专利名称：一种从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法
技术领域：
本发明属于生物化工分离领域，具体涉及的是一种从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法。背景技术：
丁二酸(Succinic Acid)，又称琥珀酸，是碳四平台化合物中最为重要的有机二元酸之一，可广泛应用于聚酯、橡胶、制药、食品工业、防护涂料、染料和其他精细化学品等产业中。目前，丁二酸的合成主要采用丁烷经顺丁烯二酐化学电解法，这种方法污染大，成本高，严重阻碍了丁二酸的规模化生产。与化学电解法相比，生物发酵法制备丁二酸具有利用廉价可再生资源作为原料和固定温室气体二氧化碳实现减排等特点，最近受到了美国、日本、韩国和中国等国家学术与工业界的广泛关注。在生物发酵制丁二酸过程中，发酵液中的主产物丁二酸及副产物甲酸、乙酸含量会随着发酵时间会有所累积。同时，这些增加的酸性组分也会降低发酵液的PH值，使得菌株偏离正常的生长环境，进而影响菌株的活性以及丁二酸收率。因此，在发酵过程中一般需要在发酵液中补充氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁、氨水、碳酸钠、碳酸镁、碳酸铵等碱性物质中和发酵液中的有机酸，维持发酵液PH值为近中性，发酵液中的丁二酸、甲酸和乙酸实际是以相应盐的形式存在。一般而言，从发酵液中分离获得丁二酸需将丁二酸盐转化为丁二酸。JP62294090和US5168055报道了在发酵液中直接加入钙盐，与丁二酸负离子形成丁二酸钙沉淀，而后采用酸化、结晶的方式获得丁二酸产品的方法。尽管这种方法简单、较为节能，但在沉淀过程中会有部分蛋白和色素夹杂在丁二酸钙产品中，不仅影响了丁二酸的质量，而且在分离过程中加入的钙盐和硫酸也无法实现回用，造成了大量的浪费。US5143834、JP2283289和JP2944157披露了采用电解方法获得丁二酸的方法。该过程是将低浓度的丁二酸盐溶液进行电分解，使其成为丁二酸的过饱和溶液和碱液。其中，分离出的碱液可以返回到发酵池中和丁二酸实现回用。然而，该电解工艺初期投资和运行费用较高，并且只适合电解丁二酸的一价盐发酵液，对丁二酸钙盐并不适合。Yun Suk Huh等采用昂贵的三辛胺正辛醇溶液络合萃取丁二酸。该工艺采用毒性较大的三辛胺可能会影响丁二酸的品质，而且溶剂的回收使用也存在脱除杂质的问题(Process Biochemistry，2006 年第 41 卷 1461 - 1465 页)。JP2001514900 将丁二酸 发酵液进行预先酸化，而后加入硫酸铵盐析出丁二酸，但该过程涉及水相和甲醇两相操作，设备投资费用较高。US5958744公开了在发酵液中加入氨水和硫酸调节酸碱度，后续进行粗结晶和甲醇重结晶获得丁二酸的方法。该专利中，氨水和硫酸反应生成的硫酸铵在300°C高温条件下热分解可将氨水和硫酸循环使用，但在重结晶过程中使用有毒的甲醇对环境不友好。CN101748161尽管对US5958744中报道的方案进行简化，但仍然需要采用有毒性的甲醇作为丁二酸重结晶的溶剂。US20090234160报道了从包含碱金属的丁二酸盐溶液中获得丁二酸的方法。该工艺利用碱金属硫酸盐与丁二酸溶解度随温度变化趋势不同的特点，在碱金属丁二酸盐溶液中加入硫酸，高温结晶沉淀分离出部分碱金属硫酸盐，而后低温沉淀脱除丁二酸结晶粗品，最后丁二酸粗品溶解、活性炭脱色、再结晶和干燥获得丁二酸产品。然而，该专利中披露的步骤较为繁琐，碱金属硫酸盐可能会影响丁二酸产品的品质。CN100445257报道了从厌氧发酵液中分离获得丁二酸的方法。具体包括将厌氧发酵生产的丁二酸发酵液经微滤膜过滤、超滤膜超滤脱蛋白，活性炭脱色、酸化、蒸发浓缩和结晶等步骤，其过程较为繁琐，而且在蒸发浓缩4-6倍过程中，可能会有大量含有甲酸、乙酸的水蒸出，这部分水无法实现直接回用。CN101475464公开了一种利用纳滤手段从发酵液中获得丁二酸的方法。尽管在该获得过程中不需要另外加入有机溶剂或活性炭，但该工艺设备投资较大，操作较为繁琐。
发明内容
丁二酸中的杂质组成，主要包括氮含量、色素含量和金属含量等指标，是影响丁二酸品 质，特别是能否应用于聚酯、制药和食品等行业的关键。本发明的目的是针对现有分离技术的各种不足，提出一种从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，其工艺路线简单、设备投资小、能耗低和便于操作，可实现大量水的回用，降低生产成本。一种从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，包括以下步骤
1)将丁二酸发酵液离心脱除菌体和大颗粒悬浮物得发酵离心上清液；
2)将发酵离心上清液浓缩，蛋白质变性得蒸馏悬浊液；
3)将蒸馏悬浊液离心分离，离心后析出的变性蛋白进行水洗以脱除吸附在变性蛋白上的丁二酸盐；水洗后含有少量丁二酸盐的冲洗水与蒸馏悬浊液离心分离后的上清液体合并组成浓缩液。4)在浓缩液中加入活性碳，一定温度下吸附脱除浓缩液中色素和残余小分子蛋白等杂质，酸性条件下结晶、过滤、干燥得高纯度丁二酸。所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，其中的菌体和大颗粒悬浮物脱除是在的离心机上进行，得到离心上清液。所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，其中发酵离心上清液浓缩、蛋白质变性是将离心上清液浓缩至3. 3飞.7倍，得到蒸馏悬浊液。所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，其中的发酵离心上清液浓缩、蛋白质变性是在温度为8(Tl45°C，压力为O. 04、. IOMPa的条件下进行，温度优选为ll(Tl40°C，压力优选为O. 06^0. 09MPao所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，其中步骤3)的变性蛋白质水洗脱除是将含有变性蛋白的蒸馏悬浊液离心分离，离心后析出的变性蛋白进行水洗，脱除吸附在变性蛋白上的丁二酸盐。所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，上述的变性蛋白水洗是指加入蒸馏悬浊液液体体积的2 8%的去离子水进行水洗，水洗后含有少量丁二酸盐的冲洗水与蒸馏悬浊液离心分离后的上清液体合并组成浓缩液。所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，其中步骤4)中按浓缩液体积计算，活性炭用量为2~8(w/v)%,温度为2(T70°C。所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，温度优选为5(T70°C，更优选为55 70。。。所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，其中的酸性条件下结晶是在脱色后液体中加入酸调节PH值至O. 8^5. O,结晶析出丁二酸晶体。所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，其中的酸性条件下结晶优选pH值为 2. 5 3. 2。所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，其中用于调节脱色液体pH的酸包括盐酸、硫酸。所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，其中的干燥是在温度为7(Tl20°C条件下进行。本发明所述的丁二酸发酵液由产丁二酸的菌株在pH值为6 7. 5、厌氧条件下发酵生产，丁二酸在发酵液中浓度为36、0g/L。本发明所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，与现有技术相比优越性在于利用蒸馏方式实现蛋白质变性与脱水相耦合，使得变性蛋白采用简单方式便可从浓缩液中脱除，节省了微滤和超滤单元，简化了工艺流程，降低了设备投资成本，而且不存在微滤和超滤膜洗膜废水的排放。与专利CN100445257相比，该发明在蒸馏过程中由于发酵液pH值为近中性保证了蒸馏水可以直接返回到发酵单元作为溶剂或分离单元作为洗涤用水，实现大量水不需要处理而直接回用。本发明所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，工艺条件温和，不加入任何有机溶剂及其他有机化合物，不会造成外界环境对丁二酸的污染，产品安全性好。本发明所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，结晶、过滤和干燥后得到的丁二酸样品，一次结晶丁二酸收率可达82%。本发明中丁二酸的纯度采用高效液相色谱法分析(参考Process Biochemistry, 2006年41卷1461 1465页)；氮含量采用突光硫氮分析仪检测(ASTM D4629标准);产品的色度丁二酸的色度检测是将本发明制备的丁二酸配制成10g/L的溶液，在430nm波数下以纯水为参比，用分光光度计检测(参考中华人民共和国药典2000版二部364页L-2-氨基-3-苯丙酸检测方法)。本发明所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，结晶、过滤和干燥后得到的丁二酸样品，丁二酸纯度可达99. 5%，氮含量低于200ppm，透光率高于99. 0%。
具体实施例方式用以下的实施例对本发明作进一步说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的进一步说明，并不构成对本发明保护范围的限制。实施例I
取丁二酸浓度为37. 6g/L的厌氧发酵液4. 0L，在离心机上离心脱除菌体及大颗粒悬浮物。得到的离心上清液在温度为80°C、压力为O. 04Mpa的条件下，蒸发出水3. 2L (浓缩5倍)。在离心机上离心分离变性蛋白，得到蒸馏后液体O. 7L，并以O. 014L去离子水冲洗变性蛋白脱除吸附的少量丁二酸，将冲洗变性蛋白用水与蒸馏后液体合并组成O. 71L浓缩液体。上述浓缩液体中加入O. 014Kg活性炭，在温度为20°C、脱色除杂30分钟。过滤脱除活性炭,并加入O. 04L去离子水冲洗活性炭，洗涤后去离子水和脱色除杂过滤后液体合并构、成脱色液。在脱色液体中加入盐酸调节PH至O. 8，在温度为1°C条件下，冷却结晶10小时，析出晶体。晶体经80°C烘干至恒重，重量为109 g，收率为72.4%。丁二酸分离提取过程检测结果见表I。
权利要求
1.一种从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，包括以下步骤 1)将丁二酸发酵液离心脱除菌体和大颗粒悬浮物得发酵离心上清液； 2)将发酵离心上清液浓缩，蛋白质变性得蒸馏悬浊液； 3)将蒸馏悬浊液离心分离，离心后析出的变性蛋白进行水洗以脱除吸附在变性蛋白上的丁二酸盐；水洗后含有少量丁二酸盐的冲洗水与蒸馏悬浊液离心分离后的上清液体合并组成浓缩液； 4)在浓缩液中加入活性碳，一定温度下吸附脱除浓缩液中色素和残余小分子蛋白等杂质，酸性条件下结晶、过滤、干燥得高纯度丁二酸。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述发酵离心上清液浓缩、蛋白质变性是将离心上清液浓缩3. 3飞.7倍，得到蒸馏悬浊液。
3.根据权利要求I所述的的方法，其特征在于所述发酵离心上清液浓缩、蛋白质变性是在温度为80 145°C，压力为O. 04 0· IOMPa的条件下进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于其中的发酵离心上清液浓缩、蛋白质变性是在温度为11(T140°C，压力为O. 06 0· 09MPa的条件下进行的。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于其中步骤3)的变性蛋白质水洗脱除是将含有变性蛋白的蒸馏悬浊液离心分离，将离心后析出的变性蛋白进行水洗，脱除吸附在变性蛋白上的丁二酸盐。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的变性蛋白水洗是指加入蒸馏悬浊液液体体积的2 8%的去离子水进行水洗，水洗后含有少量丁二酸盐的冲洗水与蒸馏悬浊液离心分离后的上清液体合并组成浓缩液。
7.根据权利要求所述的方法，其特征在于步骤4)中按浓缩液体积计算，活性炭用量为 2 8 (w/v) %，温度为 2(T70°C。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法，温度为5(T70°C。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于.其中的酸性条件下结晶是在脱色后液体中加入酸调节PH值至O. 8^5. O,结晶析出丁二酸晶体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于其中的酸性条件下结晶是在脱色后液体中加入酸调节PH值为2. 5 3. 2，结晶析出丁二酸晶体。
全文摘要
本发明提供一种从发酵液中分离高纯度丁二酸的方法。包括将丁二酸发酵液脱除菌体、浓缩、离心分离、加入活性碳除杂、酸性条件下结晶过滤干燥得高纯度丁二酸,本发明与现有技术相比优越性在于利用蒸馏方式实现蛋白质变性与脱水相耦合，使得变性蛋白采用简单方式便可从浓缩液中脱除，节省了微滤和超滤单元，简化了工艺流程，降低了设备投资成本，而且不存在微滤和超滤膜洗膜废水的排放。
文档编号C07C55/10GK102731288SQ20111008051
公开日2012年10月17日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者刘丽娟, 刘经纬, 孟海, 朱伟, 李晓强, 李泽壮, 杨爱武, 柏基业, 阚林, 陈韶辉 申请人:中国石化扬子石油化工有限公司, 中国石油化工股份有限公司