专利名称：一种丹参花中三萜类化合物及其提取方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于天然产物化学领域，特别涉及一种丹参花中三萜类化合物及其提取方 法和应用。
背景技术：
丹参为多年生直立草本植物，其干燥根及根茎，也就是我们常说的中药“丹参”，是 一种主治心血管系统疾病的常用中药。研究表明，中药丹参主要有两类活性成分一种为脂 溶性的二萜类化合物，另一种为水溶性的多聚酚酸类成分。丹参花为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的花。丹参为 无限性开花植物，一年生即可开花。丹参一般四月份开花，持续到10月下旬植株几近枯萎 时。丹参植株地上部分生长旺盛，分枝较多，持续开花，为无限花序，花序轴一般为腋生，从 地上部分生长观察来看，地上茎分枝越多，腋生花序相应的也较多，特别是在7-8月份地上 生长旺盛时期。丹参花中三萜类化合物的发现以及提取一直是研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种丹参花中三萜类化合物，所述的三萜类化合物具有一 定细胞毒作用，具有较强抗肿瘤作用。本发明采用的技术方案如下一种丹参花中三萜类化合物，所述的三萜类化合物分子式为C3tlH5tlO2,结构式为I 或II所示 两个新化合物的名称分别为:01ean-12-ene-3a，23-diol (SMBF-1)(式I化合 物)，中文名丹参二醇A ；Urs-12-ene-3 α，23-diol (SMBF-2)，中文名丹参二醇B (式II化合 物)，分子量都是442。新化合物的结构鉴定是通过各种有机波谱分析(1H NMR 13C NMR DEPT2D-NMR1H-1H COSY, HSQC，HMBC, N0ESY)以及与类似化合物的波谱数据进行比较而获得其未知化合物的结 构。
化合物SMBF-I的波谱数据如下白色粉末·[ ]25 = +8.6 (C 0.74, MeOH). IR(KBr) =3404,2930,1635，1459， 1384，1258，1045. 1H-Wr(CdcI3JOOMHz) δ 5. 21 (1Η, t，3. 5，H-12)，3. 72 (1H，brs, H_3)， 3. 44,3. 58 (each 1H, d, 11. 3，H—23)，0· 72,0. 84,0. 87,0. 88,0. 98,0. 99，1. 17 (each 3H, s，)· 13C-WR(CDCl3,125MHz) : δ (Cl 30) :32· 8,26. 3,76. 6,40. 2,42. 7，18. 0,32. 2,40. 0， 47. 5,36. 7,23. 5，121. 6，145. 3,41. 8,27. 0,26. 1,32. 5,47. 3,46. 8,31. 1,34. 8,37. 2,71. 4， 17. 9，16. 8，15. 6,26. 2,28. 4,33. 3,23. 7。HR-ESI—MS :442· 3802 ([M+Na]+，C30H50O2Na+ ； calc. 442. 3788)。化合物SMBF-2的波谱数据如下白色粉末.[α]25= +10.1 (C 0.67, MeOH). IR(KBr) =3406,2931,1640, 1461，1384，1258，1040. 1H-Wr(CdcI3JOOMHz) δ 5. 16 (1Η, t，3. 6，H-12) ,3. 72 (1H，brs, H-3)，3· 44,3. 58 (each 1H, d，11. 3，H-23)，0. 72,0. 81 (3H, d，6. 5) ,0. 83，0. 93 (3H, d, 6. 4)，0. 97，0. 98，1. 13 (each 3H, s). 13C-NMR (CDCl3,125MHz) δ (Cl 30) 32. 4,26. 4, 76. 7,40. 2,42. 7，18. 1,33. 1,40. 2,47. 5,36. 7,23. 3，124. 3，139. 7,42. 2,28. 1,26. 6,33. 8， 59. 1,39. 6,39. 6,31. 3,41. 6,71. 4，18. 0，16. 9，15. 8,23. 4,28. 8，17. 5,21. 4。 HR-ESI-MS 442. 3784 ([M+Na]+，C30H50O2Na+ ；calc. 442. 3788)。化合物SMBF-I和SMBF-2的晶体数据 从丹参花中提取的三萜类化合物，除了上述两个新的化合物外，还有6个已知的 化合物，这六个已知的化合物分别为齐墩果酸(oleanolic acid，记作SMBF-3)，C30H48O3 ； 熊果酸(ursolic acid,记作 SMBF-4)，C30H48O6 ；2α-羟基乌苏酸(corosolic acid,记作 SMBF-5)，C30H48O4 ；2 α-羟基齐敦果酸(2 α -ursolic acid,记作 SMBF-6)，C30H48O4 ；3 β， 23- 二羟基-12-烯-28-齐墩果酸(hederagenin,记作 SMBF-7)，C30H48O4 ；2 α，3 β，23-三羟 基-12-烯-28-齐墩果酸(arjunolic acid,记作SMBF-8)，C30H48O50它们的结构式如下 本发明还提供了一种所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，包括下列步骤1)将丹参花用体积浓度为60-95%的乙醇水溶液回流提取，减压浓缩得到浸膏状 物；2)将浸膏状物与蒸馏水/石油醚混合物充分混合，待溶液分液后，石油醚层减压 浓缩得石油醚提取物；水层用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；3)石油醚提取物用硅胶柱层析分离，先以石油醚-乙酸乙酯溶剂进行梯度洗脱， 石油醚与乙酸乙酯的体积比从8 1逐渐递减至1 1;之后以乙酸乙酯-甲醇溶液进行 梯度洗脱，乙酸乙酯与甲醇的体积比从100%乙酸乙酯、19 1逐渐递减到100%甲醇；对 上述柱层析馏分纯化分离得三萜类化合物I、II以及化合物SMBF-3、SMBF-4。较为具体的，步骤1)中丹参花先用重量为其8-10倍的60-95%的乙醇水溶液回流 提取3-5小时，过滤后滤渣用重量为丹参花6-8倍的60-95%的乙醇水溶液回流提取两次， 每次提取3-5小时，合并三次提取液减压浓缩得到浸膏状物。步骤2)中分液后，水层再用石油醚萃取1-2次，萃取液与石油醚层合并后再减压 浓缩。步骤3)中石油醚与乙酸乙酯的体积比的递减按照8 1、6 1、5 1、4 1、 3 1、2 1、1 1进行，每个梯度的洗脱体积为1.5BV;乙酸乙酯与甲醇的体积比的递减按 照100%乙酸乙酯、19 UlO 1、5 1、100%甲醇进行，每个梯度的洗脱体积为1.5BV。具体的，所述的分离纯化为部分馏分采用凝胶柱层析脱色，用氯仿_甲醇体积比 为2-3 1的溶剂进行重结晶得到式I、II化合物，凝胶柱可选择TOyOpearlHW-40C ；后续 重结晶采用乙酸乙酯-石油醚溶剂。部分馏分采用硅胶柱层析、凝胶柱层析、高效液相色谱 分离得到化合物SMBF-3、SMBF-4。所述的分离纯化并不仅限于上述方法，采用常规实验手 段即可，是本领域技术人员的公知常识，此次不再赘述。化合物SMBF-5、SMBF-6、SMBF-7、SMBF-8 提取步骤如下将步骤2)中的乙酸乙酯提取物用硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯溶剂进 行洗脱，石油醚与乙酸乙酯的体积比从4 1逐渐递减至1 4;之后以乙酸乙酯-甲醇溶 剂进行洗脱，乙酸乙酯与甲醇的体积比从100%乙酸乙酯、10 1逐渐递减到100%甲醇； 然后薄层色谱分析合并相似馏分，对馏分进行分离纯化获得三萜类化合物SMBF-5、SMBF-6、 SMBF-7、SMBF-8。具体的，石油醚-乙酸乙酯溶剂按照4 1、3 1、2 1、1 1、1 2、1 3、
61 4的梯度递减，每个梯度的洗脱体积为1.5BV;乙酸乙酯-甲醇溶剂按照100%乙酸乙 酯、10 1、5 1、3 1、100%甲醇进行梯度递减，每个梯度的洗脱体积为1.5BV。所述的丹参花中三萜类化合物具有一定的细胞毒活性，在制备抗肿瘤药物中有很 好的应用。本发明相对于现有技术，有以下优点从丹参花中提取分离得到新的三萜类化合物，并经药理试验证明这些三萜类化合 物具有一定的细胞毒作用可以抑制肿瘤细胞，其制备过程快速、简便。
具体实施例方式原料丹参花2Kg，于2007年4月采自河南省栾川县豫西丹参GAP种植基地，由洛阳 梓生科技开发有限公司王忠东教授鉴定。实施例1丹参花2Kg用18Kg体积浓度为95%的乙醇在50°C回流提取4小时，过滤，再用 15Kg的95%乙醇回流提取两次，每次4小时，合并滤液，减压浓缩得到浸膏状物300g，将浸 膏状物加水3L和石油醚2. 5L混旋，分离石油醚层，水层再用石油醚萃取4次，每次2L，合 并石油醚萃取液，浓缩至浸膏状得石油醚萃取物58g ；采用同样的方法，水层用乙酸乙酯萃 取，回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物75g。1、将上述石油醚层萃取物50g用硅胶柱层析分离(IOOOg硅胶，层析柱 50X 1200mm)，以石油醚-乙酸乙酯溶剂系统(8 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1， 1 1)，然后用乙酸乙酯-甲醇系统(100%乙酸乙酯，19 1,10 1,5 1，100%甲醇) 各1500mL进行梯度洗脱，得馏分20个(以SMBO101-SMB0120命名)。馏分SMB0106(2. 3g)采用凝胶柱色谱(HW-40C)层析，洗脱剂氯仿甲醇=2 1， 得5个组分(SMB0301-0305)，组分SMB0304经乙酸乙酯-石油醚重结晶得单体化合物 SMBF-I 和化合物 SMBF-2。馏分SMB0110(5. Ig)采用硅胶柱层析(硅胶700g，洗脱剂氯仿/甲醇= 99 19,7 3,95 5,9 1,8 2)进行洗脱，薄层层析检测合并类似馏分，得10组分 (SMB0401-0410)。将馏分SMB0406(1. Ig)经凝胶柱色谱层析(HW-40C，洗脱剂氯仿甲醇 =2 1，)分离，得5个组分(SMB0501-0505)，组分SMB0503经反相高效液相色谱分离得 单体化合物SMBF-3和SMBF-4。乙酸乙酯萃取物(70g)用硅胶柱层析分离(1300g硅胶，层析柱50X 1200mm)，以 石油醚-乙酸乙酯溶剂系统(4 1,3 1,2 1,1 1,1 2,1 3,1 4)，然后用乙酸 乙酯-甲醇系统(100%乙酸乙酯，10 1,5 1,3 1，100%甲醇)各2000mL进行梯度洗 脱，薄层色谱分析合并相似馏分，得馏分22个(以SMB1001-SMB1022命名)。馏分SMB1010 (8. 8g)经硅胶柱层析(硅胶lOOOg，洗脱剂氯仿/甲醇= 95 5,9 1,8 2,7 3)进行洗脱，薄层层析检测合并类似馏分，得12个组分 (SMB1301-SMB1312)，组分SMB1305采用凝胶柱色谱(HW-40C)层析，洗脱剂氯仿甲醇 =2 1，得5个组分(SMB1401-1405)，组分SMB1403经反相高效液相色谱(0DS-A色谱 柱20\250讓，5 4!11，流动相甲醇/水=8 2)，分离得单体化合物SMBF-5、SMBF-6和 SMBF-7。
馏分SMB1014(5. 7g)经硅胶柱层析(硅胶700g，洗脱剂氯仿/甲醇=95 5， 9 1,8 2,7 3,6 4)进行洗脱，薄层层析检测合并类似馏分，得15个组分 (SMB1601-SMB1615)，组分SMB1607采用凝胶柱色谱(HW-40C，洗脱剂氯仿/甲醇=2 1) 层析，得6个组分(SMB1701-1706)，组分SMB1704经反相高效液相色谱(0DS-A色谱柱 20 X 250mm, 5 μ m,流动相甲醇/水=8 2)，分离得单体化合物SMBF-8。上述分离得到的化合物的细胞毒活性采用MTT法测试，试验具体操作步骤如下1.取对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的RPM1640培养液，制成单细胞悬液 5 X IO4个/mL，将该悬液加到96孔培养板中，每孔加入1 X IO4个细胞。培养24h后，加入受 试药物，化学单体浓度分别为30 μ g/mL、10 μ g/mL。2.将平板在37°C，含5% CO2空气及100%湿度的温箱中孵育3天，去除培养液。3. MTT用无血清的RPM1640培养液配成lmg/mL溶液，每孔加100 μ L，37°C温育4h， 使MTT还原为甲臢。4.吸出上层清液，加入150 μ L DMSO使甲臢溶解，于ELISA仪570nm处测OD值。表4分离化合物细胞毒活性实验数据(η = 6) 以上只是本发明的优选实施方式，但本发明保护范围不限于此，凡是不违背本发 明的原理、精神……都在本发明的保护之列。
权利要求
一种丹参花中三萜类化合物，其特征在于，所述的三萜类化合物分子式为C30H50O2，结构式为I或II所示FSA00000190604900011.tif
2.丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，包括下列步骤1)将丹参花用体积浓度为60-95%的乙醇水溶液回流提取，减压浓缩得到浸膏状物；2)将浸膏状物与蒸馏水/石油醚混合物充分混合，待溶液分液后，石油醚层减压浓缩 得石油醚提取物；水层用乙酸乙酯萃取，减压浓缩得乙酸乙酯萃取物；3)石油醚提取物用硅胶柱层析分离，先以石油醚-乙酸乙酯溶剂进行梯度洗脱，石油 醚与乙酸乙酯的体积比从8 1逐渐递减至1 1;之后以乙酸乙酯-甲醇溶液进行梯度 洗脱，乙酸乙酯与甲醇的体积比从100%乙酸乙酯、19 1逐渐递减到100%甲醇；对上述 柱层析馏分纯化分离得三萜类化合物I、II以及化合物SMBF-3、SMBF-4 ；所述的SMBF-3、
3.如权利要求2所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，步骤1)中丹 参花先用重量为其8-10倍的60-95%的乙醇水溶液回流提取3-5小时，过滤后滤渣用重量 为丹参花6-8倍的60-95%的乙醇水溶液回流提取两次，每次提取3-5小时，合并三次提取 液减压浓缩得到浸膏状物。
4.如权利要求2所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，步骤2)中分 液后，水层再用石油醚萃取1-2次，萃取液与石油醚层合并后再减压浓缩。
5.如权利要求2所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，步骤3)中石 油醚与乙酸乙酯的体积比的递减按照8 1、6 1、5 1、4 1、3 1、2 1、1 1进行，每个梯度的洗脱体积为1. 5BV。
6.如权利要求2所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，步骤3)中乙 酸乙酯与甲醇的体积比的递减按照100%乙酸乙酯、19 UlO 1、5 1、100%甲醇进行， 每个梯度的洗脱体积为1. 5BV。
7.如权利要求2-6之一所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，分离 纯化为采用凝胶柱层析，然后用乙酸乙酯_石油醚溶剂重结晶。
8.如权利要求2-6之一所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，将步 骤2)中的乙酸乙酯提取物用硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯溶剂进行洗脱，石油醚 与乙酸乙酯的体积比从4 1逐渐递减至1 4;之后以乙酸乙酯-甲醇溶剂进行洗脱，乙 酸乙酯与甲醇的体积比从100%乙酸乙酯、10 1逐渐递减到100%甲醇；然后薄层色谱分 析合并相似馏分，对馏分进行分离纯化获得三萜类化合物SMBF-5、SMBF-6、SMBF-7、SMBF-8 ； 所述的 SMBF-5、SMBF-6、SMBF-7、SMBF-8 如式 III 中所示。
9.如权利要求8所述的丹参花中三萜类化合物的提取方法，其特征在于，石油醚-乙酸 乙酯溶剂按照4 1、3 1、2 1、1 1、1 2、1 3、1 4的梯度递减，每个梯度的洗 脱体积为1.5BV;乙酸乙酯-甲醇溶剂按照100%乙酸乙酯、10 1、5 1、3 1、100%甲 醇进行梯度递减，每个梯度的洗脱体积为1. 5BV。
10.丹参花中三萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要
一种丹参花中三萜类化合物，所述的三萜类化合物分子式为C30H50O2，结构式为I或II所示；从丹参花中提取分离得到的三萜类化合物，经药理试验证明具有一定的细胞毒作用可以抑制肿瘤细胞，其制备过程快速、简便。
文档编号C07J75/00GK101891792SQ20101021251
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者刘普, 孙鲜明, 尹卫平, 柴元武, 梁菊, 段文录, 邓瑞雪 申请人:河南科技大学