先天免 疫性和适应免疫性两方面。对于先天免疫性，瘦蛋白调控嗜中性粒细胞活性，增加单核细胞 /巨噬细胞的吞噬作用，并增强急性期应答的炎性调节物的分泌。对于适应免疫性，瘦蛋白 促进幼稚T细胞的增殖和白细胞介素2 (IL-2)分泌；而对于记忆T细胞，它通过增加干扰 素-Y (INF- γ )和肿瘤坏死因子-α (TNF- α分泌)促进向辅助T细胞1 (Thl)免疫应答的 转换。如果瘦蛋白的表达和/或生成被扰乱，那么疾病的病理学表现会因对能量代谢和 免疫状态的影响而变得复杂。除了已确定的与肥胖的联系以外，瘦蛋白的减少也与不育、骨 质疏松和免疫抑制有关。本公开涉及具有改善的药物代谢动力学(PK)和活性的瘦蛋白重组形式的鉴定。 新的瘦蛋白分子具有生物活性，形成二聚体，并具有改进的稳定性。根据本发明的一个方面，提供了核酸分子，该核酸分子包含编码具有瘦蛋白活性 的多肽的核酸序列，所述多肽包含直接或间接地连接到瘦蛋白受体多肽的至少一个瘦蛋白 结合域的瘦蛋白多肽。根据本发明的一个方面，提供了融合多肽，该融合多肽包含直接或间接地连接到 瘦蛋白受体多肽的至少一个瘦蛋白结合域的瘦蛋白多肽或其活性部分的氨基酸序列。在本发明优选的实施方案中，所述融合多肽包含两个瘦蛋白结合域。在本发明的另外的优选的实施方案中，所述融合多肽包含一个免疫球蛋白样结构 域。在本发明优选的实施方案中，所述融合多肽包含至少一个细胞因子样同源性结构域；优选地两个细胞因子样同源性结构域。在本发明又另外的优选的实施方案中，所述融合多肽包含至少一个纤维连接蛋白III结合域；优选地两个纤维连接蛋白III结合域。在本发明优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸残基 428-535。在本发明优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸残基 536-635。在本发明优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸残基 326-437。在本发明优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸残基 62-178。在本发明优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸残基 235-325。在本发明优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸残基 639-732。在本发明优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸残基 734-829。在本发明优选的实施方案中，所述融合多肽包含SEQ ID N0:41的氨基酸残基 428-635。在本发明优选的实施方案中，所述瘦蛋白多肽连接到瘦蛋白受体的至少一个瘦蛋 白结合域，其中在所述融合多肽中，所述瘦蛋白多肽被置于所述瘦蛋白结合域的氨基末端。在本发明优选的实施方案中，所述瘦蛋白多肽连接到瘦蛋白受体的至少一个瘦蛋 白结合域，其中在所述融合多肽中，所述瘦蛋白多肽被置于所述瘦蛋白结合域的羧基末端。在本发明优选的实施方案中，所述瘦蛋白多肽通过肽连接体、优选地柔性连接体 连接到瘦蛋白受体多肽的至少一个结合域。在本发明优选的实施方案中，所述肽连接分子包含至少一个拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0在本发明优选的实施方案中，所述肽连接分子包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个拷贝 的肽 Gly Gly Gly Gly Ser0优选地所述肽连接分子由6个拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser组成。优选地所述肽连接分子由8个拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser组成。在本发明可选的实施方案中，所述多肽不包含肽连接分子，而是瘦蛋白多肽和瘦 蛋白受体多肽的至少一个瘦蛋白结合域的直接融合体。根据本发明的一个方面，提供了核酸分子，所述核酸分子包含选自下列的核酸序 列i)SEQ ID NO 3所示的核酸序列；ii)SEQ ID NO 5所示的核酸序列；iii)SEQ ID NO 7所示的核酸序列；iv) SEQ ID NO 9所示的核酸序列；
ν) SEQ ID NO 11所示的核酸序列；vi) SEQ ID NO 13所示的核酸序列；vii) SEQ ID NO 15所示的核酸序列；viii)SEQ ID NO 17 所示的核酸序列；ix) SEQ ID NO 19所示的核酸序列；x) SEQ ID NO 21所示的核酸序列；xi) SEQ ID NO 23所示的核酸序列；xii) SEQ ID NO 25所示的核酸序列；xiii)SEQ ID NO 27 所示的核酸序列；核酸分子，该核酸分子包含在严格杂交条件下与SEQ IDN0:3、5、7、9、11、13、15、 17、19、21、23、25或27杂交的核酸序列并且编码具有瘦蛋白受体调节活性的多肽。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子编码瘦蛋白激动剂。在本发明可选的优选的实施方案中，所述核酸分子编码瘦蛋白拮抗剂。当两条互补的核酸分子经历一定数量的氢键键合时，即发生核酸分子的杂交。杂 交的严格性可根据核酸分子周围的环境条件、杂交方法的特性和所使用的核酸分子的组成 和长度而变化。关于获得特定程度严格性所需的杂交条件的计算方法在Sambrook等人， Molecular Cloning :A LaboratoryManual (分子克隆实验室手册)(Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY,2001)；禾口 Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes (生 物化学与分子生物学实验室技术一核酸探针杂交)，第I部分，第2章(Elsevier，NewYork， 1993)中被论述。Tm是核酸分子的50%的给定链与其互补链杂交时的温度。下列是杂交条 件的示例性设定并且是非限制性的超高严格性(允许共有至少90%同一性的序列杂交)杂交5x SSC 在 65 °C 16 小时漂洗两次 2x SSC在室温(RT)每次15分钟漂洗两次 0.5x SSC在65°C每次20分钟高严格性(允许共有至少80%同一性的序列杂交)杂交5x_6x SSC 在 65 °C -70 °C 16-20 小时漂洗两次 2x SSC在室温每次5-20分钟漂洗两次 Ix SSC在55°C _70°C每次30分钟低严格性(允许共有至少50%同一性的序列杂交)杂交6x SSC在室温至55 °C 16-20小时漂洗至少两次2x-3x SSC在室温至55°C每次20_30分钟。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ IDNO 3所示的核酸序列或 由其组成。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 5所示的核酸序列或 由其组成。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 7所示的核酸序列或
由其组成。
在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO 9所示的核酸序列或
由其组成。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :11所示的核酸序列或
由其组成。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :13所示的核酸序列或
由其组成。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :17所示的核酸序列或
由其组成。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :19所示的核酸序列或
由其组成。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :21所示的核酸序列或
由其组成。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :23所示的核酸序列或
由其组成。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :25所示的核酸序列或
由其组成。在本发明优选的实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO :27所示的核酸序列或
由其组成。根据本发明的一个方面，提供了多肽，该多肽由根据本发明的核酸编码。根据本发明的另外的方面，提供了多肽，该多肽包含SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 所示的氨基酸序列或
由其组成。根据本发明的一个方面，提供了同型二聚体，所述同型二聚体由两个多肽组成，其 中每个所述多肽包含i)包含瘦蛋白或其受体结合域的第一部分，该第一部分任选地通过肽连接分子连 接到ii)包含瘦蛋白受体的至少一个瘦蛋白结合域或其部分的第二部分。在本发明优选的实施方案中，所述同型二聚体包含两个多肽，所述多肽包含SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39
或40或者由其组成。根据本发明的另外的方面，提供了载体，该载体包含根据本发明的核酸分子。在本发明优选的实施方案中，所述载体是适于表达根据本发明的核酸分子的表达 载体。包括根据本发明的核酸的载体不必包括启动子或其它调控序列，特别是当所述载 体被用于将核酸引入细胞以重组到基因组用于稳定转染时。优选地载体中的核酸被可操作 地连接到适当的启动子或其它调控元件以在宿主细胞中转录。该载体可能是在多个宿主中 发挥作用双功能表达载体。通过“启动子”意指转录起始位点上游的核苷酸序列，并且该序 列含有转录所需的全部调控区域。适合的启动子包括用于在真核或原核细胞中表达的组成 型的、组织特异性的、可诱导的、发育的或其它启动子。“可操作地连接”意指作为相同核酸分子的部分连接，适当地定位并定向以从启动子起始转录。可操作地连接到启动子的DNA 是启动子“转录起始调控下的”。在优选的实施方案中，启动子是组成型的、可诱导的或可调控的启动子。根据本发明的另外的方面，提供了细胞，该细胞用根据本发明的核酸分子或载体 转染或转化。优选地所述细胞是真核细胞。可选地所述细胞是原核细胞。在本发明优选的实施方案中，所述细胞选自由下列组成的组真菌细胞(例如毕 赤酵母属(Pichia spp)、酵母属(Saccharomyces spp)、链孢霉属(Neurospora spp))；昆 虫细胞(例如灰翅夜蛾属(Spodoptera spp))；哺乳动物细胞(例如COS细胞、CHO细胞)； 植物细胞。根据本发明的另外的方面，提供了药物组合物，该药物组合物包含根据本发明的 多肽，包含赋形剂或载体。在本发明优选的实施方案中，所述药物组合物与另外的治疗剂组合。施用时本发明的药物组合物以药学上可接受的制品施用。此类制品可常规地含有 药学上可接受的浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体和任选地其它治疗剂。本发明的药物组合物可以通过任何常规的路线施用，包括注射。施用和应用可以 例如是口服的、静脉内的、腹膜内的、肌肉内的、腔内的、关节内的、皮下的、局部的(眼睛)、 皮肤的(例如乳膏状脂溶性插入物，插入皮肤或粘膜)、透皮的或鼻内的。本发明的药物组合物按有效量施用。“有效量”是指单独或与另外的剂量或协同的 药物一起产生预期的反应的药物/组合物的量。这可包括仅暂时地减缓疾病的进展，尽管 更优选地是，它包括永久地终止疾病的进展。这可以通过常规方法监测或者可以根据诊断 方法监测。受治疗者施用的药物组合物的剂量可以依照不同的参数进行选择，特别是依照使 用的施用方式和受治疗者的状态(即年龄、性别)。施用时，本发明的药物组成以药学上可 接受的量和药学上可接受的组合物应用。当在药品中使用时，盐应该是药学上可接受的，但 是非药学上可接受的盐可被方便地用于制备其药学上可接受的盐，并且不被排除在本发明 的范围之外。此类药理学和药学上可接受的盐包括但不限于从下列酸制备的那些盐盐酸、 氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸及类似酸。而 且，药学上可接受的盐可以被制成碱金属盐或碱土盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。如果需要，药物组合物可以与药学上可接受的载体组合。在此处用到的术语“药学 上可接受的载体”意指适于施用于人类的一种或多种相容的固体或液体填充物、稀释剂或 包封物质。术语“载体”意指天然的或合成的有机或无机的成分，其与活性成分组合以助应 用。药物组合物的成分也能够以没有将显著损害所期望的药物功效的相互作用的方式与本 发明的分子以及与彼此共混。药物组合物可能含有适当的缓冲剂，包括盐形式的乙酸；盐形式的柠檬酸；盐形 式的硼酸；和盐形式的磷酸。药物组合物也可含有任选地适当的防腐剂，如氯化苯甲烃铵、氯丁醇、对羟基苯 甲酸酯类和硫柳汞。药物组合物可能方便地被制成单位剂型，并可能被通过药剂学领域熟知的任一方法制备。所有的方法包括将活性剂与组成一种或多种的助剂的载体联合的步骤。通常，该组合物通过以下制备将活性化合物与液态载体、精细分离的固态载体、或者两者均勻并紧 密地联合，然后，如有需要，塑形该产品。适于口服施用的组合物可被制备为离散的单元，例如胶囊、片剂、锭剂，每种都包 含预定量的活性化合物。其它的组合物包括于含水液体或不含水液体中的悬浮液如糖浆 齐U、酏剂或乳剂。适于肠胃外施用的组合物方便地包含无菌的含水或非含水制品，优选地与受者 (recipient)的血液等渗。此制品可根据使用适当的分散剂或湿润剂以及悬浮剂的已知的 方法制备。无菌的可注射的制品还可是溶于无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无 菌的可注射的溶液或悬浮液，例如溶于1，3_ 丁二醇中的溶液。可被使用的可接受的溶剂 是水、林格溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发油被常规地用作溶剂或悬浮介 质。对于此为目的，任何温和的不挥发油可被使用，包括合成的甘油单酯或二酯。此外，月旨 肪酸如油酸，可能被用于制备注射剂。适于口服、皮下、静脉内、肌肉内等施用的载体配方可 在 Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明顿药物禾斗学)，Mack Publishing Co., Easton，PA 中找到。根据本发明的另外的方面，提供了治疗患有将从施用瘦蛋白激动剂受益的病况的 人类受治疗者的方法，其包括施用有效量的至少一种根据本发明的多肽。在本发明优选的方法中，所述病况是肥胖。在本发明的另外的优选的方法中，所述病况是肥胖相关的病况。在本发明优选的方法中，所述肥胖相关的病况是II型糖尿病。在本发明优选的方法中，所述肥胖相关的病况是心脏病。在本发明可选择的优选的方法中，所述病况是免疫抑制。根据本发明的另外的方面，提供了治疗患有将从施用瘦蛋白拮抗剂受益的病况的 人类受治疗者的方法，其包括施用有效量的至少一种根据本发明的多肽。在本发明优选的方法中，所述病况是厌食症。在本发明的另外的优选的方法中，所述病况是自身免疫疾病。在本发明优选的方法中，所述自身免疫疾病选自由以下组成的组多发性硬 化、I型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性肝炎、类风湿性关节炎、自身免疫性 结肠炎、克隆氏病、乳糜泻、自身免疫性肾炎、自身免疫性神经病(guillan Barre)、脑病 (Rasmussen)、纤维性肺泡炎。在本发明优选的方法中，所述多肽通过静脉内施用。在本发明可选择的优选的方法中，所述多肽通过皮下施用在本发明的另外的优选的方法中，所述多肽以两天的间隔施用；优选地所述多肽 以每周、每2周或每月的间隔施用。根据本发明的另外的方面，提供了单克隆抗体，该单克隆抗体结合根据本发明的 多肽或二聚体。优选地所述单克隆抗体是结合所述多肽或二聚体但不具体地特异性结合瘦蛋白 或瘦蛋白受体的抗体。所述单克隆抗体结合通过本发明的多肽或包含本发明的多肽的二聚体而呈递的构象抗原。在本发明的另外的方面，提供了制备产生根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，该方法包含下列步骤i)使用含有至少一种根据本发明的多肽的免疫原使免疫活性的哺乳动物免疫；ii)将免疫的免疫活性的哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细 胞；iii)根据对(i)中的多肽的结合活性，筛选通过步骤(ii)的杂交瘤细胞生产的单 克隆抗体；iv)培养杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；以及ν)从培养上清液回收单克隆抗体。优选地，所述免疫活性的哺乳动物是小鼠。可选择地，所述免疫活性的哺乳动物是 大鼠。用杂交瘤细胞产生单克隆抗体是本领域所共知的。用来产生单克隆抗体的方法 由 Kohler 和 Milstein 在 Nature 256,495-497(1975)上公开，并且也被 Donillard 和 Hoffman ^ Basic Facts about Hybridomas ( ^Τ^^^^^ ^^ ), T Compendium of Immunology (免疫学概要)第VII版，Schwartz, 1981公开，其通过引用并入。根据本发明另外的方面，提供了杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系通过根据本发明 的方法获得或是可获得的。遍及本说明书的描述和权利要求，词“包含”(comprise)和“含有”以及所述词的 变体例如“包含”(comprising)和“包含”(comprises)意指“包括但不限于”，并且不意图 (并且不)排除其他的部分、添加剂、成分、整数或步骤。遍及本说明书的描述和权利要求，除非上下文另外要求，单数包含复数。尤其是当 使用不定冠词时，除非上下文另外要求，说明书应被理解为考虑复数以及单数。连同本发明的特定的方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化 学部分或组应被理解为除非与其矛盾，则可用于本文描述的任何其他的方面、实施方案或 实施例。现在将仅通过实施例并引用下列附图来描述本发明的实施方案表ILR融合体的命名；表2瘦蛋白LR-融合体的表达水平，使用抗瘦蛋白受体的抗体通过ELISA检测(nd =未检测到)；图Ia是细菌表达的瘦蛋白的核酸序列；图Ib是氨基酸序列；图2a是LR 2A1的核酸序列；图2b是LR 2A1的氨基酸序列；图3a是LR 2A1的核酸序列；图3b是适合细菌表达的LR 2A1的氨基酸序列；图4a是LR 2B1的核酸序列；图4b是LR 2B1的氨基酸序列；图5a是LR 2D1的核酸序列；图5b是LR 2D1的氨基酸序列；图6a是LR 2E1的核酸序列；图6b是LR 2E1的氨基酸序列；图7a是LR 2F1的核酸序列；图7b是LR 2F1的氨基酸序列；图8a是LR 2G1的核酸序列；图8b是LR 2G1的氨基酸序列；图9a是LR 2H1的核酸序列；图9b是LR 2H1的氨基酸序列；
图IOa是LR 211的核酸序列；图IOb是LR 211的氨基酸序列；图Ila是LR 2Jl的核酸序列；图lib是LR 2Jl的氨基酸序列；

图12a是LR 2K1的核酸序列；图12b是LR 2K1的氨基酸序列；图13a是LR 2L1的核酸序列；图13b是LR 2L1的氨基酸序列；
图14a是LR 2M1的核酸序列；图14b是LR 2M1的氨基酸序列；图15a)将瘦蛋白结合域(LBD)连接到表达载体pSecTag以产生 pSecTaglinkSSLBD。b)将瘦蛋白连接到 pSecTaglinkSSLBD 以产生 pSecTag2Al (Im)。c)合 成DNA并将其连接到PSecTag2Al (Im)以引入(G4S)5 ；图16表达瘦蛋白LR-融合体的CHO细胞的培养基的蛋白质印迹。各泳道的内 容为:12A1 表达；2. 2B1 表达；3. 2D1 表达；4.分子量标记(20、25、37、50、75、100、150、 200kDa)。蛋白质印迹以抗瘦蛋白的抗体为探针检测。图17a)将瘦蛋白受体胞外结构域(ObRex)连接到表达载体pSecTag以产生 pSecTaglinkSSObRex。b)将瘦蛋白连接到 pSecTaglinkSSObRex 以产生 pSecTag2Bl (Im)。 c)合成DNA并将其连接到PSecTag2Bl (Im)以引入(G4S)5 ；图18a)使用PCR产生由侧翼为适合的限制性位点(包含在引物Rl_4中)的感兴 趣的基因组成的DNA。b)将PCR产物连接至适合的载体中的连接体区域的任一侧。c)之后 修饰构建体以引入正确的连接体，其不含有任何不需要的序列(即非天然的限制性位点)；图19a)设计寡核苷酸以形成具有独特的重叠的部分双链区域，并且当被退火和 加工时，所述寡核苷酸将编码将退火至配体和受体的具有侧翼区的连接体，b)使用“大引 物” (megaprimer)和末端引物(Rl和R2)进行PCR以产生LR-融合体基因。Rl和R2引物 被设计为引入用于连接至靶载体的有用的侧翼限制性位点；图20是全长瘦蛋白受体的氨基酸序列；图21是瘦蛋白LR-融合体构建体的概略图。图22是表达2A1、2B1和2D1构建体的CHO Flp-In稳定细胞系的免疫印迹分析。 泳道 M =分子量标记(250、150、100、75、50、37、25 和 20kDa)；泳道 1 = CHO Flp-In 对照细 胞，泳道2 = 2A1表达培养基，泳道3 = 2B1表达培养基，泳道4 = 2D1表达培养基；图23是2AlEcopt的表达。A)显示2AlEcopt的表达的考马斯(Coomassie)染色 胶。泳道M=分子量标记(250、150、100、75、50、37、25、20和15kDa)；泳道1 =诱导时的表 达；泳道2 =诱导后4小时的表达；泳道3 =诱导后并孵育过夜的表达；泳道4 = 2AlEcopt 表达细胞的不可溶级分；泳道5 = 2AlEcopt表达细胞的可溶级分。B)2AlEcopt表达的免 疫印迹。泳道M=分子量标记(250、150、100、75、50、37、25、20和15kDa)；泳道1 =诱导时 的表达；泳道2 =诱导后4小时的表达；泳道3 =诱导后孵育过夜的表达；图24是2A1 Ecopt的包涵体制备物的考马斯染色的SDS-PAGE胶。泳道M =分 子量标记(250、150、100、75、50、37、25 和 20kDa)；泳道 1 =大肠杆菌(E. coli)BL21 (DE3) 2AlEcopt的全细胞；泳道2 =细胞裂解物一可溶级分；泳道3 =细胞裂解物一不可溶级 分；泳道4-7 = 2%的脱氧胆酸钠漂洗1-4次；泳道8-9 =水漂洗1-2次；泳道10 =包涵体 制备物。图25是表达2A1的CHO Flp-In细胞的粗培养基的体外生物测定。在瘦蛋白体外 生物测定中，表达2A1的CHO Flp-In细胞的粗培养基(IOx浓缩物)被用于刺激细胞。培养基具有激动剂活性，来自王表达2A1的细胞的培养基无活性(黑色柱)；和图26是纯化的2AlEcopt的体外生物测定。在免疫印迹中在2AlEcopt正确大小的 位置显示单一条带的再折叠的2A1 Ecopt样品被用于在瘦蛋白体外生物测定中刺激细胞。 样品显示激动剂活性。材料与方法体外检骑检测和评估瘦蛋白活性的体外方法是本领域已知的。例如参见 Liu ^ 人(Endocrinology (1997) 138,8 :p3548-3554) , White ^ 人(J. Biol Chemistry (1997) 272 (7) :p4065_4071)和 Maamra 等人(Endocrinology (2007) 142(10) 4389-4393)，上述每篇文章描述了尤其是在基于细胞的分析中瘦蛋白受体的表达。此外，用双萤光素酶生物测定检测瘦蛋白LR-融合体的体外活性。简要地，用表 达SIE诱导的萤火虫萤光素酶、瘦蛋白受体(ObR)、STAT3和海肾(Renilla)萤光素酶(后 三种蛋白是组成型表达)的质粒转染MCF-7哺乳动物细胞。24小时以后，该细胞被瘦蛋白 LR-融合体刺激6小时。裂解细胞并测定萤火虫萤光素酶活性，这与LR-融合体对瘦蛋白受 体的刺激成比例。将此值除以组成型表达的海肾萤光素酶的活性给出修正了实验误差的活 性。体内检骑体内动物模型是本领域中已知的。ob/ob小鼠模型(Zhang等人Nature (1994) 372 425-432)是瘦蛋白突变的纯合体，并已被用于评估瘦蛋白激动剂和拮抗剂的活性；参 见 Chehab 等人(Nature Genetics(1996) 12 :318_320) ；Lord 等人(Nature(1998)394 897-901)；和 Pellymounter 等人(Science (1995) 269 :540_542)。免疫学检验测量配体或受体与多克隆和单克隆抗体的结合的免疫测定是本领域中已知的。商 业可得的抗体可用于检测样品中的配体或受体，并且也能用于竞争性抑制研究。例如，参见 http//www, abeam, com/index, html，AbcamPLC0融合蛋白的重组生产融合蛋白的组件通过PCR产生，所述PCR使用设计为与配体或受体退火和引入用 于克隆至靶载体的适合的限制性位点的引物(图Xla)。PCR的模板包含靶基因并且从IMAGE 克隆、cDNA文库或从定制合成的基因获得。一旦合成具有适当的侧翼限制性位点的配体和 受体基因合成，之后将这些基因连接到靶载体中连接体区域的任何一侧(图Xlb)。之后通 过将定制合成长度的DNA插入连接体区域任一侧的两个独特的限制性位点之间、通过经由 ssDNA修饰技术的连接体区域的突变、通过将引物双链体/多链体插入适合的限制性位点 之间或通过PCR修饰将构建体修饰为含有无侧翼限制性位点的正确的连接体(图Xlc)。可选地，设计为与所选择的配体或受体结构域退火的具有侧翼序列的连接体通过 产生寡核苷酸双链体来初始合成，并且其被加工以产生双链的DNA (图X2a)。之后进行PCR， 所述PCR使用所述连接体序列作为“大引物”，设计为针对与“大引物”退火配体和受体的相 反末端的引物，并用配体和受体作为模板。末端引物被设计为具有用于连接至所选择的表 达载体的适合的限制性位点(图X2b)。融合蛋白的表达和纯化
在适当的体系(例如哺乳动物CHO细胞、大肠杆菌等)中进行表达并且这取决于 产生LR-融合体基因的载体。之后使用不同的方法分析表达，这可包括SDS-PAGE、非变性 PAGE、蛋白质印迹、ELISA中的一种或多种。一旦达到合适的表达水平，就以更大规模表达LR-融合体以产生足够的蛋白用于 纯化和而后的分析。使用适当组合的一种或多种色谱手段进行纯化，如离子交换色谱法、疏水相互作 用色谱法、硫酸铵沉淀法、凝胶过滤法、尺寸排阻色谱法和/或亲和色谱法(利用镍/钴树 月旨、抗体固定的树脂和/或配体/受体固定的树脂)。使用不同方法对纯化的蛋白进行分析，这些方法可包括Bradford测定、 SDS-PAGE、非变性PAGE、蛋白质印迹、ELISA中的一种或多种。LR-融合体的特件变性PAGE、非变性PAGE胶和蛋白质印迹被用于分析融合多肽，并且使用对LR-融 合体非构象地(non-conformationally)敏感的抗体进行蛋白质印迹。非变性溶解状态分 子量信息可以通过例如使用Superose G200分析柱的尺寸排阻色谱法和分析型超速离心的 技术获得。LR-融合体的构津通过产生在任一端具有独特的相容的限制性位点的0b、LBD、ObREc和连接体组 件，并将它们连接到一起形成完整的基因，来合成2A1、2B1和2D1基因。随后通过将定制合 成的DNA片段(Genecust，France)连接到0b、LBD和ObREc基因的独特的限制性位点之间 除去2B1和2D1中的外来序列(即限制性位点)，这样产生了 2B2和2D2。2AlEcopt基因通 过定制DNA合成并连接到pET21a+来产生。2A1 Ecopt序列进行密码子优化以在大肠杆菌 中表达，并具有C末端His标签。LR-融合体的表达哺乳动物表达使用修饰的Invitrogen 载体 pSecTag-V5/FRT_Hist 在 6 孔板中使用 Fugene-6 作 为转染试剂产生稳定的细胞系。用表达载体和P0G44共转染CHO Flp-In细胞，pOG44是表 达导致LR-融合体基因重组到细胞染色体“热点”的flp重组酶的质粒。潮霉素B被用于 选择具有阳性重组体的细胞。一旦建立了稳定细胞系，它们在75cm2培养皿中生长达到50_70%融合度 (confluency)时，培养基被换成无血清培养基。培养物再孵育2_4天，此后采集培养基样 品。样品在13% SDS-PAGE胶上分离并转移至PVDF膜用于免疫印迹。在溶于PBS+0.05% (ν/ν)吐温20的5% (w/v)乳蛋白中封闭后，使用特异性抗瘦蛋白抗体与轭合第二抗体的 辣根过氧化物酶(HRP) —起进行样品检测。使用HRP检测试剂盒通过照相胶片的化学发光 来显影显示来自哺乳动物体系的LR-融合体表达的免疫印迹如图22所示。大肠杆菌表达将pET21a+ :2AlEcopt转化到化学感受态大肠杆菌BL21 (DE3)细胞。而后表达2A1 Ecopt的克隆在补充了羧苄青霉素(100yg/ml)的LB培养基中生长，并于室温在平板摇床 上生长。用ImM IPTG在OD6tltl为0.4时进行诱导，并且使培养物生长过夜。而后收集并裂解细胞，在SDS-PAGE胶上分离样品，并进行考马斯染色或免疫印迹。显示来自大肠杆菌体系的LR-融合体表达的免疫印迹如图23所示。LR-融合体的纯化大肠杆菌表汰的LR-融合体的纯化(2AlEcoDt)在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中表达来自质粒pET21a+:2A1 Ecopt的2A1 Ecopt0使用Ni-Probond树脂柱纯化2A1 Ecopt。将裂解细胞的不溶级分用2%脱氧胆酸 钠漂洗四次，并用蒸馏水漂洗两次，从而获得包涵体制备物。该步骤去除了大多数的污染蛋 白，得到纯度> 80%的2A1 Ecopt ；图24。Mt如果两组的方差是正态分布，用学生检验(Student' s test)进行比较；或者如 果不是正态分布，用学生-萨脱斯威特检验(Student-Satterthwaite' stest)进行比较。 用F检验来检验分布。使用单向ANOVA比较3组或更多组的平均值，并且如果显著性水平 为ρ < 0. 05，用邓奈特检验(Durmett' s tests)进行个体比较。所有的统计检验在5%显 著性水平是双侧的，并且不对漏失值进行填补(imputation)。实施例1 :2A1侧翼为BamHI和HindIII的编码瘦蛋白受体(ObR)的瘦蛋白结合域(LBD)的DNA 通过PCR产生。该DNA而后被连接到修饰过的pSecTag-FRT-V5-His TOPO载体以产生 PSecTagLinkSSLBD (图15a)。侧翼为NheI和BamHI的编码瘦蛋白的DNA由使用引物Nh eObssF (5‘ -gggaaagctagccaccatgcattggggaaccctgtgcg-3‘)和ObBamR(5‘ -gggaaagga tccgcacccagggctgaggtcc-3 ‘)的 PCR 产生。该 DNA 被连接到 pSecTagLinkSSLBD 以产生 PSecTag2Al (Im)(图15b)。在AleI和NsiI限制性位点之间定制合成连接体区域，并且将 其插入到 pSecTag2Al (Im)以获得 pSecTag2Alstop (图 15c)。将 pSecTag2Alstop 转染到中 国仓鼠卵巢(CHO)细胞，并开发瞬时表达细胞系和稳定表达细胞系。然而使用抗瘦蛋白抗 体进行的表达培养基的蛋白质印迹显示2A1被表达(图16)。2A1也在大肠杆菌细胞中表 达。反向翻译2A1的氨基酸序列并进行大肠杆菌密码子使用优化。定制基因合成密码子优 化的基因(2AlEcopt)，而后将其插入到pET21a+表达载体并在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中 表达蛋白。实施例2 :2B1侧翼为BamHI和HindIII的编码瘦蛋白受体胞外域(ObRex)的DNA通过 PCR产生。该DNA而后被连接到修饰过的pSecTag-FRT-V5-His TOPO载体以产生 PSecTagLinkSSObRex(图17a)。侧翼为NheI和HindIII的编码瘦蛋白的DNA由使用引物 NheObssF (5‘ -gggaaagctagccaccatgcattggggaaccctgtgcg-3‘)和ObBamR(5‘ -gggaaag gatccgcacccagggctgaggtcc-3 ‘)的 PCR 产生。该 DNA 而后被连接到 pSecTagLinkSSObRex 以产生pSecTag2Bl (Im)(图17b)。在AleI和BstBI限制性位点之间定制合成连接体区域， 并且将其插入到 pSecTag2Bl(Im)以获得 pSecTag2Blstop (图 17c)。将 pSecTag2Blstop 转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，并开发瞬时表达细胞系和稳定表达细胞系。如通过使用 抗ObR的抗体进行的ELISA测量的，表达水平确定为低ng/ml水平(表2)。然而这些表达 水平可能被ELISA低估了，因为表达培养基的蛋白质印迹显示已经达到了更高的表达水平 (图 16)。
实施例3 :2D1pSecTag2Dlstop 以与上述 pSecTag2Blstop 类似的方式合成。将 pSecTag2Dlstop 转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，并开发瞬时表达细胞系和稳定表达细胞系。如通过使用 抗ObR的抗体进行ELISA测量的，表达水平确定为低ng/ml水平(表2)。然而这些表达水平 可能被ELISA低估了，因为表达培养基的蛋白质印迹显示已经达到了更高的表达水平(图 16)。实施例4 体外牛物测定结果体外生物测定使用双萤光素酶报告体系测量受刺激的MCF-7细胞的活性。用表达0bR、STAT5、SIE和海肾萤光素酶的质粒转染MCF-7细胞。ObR的活化经由 STAT3和SIE引发了萤火虫萤光素酶可诱导的、成比例的表达；海肾萤光素酶组成型表达并 作为归一化萤火虫萤光素酶活性测量的对照。萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶二者都使用 双萤光素酶报告子测定体系(Promega)和光度计(luminometer)测量。将萤火虫萤光素酶 测量值除以海肾萤光素酶测量值给出了修正的活性(即修正样品间的差异，如细胞密度和 转染效率的差异)。而后将修正的活性除以未受刺激的细胞的活性以获得“诱导倍数”值。
2A1 (IOx浓缩)和2AlEcopt (纯化的)的生物活性分别如图25和26所示。
权利要求
一种核酸分子，该核酸分子包含编码具有瘦蛋白活性的多肽的核酸序列，所述多肽包含直接或间接地连接到瘦蛋白受体多肽的至少一个瘦蛋白结合域的瘦蛋白多肽。
2.一种融合多肽，该融合多肽包含直接或间接地连接到瘦蛋白受体多肽的至少一个 瘦蛋白结合域的瘦蛋白多肽或其活性部分的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的融合多肽，其中所述多肽包含两个瘦蛋白结合域。
4.根据权利要求2或3所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含免疫球蛋白样结构域。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含至少一个细胞因子 样同源性结构域。
6.根据权利要求2-4中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含两个细胞因子样同 源性结构域。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含至少一个纤维连接 蛋白III结合域。
8.根据权利要求2-6中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含两个纤维连接蛋白 III结合域。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸残基425-535。
10.根据权利要求2-9中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸残基536-635。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸残基326-427。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸残基62-178。
13.根据权利要求2-12中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸残基235-325。
14.根据权利要求2-13中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸残基636-733。
15.根据权利要求2-14中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸残基734-829。
16.根据权利要求2-15中任一项所述的融合多肽，其中所述多肽包含SEQID NO :41的 氨基酸残基428-635。
17.根据权利要求2-16中任一项所述的融合多肽，其中所述瘦蛋白多肽连接到瘦蛋白 受体的至少一个瘦蛋白结合域，其中在所述融合多肽中，所述瘦蛋白多肽被置于所述瘦蛋 白结合域的氨基末端。
18.根据权利要求2-16中任一项所述的融合多肽，其中所述瘦蛋白多肽连接到瘦蛋白 受体的至少一个瘦蛋白结合域，其中在所述融合多肽中，所述瘦蛋白多肽被置于所述瘦蛋 白结合域的羧基末端。
19.根据权利要求2-18中任一项所述的融合多肽，其中所述瘦蛋白多肽通过肽连接体 连接到瘦蛋白受体多肽的至少一个结合域。
20.根据权利要求19中所述的融合多肽，其中所述肽连接分子包含至少一个拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0
21.根据权利要求20中所述的融合多肽，其中所述肽连接分子包含2、3、4、5、6、7、8、9 或10个拷贝的肽Gly Gly Gly Gly Ser0
22.根据权利要求21中所述的融合多肽，其中所述肽连接分子由6个拷贝的肽GlyGly Gly Gly Ser 组成。
23.根据权利要求21中所述的融合多肽，其中所述肽连接分子由8个拷贝的肽GlyGly Gly Gly Ser 组成。
24.根据权利要求2-18中任一项所述的融合多肽，其中所述融合多肽是瘦蛋白多肽和 瘦蛋白受体多肽的至少一个瘦蛋白结合域的直接融合体。
25.一种核酸分子，该核酸分子包含选自以下的核酸序列i)SEQID NO 3所示的核酸序列；ii)SEQID NO 5所示的核酸序列；iii)SEQID NO :7所示的核酸序列；iv)SEQ ID NO :9所示的核酸序列；v)SEQ ID NO 11所示的核酸序列；vi)SEQ ID NO 13所示的核酸序列；vii)SEQ ID NO :15所示的核酸序列；viii)SEQ ID NO :17所示的核酸序列；ix)SEQ ID NO 19所示的核酸序列；x)SEQ ID NO 21所示的核酸序列；xi)SEQ ID NO 23所示的核酸序列；xii)SEQ ID NO :25所示的核酸序列；xiii)SEQ ID NO :27所示的核酸序列；核酸分子，该核酸分子包含在严格杂交条件下与SEQ ID N0:3、5、7、9、ll、13、15、17、 19、21、23、25或27杂交的核酸序列并编码具有瘦蛋白受体调节活性的多肽。
26.根据权利要求25所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码瘦蛋白激动剂。
27.根据权利要求25所述的核酸分子，其中所述核酸分子编码瘦蛋白拮抗剂。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO: 3所示的核酸序列。
29.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO: 5所示的核酸序列。
30.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO 7所示的核酸序列。
31.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO :9所示的核酸序列。
32.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO: 11所示的核酸序列。
33.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO 13所示的核酸序列。
34.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO: 15所示的核酸序列。
35.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO: 17所示的核酸序列。
36.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQIDNO 19所示的核酸序列。
37.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO 21所示的核酸序列。
38.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO 23所示的核酸序列。
39.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO :25所示的核酸序列。
40.根据权利要求25-27中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQID NO 27所示的核酸序列。
41.一种多肽，该多肽由根据权利要求1或25-40中任一项所述的核酸分子编码。
42.一种多肽，该多肽包含 SEQ ID NO :4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 所示的氨基酸序列。
43.一种同型二聚体，该同型二聚体由两个多肽组成，其中每个所述多肽包含i)包含瘦蛋白或其受体结合域的第一部分，该第一部分任选地通过肽连接分子连接到 )包含瘦蛋白受体的至少一个瘦蛋白结合域或其部分的第二部分。
44.根据权利要求43所述的同型二聚体，其中所述同型二聚体包含两个多肽，所述多 肽包含 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、29、30、31、32、33、34、35、 36、37、38、39 或 40。
45.一种载体，该载体包含根据权利要求1或25-40中任一项所述的核酸分子。
46.一种细胞，该细胞用根据权利要求1、25-40或45中任一项所述的核酸分子或载体 转染或转化。
47.根据权利要求46所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞。
48.根据权利要求46所述的细胞，其中所述细胞是原核细胞。
49.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求2-24或41或42中任一项所述 的多肽，包含赋形剂或载体。
50.根据权利要求49所述的药物组合物，其中该组合物与另外的治疗剂组合。
51.一种治疗患有将从施用瘦蛋白激动剂受益的病况的人类受治疗者的方法，该方法 包括施用有效量的至少一种根据权利要求2-24或41或42中任一项所述的多肽。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述病况是肥胖。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述病况是肥胖相关的病况。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述肥胖相关的病况是II型糖尿病。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述肥胖相关的病况是心脏病。
56.根据权利要求51所述的方法，其中所述病况是免疫抑制。
57.一种治疗患有将从施用瘦蛋白拮抗剂受益的病况的人类受治疗者的方法，该方法包括施用有效量的至少一种根据权利要求2-24或40或41中任一项所述的多肽。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述病况是厌食症。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述病况是自身免疫疾病。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述自身免疫疾病选自由下列组成的组多发 性硬化、1型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性肝炎、类风湿性关节炎、自身免疫 性结肠炎、克隆氏病、乳糜泻、自身免疫性肾炎、自身免疫性神经病、脑病、纤维性肺泡炎。
61.根据权利要求51-60中任一项所述的方法，其中所述多肽通过静脉内施用。
62.根据权利要求51-60中任一项所述的方法，其中所述多肽通过皮下施用。
63.根据权利要求51-62中任一项所述的方法，其中所述多肽以两天的间隔施用。
64.根据权利要求51-62中任一项所述的方法，其中所述多肽以每周的间隔施用。
65.根据权利要求51-62中任一项所述的方法，其中所述多肽以每2周的间隔施用。
66.根据权利要求51-62中任一项所述的方法，其中所述多肽以每月的间隔施用。
67.一种单克隆抗体，该单克隆抗体结合根据权利要求2-24或40、41或43或44中任 一项所述的多肽或二聚体。
68.根据权利要求67所述的抗体，其中所述单克隆抗体是结合所述多肽或二聚体、但 不具体地特异性结合瘦蛋白或瘦蛋白受体的抗体。
69.一种制备产生根据本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，该方法包括下列 步骤i)使用含有至少一种根据本发明的多肽的免疫原使免疫活性的哺乳动物免疫； )将免疫的免疫活性的哺乳动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；iii)根据对(i)中的多肽的结合活性，筛选步骤(ii)的杂交瘤细胞生产的单克隆抗体；iv)培养所述杂交瘤细胞以增殖和/或分泌所述单克隆抗体；以及 ν)从培养上清液中回收单克隆抗体。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述免疫活性的哺乳动物是小鼠或大鼠。
71.一种杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系通过根据权利要求69或70所述的方法获得或 是可获得的。
72.—种在生物样品中检测根据本发明的多肽的诊断检验，该诊断检验包括 i)提供分离的样品以供检验； )用结合根据权利要求2-24或40或41或43或44中任一项所述的多肽或二聚体的 配体接触所述样品；和iii)检测所述样品中所述配体的结合。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述配体是抗体。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
全文摘要
本公开涉及瘦蛋白融合多肽；编码所述多肽的核酸分子和使用所述多肽的治疗方法。
文档编号C07K14/715GK101827858SQ200880110351
公开日2010年9月8日 申请日期2008年7月23日 优先权日2007年8月3日
发明者乔恩·塞耶斯, 彼得·阿蒂米克, 理查德·罗斯 申请人:埃斯特瑞恩有限公司