具有β-葡糖苷酶活性的嵌合多肽和对其进行编码的多核苷酸的制作方法

具有β-葡糖苷酶活性的嵌合多肽和对其进行编码的多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有β-葡糖苷酶活性的嵌合多肽。本发明还涉及编码这些嵌合多肽的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些嵌合多肽的方法。
【专利说明】具有β-葡糖苷酶活性的嵌合多肽和对其进行编码的多核苷酸
[0001]关于受到联邦政府资助的研究与开发的发明权利的声明
[0002]本发明是在受到政府资助的由能源部签订的合作协议DE-FC36-08G018080下做出的。政府拥有本发明的某些权利。
[0003]序列表的参考
[0004]本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0005]发明背景
发明领域
[0006]本发明涉及一种具有β_葡糖苷酶活性的嵌合多肽、编码该嵌合多肽的多核苷酸、产生这些嵌合多肽的方法、以及使用这些嵌合多肽的方法。
[0007]相关技术说明
[0008]纤维素是单糖葡萄糖通过β-1，4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解 连接的葡聚糖的酶。这些酶包括葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶和葡糖苷酶。葡
聚糖内切酶在随机位置消化纤维素聚合物，将其打开受纤维二糖水解酶的攻击。纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡萄糖的水溶性β -1, 4-连接的二聚体。β -葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。
[0009]将木质纤维素原料转化成乙醇具有如下优点，即易于获得大量原料、避免燃烧或填埋材料的有利条件、以及乙醇燃料的清洁性。现在已经认为木材、农业残余物、草本作物、和城市固体废物是生产乙醇的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦木质纤维素被转化成可发酵糖，例如葡萄糖，则这些可发酵糖可以容易地由酵母发酵为乙醇。
[0010]美国专利号7，244，605披露了一种烟曲霉GH3Ai3-葡糖苷酶及其多核苷酸。川口(Kawaguchi)等人，1996，《基因》(Gene) 173:287-288，披露了一种棘孢曲霉GH3A0 -葡糖苷酶及其多核苷酸。
[0011]在本领域中将有利的是改进β葡糖苷酶降解木质纤维素原料的能力。
[0012]本发明提供了具有β -葡糖苷酶活性的嵌合多肽。
[0013]发明概述
[0014]本发明涉及具有β -葡糖苷酶活性的分离的嵌合多肽，该嵌合多肽包括:
[0015](a)在该嵌合多肽N末端的一个第一多肽片段，选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 2的氨基酸20至404具有至少60%—致性的一个多肽片段；(ii)由在至少低严谨度条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸131至1455或其cDNA序列杂交、或者与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一个多肽片段；(iii)由与SEQ ID NO:1的核苷酸131至1455或其cDNA序列具有至少60% —致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iv) 一个多肽片段，包括SEQ ID NO:2的氨基酸20至404或由其组成；
[0016](b)在该第一多肽片段C末端的一个第二多肽片段，选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 4的氨基酸406至589具有至少60% —致性的一个多肽片段；(ii)由在至少低严谨度条件下与SEQ ID NO: 3的核苷酸1570至2184或其cDNA序列杂交、或者与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一个多肽片段；(iii)由与SEQ ID NO:3的核苷酸1570至2184或其cDNA序列具有至少60% —致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iv) —个多肽片段，包括SEQ ID NO: 4的氨基酸406至589或由其组成；以及
[0017](C)在该第二多肽片段C末端的一个第三多肽片段，选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 2的氨基酸589至860具有至少60% —致性的一个多肽片段；(ii)由在至少低严谨度条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸2072至2937或其cDNA序列杂交、或者与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一个多肽片段；(iii)由与SEQ ID NO:1的核苷酸2072至2937或其cDNA序列具有至少60% —致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iv) —个多肽片段，包括SEQ ID NO:2的氨基酸589至860或由其组成。
[0018]本发明还涉及编码这些嵌合多肽的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及产生这些嵌合多肽的方法。
[0019]本发明还涉及降解或转化纤维素材料的方法，该方法包括:在本发明的具有β -葡糖苷酶活性的嵌合多肽的存在下，用酶组合物处理纤维素材料。
[0020]本发明还涉及用于生产发酵产物的方法，该方法包括:(a)在本发明的具有具有β -葡糖苷酶活性的嵌合多肽的存在下，用酶组合物对纤维素材料进行糖化；(b)用一种或多种(例如若干种) 发酵微生物对糖化的纤维素材料进行发酵，以产生发酵产物；并且(C)从发酵中回收发酵产物。
[0021]本发明还涉及对纤维素材料进行发酵的方法，该方法包括用一种或多种(例如若干种)发酵微生物对纤维素材料进行发酵，其中纤维素材料是在本发明的具有β -葡糖苷酶活性的嵌合多肽的存在下用酶组合物糖化的。
[0022]附图简要说明
[0023]图1A和IB示出了棘孢曲霉GH3AP-葡糖苷酶基因的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:1和2)。预测的信号肽标以下划线，并且预测的内含子以斜体表不。
[0024]图2A和2B示出了烟曲霉GH3a β -葡糖苷酶基因的基因组DNA序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID Ν0:3和4)。预测的信号肽标以下划线，预测的内含子以斜体表示。
[0025]图3示出了 pAG114的限制性酶切图谱。
[0026]图4示出了 pDFngll6的限制性酶切图谱。
[0027]图5示出了野生型烟曲霉GH3A β -葡糖苷酶、野生型棘孢曲霉GH3A β -葡糖苷酶、以及嵌合的β-葡糖苷酶对通过里氏木霉水解纤维素蛋白组合物预处理玉米秸杆(PCS)的水解的作用。圆圈=嵌合β-葡糖苷酶。菱形=野生型棘孢曲霉GH3Ai3-葡糖苷酶。方块=野生型烟曲霉GH3A β -葡糖苷酶。
[0028]图6示出了野生型烟曲霉GH3A β -葡糖苷酶、野生型棘孢曲霉GH3A β -葡糖苷酶、以及嵌合β-葡糖苷酶变体对通过里氏木霉水解纤维素蛋白组合物预处理玉米秸杆(PCS)的水解的作用。圆圈=嵌合β-葡糖苷酶变体。菱形=野生型棘孢曲霉GH3Ai3-葡糖苷酶。方块=野生型烟曲霉GH3A β -葡糖苷酶。
[0029]定义[0030]乙酰基木聚糖酯酶:术语“乙酰基木聚糖酯酶”是指对来自聚合木聚糖、乙酰化的木糖、乙酰化的葡萄糖、α-乙酸萘酯、以及对乙酸硝苯酯的乙酰基的水解进行催化的羧酸酯酶(EC3.1.1.72)。出于本发明的目的，使用在含有0.01%TWEEN?20(聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯)的50mM乙酸钠pH5.0中的0.5mM对硝基苯乙酸酯作为底物确定乙酰基木聚糖酯酶活性。一个单位的乙酰基木聚糖酯酶被定义为，在pH5，25°C，每分钟能够释放Iymol对硝基酚根阴离子的酶的量。
[0031]等位变体:术语“等位变体”是指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可变形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中无改变)，或可以编码出具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
[0032]a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶:术语“ a _L_阿拉伯呋喃糖苷酶”是指催化a _L_阿拉伯糖苷中的末端非还原a-L-阿拉伯呋喃糖苷残基水解的a-L-阿拉伯呋喃糖苷阿拉伯呋喃糖水解酶(EC3.2.1.55)。该酶作用于a-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，3)-和/或(1，5)_键的a-L-阿聚糖、阿拉伯木聚糖、以及阿拉伯半乳聚糖。a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶也称为阿拉伯糖苷酶、α -阿拉伯糖苷酶、a -L-阿拉伯糖苷酶、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、多糖a _L_阿拉伯呋喃糖苷酶、a -L-阿拉伯呋喃糖苷水解酶、L-阿拉伯糖苷酶、或a _L_阿拉伯聚糖酶。出于本发明的目的，使用200 μ I总体积中的IOOmM乙酸钠(ρΗ5)的5mg/ml中等粘度小麦阿拉伯木聚糖(Megazyme International Ireland,股份有限公司，布雷(Bray) C0.威克洛(Wicklow)爱尔兰)在40°C持续30分钟，随后通过AMINEX? HPX-87H柱色谱法(Bio-RadLaboratories公司，海格立斯(Hercules),加利福尼亚州，美国)进行阿拉伯糖分析,来确定a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。
[0033]α -葡萄糖醛酸酶:术语“ α -葡萄糖醛酸酶”是指催化a -D-葡糖醛酸苷水解为D-葡糖醛酸酯和醇的a-D-葡糖苷醛酸酯葡糖醛酸水解酶(EC3.2.1.139)。出于本发明的目的，根据德弗里斯(de Vries), 1998,《细菌学杂志》(J.Bacteriol).180:243-249确定α-葡萄糖醛酸酶活性。一个单位的α-葡萄糖醛酸酶等于，在PH5，40°C，每分钟能够释放I μ mo I的葡糖醛酸或4-邻位甲基葡萄糖醛酸的酶的量。
[0034]β -葡糖苷酶:术语“ β -葡糖苷酶”是指催化末端非还原β -D-葡萄糖残基水解，同时释放β-D-葡萄糖的β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)。出于本发明的目的，使用对硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷作为底物来确定β -葡糖苷酶活性，根据的是文图里(Venturi )等人,2002的程序，来自一种嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum var.coprophilum)的细胞外β-D-葡糖苷酶:生产、纯化以及一些生物化学特性，《基础微生物学杂志》(J.Basic Microbiol.)42:55-66。一个单位的β _葡糖苷酶被定义为在25°C，每分钟从含有0.01% TWEEN? 20的50mM柠檬酸钠pH4.8中，或者从含有0.01%TWEEN?20的50mM乙酸钠pH5.0中，以ImM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物而产生的
1.0 μ mo I的对硝基酹根阴离子。
[0035]β -木糖苷酶:术语“ β -木糖苷酶“是指催化短β - (I — 4)-低聚木糖的外切水解，以从非还原末端除去连续的D-木糖残基的β-D-木糖苷木糖苷酶(E.C.3.2.1.37)。出于本发明的目的，一单位的木糖苷酶被定义为在40°C，pH5，每分钟从含有0.01% TWEEN? 20的IOOmM柠檬酸钠中，以ImM对硝基苯基-β -D-木糖苷作为底物而产生的1.0 μ mol的对硝基酚根阴离子。
[0036]cDNA:术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
[0037]纤维二糖水解酶:术语“纤维二糖水解酶”是指催化纤维素、纤维寡糖、或任何含β -1, 4-连接的葡萄糖的聚合物中的1，4-β -D-糖苷键水解，从该链的还原端或非还原端释放纤维二糖的1，4-β -D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)(泰里(Teeri ),1997,晶态纤维素降解:纤维二糖水解酶功能的新见解(Crystal I inecellulose degradation:New insight into the function of cellobiohydrolases),《生物技术趋势》(Trends in Biotechnology) 15:160-167 ;泰里(Teeri )等人，1998,里氏木霉纤维二糖水解酶:为何对晶态纤维素如此有效？ (Trichoderma reeseicellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose?),《生物化学学会学报》(Biochem.Soc.Trans.) 26:173-1780。根据莱韦尔(Lever)等人，1972，《分析生物化学》(Anal.Biochem.) 47:273-279 ;范帝伯赫(van Tilbeurgh)等人，1982，《FEBS 快报》(FEBS Letters), 149:152-156 ;范帝伯赫(van Tilbeurgh)和克赖森斯(Claeyssens)，1985，《FEBS通讯》，187:283-288 ；以及多姆(Tomme)等人，1988，《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.>170:575-581所述的程序确定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，可以使用多姆(Tomme)等人的方法来确定纤维二糖水解酶活性。
[0038]纤维素分解酶或纤维素酶:术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”是指水解纤维素材料的一种或多种(例如若干种)酶。此类酶包括一种或多种葡聚糖内切酶、一种或多种中国纤维二糖水解酶、β -葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括:(I)测量总纤维素分解活性，以及(2)测量单独的纤维素分解活性(葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、和葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，对纤维素酶改进的展望:筛选和选择策略(Outlook for cellulase improvement:Screening and selection strategies),2006,《生物技术进展》(Biotechnology Advances)24:452-481中综述。通常使用不溶底物，包括沃特曼(Whatman) No I滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉、预处理的木质纤维素、等，测量总纤维素分解活性。最常用的总纤维素分解活性测定是使用沃特曼(Whatman)Na I滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会((IUPAC)建立的(高斯(Ghose), 1987,纤维素酶活性的测量(Measurement of cellulase activities),《纯粹与应用化学》(Pure Appl.Chem.) 59:257-68)。
[0039]出于本发明的目的，在以下条件下，通过测量一种或多种纤维素分解酶水解纤维素材料的增加确定纤维素分解酶活性:在合适的温度下，例如50°C、55°C、或60°C，以及合适的pH，例如4-9，l-50mg的纤维素分解酶蛋白/PCS中的g纤维素(或其他预处理的纤维素材料)持续3-7天，与不添加纤维素分解酶蛋白的对照水解进行比较。典型的条件是Iml反应，洗涤或未洗涤的PCS，5%不溶固体，50mM乙酸钠pH5，ImM MnSO4, 50°C、55°C、或60°C，72 小时，用AMINEX? HPX-87H 柱(Bio-Rad Laboratories 公司，海格立斯(Hercules),加利福尼亚州，美国)的糖分析。[0040]纤维素材料:术语“纤维素材料”是指含纤维素的任何材料。在生物质初生细胞壁中的主要多糖是纤维素，第二最丰富的是半纤维素，而第三丰富的是果胶。细胞已经停止生长之后产生的次生细胞壁也含有多糖，而且次生细胞壁通过与半纤维素共价交联的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此为直链的β_ (1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，例如具有多种取代基的复杂分支结构的木聚糖、木糖葡聚糖、阿糖木聚糖、和甘露聚糖。虽然纤维素通常是多形的，但在植物组织中发现的纤维素主要为平行葡聚糖链的不溶晶体基质(crystalline matrix)。半纤维素通常与纤维素连同其他半纤维素通过氢键结合，这有助于稳定细胞壁基质。
[0041]例如，纤维素通常发现于植物的茎、叶、外壳、外皮、以及穗轴，或树木的叶、枝、以及干。纤维素材料可以是，但不局限于农业残留物、草本材料(包括能源作物)、市政固体废物、木浆和造纸厂残留物、废纸、以及木材(包括林业残留物)(参见例如威瑟洛格尔(Wiselogel)等人，I"5,《关于生物乙醇的手册》(Handbook on Bioethanol)(查尔斯E.怀曼((Charles E.Wyman)编辑)，105-118 页，Taylor&Francis 出版集团，华盛顿；怀曼(Wyman), 1994,《生物资源技术》(Bioresource Technology) 50:3-16 ;林德(Lynd), 1990，《应用生物化学与生物技术》(Applied Biochemistry and Biotechnology)24/25:695-719 ；莫热(Mosier)等人，1999,木质纤维素的生物转化的最新进展(Recent Progress inBioconversion of Lignocellulosics),《生化工程 / 生物技术进展》(Advances inBiochemical Engineering/Biotechnology),舍佩尔(T.Scheper)，总编辑，65 卷，23-40页，Springer-V erlag出版社，纽约)。在此应理解，纤维素可以是以下形式:木质纤维素，含混合基质中的木质素、纤维素、和半纤维素的植物细胞壁材料。在一个优选的方面，纤维素材料是任何生物质材料。在另一个优选的方面，纤维素材料是木质纤维素，它包括纤维素、半纤维素、和木质素。
[0042]在一个方面，纤维素材料是农业残留物。在另一个方面，纤维素材料是草本材料(包括能源作物)。在另一个方面，纤维素材料是市政固体废物。在另一个方面，纤维素材料是木浆和造纸厂残留物。在另一个方面，纤维素材料是废纸。在另一个方面，纤维素材料是木材(包括林业残留物)。
[0043]在另一个方面，纤维素材料是芦竹属。在另一个方面，纤维素材料是甘蔗渣。在另一个方面，纤维素材料是竹子。在另一个方面，纤维素材料是玉米穗轴。在另一个方面，纤维素材料是玉米纤维。在另一个方面，纤维素材料是玉米秸杆。在另一个方面，纤维素材料是芒属。在另一个方面，纤维素材料是橙皮。在另一个方面，纤维素材料是水稻秸杆。在另一个方面，纤维素材料是柳枝稷。在另一个方面，纤维素材料是麦秸。
[0044]在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是桉树。在另一个方面，纤维素材料是揪树。在另一个方面，纤维素材料是松树。在另一个方面，纤维素材料是白杨。在另一个方面，纤维素材料是云杉。在另一个方面，纤维素材料是柳树。
[0045]在另一个方面，纤维素材料是藻类纤维素。在另一个方面，纤维素材料是细菌纤维素。在另一个方面，纤维素材料是棉籽绒。在另一个方面，纤维素材料是滤纸。在另一个方面，纤维素材料是微晶纤维素。在另一个方面，纤维素材料是磷酸处理的纤维素。
[0046]在另一个方面，纤维素材料是水生生物质。如在此使用，术语“水生生物质”是指在水生环境中，由光合作用过程产生的生物质。水生生物质可以是藻类、挺水植物、浮叶植物、或沉水植物。
[0047]使用本领域已知的方法，纤维素材料可以在预处理时使用或可以经受预处理，如在此所述。在一个优选的方面，纤维素材料是预处理的。
[0048]具有β -葡糖苷酶活性的嵌合多肽:术语“具有β -葡糖苷酶活性的嵌合多肽”是指一种多肽，它的构成是这样产生的:通过用来自一种或多种(例如若干种)其他β_葡糖苷酶的同源位置的那些氨基酸置换来自一个β_葡糖苷酶的氨基酸的一个或多个(例如若干个)序列，其中该嵌合多肽具有葡糖苷酶活性。术语“具有葡糖苷酶活性的嵌合多肽”在此还称为“嵌合β -葡糖苷酶”。
[0049]编码序列:术语“编码序列”是指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般是通过以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束的一个开放读码框来确定。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0050]控制序列:术语“控制序列”是指对于编码多肽的多核苷酸的表达为必要的核酸序列。各个控制序列可以相对于编码多肽的多核苷酸是原生的(native)(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这样的控制序列包括但不局限于前导子，聚腺苷酸化序列，前肽序列，启动子，信号肽序列，和转录终止子。最少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。可以为这些控制序列提供为了引入以特定限制性位点的接头，以促进这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接。
[0051]葡聚糖内切酶:术语“葡聚糖内切酶”是指内切-1，4-(1，3;1，4)-3-0-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，它催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的l，4-13-D-糖苷键，混合的β_1，3葡聚糖(例如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖)中的β_1，4键，以及含有纤维素组分的其他植物材料的内切水解。可以通过测量底物粘度的减小，或通过还原糖测定确定还原端增加来确定葡聚糖内切酶活性(张(Zhang)等人，2006,《生物技术进展》(Biotechnology Advances)24:452_481))。出于本发明的目的，根据高斯(Ghose)，1987，《纯粹与应用化学》(Pure and Appl.Chem) 59:257-268的程序，在pH5，40°C下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，确定葡聚糖内切酶活性。
[0052]表达:术语“表达”包括产生多肽涉及的任何步骤，包括但不局限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、和分泌。
[0053]表达载体:术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与提供了其表达的控制序列相连接的线性或环状DNA分子。
[0054]家族GH3i3-葡糖苷酶:术语“家族GH3 β -葡糖苷酶”是指根据库迪尼奥(Coutinho, P.Μ.)和亨利萨特(Henrissat, B.), 1999,碳水化合物活性酶:一种集中数据库方法(Carbohydrate-active enzymes:an integrated database approach) “在碳水化合物生物工程新进展(Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering) ”，吉尔伯特(H.J.Gilbert)、戴维斯(G.Davies),亨利萨特(B.Henrissat)、和 B.Svensson (斯文森)编辑，英国皇家化学会(The Royal Society of Chemistry),剑桥,3-12页的家族3糖苷水解酶。
[0055] 家族61糖苷水解酶:术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61是指根据亨利萨特(Henrissat)，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities),《生物化学杂志》(Biochem.J.) 280:309-316 ;以及亨利萨特(HenrissatB.)和巴洛赫(Bairoch A.), 1996,糖基水解酶分类的基于序列的更新(Updating thesequence-based classification of glycosyl hydrolases),〈〈生物化学杂志〉〉(Biochem.J.) 316:695-696,属于糖苷水解酶家族61中的多肽。基于一个家族成员中非常弱的内切-1，4-β -D-葡聚糖酶活性的测量，这一家族中的酶最初分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被认为是真实的糖苷酶。然而，当结合纤维素酶或纤维素酶混合物使用时，基于它们增强木质纤维素分解的能力，它们被保持在CAZy分类中。
[0056]阿魏酰基酯酶:术语“阿魏酰基酯酶”是指催化来自酯化的糖(通常是天然生物质底物中的阿拉伯糖)的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)基团的水解以产生阿魏酸根(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸根)的4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基-糖水解酶(EC3.1.1.73)。阿魏酰基酯酶也称为阿魏酸酯酶、羟基肉桂酰基酯酶、FAE-1I1、肉桂酰基酯水解酶、FAEA、、cinnAE、FAE-1、或FAE-1I。出于本发明的目的，使用在50mM乙酸钠(pH5.0)中的0.5mM对硝基苯基阿魏酸酯作为底物确定阿魏酰基酯酶活性。一个单位的阿魏酰基酯酶等于，在pH5，25°C，每分钟能够释放Iymol的对硝基酚根阴离子的酶的量。
[0057]片段:术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有葡糖苷酶活性。在一个方面，一个片段含有SEQID NO: 2的至少720个氨基酸残基，例如至少760个氨基酸残基或至少800个氨基酸残基。在另一个方面，一个片段含有SEQ ID NO:4的至少720个氨基酸残基，例如至少760个氨基酸残基或至少800 个氨基酸残基。在另一个方面，一个片段含有SEQ ID Ν0:6或SEQ IDNO:8的至少720个氨基酸残基，例如至少760个氨基酸残基或至少800个氨基酸残基。
[0058]半纤维素分解酶或半纤维素酶:术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”是指水解半纤维素材料的一种或多种(例如若干种)酶。参见例如沙龙(Shallom，D.)和肖汉姆(Shoham, Y)微生物半纤维素酶(Microbial hemicelIulases),《微生物学新见》(CurrentOpinion In Microbiology)，2003，6 (3): 219-228。半纤维素酶是植物生物质降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不局限于乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酰基酯酶、半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、以及木糖苷酶。这些酶的底物，半纤维素，是经由氢键结合至植物细胞壁中的纤维素微原纤维的分支的和直链的多糖类的多相群，将它们交联成鲁棒的网络。半纤维素还共价地附接至木质素，与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织需要用于其完全降解的许多酶的协调作用。半纤维素的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸酯或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。基于它们的一级序列的同源性，这些催化模块可以分为GH和CE家族。一些家族，具有总体类似的折叠，可以被进一步分组为多个小族，按字母顺序标记(例如GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最有信息的和最新分类在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中是可得的。根据高斯(Ghose)和比赛亚(Bisaria), 1987,《纯粹与应用化学》(Pure&App1.Chem.)59:1739-1752，在合适的温度，例如50°C、55°C、或60°C，以及pH例如5.0或5.5，可以测量半纤维素分解酶活性。[0059]高严谨度条件:术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准 DNA 印迹(Southern blotting)程序，在 42°C下在 5XSSPE、0.3%SDS、200 微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在65°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0060]宿主细胞:术语“宿主细胞”是指对转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型，或具有包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的类似者。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的该亲本细胞的任何后代。
[0061]增加的比活性:术语“增加的比活性”是指与每分子或μ mol的嵌合β -葡糖苷酶或其变体的一种或多种(例如若干种)亲本的酶活性相比，每分子或ymol的嵌合β-葡糖苷酶或其变体的更高酶活性。可以相对于一种或多种亲本来评估嵌合葡糖苷酶或其变体的增加的比活性，例如在pH、温度、底物浓度、以及产物抑制剂(例如葡萄糖)浓度的一种或多种(例如若干种)条件下。
[0062]在一个方面，相对于亲本葡糖苷酶中的一种或多种，嵌合葡糖苷酶或其变体具有增加的比活性。在另一个方面，相对于亲本β_葡糖苷酶中的一种，嵌合β_葡糖苷酶或其变体具有增加的比活性。在另一个方面，相对于亲本β_葡糖苷酶中的每一种，嵌合β-葡糖苷酶或其变体具有增加的比活性。
[0063]在一个方面，条件是pH。例如，pH可以是范围3至7中的任何pH，例如3.0、3.5、
4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0 (或其中间)。可以使用达到希望的pH的任何合适的缓冲液。
[0064]在另一个方面，条件是温度。例如，温度可以是范围25°C至90°C中的任何温度，例如 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、或 90°C (或其中间)。
[0065]在另一个方面，条件是底物浓度。例如，底物浓度可以是范围ImM至IOOmM中的任何底物浓度，例如lmM、10mM、25mM、50mM、75mM、或IOOmM (或其中间)。底物的实例包括而不局限于纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、β -龙胆二糖、海带糖(laminaribose)、或槐糖。
[0066]在另一个方面，条件是产物抑制剂浓度。例如，产物抑制剂浓度可以是范围ImM至120禮中的任何浓度，例如11111、101111、251111、501111、751111、1001111、或1201111 (或其中间)。产物的实例包括而不局限于葡萄糖、β -D-甘露糖、β -D-山梨糖、或D-葡糖醛酸。
[0067]在另一个方面，使用两种或更多种(例如若干种)以上条件的组合来确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的增加的比活性，例如在范围25°C至90°C中的任何温度，例如 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、或 90°C(或其中间)，在范围 3 至 7 的pH，例如 3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5、或 7.0 (或其中间)。
[0068]在一个方面，在pH4.0和25°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和30°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和35°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和40°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和45°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和50°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和55°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和60°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在PH4.0和65°C确定嵌合β_葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和70°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和75°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和80°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和85°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.0和90°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。
[0069]在另一个方面，在ρΗ4.5和25°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.5和30°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.5和35°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.5和40°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.5和45°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.5和50°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.5和55°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.5和60°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.5和65°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ρΗ4.5和70°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ρΗ4.5和75°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ρΗ4.5和80°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ρΗ4.5和85°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ4.5和90°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。
[0070]在另一个方面， 在ρΗ5.0和25°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和30°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和35°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和40°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和45°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和50°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和55°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和60°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和65°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和70°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和75°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和80°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和85°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.0和90°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。
[0071]在另一个方面，在ρΗ5.5和25°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.5和30°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.5和35°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.5和40°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.5和45°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在PH5.5和50°C确定嵌合β_葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.5和55°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.5和60°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.5和65°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ρΗ5.5和70°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ρΗ5.5和75°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ρΗ5.5和80°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ρΗ5.5和85°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ5.5和90°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。
[0072]在另一个方面，在ρΗ6.0和25°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和30°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和35°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和40°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和45°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和50°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和55°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和60°C确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和65°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和70°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和75°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和80°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和85°C确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在另一个方面，在ΡΗ6.0和90°C确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。
[0073]在以上方面的每一个中，可以在浓度为IOmM的葡萄糖的存在下确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在以上方面的每一个中，可以在浓度为25mM的葡萄糖的存在下确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在以上方面的每一个中，可以在浓度为50mM的葡萄糖的存在下确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在以上方面的每一个中，可以在浓度为75mM的葡萄糖的存在下确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在以上方面的每一个中，可以在浓度为IOOmM的葡萄糖的存在下确定嵌合葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。在以上方面的每一个中，可以在浓度为120mM的葡萄糖的存在下确定嵌合β-葡糖苷酶或其变体相对于亲本的比活性。
[0074]可以使用本领域已知的用于β -葡糖苷酶的任何酶活性测定确定嵌合β -葡糖苷酶或其变体相对于亲本的增加的比活性。此类酶活性测定包括而不局限于纤维二糖或对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物。可替代地，可以使用用于嵌合葡糖苷酶或其变体的任何应用测定来确定嵌合β_葡糖苷酶或其变体相对于亲本的增加的比活性，其中将嵌合β_葡糖苷酶或其变体的性能与亲本进行比较。例如，可以使用描述于实例7中的应用测定。
[0075] 在一个方面，嵌合葡糖苷酶或其变体的比活性至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.1倍、至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、以及至少50倍高于亲本的比活性。
[0076]分离的:术语“分离的”是指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(I)任何非天然存在的物质，(2)任何物质，包括但不局限于从与其性质上相关的一种或多种或所有天然存在的组分至少部分除去的任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子；⑶相对于自然中发现的物质，由人手工修饰的物质；或⑷通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
[0077]低严谨度条件:术语“低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准 DNA 印迹(Southern blotting)程序，在 42°C下在 5XSSPE、0.3%SDS、200 微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在50°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0078]成熟多肽:术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化、等)后，处于其最终形式的多肽。在一个方面，基于SignalP程序(尼尔森(Nielsen)等，1997,《蛋白质工程》(Protein Engineering) 10:1-6)预测 SEQID NO:1的氨基酸I至19是信号肽，该成熟多肽是SEQ ID NO: 2的氨基酸20至860。在另一个方面，基于SignalP程序预测SEQ ID NO: 4的氨基酸I至19是信号肽，该成熟多肽是SEQ ID NO: 4的氨基酸20至863。在另一个方面，基于SignalP程序预测SEQ ID NO: 6的氨基酸I至19是信号肽，该成熟多肽是SEQ ID NO: 6的氨基酸20至860。在另一个方面，基于SignalP程序预测SEQ ID NO: 8的氨基酸I至19是信号肽，该成熟多肽是SEQ ID NO: 8的氨基酸20至860。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
[0079]成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有β -葡糖苷酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，基于SignalP程序(尼尔森(Nielsen)等，1997，同上)预测SEQ ID NO:1的核苷酸I至57编码信号肽，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的131至2937。在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸131至2937中所含有的cDNA序列。在另一个方面，基于SignalP程序预测SEQ ID NO:3的核苷酸I至57编码信号肽，该成熟多肽编码序列是SEQ ID N0:3的58至3057。在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 3的核苷酸58至3057中所含有的cDNA序列。在另一个方面，基于SignalP程序预测SEQ ID NO: 5的核苷酸I至57编码信号肽，该成熟多肽编码序列是SEQID NO: 5的131至2936。在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 5的核苷酸131至2936中所含有的cDNA序列。在另一个方面，基于SignalP程序预测SEQ ID NO: 7的核苷酸I至57编码信号肽，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 7的131至2936。在另一个方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 7的核苷酸131至2936中所含有的cDNA序列。
[0080] 中严谨度条件:术语“中严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2%SDS，在55 °C下洗涤三次，每次15分钟。[0081]中-高严谨度条件:术语“中-高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC,0.2%SDS，在60°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0082]突变体:术语“突变体”意是指编码变体的多核苷酸。
[0083]核酸构建体:术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离的、或被修饰成以自然中不会另外出现的方式包含核酸区段的、或合成的单链的或双链的核酸分子，它包含一个或多个控制序列。
[0084]可操作地连接:术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列位于相对于一个多核苷酸的编码序列的适当位置处，这样使得该控制序列指导该编码序列的表达。
[0085]亲本或亲本β -葡糖苷酶(嵌合β -葡糖苷酶):对于嵌合β -葡糖苷酶，术语“亲本”或“亲本葡糖苷酶”是指一种葡糖苷酶，其一部分是嵌合葡糖苷酶或其变体的部件。
[0086]亲本或亲本葡糖苷酶(变体):对于变体，术语“亲本”或“亲本葡糖苷酶”是指一种β_葡糖苷酶，在一个或多个(若干个)位置对其进行改变，即取代、插入、和/或缺失，以产生本发明的变体。该亲本可以是天然存在的(野生型)多肽、嵌合多肽、融合多肽、或其变体、或其片段。
[0087]具有增强的纤维素分解活性的多肽:术语“具有增强的纤维素分解活性的多肽”是指催化由具有纤维素分解活性的酶进行的纤维素材料水解的增强的GH61多肽。出于本发明的目的，通过在以下 条件下，测量来自由纤维素分解酶进行的纤维素材料水解的还原糖的增加、或总纤维二糖和葡萄糖的增加，确定增强的纤维素分解活性:l_50mg的总蛋白/g的在预处理的玉米秸杆(PCS)中的纤维素，其中总蛋白组成为:50-99.5%w/w纤维素分解酶蛋白和0.5-50%w/w具有增强的纤维素分解活性的GH61多肽的蛋白，持续1_7天，在合适的温度，例如50°C、55°C、或60°C，以及合适的pH,例如4-9，例如5.0或5.5，与对照水解进行比较，其中具有相等的总蛋白加载，但不具有增强的纤维素分解活性(l_50mg的纤维素分解蛋白/g的PCS中的纤维素)。在一个优选的方面，在占总蛋白重量2%-3%的米曲霉β-葡糖苷酶(根据W002/095014，在米曲霉中重组产生)或占总蛋白重量2%_3%的烟曲霉β -葡糖苷酶(如W02002/095014中所述，在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白加载的存在下，CELLUCLAST1.5L (诺维信公司，Bagsvaerd，丹麦)的混合物被用作纤维素分解活性的来源。
[0088]具有增强的纤维素分解活性的GH61多肽增强了纤维素材料的由具有纤维素分解活性的酶催化的水解，将达到相同水解度所需的纤维素分解酶的量优选减少了至少1.01倍，例如至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍。
[0089]预处理的玉米秸杆:术语“PCS”或“预处理的玉米秸杆”是指通过用加热和稀硫酸处理、碱预处理、或中性预处理，源自玉米秸杆的纤维素材料。
[0090]序列一致性:用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的亲缘关系。
[0091]出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman (尼德曼)和Wunsch (翁施)，1970, J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite), Rice (赖斯)等人，2000,Trends Genet.(遗传学趋势)16:276-277)的 Needle 程序所实施的，优选 3.0.0、5.0.0版或更新版本。所使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的Needle (尼德尔)的输出(使用-nobrief选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下:
[0092](一致的残基X100) / (比对长度-比对中的空位总数)
[0093]为了本发明的目标,使用Needleman (尼德曼)-Wunsch (翁施)算法(Needleman (尼德曼)和Wunsch (翁施)，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性，如在EMBOSS包中的Needle (尼德尔)程序中实施(EMB0SS:欧洲分子生物学开放软件套装(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite), Rice (赖斯)等人，2000,同上)，优选是版本3.0.0,5.0.0或更新版本。使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL (NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的Needle(尼德尔)的输出(使用-nobrief选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下:
[0094](一致的脱氧核糖核酸X100) / (比对长度-比对中的空位总数)
[0095]子序列:术语“子序列”是指具有从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有β -葡糖苷酶活性的片段。在一个方面，子序列含有至少85%，例如至少90%或至少95%的SEQ ID NO: 1、SEQID NO:3, SEQ ID Ν0:5、 或SEQ ID Ν0:7的成熟多肽编码序列的核苷酸；或其cDNA序列。
[0096]变体:术语“变体”是指包含一个改变(即在一个或多个(例如，若干)位置处的一个取代、插入和/或缺失)的β_葡糖苷酶或嵌合β_葡糖苷酶。取代是指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸替代；缺失是指占据一个位置的氨基酸的移除；并且插入是指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
[0097]非常高严谨度条件:术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC,0.2%SDS，在70°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0098]非常低严谨度条件:术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC,0.2%SDS，在45°C下洗涤三次，每次15分钟。
[0099]含木聚糖材料:术语“含木聚糖材料”是指包含植物细胞壁多糖的任何材料，该植物细胞壁多糖含有β-(1-4)-连接的木糖残基的主链。陆生植物的木聚糖是拥有β -(1-4)-D-吡喃木糖主链的杂聚物，它由短碳水化合物链分支。它们包含D-葡糖醛酸或其4-0-甲基醚、L-阿拉伯糖、和/或不同寡糖，由D-木糖、L-阿拉伯糖、D-或L-半乳糖、和D-葡萄糖组成。木聚糖型多糖可以分为同聚木聚糖和杂聚木聚糖，后者包括葡糖醛酸木聚糖、(阿拉伯)葡糖醛酸木聚糖、(葡糖醛酸)阿拉伯木聚糖、阿拉伯木聚糖、和复杂的杂木聚糖。参见例如伊布林格洛娃(Ebringerova)等人,2005,《聚合物科学进展》(Adv.Polym.Sc1.) 186:1-67。[0100]在本发明的方法中，可以使用任何含有木聚糖的材料。在一个优选的方面，含木聚糖材料是木质纤维素。
[0101]聚木糖降解活性或木聚糖分解活性:木聚糖术语“木聚糖降解活性”或“木聚糖分解活性”是指水解含木聚糖材料的生物活性。用于测量木聚糖分解活性的两种基本方法包括:(1)测量总木聚糖分解活性，以及(2)测量单独的木聚糖分解活性(例如木聚糖内切酶、β -木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、α -葡萄糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酰基酯酶、以及α-葡糖醛酸酯酶)。在若干出版物中总结了木聚糖分解酶测定中的最新进展，包括比利(Biely)和普乔尔德(Puchard), 2006,木聚糖分解酶测定中的最新进展(Recentprogress in the assays of xylanolytic enzymes),《食品与农业科学期刊》(Journal ofthe Science of Food and Agriculture) 86 (11): 1636-1647 ;斯帕尼科娃(Spanikova)和比利(Biely)，2006，葡糖醛酸酯酶-由裂褶菌产生的新颖的碳水化合物酯酶(Glucimmoylesterase-Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune), FEBS通讯(FEBS Letters) 580 (19): 4597-4601 ；赫尔曼(Herrmann)、沃桑斯卡(Vrsanska)、尤日奇科娃(Jurickova)、赫希(Hirsch)、比利(Biely)和库比切克(Kubicek), 1997,里氏木霉的β-D-木糖苷酶是多功能β-D-木聚糖木水解酶(The beta-D-xylosidase ofTrichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylan xylohydrolase),〈〈生物化学杂志》(Biochemical Journal) 321:375-381。
[0102]可以通过确定由不同类型的木聚糖，包括例如燕麦木聚糖、山毛榉木材木聚糖、和落叶松木材木聚糖形成的还原糖，或者通过光度确定从不同共价染色的木聚糖释放的染色的木聚糖片段，测量总木聚糖降解活性。最常见的总木聚糖分解活性测定是基于来自聚合的4-0-甲基葡糖醒酸木聚糖的还原糖的产生,如在贝利(Bailey)、比利(Biely)、普坦尼(Poutanen), 1992,用于木聚糖酶活性的测定的方法的实验室间检验(Interlaboratorytesting of methods for assay of xylanase activity),〈〈生物技术杂志〉〉(Journal ofBiotechnology) 23(3):257-270中所述。还可以在37°C，用0.2%AZCL_阿拉伯木聚糖作为底物，在 0.01% TRITON? X-100 (4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)和 200mM磷酸钠缓冲液PH6中，确定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37°C、pH6下，在200mM磷酸钠pH6缓冲液中每分钟从0.2%AZCL_阿拉伯木聚糖底物中产生的1.0 μ mol的天然青萃安染料。
[0103]出于本发明的目的，通过在以下典型条件下:1ml反应，5mg/ml底物(总固体)，5mg的木聚糖分解蛋白/g的底物，50mM乙酸钠pH5，50°C，24小时，使用对羟基苯甲酸酰肼(PHBAH)测定的糖分析，测量由一种或多种木聚糖降解酶所致的白桦木材木聚糖(Sigma Chemical C0.,公司，圣路易斯,密苏里州，美国)的水解的增加,确定木聚糖降解活性，如由利弗(Lever), 1972,用于比色确定碳水化合物的新反应(A new reaction forcolorimetric determination of carbohydrates),〈〈分析生物化学》(Anal.Biochem)47:273-279 所述。
[0104]木聚糖酶:术语“木聚糖酶”是指催化木聚糖中的1，4- β -D-木糖苷键内切水解的1,4-β -D-木聚糖-木水解酶(Ε.C.3.2.1.8)。出于本发明的目的，在37°C，用0.2%AZCL_阿拉伯木聚糖作为底物，在0.01% TRITON? X-100和200mM磷酸钠缓冲液pH6中，确定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶活性定义为在37°C、pH6下，在200mM磷酸钠pH6缓冲液中每分钟从0.2%AZCL-阿拉伯木聚糖底物中产生的1.0 μ mol的天然青萃安染料。
[0105]野生型多肽:术语“野生型多肽”是指由天然存在的微生物(例如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的一种酶。
[0106]发明详细说明
[0107]本发明涉及具有β -葡糖苷酶活性的嵌合多肽，该嵌合多肽包括:
[0108](a)在该嵌合多肽N-末端的一个第一多肽片段，选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO:2的氨基酸20至404具有至少60%—致性的一个多肽片段；(ii)由在至少低严谨度条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸131至1455或其cDNA序列杂交、或者与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一个多肽片段；(iii)由与SEQ ID NO:1的核苷酸131至1455或其cDNA序列具有至少60% —致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iv) 一个多肽片段，包括SEQ ID NO:2的氨基酸20至404或由其组成；
[0109](b)在该第一多肽片段C末端的一个第二多肽片段，选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 4的氨基酸406至589具有至少60% —致性的一个多肽片段；(ii)由在至少低严谨度条件下与SEQ ID NO: 3的核苷酸1570至2184或其cDNA序列杂交、或者与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一个多肽片段；(iii)由与SEQ ID N0:3的核苷酸1570至2184或其cDNA序列具有至少60% —致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iv) —个多肽片段，包括SEQ ID NO:4的氨基酸406至589或由其组成；以及
[0110](C)在该第二多肽片段C末端的一个第三多肽片段，选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 2的氨基酸589至860具有至少60% —致性的一个多肽片段；(ii)由在至少低严谨度条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸2072至2937或其cDNA序列杂交、或者与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一个多肽片段；(iii)由与SEQ ID NO:1的核苷酸2072至2937或其cDNA序列具有至少60% —致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iv) —个多肽片段，包括SEQ ID NO:2的氨基酸589至860或由其组成。
[0111]在一个实施例中，与SEQ ID NO: 2的成熟多肽、SEQ ID NO:4的成熟多肽、或与SEQID NO: 2的成熟多肽和SEQ ID NO: 4的成熟多肽这二者相比，本发明的嵌合多肽具有增加的比活性。
[0112]在一个第一方面，在嵌合多肽的N-末端的第一多肽片段具有与SEQ ID N0:2的氨基酸20至404的至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一个实施例中，第一多肽片段与SEQ ID NO: 2的氨基酸20至404区别在于最多10个氨基酸，例如区别在于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
[0113]在另一个实施例中，第一多肽片段是至少240个氨基酸，例如至少260、至少280、至少300、至少320、至少340、至少360个氨基酸、至少370个氨基酸、或至少380个氨基酸。在另一个实施例中，第一多肽片段是385个氨基酸。
[0114]在另一个实施例中，第一多肽片段包括SEQ ID NO:2的氨基酸20至404、或其等位变体或由它们组成；或是其一个片段。在另一方面，第一多肽片段包括SEQ ID N0:2的氨基酸20至404或由其组成。
[0115]在另一个第一方面，在第一多肽片段的C-末端的第二多肽片段具有与SEQ IDNO: 4的氨基酸406至589的至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一个实施例中，第二多肽片段与SEQ ID NO:4的氨基酸406至589区别在于最多10个氨基酸，例如区别在于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
[0116]在另一个实施例中，第二多肽片段是至少100个氨基酸，例如至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170个氨基酸、或至少180个氨基酸。在另一个实施例中，第二多肽片段是184个氨基酸。
[0117]在另一个实施例中，第二多肽片段包括SEQ ID NO: 4的氨基酸406至589、或其等位变体或由它们组成；或是其一个片段。在另一方面，第二多肽片段包括SEQ ID N0:4的氨基酸406至589或由其组成。
[0118]在另一个第一方面，在第二多肽片段的C-末端的第三多肽片段具有与SEQ IDNO: 2的氨基酸589至860的至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一个实施例中，第三多肽片段与SEQ ID NO:2的氨基酸589至860区别在于最多10个氨基酸，例如区别在于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
[0119]在另一个实施例中，第三多肽片段是至少160个氨基酸，例如至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260个氨基酸、或至少270个氨基酸。在另一个实施例中，第三多肽片段是272个氨基酸。
[0120]在另一个实施例中，第三多肽片段包括SEQ ID NO: 2的氨基酸589至860、或其等位变体或由它们组成；或是其一个片段。在另一方面，第三多肽片段包括SEQ ID N0:2的氨基酸589至860或由其组成。
[0121]在一个第二方面，第一多肽片段是由在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码的:(i)SEQ ID NO:1的核苷酸131至1455，(ii)其cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989,《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning, ALaboratory Manual),第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor),纽约)。
[0122]在另一个第二方面，第二多肽片段是由在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码的:(i)SEQ ID NO:3的核苷酸1570至2184，(ii)其cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989,同上)。
[0123]在另一个第二方面，第三多肽片段是由在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码的:(i)SEQ ID NO:1的核苷酸2072至2937，(ii)其cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989,同上)。
[0124]S EQ ID NO:1 的核苷酸 131 至 1455、SEQ ID NO: 3 的核苷酸 1570 至 2184、或 SEQID NO:1的核苷酸2072至2937、或其子序列、连同SEQ ID NO: 2的氨基酸20至404、SEQ IDNO: 4的氨基酸406至589、或SEQ ID NO: 2的氨基酸589至860、或其片段，可以用于设计核酸探针，用来根据本领域熟知的方法，鉴定和克隆对来自不同属或种的株系的具有β-葡糖苷酶活性的多肽进行编码的DNA。具体地说，可以使用这类探针，遵循DNA印迹程序，与感兴趣细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别并分离出其中的相应基因。这样的探针可以大大短于整个序列，但是长度应该至少为15个，例如至少25个、至少35个、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记，用于检测相应的基因(例如，用32p、3h、35s、生物素、或抗生物素蛋白)。本发明涵盖此类探针。
[0125]可以针对与以上描述的探针杂交并且编码出具有β_葡糖苷酶活性的多肽的DNA，对由这类其他株系制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自这类其他菌株的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴定一个克隆或DNA，优选地将载体材料用于DNA印迹法。
[0126]出于本发明的目的，杂交指示，在非常低至非常高严谨度条件下，该多核苷酸杂交至标记的多核苷酸探针，这一标记的多核苷酸探针对应SEQ ID NO:1的核苷酸131至1455或其cDNA序列；SEQ ID NO: 3的核苷酸1570至2184或其cDNA序列；或SEQ ID NO:1的核苷酸2072至2937或其cDNA序列；或其全长互补体；或其子序列。在这些条件下与该核酸探针杂交的分子可以使用例如X射线薄膜或本领域中已知的任何其他检测手段进行检测。
[0127]在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸131至1455或其cDNA序列。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO: 3的核苷酸1570至2184或其cDNA序列。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的核苷酸2072至2937或其cDNA序列。在另一方面，核酸探针是编码SEQ ID NO: 2的氨基酸20至404或其一个片段的多核苷酸。在另一方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:4的氨基酸406至589或其一个片段的多核苷酸。在另一方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的氨基酸589至860或其一个片段的多核苷酸。
[0128]在一个第三方面，第一多肽片段是由以下多核苷酸编码的，该多核苷酸具有与SEQID NO:1的核苷酸131至1455或其cDNA序列的至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[0129]在另一个第三方面，第二多肽片段是由以下多核苷酸编码的，该多核苷酸具有与SEQ ID NO: 3的核苷酸1570至2184或其cDNA序列的至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[0130]在另一个第三方面，第三多肽片段是由以下多核苷酸编码的，该多核苷酸具有与SEQ ID NO:1的核苷酸2072至2937或其cDNA序列的至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
[0131]在另一方面，嵌合β-葡糖苷酶包括SEQ ID Ν0:6或其成熟多肽或由它们组成。在另一方面，嵌合葡糖苷酶包括SEQ ID Ν0:6的氨基酸20至860或由其组成。在另一方面，嵌合β-葡糖苷酶是由SEQ ID NO:5的多核苷酸或其成熟多肽或其cDNA序列编码的。在另一方面，嵌合多肽β -葡糖苷酶是由SEQ IDNO:5的核苷酸131至2936或其cDNA序列编码的。在以上每个方面，成熟嵌合多肽可以进一步包括信号肽。在一个方面，信号肽是SEQ ID N0:2的信号肽。在另一个方面，信号肽是SEQ ID NO:2的氨基酸I至19。在另一方面，信号肽是SEQ ID N0:4的信号肽。在另一方面，信号肽是SEQ ID NO:4的氨基酸I至19。
[0132]在另一方面，本发明的嵌合多肽包括在对应SEQ ID NO:6的成熟多肽的位置455和511的一个位置或全部两个位置的取代，其中该嵌合β_葡糖苷酶变体具有β_葡糖苷酶活性。
[0133]在描述本发明的嵌合葡糖苷酶变体时，以下所述的命名法适于方便参考。采用了已接受的IUPAC单个字母和三字母的氨基酸缩写。
[0134]取代。对于一个氨基酸取代，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226上的苏氨酸被丙氨酸取代被表示为“Thr226Ala”或者“Τ226Α”。多个突变由加号(“ + ”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或者“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411上甘氨酸(G)被精氨酸(R)并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。
[0135]缺失。对 于一个氨基酸缺失，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195上的甘氨酸缺失被表示为“Glyl95*”或者“G195*”。多个缺失由加号(“ + ”)分开，例如 “Glyl95*+Ser411*，，或者 “G195*+S411*，，。
[0136]插入。对于一个氨基酸插入，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸被表示为“Glyl95GlyLys”或者“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2 ;等]。例如，在位置195上的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸被表示为 “Glyl95GlyLysAla” 或者 “G195GKA”。
[0137]在这类情况下，通过将小写字母添加到在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是:
[0138]

亲本:I变体:

195 195195al95b~

G G-K-A
[0139]多种改变。包含多种改变的变体由加号(“ + ”)分开，例如“Argl70Tyr+Glyl95Glu”或者“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195上的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
[0140]不同改变。可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由一个逗号分开，例如“Argl70Tyr，Glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyrl67Gly, Ala+Argl70Gly, Ala” 表不以下变体:
[0141]“Tyrl67Gly+Argl70Gly”、“Tyrl67Gly+Argl70Ala”、“Tyrl67Ala+Argl70Gly”、以及 “Tyrl67Ala+Argl70Ala”。
[0142]在一个实施例中，嵌合β -葡糖苷酶变体与具有β -葡糖苷酶活性的亲本多肽的氨基酸序列具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%，但小于100%
的序列一致性。
[0143]在另一个实施例中，嵌合β -葡糖苷酶变体与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、例如至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%、但小于100%的序列一致性。
[0144]在另一方面，本发明的嵌合β_葡糖苷酶变体中的取代数是I个取代。在另一方面，本发明的嵌合葡糖苷酶变体中的取代数是2个取代。
[0145]在另一方面,嵌合β -葡糖苷酶变体包括在对应于位置455和511的位置之一的一个取代。在另一方面，变体包括在对应于位置455和511的每个位置的一个取代。
[0146]在另一方面，嵌合β -葡糖苷酶变体包括在对应于位置455的一个位置的一个取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置455的一个位置的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或者 Val 取代，优选被Glu取代。在另一方面，变体包括SEQ ID N0:6的成熟多肽的取代N455E或由其组成。
[0147]在另一方面，嵌合β -葡糖苷酶变体包括在对应于位置511的一个位置的一个取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置511的一个位置的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或者 Val 取代，优选被Tyr取代。在另一方面，变体包括SEQ ID N0:6的成熟多肽的取代F511Y或由其组成。
[0148]在另一方面，嵌合β -葡糖苷酶变体包括在对应于位置455和511的位置的一个取代或由其组成，如以上所述的那些。
[0149]在另一方面，嵌合葡糖苷酶变体包括取代Ν455Ε和F511Y之一或全部二者或由其组成
[0150]在另一方面，嵌合β-葡糖苷酶变体包括SEQ ID Ν0:6的成熟多肽的取代N455E+F511Y或由其组成。
[0151]在另一方面，在SEQ ID Ν0:7和SEQ ID Ν0:8中分别示出了嵌合β -葡糖苷酶变体的DNA序列和推导的氨基酸序列。
[0152] 在另一方面，嵌合β-葡糖苷酶变体包括SEQ ID NO:8或其成熟多肽或由它们组成。在另一方面，嵌合葡糖苷酶变体包括SEQ ID Ν0:8的氨基酸20至860或由其组成。在另一方面，嵌合葡糖苷酶变体是由SEQ ID NO: 7的多核苷酸、或其成熟多肽编码序列、或其cDNA序列编码的。在另一方面，嵌合β-葡糖苷酶变体是由SEQ ID Ν0:7的核苷酸131至2936或其cDNA序列编码的。在每个以上方面，成熟的嵌合β _葡糖苷酶变体可以进一步包括一个信号肽。在一个方面，信号肽是SEQ ID Ν0:2的信号肽。在另一个方面，信号肽是SEQ ID N0:2的氨基酸I至19。在另一方面，信号肽是SEQ ID NO:4的信号肽。在另一方面，信号肽是SEQ ID N0:4的氨基酸I至19。
[0153]本发明的嵌合β -葡糖苷酶变体可以进一步包括在一个或多个(例如若干个)其他位置的一个改变，例如缺失、插入、和/或取代。
[0154]这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的较小缺失；较小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；至多20-25个残基的较小连接子肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的较小延伸，如聚组氨酸序列(tract)、抗原表位或结合结构域。
[0155]保守取代的实例是在下组的范围内:碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不改变特定活性的氨基酸取代是本领域已知的，例如由诺伊拉特(H.Neurath)和希尔(R.L.Hill), 1979,在《蛋白质》(The Proteins),学术出版社(Academic Press),纽约所述。常见取代是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly。
[0156]可替代地，氨基酸改变本质是多肽的物理化学特性的改变。举例来说，氨基酸变化可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变PH最佳值等。
[0157]可以根据本领域已知程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham (坎宁安)和 Wells (威尔斯)，1989，《Science》(科学)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每一残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的葡糖苷酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，271:4699-4708。具有β -葡糖苷酶的多肽的活性位点或其他生物相互作用还可以通过物理结构分析结合推定的接触位点氨基酸的突变来确定，该物理结构分析如通过如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和性标记的技术确定。参见例如德福斯(de Vos)等人，科学(Science)255:306-312 ;史密斯(Smith)等人，1992，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.) 224:899-904 ;沃勒达尔(Wlodaver)等人，1992，《FEBS通讯》(FEBS Lett.)309:59_64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴别必需氨基酸。
[0158]嵌合β -葡糖苷酶变体可以由720至857个氨基酸，例如720至739、740至759、760至779、780至799、800至819、以及820至841个氨基酸组成。
[0159]在一个实施例中，与SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 4的成熟多肽相比，嵌合β -葡糖苷酶变体具有增加的比活性。
[0160]亲本β -葡糖苷酶可以是(a)与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少60%序列一致性的一种多肽；(b)由在低严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码的一种多肽:(i)SEQID NO:5的成熟多肽编码序列，或者(ii)其cDNA序列，或者(iii) (i)或(ii)的全长互补体；或者(c)由与SEQ ID NO: 5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60%序列一致性的多核苷酸编码的多肽。
[0161]在一个第一方面，亲本具有与SEQ ID N0:6的成熟多肽的至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性，它具有β -葡糖苷酶活性。在一个方面，亲本的氨基酸序列与SEQ ID ΝΟ:6的成熟多肽的区别在于最多10个氨基酸，例如区别在于1、2、3、4、5、6、7、8或10个氨基酸。
[0162]亲本优选包括SEQ ID NO: 6的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，亲本包括SEQID Ν0:6的成熟多肽或者由其组成。在另一方面，亲本包括SEQ ID NO: 6的氨基酸20至860或由其组成。
[0163]在一个实施例中，亲本是含有至少720个氨基酸残基，例如760个氨基酸残基或至少800个氨基酸残基的SEQ ID NO:6的成熟多肽的一个片段。
[0164]在另一个实施例中，亲本是SEQ ID Ν0:6的成熟多肽的一个等位变体。
[0165]在一个第二方面，亲本是由在非常低严谨度条件、低严谨度条件、中严谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下杂交的多核苷酸编码的:(i)SEQ ID NO:5的成熟多肽，(ii)其cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989,《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning, A LaboratoryManual),第二版,冷 泉港(Cold Spring Harbor),纽约)。
[0166]可以使用SEQ ID NO:5的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:6的多肽或其片段来设计核酸探针，以从如在此所述的基因组DNA或cDNA文库对编码亲本的DNA进行鉴别
并克隆。
[0167]在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO: 5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列。在另一方面，核酸探针是SEQ ID NO: 5的核苷酸131至2936。在另一方面，核酸探针是编码SEQID NO:6的多肽或其一个片段的多核苷酸。在另一方面，核酸探针是SEQ ID勵:5或其(^嫩序列。
[0168]在一个第三方面，亲本是由具有与SEQ ID NO: 5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列的至少60%，例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列一致性的多核苷酸编码的，该多核苷酸编码具有β_葡糖苷酶活性的多肽。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO: 5的核苷酸131至2936，或其cDNA序列。在一个实施例中，亲本是由一个多核苷酸编码的，该多核苷酸包括SEQ ID NO: 5、或其成熟多肽编码序列、或其cDNA序列或由它们组成。
[0169]该亲本可以从任何属类的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应指由一种多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一个细胞产生。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。
[0170]多核苷酸
[0171]本发明还涉及编码本发明的任何嵌合多肽的分离的多核苷酸。
[0172]核酸构建体
[0173]本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括编码本发明的嵌合葡糖苷酶或其变体的一个多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，在与控制序列兼容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
[0174]可以按多种方式操纵该多核苷酸，以提供嵌合β_葡糖苷酶或其变体的表达。取决于表达载体，在将该多核苷酸插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
[0175]控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子含有介导该嵌合β_葡糖苷酶或其变体表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变体、截短的及杂合启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
[0176]在细菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体转录的启动子的实例是获得自以下各项的启动子:解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse (诶盖斯)和Lereclus (乐瑞克鲁斯)，1994, MolecularMicrobiology (分子微生物学)13:97-107)、大肠杆菌Iac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon (埃贡)等人，1988，Gene (基因)69:301_315)，天蓝色链霉菌琼脂酶基因(dagA)、和原核β -内酰胺酶基因(Villa (维拉)-Kamaroff (卡玛诺夫)等人，1978, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院院刊)75:3727-3731)，连同tac启动子(DeBoer (德波尔)等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院院刊)80:21-25)。另外的启动子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria(来自重组细菌的有用蛋白)”,Gilbert(吉尔伯特)等人，1980, Scientific American (科学美国人)，242:74-94 ;以及 Sambrook (萨姆布鲁克)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在W099/43835中。
[0177]在丝状真菌宿主细胞中，适合指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子:构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶-样蛋白酶(W096/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、镶片镰孢菌Daria (达莉亚)(W000/56900)、镶片镰孢菌Quinn (奎恩)(W000/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β -葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶I1、里氏木霉葡聚糖内切酶1、里氏木霉葡聚糖内切酶I1、里氏木霉葡聚糖内切酶II1、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉木聚糖酶II1、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉翻译延长因子，连同NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中非翻译前导子已经用来自一种曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导子替换；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中非翻译前导子已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导子替换)；及其突变的、截短的、和杂交的启动子。其他启动子描述于美国专利号6，011，147中。
[0178] 在一个酵母宿主中，有用的启动子获得自以下各项的基因:酿酒酵母烯醇酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(ΤΡΙ)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUPl)以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992,《酵母》(Yeast) 8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
[0179]该控制序列还可以是被宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子可操作地连接至编码嵌合β_葡糖苷酶或其变体的多核苷酸的3’末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
[0180]优选的用于细菌宿主细胞的终止子是由克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)及大肠杆菌核糖体RNA (rrnB)的基因获得。
[0181]用于丝状真菌宿主细胞的优选的终止子是从以下各项的基因中获得:构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶-样蛋白酶、里氏木霉葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶I1、里氏木霉葡聚糖内切酶1、里氏木霉葡聚糖内切酶I1、里氏木霉葡聚糖内切酶II1、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶1、里氏木霉木聚糖酶I1、里氏木霉木聚糖酶II1、里氏木霉β -木糖苷酶、和里氏木霉翻译延长因子。
[0182]酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的:酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C (CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸去氢酶。Romanos (罗马诺斯)等人，1992，同上，描述了酵母宿主细胞的其他有用的终止子。
[0183]控制序列还可以是启动子下游和本发明的嵌合葡糖苷酶或其变体的编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加嵌合β -葡糖苷酶或其变体的表达。
[0184]适用的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的:苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(W094/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue (化)等人，1995，《细菌学杂志》(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
[0185]该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子可操作地连接至编码嵌合β_葡糖苷酶或其变体的多核苷酸的5’末端。在宿主细胞中起作用的任何前导子都可以使用。
[0186]丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从以下各项的基因中获得的:米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
[0187]酵母宿主细胞的合适的前导子是从以下各项的基因中获得的:酿酒酵母烯醇酶(ΕΝ0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α -因子、和酿酒酵母醇去氢酶/甘油醛-3-磷酸去氢酶(ADH2/GAP)。
[0188]控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，即可操作地连接至嵌合β -葡糖苷酶或其变体编码序列的3’ -末端并且当转录时由宿主细胞识别成将聚腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可以使用。
[0189]用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的:构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
[0190]Guo (郭)&Sherman (谢尔曼)，1995,《分子与细胞生物学杂志》(Mol.CellularBiol.) 15:5983-5990描述了酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列。
[0191]控制序列还可以是编码连接至嵌合β -葡糖苷酶或其变体的N-末端上的一个信号肽并指导嵌合β-葡糖苷酶或其变体进入细胞的分泌途径的一个信号肽编码区域。该多核苷酸的编码序列的5 ’-末端可以固有地含有在翻译读码框内与编码β-葡糖苷酶或其变体的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，该编码序列的5’ -末端可以含有对该编码序列是外源的一种信号肽编码序列。该编码序列不天然地包含一个信号肽编码序列时，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，一种外源信号肽编码序列可简单地替换该天然的信号肽编码序列以便增强葡糖苷酶或其变体的分泌。然而，可以使用指导所表达的β_葡糖苷酶或其变体进入宿主细胞的分泌途径中的任何信号肽编码序列。
[0192]细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列:芽孢杆菌NCIBl 1837麦芽淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β -内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。Simonen (西蒙纳)和Palva (帕尔瓦)，1993,《微生物学评论》(Microbiological Reviews) 57:109-137 描述了另外的信号妝。
[0193]丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因中获得的信号肽编码序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉葡聚糖内切酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0194]酵母宿主细胞有用的信号肽是从以下各项的基因中获得的:酿酒酵母α -因子和酿酒酵母转化酶。Romanos (罗马诺斯)等人，1992，同上，描述了其他有用的信号肽编码序列。
[0195]控制序列还可以是对位于本发明的嵌合β -葡糖苷酶或其变体的N-末端的一种前肽进行编码的一种前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原一般是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因中获得:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(W095/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α -因子。
[0196]在信号肽序列和前肽序列都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻嵌合β -葡糖苷酶或其变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
[0197]还令人希望的可以是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节嵌合β_葡糖苷酶或其变体的表达。调节序列的实例是响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而引起基因的表达开启或关闭的那些。在原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α -淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子、和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码嵌合β-葡糖苷酶或其变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
[0198]表达载体
[0199] 本发明还涉及包含编码本发明的嵌合葡糖苷酶或其变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。可以将不同核苷酸和控制序列连接在一起，产生可包括一个或多个(例如，若干个)方便的限制性位点的重组表达载体，从而允许在这类位点插入或取代对嵌合β-葡糖苷酶或其变体进行编码的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生表达载体时，该编码序列是位于该载体中，由此使该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
[0200]重组表达载体可以是可以便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
[0201]该载体可以是一种自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，该载体的复制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制任何工具。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒、或两种或更多种载体或质粒(这些载体或质粒共同包含了有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)、或转座子。
[0202]载体优选地包含一个或多个(例如若干个)选择性标记，这些选择性标记使得易于选择经过经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
[0203]细菌的选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨比西林(ampici 11 in)、氯霉素(chloramphenicol )、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、大观霉素(spectinomycin)或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不局限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不局限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB (磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS (乙酰胺酶)、argB (鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar (草丁膦乙酰转移酶)、hph (潮霉素磷酸转移酶)、niaD (硝酸还原酶)、pyrG (乳清酸核苷-5’磷酸脱羧酶)、sC (硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC (邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。优选在木霉细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、和pyrG基因。
[0204]选择性标记可以是在W02010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
[0205]该载体优选包含允许将该载体整合到宿主细胞基因组中或者该载体在细胞中不依赖该基因组而自主复制的一种或多种元件。
[0206]对于整合到该宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码嵌合β -葡糖苷酶或其变体的多核苷酸序列或者该载体的任何其他元件通过同源或非同源重组整合到该基因组中。可替代地，该载体可以包含指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10，000个碱基对、400至10，000个碱基对、以及800至10，000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，通过非同源重组可以将该载体整合到该宿主细胞的基因组内。
[0207]对于自主复制，该载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞内进行自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞内起作用的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语“复制起点”或“质粒复制因子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0208]细菌的复制起点的实例是允许在大肠杆菌内进行复制的质粒pBR322、pUC19、PACYC177、以及pACYC184以及允许在芽孢杆菌内进行复制的pUB110、pE194、pTA1060、以及ρΑΜβ I的复制起点。
[0209]用于在酵母宿主细胞内使用的复制起点的实例是2微米(2micron)的复制起点、ARS1、ARS4、ARSl与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
[0210]在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMAl和ANSI (Gems (格姆斯)等人，1991, Gene (基因)98:61-67 ;Cullen (卡伦)等人，1987, Nucleic Acids Res.(核酸研究)15:9163-9175 ;W000/24883)。根据W000/24883中披露的方法可以实现AMAl基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
[0211]可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加嵌合β-葡糖苷酶或其变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其 中通过在适当选择性试剂存在下培养细胞可以选择包含可扩增的选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞，并且由此是该多核苷酸的另外的拷贝。
[0212]用于连接上文所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员来说是熟知的(参见，例如Sambrook (萨拉布鲁克)等人，1989，同上)。
[0213]宿主细胞
[0214]本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的嵌合葡糖苷酶或其变体的、可操作地连接至一个或多个(例如若干个)控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的嵌合β_葡糖苷酶或其变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早先所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码嵌合β-葡糖苷酶或其变体的基因及它的来源。
[0215]宿主细胞可以是在重组产生嵌合葡糖苷酶或其变体中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
[0216]原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括，但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括，但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门菌属和脲原体属。
[0217]细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不局限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。[0218]细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不局限于似马链球菌、化脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽疫亚种细胞。
[0219]细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不局限于产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、及变铅青链霉菌细胞。
[0220]可以例如通过原生质体转化(参见，例如昌(Chang)和科恩(Cohen)，1979，《现代分子生物学》(Mol.Gen.Genet.) 168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如杨(Young)和斯皮宰曾(Spizizen), 1961,《细菌学杂志》(J.Bacteriol.) 81:823-829,或杜卜那(Dubnau)和大卫杜夫-艾柏尔森(Davidoff_Abelson)，1971，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)56:209-221 )、电穿孔(参见，例如斯格卡娃(Shigekawa)和道尔(Dower),1988,((生物技术》(Biotechniques) 6:742-751)或通过接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne),1987，《细菌学杂志》(J.Bacteriol.) 169:5271-5278)实现向芽孢杆菌属细胞中引入DNA。通过原生质体转化(参见例如，Hanahan (哈那汗)，1983，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)166:557-580)或电穿孔(参见例如,Dower (道尔)等人，1988, Nucleic Acids Res.(核酸研究)16:6127-6145)可以实现将DNA引入到大肠杆菌细胞中。通过原生质体转化/电穿孔(参见例如，宫(Gong)等人,2004, Folia Microbiol.(微生物学报)(Praha (布拉格))49:399-405)、接合(参见,例如，Mazodier (马佐迪耶)等人，1989, J.Bacteriol.(细菌学杂志)171:3583-3585)、或转导(参见，例如，Burke (博科)等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院院刊)98:6289-6294)可以实现将DNA引入到链霉菌属细胞中。通过电穿孔(参见例如，崔(Choi)等人，2006，《微生物学方法杂志》(J.Microbiol.Methods) 64:391-397)或轭合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.) 71:51-57)可以实现将DNA引入到假单胞菌细胞中。通过天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和仓光(Kuramitsu), 1981,《感染与免疫》(Infect.1mmun.) 32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和朱力克(Jollick)，1991，《微生物》(Microbios) 68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999,《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)或者轭合(参见，例如，克拉维尔(Clewell), 1981,《微生物学评论》(Microbiol.Rev.)45:409-436)可以实现将DNA弓丨入到链球菌细胞中。然而，可以使用在本领域已知的任何方法将DNA引入到宿主细胞中。
[0221]该宿主细胞还可以是真核细胞，例如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。
[0222]该宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如霍克斯沃思(Hawksworth)等人定义，引自:Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第 8 版，1995,国际 CAB,大学出版社(University Press),剑桥(Cambridge),英国)。
[0223]该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用，“酵母”包括产子囊孢子酵母(内孢霉目)、产担子酵母，以及属于半知菌(芽生菌)的酵母。由于酵母的分类未来可能改变，故出于本发明的目的，酵母应当如《酵母生物学与活性》(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner),帕斯莫(Passmore)及达文波特(Davenport)编辑，《应用细菌学学会》(Soc.App.Bacteriol.Symposium),第 9 期，1980)中所描述进行定义。[0224]酵母宿主细胞可以是假丝酵母、汉逊酵母、克鲁维酵母菌、毕赤酵母、酵母菌属酵母、裂殖酵母、或亚罗酵母细胞，例如产乳糖酶酵母、卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁费酵母、诺地酶母、卵形酵母、或亚罗解脂酵母细胞。
[0225]真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有丝状形式的细分真菌门和卵菌门(如由Hawksworth (霍克斯沃思)等人，1995,同上所定义)。丝状真菌的特征一般在于由甲壳素、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复合多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长来进行的并且碳分解代谢是专性需氧的。相比之下，酵母(例如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽而进行的，并且碳分解代谢可以是发酵的。
[0226]丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球酵母属、Filibasidium、镰刀菌属、腐质霉属、大毁壳属、毛霉菌属、蚀丝霉属、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、梨囊鞭菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳菌属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属细胞。
[0227]例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟腊菌、卡内基拟腊菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟腊孔菌、潘诺希 塔拟腊菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟腊菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟腊 菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟腊菌、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、拉克悼金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)> 幾状金抱子菌(Chrysosporiummerdarium)> 租金抱子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysospor iumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、太瑞斯梭孢壳霉、长绒毛栓菌、韩国白腐菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
[0228]可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及本身已知的一种方式进行细胞壁再生的一个过程来转化真菌细胞。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于 EP238023，Yelton (约尔顿)等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院院干丨J) 81:1470-1474,以及 Christensen (克里斯滕森)等人，1988, Bio/Technology (生物 /技术)6:1419-1422 中。马拉迪耶(Malardier)等人，1989，《基因》(Gene) 78:147-156 和W096/00787描述了用于转化镰刀菌物种的合适方法。可以使用贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)在阿贝尔森(Abelson, J.N.)和西蒙(Simon, Μ.1.)编辑,对酵母遗传学和分子生物学的指导(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology),酶学方法(Methodsin Enzymology), 194 卷，182-187 页,学术出版社公司(Academic Press, Inc.)，纽约;伊藤(Ito)等人，1983,《细菌学杂志》(J.Bacteriol.) 153:163 ;以及希南(Hinnen)等人,1978,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA) 75:1920中描述的程序来转化酵母。
[0229]生产方法
[0230]本发明还涉及产生嵌合葡糖苷酶或其变体的方法，该方法包括:(a)在适合于嵌合葡糖苷酶或其变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；并且可任选地(b)回收嵌合β-葡糖苷酶或其变体。
[0231]使用本领域已知的方法在适合于产生嵌合β -葡糖苷酶或其变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过在一种合适的培养基中并在允许嵌合β_葡糖苷酶或其变体表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养、或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养这些细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。合适的培养基从商业供应商处可获得，或者可根据公开的组成(例如，在美国模式培养物保藏所目录中)来制备。如果将嵌合β-葡糖苷酶或其变体分泌到营养培养基中，则可以从该培养基直接回收嵌合β_葡糖苷酶或其变体。如果嵌合β_葡糖苷酶或其变体没有分泌，则可从细胞裂解液中对其进行回收。
[0232]可以使用本领域已知的特异性针对嵌合β -葡糖苷酶或其变体的方法来检测嵌合β_葡糖苷酶或其变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定嵌合β_葡糖苷酶或其变体的活性。
[0233]可以使用本领域已知的方法来回收嵌合葡糖苷酶或其变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收嵌合β -葡糖苷酶或其变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。在一个方面，回收包含多肽的整个发酵液。
[0234]可以通过本领域已知的多种程序来纯化嵌合葡糖苷酶或其变体以获得基本上纯的嵌合葡糖苷酶或其变体，这些程序包括但不局限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及大小排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、溶解度差异(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或者提取(参见，例如《蛋白纯化》(Protein Purif ication),詹森(J.-C.Janson)和拉尔斯赖登(Lars Ryden)编辑,VCH 出版社(VCHPublisher),纽约，1989)。
[0235]发酵液配制品或细胞组合物
[0236]本发明还涉及包括本发明的嵌合葡糖苷酶或其变体的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包括用于发酵过程中的其他额外成分，例如像，细胞(包括，用来产生感兴趣的多肽的含有编码本发明的嵌合β-葡糖苷酶或其变体的基因的宿主细胞)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片、和培养基的细胞灭活全培养液。
[0237]如在此使用，术语“发酵液”是指由经历无或最小回收和/或纯化的细胞发酵产生的制剂。例如，当微生物培养生长至饱和时产生发酵液，在限碳条件下孵育以允许蛋白合成(例如通过宿主细胞的酶表达)并且分泌到细胞培养基中。发酵液可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含例如通过离心除去微生物细胞(例如丝状真菌细胞)后存在的耗尽的培养基和细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有耗尽的细胞培养基、细胞外的酶、和活的和/或非活的微生物细胞。
[0238]在 一个实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分和/或其盐以及第二有机酸组分和/或其盐，该第一有机酸组分包含至少一种1-5个碳的有机酸，该第二有机酸组分包含至少一种6或更多个碳的有机酸。在特定的实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、它们的盐、或以上的两种或更多种的混合物，并且第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、它们的盐、或以上的两种或更多种的混合物。
[0239]在一个方面，该组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞灭活全培养液除去杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含有这些组分的组合物。
[0240]发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑制细菌的)试剂，包括但不局限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、和本领域已知的其他物质。
[0241]发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含多种酶活性，例如一种或多种(例如若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成:纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素降解酶、果胶酶(pectinase)、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀因子(swollenin)。发酵液配制品或细胞组合物还可以包含一种或多种(例如若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成:水解酶、异构酶、连接酶、裂合酶、氧化还原酶、或一种转移酶，例如α-半乳糖苷酶、α -葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酶、β -木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、甲壳酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、葡聚糖内切酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、过氧化物酶、植酸酶、多酹氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
[0242]细胞灭 活全培养液或组合物可以含有在发酵结束时衍生的发酵材料的未分级的内容物。典型地，细胞灭活全培养液或组合物含有微生物细胞(例如丝状真菌细胞)生长至饱和或存在的耗尽的培养基，在限碳条件下孵育以允许蛋白合成(例如表达纤维素酶和/或一种或多种葡糖苷酶)。在一些实施例中，细胞灭活全培养液或组合物含有耗尽的细胞培养基、细胞外的酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞灭活全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
[0243]在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶的酶。在一些实施例中，可以除去不溶组分以提供澄清的液体组合物。
[0244]可以通过W090/15861或W02010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制
品和细胞组合物。
[0245]以下给出了本发明的组合物的优选用途的实例。组合物的剂量以及使用该组合物时的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
[0246]酶组合物
[0247]本发明还涉及包含本发明的嵌合β -葡糖苷酶或其变体的组合物。优选地，这些组合物富集此类多肽。术语“富集”是指组合物的β_葡糖苷酶活性已经提高，例如富集因子为至少1.1。
[0248]这些组合物可以包含本发明的嵌合葡糖苷酶或其变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包含多种酶活性，例如一种或多种(例如若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成:纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素降解酶、果胶酶(pectinase)、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀因子(swollenin)。这些组合物还可以包含一种或多种(例如若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成:水解酶、异构酶、连接酶、裂合酶、氧化还原酶、或一种转移酶、例如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、甲壳酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、葡聚糖内切酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶(pectinolytic enzyme)、过氧化物酶、植酸酶、多酹氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以处于液体或干燥组合物的形式。这些组合物可以根据本领域中已知的方法稳定化。
[0249]以下给出了本发明的组合物的优选用途的实例。组合物的剂量以及使用该组合物的其他条件可以基于本领域中已知的方法进行确定。
[0250]应用
[0251]本发明还针对用于使用嵌合β -葡糖苷酶或其变体或其组合物的以下方法。
[0252]本发明还涉及用于降解或转化纤维素材料的方法，该方法包括:在本发明的嵌合β -葡糖苷酶或其变体的存在下，用酶组合物处理纤维素材料。在一个方面，这些方法进一步包括对降解的或转化的纤维素材料进行回收。可以使用本领域已知的方法，例如像，离心、过滤、或重力沉降，来从不溶纤维素材料分离纤维素材料的降解或转化的可溶产物。
[0253]本发明还涉及用于生产发酵产物的方法，该方法包括:(a)在本发明的嵌合β_葡糖苷酶或其变体的存在下，用酶组合物糖化纤维素材料；(b)用一种或多种(例如若干种)发酵微生物发酵糖化的纤维素材料，以产生发酵产物；并且(C)从发酵中回收发酵产物。
[0254]本发明还涉及发酵纤维素材料的方法，该方法包括用一种或多种(例如若干种)发酵微生物发酵纤维素材料，其中纤维素材料是在本发明的嵌合β -葡糖苷酶或其变体的存在下，用酶组合物糖化的。在一个方面，发酵纤维素材料产生发酵产物。在另一方面，该方法进一步包括从发酵中回收发酵产物。
[0255]本发明的方法可以用于将纤维素材料糖化为可发酵糖，并且将可发酵糖转化为多种有用的发酵产物，例如燃料、饮用乙醇、和/或平台化合物(例如酸、醇、酮、气体、等)。从纤维素材料产生希望的发酵产物典型地涉及预处理、酶水解(糖化)、和发酵。
[0256]根据本发明，可以使用本领域常规的过程来完成纤维素材料的加工。此外，可以使用被配置为根据本发明进行操作的常规生物质加工装置来实施本发明的方法。
[0257]分开或同时的水解(糖化)和发酵，，可以包括但不局限于:分开的水解和发酵(SHF);同时糖化和发酵(SSF);同时糖化和共发酵(SSCF)；复合水解和发酵(HHF);分开的水解和共发酵(SHCF);复合水解和共发酵(HHCF);以及直接的微生物转化(DMC);还有时称为联合生物加工(CBP)。SHF使用分开的加工步骤来首先将纤维素材料酶水解为可发酵糖，例如葡萄糖、纤维二糖、和戊糖单体，并且然后将可发酵糖发酵为乙醇。在SSF中，将纤维素材料的酶水解和糖至乙醇的发酵组合在一个步骤中(菲力皮迪斯(Philippidis, G.P.), 1996,纤维素生物转化技术，《关于生物乙醇的手册:生产和利用》(Cellulose bioconversiontechnology, in Handbook on Bioethanol:Production and Utilization),怀曼(Wyman, C.E.)，编辑，Taylor&Francis出版公司，华盛顿，179-212)。SSCF涉及多种糖的共发酵(希恩(Sheehan, J.)和希默尔(Himmel, M.), 1999,酶，能源和环境:关于美国能源部对生物乙醇的研究和发展活动的战略角度(Enzymes, energy and the environment:A strategicperspective on the U.S.Department of Energy’ s research and developmentactivities for bioethanol),《生物技术进展》(Biotechnol.Prog.) 15:817-827)。HHF涉及分开的水解步骤，以及此外同时的糖化和水解步骤，这些可以在同一反应器中进行。可以在不同温度进行HHF过程中的步骤，即高温酶糖化，随后在发酵株系可以耐受的更低温度进行SSF。DMC将全部三个过程(酶生产、水解、和发酵)组合在一个或多个(例如若干个)步骤中，其中使用了相同的有机体来产生用于转化纤维素材料为可发酵糖并且用于转化可发酵糖为终产物的酶(林德(Lynd)等人，2002，微生物纤维素利用:基本原理和生物技术(Microbial cellulose utiIization:Fundamentals and biotechnology)，〈〈微生物学与分子生物学评论》(Microbiol.Mol.Biol.Reviews)66:506-577)。在此应理解，本领域已知的任何方法包括预处理、酶水解(糖化)、发酵或其组合，可以用于实践本发明的方法。
[0258]常规装置可以包括补料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超过滤的连续流搅拌反应器、和/或连续活塞流动柱反应器(费尔南达德卡斯蒂约斯柯瑞芝(Fernanda deCastilhos Corazza)、(法维奥法里亚德莫赖斯(Fldivio Faria de Moraes)、吉塞拉玛丽亚扎宁(Gisella Maria Zanin)和伊沃雷特泽尔(Ivo Neitzel )，2003，用于纤维二糖水解的补料分批反应器中的最佳控制(Optimal control in fed-batch reactor for thecellobiose hydrolysis)，《技术学报》(Acta Scientiarum.Technology) 25:33-38 ;古萨科夫(Gusakov，A.V.)和辛涅特西(Sinitsyn，A.P.)，1985，纤维素酶水解动力学:1.用于分批反应器过程的数学模型(Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1.Amathematical model for a batch reactor process)，《酶与微生物技术》(Enz.Microb.Technol.) 7:346-352)，研磨反应器(隆(Ryu)和李(Lee)，1983，通过使用研磨生物反应器，生物转化废物纤维素(Bioconversion of waste cellulose by using an attritionbioreactor),《生物技术和生物工程》(Biotechnol.Bioeng) 25:53-65)，或具有电场诱导的有力搅拌的反应器(古萨科夫(Gusakov)等人，1996，使用具有电场诱导的有力搅拌的新颖类型的生物反应器的纤维素酶水解的增强(Enhancement of enzymatic cellulosehydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring inducedby electromagnetic field)，《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.)56:141-153)。额外的反应器类型包括流化床、上流式床、固定的和挤出机型反应器，用于水解和/或发酵。
[0259]预处理。在实践本发明的方法中，可以使用本领域R知的仟何预处理过稈来破坏纤维素材料的细胞壁组分(钱德拉(Chandra)等人，2007，底物预处理:木质纤维素的有效酶水解的关键？ (The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics?)《生物化学工程/生物技术进展》(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.) 108:67-93 ；加尔布(Galbe)和朱奇(Zacchi)，2007，用于生物乙醇有效生产的不是纤维素材料的预处理(Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanolproduction),《生物化学工程 / 生物技术进展》(Adv.Biochem.Engin./Biotechnol.)108:41-65 ;亨德里克斯(Hendriks)和塞曼(Zeeman)，2009，预处理以增强木质纤维素生物质的可消化性(Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosicbiomass)，《生物资源技术》(Bioresource Technol.)100:10-18 ;莫热(Mosier)等人，2005，用于预处理木质纤维素生物质前景技术的特征(Features of promising technologiesfor pretreatment of lignocellulosic biomass)，《生物资源技术》(BioresourceTechnol.) 96:673-686 ;塔赫扎德(Taherzadeh)和卡里米(Karimi )，2008，预处理木质纤维素废物来改进乙醇和生物气生产:综述(Pretreatment of lignocellulosic wastes toimprove ethanol and biogas production:A review)《分子科学国际期干丨J》(Int.J.0fMol.Sc1.) 9:1621-1651 ^(Yang)和怀曼(Wyman), 2008,预处理:用来解锁低成本纤维素乙酉享的关键(Pretreatment:the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol),《生物燃料、生物产品与生物精炼》(Biofuels Bioproducts and Biorefining-Biofpr.)2:26-40)。
[0260]在使用本领域已知的方法进行预处理之前，纤维素材料还可以经受粒度缩分、筛分、预浸泡、湿润、洗涤和/或调理。
[0261]常规预处理包括但不局限于蒸汽预处理(用或不用爆发)、稀酸预处理、热水预处理、碱预处理、石灰预处理、湿氧化、湿爆发、氨纤维爆发、有机溶剂预处理、和生物预处理。额外的预处理包括氨渗透、超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H20、臭氧、离子液体、和Y辐射预处理。
[0262]可以在水解和/或发酵前预处理纤维素材料。优选在水解前进行预处理。可替代地，可以同时用酶水解进行预处理，以释放可发酵糖，例如葡萄糖、木糖、和/或纤维二糖。在多数情况下，预处理步骤自身导致将生物质转化为可发酵糖(即使在没有酶的情况下)。
[0263]蒸汽预处理。在蒸汽预处理中，加热纤维素材料以破坏植物细胞壁组分，包括木质素、半纤维素、和纤维素以使纤维素和其他级分，例如半纤维素可接近酶。纤维素材料经过或穿过反应容器，将蒸汽注入该反应容器以增加温度至所需温度和压力，并且将蒸汽保持在其中持续希望的反应时间。优选在140°C _250°C，例如160°C -200°C或170°C _190°C进行蒸汽预处理，其中最佳温度范围取决于化学催化剂的添加。蒸汽预处理的停留时间优选是1-60分钟，例如1-30分钟、1-20分钟、3-12分钟、或4_10分钟，其中最佳停留时间取决于温度范围和化学催化剂的添加。蒸汽预处理允许相对高的固体负载，这样使得在预处理期间纤维素材料总体上只是潮湿了。蒸汽预处理通常结合预处理后材料的爆发排出，称为蒸汽爆发，即迅速地急骤蒸发至大气压和材料的湍流，以通过破碎增加可接近的表面积(达夫(Duff )和默里(Murray), 1996,《生物资源技术》(Bioresource Technology) 855:1-33 ；加尔布(Galbe)和朱奇(Zacchi)，2002，《应用微生物学与生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.) 59:618-628 ;美国专利申请号20020164730)。在蒸汽预处理期间，半纤维素乙酰基被切割并且生成的酸自动催化半纤维素水解为单醣和寡糖。木质素仅被除去至一个有限的程度。
[0264]化学预处理:术语“化学预处理”是指促进分离和/或释放纤维素、半纤维素、和/或木质素的任何化学预处理。此类预处理可以转化结晶纤维素为无定形纤维素。合适的化学预处理过程的实例包括例如稀酸预处理、石灰预处理、湿氧化、氨纤维/冷冻爆发(AFEX )、氨渗透(APR )、离子液体、和有机溶剂预处理。
[0265] 通常在蒸汽预处理之前添加催化剂，例如H2SO4或SO2 (典型地0.3%至5%w/w)，这缩减了时间和温度，增加了回收，并且改进了酶水解(巴列斯特罗斯(Ballesteros)等人，2006，《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.) 129-132:496-508 ；瓦尔加(Varga)等人,2004,《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.)113-116:509-523 ;萨斯内尔(Sassner)等人,2006,《酶与微生物技术》(Enzyme Microb.Technol.) 39:756-762)。在稀酸预处理中，纤维素材料与稀酸(典型地是H2SO4)和水混合，以形成浆液，由蒸汽加热至希望的温度，并且在停留时间后急骤蒸发至大气压。可以用多种反应器设计进行稀酸预处理，例如塞流反应器、逆流反应器、或连续逆流收缩床反应器(达夫(Duff)和默里，1996，同上，谢尔(Schell)等人，2004，《生物资源技术》(BioresourceTechnol.>91:179-188 ;李(Lee)等人，1999，《生物化学工程生物技术进展》(Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.) 65:93-115)。
[0266]还可以使用在碱条件下的若干预处理方法。这些碱预处理包括但不局限于氢氧化钠、石灰、湿氧化、氨渗透(APR)、和氨纤维/冷冻爆发(AFEX)。
[0267]用氧化钙或氢氧化钙在85°C -150°C的温度进行石灰预处理，并且停留时间从I小时至若干天(怀曼(Wyman)等人,2005,《生物资源技术》(Bioresource Technol.)96:1959-1966 ;莫热(Mosier)等人，2005,《生物资源技术》(Bioresource Technol.)96:673-686)。TO2006/110891、TO2006/110899、TO2006/110900、和 W02006/110901 披露了
使用氨的方法。
[0268]湿氧化是一种热预处理，典型地在180°C _200°C进行，持续5-15分钟，同时添加氧化剂(oxidative agent),例如过氧化氢或超压的氧(施密特(Schmidt)和汤姆森(Thomsen), 1998,《生物资源技术》(Bioresource Technol.)64:139-151 JQFrt(Palonen)等人,2004,《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.) 117:1-17 ;瓦尔加(Varga)等人，2004,《生物技术和生物工程》(Biotechnol.Bioeng.) 88:567-574 ;马丁(Martin),等人,2006,《化学技术与生物技术杂志》(J.Chem.Technol.Biotechnol.)81:1669-1677)。优选在 1%_40%干物质，例如2%_30%干物质或5%_20%干物质进行预处理，并且通常通过添加碱，例如碳酸钠提高初始pH。
[0269]湿氧化预处理方法的修改，称为湿爆发(湿氧化与蒸汽爆发组合)可以处理高达30%的干物质。在湿爆发中，在某一停留时间后，在预处理期间引入氧化剂(oxidizingagent)。然后通过急骤蒸发至大气压结束预处理(W02006/032282)。
[0270]氨纤维爆发(AFEX)涉及用液体或气体氨在适中的温度(例如90°C _150°C)和高压(例如17-20巴)处理纤维素材料，持续5-10分钟，其中干物质含量可以高达60% (戈拉帕里(Gollapalli)等人,2002,《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.)98:23-35 ;丘恩达瓦特(Chundawat)等人,2007,《生物技术和生物工程》(Biotechnol.Bioeng.>96:219-231 ;阿里扎德(Alizadeh)等人，2005，《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.) 121:1133-1141 ;泰莫里(Teymouri )等人，2005,《生物资源技术》(Bioresource Technol.) 96:2014-2018)。在AFEX预处理期间，纤维素和半纤维素保持相对完整。切割木质素-碳水化合物复合物。
[0271 ] 通过使用水性乙醇(40%-60%乙醇)在160°C -200 V持续30-60分钟进行提取，有机溶剂预处理使纤维素材料脱木质素(潘(Pan)等人，2005，《生物技术和生物工程》(Biotechnol.Bioeng.) 90:473-481 ^(Pan)等人，2006，《生物技术和生物工程》(Biotechnol.Bioeng.) 94:851-861 ;库拉比(Kurabi)等人,2005,《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.)121:219-230)。通常添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，大部分半纤维素和木质素被除去。
[0272]由谢尔(Schell)等人,2003,《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.and Biotechnol.), 105-108卷，69-85页，和莫热(Mosier)等人,2005,《生物资源技术》(Bioresource Technology)96:673-686,以及美国公开申请2002/0164730描述了合适的预处理方法的其他实例。
[0273]在一个方面，优选进行化学预处理作为稀酸处理，并且更优选作为连续稀酸处理。酸典型地是硫酸，但是也可以使用其他酸，例如乙酸、柠檬酸、硝酸、磷酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氢、或它们的混合物。优选在1-5，例如1-4或1-2.5的pH范围进行温和的酸处理。在一个方面，优选酸浓度在从0.01至10wt%酸的范围内，例如0.05至5wt%酸或0.1至2wt%酸。酸与纤维素材料接触并且优选保持在140°C -200°C的范围内的温度，例如165°C _190°C，持续范围从I至60分钟的时段。
[0274]在另一方面，在水性浆液中发生预处理。在优选的方面，在预处理期间存在的纤维素材料是以优选10-80wt%的量，例如20-70wt%或30-60wt%，例如约40wt%。可以使用本领域已知的任何方法不洗涤或洗涤预处理的纤维素材料，例如用水洗涤。
[0275]机械预处理或物理预处理:术语“机械预处理”或“物理预处理”是指促进颗粒的粒度缩分的任何预处理。例如，此类预处理可以涉及不同类型的碾磨或研磨(例如干研磨、湿研磨、或振动球磨)。
[0276]可以同时物理地(机械地)和化学地预处理纤维素材料。机械或物理预处理可以结合汽蒸/蒸汽爆发、水热分解、稀的或温和的酸处理，高温、高压处理，辐射(例如微波辐射)，或它们的组合。在一个方面，高压是指优选在约100至约400psi的范围内的压力，例如约150至约250psi。在 另一方面，高温是指在100 V至约300°C的范围内的温度，例如约140 V至约200°C。在一个优选的方面，使用蒸汽枪水解器系统，按分批法进行机械的或物理的预处理，该蒸汽枪水解器系统使用如以上定义的高压和高温，例如从Sunds Defibrator AB公司，瑞典可得的Sunds水解器。如所希望，可以顺序地或同时地进行物理的和化学的预处理。
[0277]因此，在一个优选的方面，纤维素材料经受物理的(机械的)或化学的预处理，或它们的任何组合，以促进分离和/或释放纤维素、半纤维素、和/或木质素。
[0278]生物预处理:术语“生物预处理”是指促进从纤维素材料分离和/或释放纤维素、半纤维素、和/或木质素的任何生物预处理。生物预处理技术可以涉及应用木质素溶解微生物和/或酶(参见例如许(Hsu, T.-L ) 1996，生物质预处理，《关于生物乙醇生产和利用的手册》(Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol:Productionand Utilization),怀曼(Wyman，C.E.),编辑，Taylor&Francis 出版公司，华盛顿，179-212 ;高希(Ghosh)和辛格(Singh)，1993，用于纤维素生物质的酶/微生物转化的物理化学和生物处理(Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass),《应用微生物学进展》(Adv.Appl.Microbiol.) 39:295-333 ;麦克米伦(McMillan, J.D.)，1994，预处理木质纤维素生物质:综述((Pretreating lignocellulosic biomass:a review),《生物质的酶转化用于燃料生产》(Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production),希默尔(Himmel, M.E.)、贝克(Baker, J.0.)、和奥弗伦(Overend, R.P.)编辑，ACS 研讨会丛刊 566 (ACS SymposiumSeries),美国化学会(American Chemical Society),华盛顿,第 15 章，宫(Gong, C.S.)、曹(Cao,N.J.)、杜(Du，J.)和曹(Tsao，G.T.)，1999，来自可再生资源的乙醇生产，《生物化学工程 / 生物技术进展》(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology),谢佩尔(Scheper, Τ.)编辑，Springer-Verlag Berlin Heidelberg 公司，德国，65:207-241 ;奥尔森(Olsson)和哈恩-哈格代尔(Hahn-Hagerdal), 1996,木质纤维素水解液的发酵用于乙醇生产(Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production),《酶与微生物技术》(Enz.Microb.Tech.)，18:312-331 ;以及瓦兰德(Vallander)和埃里克松(Eriksson), 1990,从木质纤维素材料生产乙醇:技术状态(Production of ethanol fromlignocellulosic materials:State of the art),《生物化学工程 / 生物技术进展》(Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.) 42:63-95)。
[0279]糖化。在水解步骤，还称为糖化中，纤维素材料(例如预处理的)被水解，来分解纤维素和/或半纤维素为可发酵糖，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶寡糖。在本发明的嵌合葡糖苷酶或其变体的存在下，通过酶组合物从酶学上进行水解。可以同时或顺序添加组合物的组分。
[0280]优选在合适的水性环境中，在由本领域普通技术人员容易确定的条件下，进行酶水解。在一个方面，在适合酶组分活性，即对酶组分而言最佳的条件下进行水解。可以按一个进料批次或连续过程进行水解，其中例如将纤维素材料逐渐进料至含酶水解溶液中。
[0281]一般在控制的pH、温度、和混合条件下，在搅拌罐反应器或发酵罐中进行糖化。可以由本领域普通技术人员容易地确定合适的加工时间、温度和PH条件。例如，糖化可以持续高达200小时，但是典型地优选进行约12至约120小时，例如约16至约72小时或约24至约48小时。优选温度是在约25°C至约70°C的范围内，例如约30°C至约65°C、约40°C至约60°C、或约50°C至约55°C。优选pH是在约3至约8的范围内，例如约3.5至约7、约4至约6、或约5.0至约5.5。优选干固体含量是在约5至约50wt%的范围内，例如约10至约40wt% 或约 20 至约 30wt%。
[0282]酶组合物可以包含在降解纤维素材料中有用的任何蛋白。
[0283]在一个方面，酶组合物可以包含或进一步包含一种或多种(例如若干种)选自下组的蛋白，该组由以下各项组成:纤维素酶、具有增强的纤维素分解活性的多肽、半纤维素酶、酯酶、扩张蛋白、漆酶、木质素降解酶、果胶酶(pectinase)、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀因子(swollenin)。在另一方面，纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如若干种)酶，该组由以下各项组成:葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、以及葡糖苷酶。在另一方面，半纤维素酶优选是选自下组的一种或多种(例如若干种)酶，该组由以下各项组成:乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酰基酯酶、半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶、和木糖苷酶。
[0284] 在另一方面，酶组合物包含一种或多种(例如若干种)纤维素分解酶。在另一方面，酶组合物包含或进一步包含一种或多种(例如若干种)半纤维素分解酶。在另一方面，酶组合物包含一种或多种(例如若干种)纤维素分解酶和一种或多种(例如若干种)半纤维素分解酶。在另一方面，酶组合物包含一种或多种(例如若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成:纤维素分解酶和半纤维素分解酶。在另一方面，酶组合物包含葡聚糖内切酶。在另一方面，酶组合物包含纤维二糖水解酶。在另一方面，酶组合物包含葡糖苷酶。在另一方面，酶组合物包含具有增强的纤维素分解活性的多肽。在另一方面，酶组合物包含葡聚糖内切酶和具有增强的纤维素分解活性的多肽。在另一方面，酶组合物包含纤维二糖水解酶和具有增强的纤维素分解活性的多肽。在另一方面，酶组合物包含β-葡糖苷酶和具有增强的纤维素分解活性的多肽。在另一方面，酶组合物包含葡聚糖内切酶和纤维二糖水解酶。在另一方面，酶组合物包含葡聚糖内切酶和β-葡糖苷酶。在另一方面，酶组合物包含纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。在另一方面，酶组合物包含葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、和具有增强的纤维素分解活性的多肽。在另一方面，酶组合物包含葡聚糖内切酶、β -葡糖苷酶、和具有增强的纤维素分解活性的多肽。在另一方面，酶组合物包含纤维二糖水解酶、β -葡糖苷酶、和具有增强的纤维素分解活性的多肽。在另一方面，酶组合物包含葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。在另一方面，酶组合物包含葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、β -葡糖苷酶、和具有增强的纤维素分解活性的多肽。
[0285]在另一方面，酶组合物包含乙酰基甘露聚糖酯酶。在另一方面，酶组合物包含乙酰基木聚糖酯酶。在另一方面，酶组合物包含阿拉伯聚糖酶(例如a -L-阿拉伯聚糖酶)。在另一方面，酶组合物包含阿拉伯呋喃糖苷酶(例如a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶)。在另一方面，酶组合物包含香豆酸酯酶。在另一方面，酶组合物包含阿魏酰基酯酶。在另一反面，酶组合物包含半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)。在另一方面，酶组合物包含葡萄糖醛酸酶(例如α -D-葡萄糖醛酸酶)。在另一方面，酶组合物包含葡糖醛酸酯酶。在另一方面，酶组合物包含甘露聚糖酶。在另一方面，酶组合物包含甘露糖苷酶(例如甘露糖苷酶)。在另一方面，酶组合物包含木聚糖酶。在一个优选的方面，木聚糖酶是家族10木聚糖酶。在另一方面，酶组合物包含木糖苷酶(例如β-木糖苷酶)。
[0286]在另一方面，酶组合物包含酯酶。在另一方面，酶组合物包含扩张蛋白。在另一方面，酶组合物包含漆酶。在另一方面，酶组合物包含木质素降解酶。在一个优选的方面，木质素降解酶是锰过氧化物酶。在另一优选的方面，木质素降解酶是木质素过氧化物酶。在另一优选的方面，木质素降解酶是产H2O2酶。在另一方面，酶组合物包含果胶酶(果胶酶)。在另一方面，酶组合物包含过氧化物酶。在另一方面，酶组合物包含蛋白酶。在另一方面，酶组合物包含膨胀因子(swollenin)。
[0287]在本发明的方法中，可以在糖化、糖化和发酵、或发酵之前或之中添加这一种或多种酶。
[0288]酶组合物的一种或多种(例如若干种)组分可以是野生型蛋白、重组蛋白、或野生型蛋白和重组蛋白的组合。例如一种或多种(例如若干种)组分可以是细胞的天然蛋白，该细胞被用作宿主细胞以重组表达酶组合物的一种或多种(例如若干种)其他组分。可以产生酶组合物的一种或多种(例如若干种)组分作为单组分，然后组合该单组分以形成酶组合物。酶组合物可以是多组分和单组分蛋白制剂的组合。
[0289]用于本发明的方法的酶可以是适合使用的任何形式，例如像发酵液配制品或细胞组合物、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化的或纯化的酶制剂、或作为酶来源的宿主细胞。酶组合物可以是干燥的粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定化的液体、或稳定化的保护的酶。例如，根据已建立的过程，可以通过添加稳定剂，例如糖、糖醇或另一种多元醇、和/或乳酸或另一种有机酸来稳定液体酶制剂。
[0290]最佳量的本发明的酶和嵌合β -葡糖苷酶或其变体取决于若干因素，包括但不局限于纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶组分的混合物、纤维素底物、纤维素底物的浓度、纤维素底物的一种或多种预处理、温度、时间、pH、和发酵有机体(例如用于同步糖化和发酵的酵母)的内含物。
[0291]在一个方面，对纤维素材料的纤维素分解酶或半纤维素分解酶的有效量是约0.5至约50mg,例如约0.5至约40mg、约0.5至约25mg、约0.75至约20mg、约0.75至约15mg、约0.5至约IOmg,或约2.5至约10mg/g的纤维素材料。
[0292]在另一方面，对纤维素材料的本发明的嵌合β -葡糖苷酶或其变体的有效量是约0.01至约50.0mg,例如约0.01至约40mg、约0.01至约30mg、约0.01至约20mg、约0.01至约 10mg、约 0.01 至约 5mg、约 0.025 至约 1.5mg、约 0.05 至约 1.25mg、约 0.075 至约 1.25mg、约0.1至约1.25mg、约0.15至约1.25mg、或约0.25至约1.0mg/g的纤维素材料。
[0293]在另一方面，对纤维素分解酶或半纤维素分解酶本发明的嵌合葡糖苷酶或其变体的有效量是约0.005至约1.0g，例如约0.01至约1.0g、约0.15至约0.75g、约0.15至约0.5g、约0.1至约0.5g、约0.1至约0.25g、或约0.05至约0.2g/g的纤维素分解酶或半纤维素分解酶。
[0294]具有纤维素分解酶活性或半纤维素分解酶活性的多肽连同在纤维素材料降解中有用的其他蛋白/多肽，例如具有增强的纤维素分解活性的多肽(此后总称为“具有酶活性的多肽”)可以衍生自或得自任何合适的来源，包括细菌、真菌、酵母、植物、或哺乳动物来源。术语“获得的”在此还指已经采用在此所述的方法，在宿主有机体中重组产生的酶，其中重组产生的酶对于宿主有机体而言是天然的或外源的，或具有修饰的氨基酸序列，例如具有一个或多个(例如若干个)缺失、插入和/或取代的氨基酸，即重组产生的酶是天然氨基酸序列的突变体和/或 片段或由本领域已知的核酸改组过程产生的酶。天然变体被涵盖在天然酶的含义内，并且重组获得的变体是在外源酶的含义内，例如通过定点诱变或改组。
[0295]具有酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如多肽可以是具有酶活性的革兰氏阳性细菌多肽，例如芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳酸杆菌属、乳球菌属、梭菌属、土芽孢杆菌属、热解纤维素菌属、热酸菌属、热裂菌属(Thermobifidia)、或海洋芽孢杆菌属多肽，或具有酶活性的革兰氏阴性细菌多肽，例如大肠杆菌、假单孢菌属、沙门氏菌属、弯曲菌属、螺杆菌属、黄质菌属，梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟菌属、或脲原体属多肽。
[0296]在一个方面，多肽是具有酶活性的嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌多肽。
[0297]在另一方面，多肽是具有酶活性的似马链球菌、化脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种多肽。
[0298]在另一方面，多肽是具有酶活性的产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰链丝菌、或变铅青链霉菌多肽。
[0299]具有酶活性的多肽还可以是真菌多肽，并且更优选是酵母多肽，例如具有酶活性的假丝酵母、克鲁维酵母菌、毕赤酵母、酵母菌属酵母、裂殖酵母、亚罗酵母多肽；或更优选是丝状真菌多肽，例如具有酶活性的支顶孢、落叶松蕈、支链孢、曲霉、短梗霉、葡萄座腔菌(Botryospaeria)、拟腊菌、毛_壳属菌、金孢子菌、麦角菌、旋孢腔菌、鬼伞属菌、家白蚁、棒囊孢壳菌、栗疫属菌、隐球酵母、壳色单隔孢属菌、黑耳属菌、线黑粉菌科菌、镰刀菌、赤霉菌、全鞭毛虫、腐质霉、耙齿菌、香菇、小球腔菌、大毁壳属菌、黑果菌属菌(Melanocarpus)、亚灰树花菌、毛霉菌、蚀丝霉属菌、新美鞭菌、脉孢菌、拟青霉属菌、青霉菌、平革菌、梨囊鞭菌属菌、一种真菌(Poitrasia)、假黑盘菌、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉、裂褶菌、柱顶孢霉、踝节菌、嗜热子囊菌、梭孢壳菌、弯颈霉、木霉属菌、长毛盘菌、轮枝孢属菌、小包脚菇、或炭角菌多肽。
[0300]在一个方面，多肽是具有酶活性的卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁费酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。
[0301]在另一个方面，多肽是具有酶活性的解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角质金孢子菌、一种金孢子菌(Chrysosporium Iucknowense)> 热带金抱子菌、一种金抱子菌(Chrysosporiummerdarium)、一种金孢子菌(Chrysosporium inops)、租金孢子菌、一种金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)> 一种金抱子菌(Chrysosporium zonatum)、杆抱状键孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、灰腐质酶、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、白囊耙齿菌、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、绳状青霉菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、无色梭孢壳、一种梭抱壳(Thielavia albomyces)、一种梭抱壳(Thielavia albopi1sa)、澳洲梭抱壳、一种梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳、卵孢梭孢壳、一种梭孢壳(Thielavia peruviana)、瘤孢梭孢壳、毛梭抱壳、耐热梭孢壳、太瑞斯梭孢壳霉、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、绿色木霉、或囊状长毛盘菌多肽。
[0302]还可以使用具有酶活性的多肽的化学修饰的或蛋白工程化的突变体。
[0303]酶组合物的一种或多种(例如若干种)组分可以是重组组分，即通过克隆编码单组分的DNA序列，并且随后用该DNA序列转化细胞，并且随后在宿主中表达而产生(参见例如W091/17243和W091/17244)。优选宿主是异源宿主(酶对于宿主而言是异源的)，但是在某些条件下，宿主还可以是同源宿主(酶对于宿主而言是原生的)。还可以通过纯化来自发酵液的这样一种蛋白来制备单组分纤维素分解蛋白。
[0304]在一个方面，一种或多种(例如若干种)纤维素分解酶包括商业纤维素分解酶制剂。例如，适合用于本发明的商业纤维素分解酶制剂的实例包括CELLIC?CTec (诺维信公司)、CELLIC?CTec2 (诺维信公司)、CELLIC?CTec3 (诺维信公司)、CELLUCLAST?(诺维信公司)、N0V0ZYM?188 (诺维信公司)、CELLUZYME? (诺维信公司)、CEREFL0? (诺维信公司)、和ULTRAFL0? (诺维信公司)、ACCELERASE? (杰能科国际(Genencor Int.))、LAMINEX? (杰能科国际)、SPEZYME?CP (杰能科国际)、FILTRASE?NL (DSM 公司)；METHAPLUS?S/L ioo (DSM 公司)、R0HAMENT?7069W (RohmGmbH 公司)、FIBREZY.M.E?LDI (Dyadic International 公司)、FIBREZYME?LBR (DyadicInternational 公司)、或VISCOSTAR? 150L (Dyadic International 公司)。以从约0.001至约5.0wt%的固体，例如约约0.025至约4.0wt%的固体或约0.005至约2.0wt%的固体的有效量添加纤维素酶。
[0305] 可以用于本发明的过程的细菌葡聚糖内切酶实例包括但不局限于:解纤维热酸菌葡聚糖内切酶(W091/05039 ；W093/15186 ;美国专利号 5，275,944 ；W096/02551 ;美国专利号5，536,655，W000/70031, W005/093050);褐色嗜热裂孢菌葡聚糖内切酶III(W005/093050);和褐色嗜热裂孢菌葡聚糖内切酶V (W005/093050)。
[0306]可以用于本发明的真菌葡聚糖内切酶的实例包括但不局限于:里氏木霉葡聚糖内切酶I (潘提拉(Penttila)，1986，《基因》(Gene) 45:253-263、里氏木霉Cel7B葡聚糖内切酶I (GENBANK?登录号M15665)、里氏木霉葡聚糖内切酶II (萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1988，《基因》(Gene) 63:11-22)、里氏木霉Cel5A葡聚糖内切酶II (GENBANK?登录号M19373)、里氏木霉葡聚糖内切酶III (冈田(Okada)等人，1988，《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.) 64:555-563, GENBANK? 登录号 AB003694)、里氏木霉葡聚糖内切酶V (萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1994,《分子微生物学》(Molecular Microbiology)13:219-228, GENBANK?登录号Z33381 )、棘孢曲霉葡聚糖内切酶(黄(Ooi)等人，1990，《核酸研究》(Nucleic Acids Research) 18:5884)、白曲霉葡聚糖内切酶(坂本(Sakamoto)等人，1995,《当代遗传学》(Current Genetics) 27:435-439)、胡萝卜软腐欧文氏菌葡聚糖内切酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人，1990，《基因》(Gene) 90:9_14)、尖孢镰刀菌葡聚糖内切酶(GENBANK?登录号L29381)、灰腐质霉高温变种葡聚糖内切酶(GENBANK?登录号AB003107)、热白丝菌葡聚糖内切酶(GENBANK?登录号MAL515703)、粗糙脉孢菌葡聚糖内切酶(GENBANK?登录号XM_324477)、特异腐质霉葡聚糖内切酶V、嗜热毁丝霉CBS117.65葡聚糖内切酶、担子菌CBS495.95葡聚糖内切酶、担子菌CBS494.95葡聚糖内切酶、太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126CEL6B葡聚糖内切酶、太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126CEL6C葡聚糖内切酶、太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126CEL7C葡聚糖内切酶、太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126CEL7E葡聚糖内切酶、太瑞斯梭抱壳霉NRRL8126CE L7F葡聚糖内切酶、一种真菌(Cladorrhinum foecundissimum)ATCC62373CEL7A葡聚糖内切酶、和里氏木霉株系N0.VTT-D-80133葡聚糖内切酶(GENBANK?登录号M15665)。
[0307]在本发明中有用的实例包括但不局限于棘孢曲霉纤维二糖水解酶II(W02011/059740)、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶1、嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶I1、特异腐质霉纤维二糖水解酶1、嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II (W02009/042871)、一种梭孢壳(Thielavia hyrcanie)纤维二糖水解酶II (W02010/141325)、太瑞斯梭孢壳霉纤维二糖水解酶II (CEL6A，W02006/074435)、里氏木霉纤维二糖水解酶1、里氏木霉纤维二糖水解酶I1、和囊状长毛盘菌纤维二糖水解酶II (W02010/057086)。
[0308]在本发明中有用的葡糖苷酶的实例包括但不局限于来自以下的葡糖苷酶:棘孢曲霉(川口(Kawaguchi)等人，1996，基因(Gene) 173:287-288)、烟曲霉(W02005/047499)、黑曲霉(丹(Dan)等人，2000，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem).275:4973-4980)、米曲霉(W02002/095014)、巴西青霉 IBT20888 (W02007/019442 和W02010/088387)、太瑞斯梭孢壳霉(W02011/035029)，以及囊状长毛盘菌(W02007/019442)。
[0309]葡糖苷酶可以是融合蛋白。在一个方面，葡糖苷酶是米曲霉葡糖苷酶变体BG融合蛋白(TO2008/057637)或米曲霉β -葡糖苷酶融合蛋白(W02008/057637)。
[0310]使用根据亨利萨特(Henrissat B.)，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶分类(A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequencesimilarities),《生物化学杂志》(Biochem.J.) 280:309-316,以及亨利萨特(HenrissatB.)和巴洛赫(Bairoch A), 1996,糖基水解酶分类的基于序列的更新(Updating thesequence-based classification of glycosylhydrolases),〈〈生物化学杂志〉〉(Biochem.J.) 316:695-696的分类，在多个糖基水解酶家族中披露了其他有用的葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、和葡糖苷酶。
[0311]在W098/13465、W098/015619、W098/015633、W099/06574、W099/10481、W099/025847、W099/031255, W02002/101078, W02003/027306, W02003/052054、W02003/052055, W02003/052056, W02003/052057, W02003/052118, W02004/016760,W02004/043980, W02004/048592, W02005/001065, W02005/028636, W02005/093050,W02005/093073, W02006/074005, W02006/117432, W02007/071818, W02007/071820,W02008/008070, TO2008/008793、美国专利号 5，457，046、美国专利号 5，648，263、和美国专利号5，686, 593中描述了可以用于本发明的其他纤维素分解酶。
[0312]在本发明的方法中，具有增强的纤维素分解活性的任何GH61多肽可以用作酶组合物的组分。
[0313]在本发明的过程中有用的具有增强的纤维素分解活性的GH61多肽的实例包括但不局限于来自以下的GH61多肽:太瑞斯梭孢壳霉(W02005/074647、W02008/148131、和 TO2011/035027)，橙色嗜热子囊菌(W02005/074656 和 W02010/065830)，里氏木霉(TO2007/089290)，嗜热毁丝霉(W02009/085935、W02009/085859、W02009/085864、和 TO2009/085868)，烟曲霉(W02010/138754)，嗜松青霉(W02011/005867)，嗜热子嚢菌属物种(W02011/039319)，青霉菌属物种(W02011/041397)，和甲壳嗜热子囊菌(W02011/041504)。
[0314]在一个方面，根据W02008/151043，在可溶活化二价金属阳离子(例如锰或铜)的存在下，使用具有增强的纤维素分解活性的GH61多肽。
[0315]在另一方面，在二氧基化合物、双环化合物、杂环化合物、含氮化合物、醌化合物、含硫化合物、或从预处理的纤维素材料(例如预处理的玉米秸杆(PCS))获得的液体的存在下，使用具有增强的纤维素分解活性的GH61多肽。
[0316]二氧基化合物可以包括含有两个或更多个氧原子的任何合适的化合物。在一些方面，二氧基化合物含有一个如在此所述的取代的芳基部分。二氧基化合物可以包括一个或多个(例如若干个)羟基和/或羟基衍生物，而且还包括缺乏羟基和羟基衍生物的取代的芳基部分。二氧基化合物的非限制性实例包括邻苯二酚或儿茶酚；咖啡酸；3，4- 二羟基苯甲酸；4_叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯二醇；连苯三酚；没食子酸；3，4，5-三羟基苯甲酸甲酯；2，3，4-三羟基二苯甲酮；2，6- 二甲氧基苯酚；芥子酸；3，5- 二羟基苯甲酸；4_氯-1，2-苯二醇；4_硝基-1，2-苯二醇；丹宁酸；没食子酸乙酯；羟乙酸甲酯；二羟基富马酸；2-丁炔-1,4-二醇；克酮酸；1,3-丙二醇；酒石酸；2，4-戊二醇；3-乙氧基-1,2-丙二醇；2，4，4’ -三羟基二苯甲酮；顺-2- 丁烯-1，4- 二醇；3，4- 二羟基-3-环丁烯-1，2- 二酮；二羟基丙酮；丙烯醛缩醛；4_羟基苯甲酸甲酯；4_羟基苯甲酸；以及3，5- 二甲氧基-4-羟基苯甲酸甲酯；或其盐或溶剂化物。
[0317] 双环化合物可以包含如在此所述的任何合适的取代的稠合环系统。化合物可以包含一个或多个(例如若干个)额外的环，并且除非另有说明，否则不局限于特定数目的环。在一个方面，双环化合物是类黄酮。在另一方面，双环化合物是任选地取代的异黄酮。在另一方面，双环化合物是一种任选地取代的花色烊(f lavy Iium)离子，例如一种任选地取代的花色素或任选地取代的花色素苷，或其衍生物。双环化合物的非限制性实例包括表儿茶素；槲皮酮；杨梅黄酮；紫杉叶素；堪非醇；桑色素；刺槐素；柚皮素；异鼠李素；芹黄素；矢车菊素；矢车菊素苷；黑豆多酚；花青素鼠李葡糖苷；或其盐或溶剂化物。
[0318]杂环化合物可以是如在此所述的任何合适的化合物，例如包含一个杂原子的任选地取代的芳香族或非芳香族环。在一个方面，杂环是包含任选地取代的杂环烷基部分或一个任选地取代的杂芳基部分的化合物。在另一方面，任选地取代的杂环烷基部分或任选地取代的杂芳基部分是任选地取代的5元杂环烷基或一个任选地取代的5元杂芳基部分。在另一方面，任选地取代的杂环烷基或任选地取代的杂芳基部分是选自以下的任选地取代的部分:吡唑基、呋喃基、咪唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁唑基、吡咯基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、噻唑基、三唑基、噻吩基、二氢噻吩并吡唑基、硫茚基、咔唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并三唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、异喹啉基、异引哚基、唳基、苯并异P惡唑基(benzoisazolyl)、二甲基乙内酰脲、吡嗪基、四氢呋喃基、吡咯啉基、吡咯烷基、吗啉基、11引哚基、二氮萆基(diazepinyl)、氮萆基(azepinyl)、噻萆基(thiepinyl)、哌唳基以及氧萆基(oxepinyl)。在另一方面,任选地取代的杂环烷基部分或任选地取代的杂芳基部分是任选地取代的呋喃基。杂环化合物的非限制性实例包括(1，2-二羟基乙基)-3，4-二羟基呋喃-2(5H)_酮；4_羟基-5-甲基_3_呋喃酮；5-羟基-2 (5H)-呋喃酮；[1，2-二羟基乙基]呋喃-2，3，4(5H)-三酮；α-羟基-r-丁内酯；核糖酸Y -内酯;醒己糖醒酸( aldohexuronicaldohexuronic acid) Y -内酯；葡萄糖酸δ -内酯；4_羟基香豆素；二氢苯并呋喃；5-(羟基甲基)糠醛；联糠醛；2(5Η)_呋喃酮；5，6- 二氢-2Η-吡喃-2-酮；以及5，6- 二氢-4-羟基-6-甲基-2Η-吡喃-2-酮；或其盐或溶剂化物。
[0319]含氮化合物可以是具有一个或多个氮原子的任何合适的化合物。在一个方面，含氮化合物包含胺、亚胺、羟胺或硝基氮部分。含氮化合物的非限制性实例包括丙酮肟；紫尿酸；吡啶-2-醛肟；2_氨基苯酚；1，2_苯二胺；2，2，6，6-四甲基_1_哌啶基氧基；5，6，7，8-四氢生物蝶呤；6，7- 二甲基-5，6，7，8-四氢蝶呤；以及顺丁烯酰胺酸；或其盐或溶剂化物。
[0320]醌化合物可以是包含如在此所述的醌部分的任何合适的化合物。醌化合物的非限制性实例包括1，4-苯醌；1，4-萘醌；2-羟基-1, 4-萘醌；2，3- 二甲氧基_5_甲基-1, 4-苯醌或辅酶Qci ;2，3，5,6-四甲基-1，4-苯醌或杜醌；1，4-二羟基蒽醌；3-羟基-1-甲基-5，6-吲哚啉二酮或肾上腺素红；4_叔丁基-5-甲氧基-1，2-苯醌；吡咯并喹啉醌；或其盐或溶剂化物。
[0321]含硫化合物可以是包含一个或多个硫原子的任何合适的化合物。在一个方面，含硫化合物包含一个选自以下的部分:亚硫酰基、硫醚、亚磺酰基、磺酰基、硫酰胺、磺酰胺、磺酸以及磺酸酯。含硫化合物的非限制性实例包括乙硫醇；2_丙硫醇；2_丙烯-1-硫醇；2-巯基乙磺酸；苯硫酚；苯-1，2- 二硫醇；半胱氨酸；蛋氨酸；谷胱甘肽；胱氨酸；或其盐或溶剂化物。
[0322]在一个方面，作为与纤维素的葡糖基单元的摩尔比，对于纤维素材料，以上所述的这样一种化合物的有效量是约10_6至约10，例如约10_6至约7.5、约10_6至约5、约10_6至约2.5、约I(T6至约1、约I(T5至约1、约I(T5至约10'约I(T4至约10'约I(T3至约10'或约10_3至约10_2。在另一方面，以上所述的这样一种化合物的有效量是约0.1 μ M至约1Μ，例如约0.5 μ M至约0.75Μ、约0.75 μ M至约0.5Μ、约I μ M至约0.25Μ、约I μ M至约0.1Μ、约5 μ M至约50mM、约10 μ M至约25mM、约50 μ M至约25mM、约10 μ M至约10mM、约5 μ M至约5mM、或约0.1mM至约ImM。
[0323]术语“液体”是指溶液相，水性的、有机的、或其组合，得自浆液中的木质纤维素和/或半纤维素材料、或其单糖(例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖、等)的处理，所在条件如在此所述，以及其可溶内容物。可以通过任选地在一种催化剂(例如酸)的存在下，任选地在一种有机溶剂的存在下，以及任选地与材料的物理破坏组合，应用热和/或压力，处理木质纤维素或半纤维素材料(或原料)，并且然后从残余固体分离溶液，产生用于GH61多肽的纤维素分解增强的液体。此类条件确定在纤维素酶制剂水解纤维素底物期间，通过组合液体和GH61多肽可获得的纤维素分解增强的程度。可以从使用本领域标准的方法，例如过滤、沉积、或离心来处理的材料分离液体。
[0324]在一个方面，对于纤维素而言液体的有效量是约10_6至约10g/g纤维素，例如约ICT6至约7.5g、约ICT6至约5g、约ICT6至约2.5g、约ICT6至约lg、约ICT5至约lg、约ICT5至约10、、约I(T4至约10、、约I(T3至约10、、或约I(T3至约l(T2g/g纤维素。
[0325]在一个方面，一种或多种(例如若干种)半纤维素分解酶包括商业半纤维素分解酶制剂。例如适合用于本发明的商业半纤维素分解酶制剂的实例包括SHEARZYME?(诺维信公司)、CELLIC(S)HTec (诺维信公司)、CELLIC?HTec2 (诺维信公司)、CELLIC?HTec3 (诺维信公司)、VISCOZYME? (诺维信公司)、ULTRAFLO? (诺维信公司)、PULPZYME?HC (诺维信公司)、MULTIFECT?Xylanase (杰能科公司(Genencor))、ACCF丄LERASE?XY (杰能科公司)、ACCELLERASE?XC (杰能科公司)、EC0.PULP⑧TX-200A (AI5 酶制剂公司(ABEnzymes))、HSP6000Xylanase(DSM公司)、UEPULlM333P (生物分析股份有限公司(Biocatalysts Limit),威尔士,英国)，DEP0L?740L (生物分析股份有限公司，威尔士，英国)，以及DEP0L?762P (生物分析股份有限公司，威尔士，英国)。
[0326]在本发明的过程中有用的木聚糖酶的实例包括但不局限于来自以下的木聚糖酶:棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790 ;TO94/21785)、烟曲霉(TO2006/078256)、嗜松青霉(W02011/041405)、青霉菌属物种(W02010/126772)、太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126(W02009/079210)、以及囊状长毛盘菌 GHlO (W02011/057083)。
[0327]在本发明的过程中有用的β-木糖苷酶的实例包括但不局限于来自以下的β-木糖苷酶:粗糙脉孢菌(SwissProt登录号Q7S0W4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)、以及埃默森篮状菌(SwissProt登录号Q8X212)。
[0328] 在本发明的过程中有用的乙酰基木聚糖酯酶的实例包括但不局限于来自以下的乙酰基木聚糖酯酶:棘孢曲霉(W02010/108918)、球毛壳菌(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳菌(GeneSeqP登录号AAB82124)、特异腐质霉DSM1800 (W02009/073709)、红褐肉座菌(W02005/001036)、嗜热毁丝菌(W02010/014880)、粗糙脉孢菌(UniProt 登录号 q7s259)、颖枯壳针孢(Uniprot登录号QOUHJl )、以及太瑞斯梭孢壳霉NRRL8126 (W02009/042846)。[0329]在本发明的过程中有用的阿魏酰基酯酶(阿魏酸酯酶)包括但不局限于来自以下的阿魏酰基酯酶:特异腐质霉DSM1800 (W02009/076122)、费希新萨托菌(UniProt登录号A1D9T4)、粗糙脉孢菌(UniProt登录号Q9HGR3)、橘灰青霉(W02009/127729)、以及太瑞斯梭孢壳霉(W02010/053838 和 W02010/065448)。
[0330]在本发明的过程中有用的阿拉伯呋喃糖苷酶的实例包括但不局限于来自以下的阿拉伯呋喃糖苷酶:黑曲霉(GeneSeqP登录号AAR94170)、特异腐质霉DSM1800(W02006/114094 和 W02009/073383)、以及大型亚灰树花菌(W02006/114094)。
[0331]在本发明的过程中有用的α-葡萄糖醛酸酶包括但不局限于来自以下的α-葡萄糖醒酸酶:棒曲霉(UniProt登录号alccl2)、烟曲霉(SwissProt登录号Q4WW45)、黑曲霉(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(SwissProt登录号Q0CJP9)、特异腐质霉(W02010/014706)、橘灰青霉(W02009/068565)、埃默森篮状菌(UniProt 登录号 Q8X211)、以及里氏木霉(Uniprot登录号Q99024)。
[0332]可以通过使用本领域已知的技术(参见例如班尼特(Bennett, J.W.)和拉热(LaSure, L.)(编辑)，《真菌中的更多基因操作》(More Gene Manipulations in Fungi),学术出版社，加利福尼亚州，1991)，在含有合适的碳源和氮源和无机盐的营养培养基上发酵以上提到的微生物株系，产生在本发明的过程中使用的具有酶活性的多肽。合适的培养基从商业供应商处可获得，或者可根据公开的组成(例如，在美国模式培养物保藏所目录中)来制备。适合生长和产生酶的温度范围和其他条件是本领域已知的(参见例如贝利(Bailey, J.E.)和奥利斯(Ollis，D.F.)，《生物化学工程基本原理》(BiochemicalEngineering Funda mentals,),麦格劳-希尔图书公司(McGraw-Hill Book Company),纽约州，1986)。
[0333]发酵可以是对导致酶或蛋白的表达或分离的细胞进行培养的任何方法。因此，发酵可以被理解为包括:在合适的培养基中，在允许酶表达或分离的条件下，进行摇瓶培养、或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)。可以从发酵培养基回收通过上述方法产生的生成的酶，并且通过常规程序纯化。
[0334]发酵。可以用一种或多种(例如若干种)能够直接或间接将糖发酵成希望的发酵产物的发酵微生物，对从水解的纤维素材料获得的可发酵糖进行发酵。“发酵”或“发酵过程”是指任何发酵过程或包括发酵步骤的任何过程。发酵过程还包括用于消费性醇工业(例如啤酒和葡萄酒)、乳品工业(例如发酵乳制品)、皮革工业和烟草工业的发酵过程。发酵条件取决于希望的发酵产物和发酵有机体，并且可以由本领域普通技术人员容易地确定。
[0335]在发酵步骤中，通过发酵有机体，例如酵母，作为预处理和酶水解步骤的结果，从纤维素材料释放的糖被发酵为产物，例如乙醇。如在此所述，水解(糖化)和发酵可以是分开的或同时的。
[0336]在实践本发明中，在发酵步骤中可以使用任何合适的水解的纤维素材料。如本领域熟知的，通常基于希望的发酵产物(即要从发酵获得的物质)选择材料。
[0337]术语“发酵培养基”在此被理解为是指在添加一种或多种发酵微生物之前的培养基，例如来源于糖化过程的培养基，连同在同步糖化和发酵过程(SSF)中使用的培养基。
[0338]“发酵有机体”是指适合用于希望的发酵过程以产生发酵产物的任何微生物，包括细菌和真菌有机体。发酵有机体可以是己糖和/或戊糖发酵有机体，或其组合。己糖和戊糖发酵有机体这二者都是本领域熟知的。合适的发酵微生物能够将糖，例如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、和/或寡糖直接或间接发酵，即转化为希望的发酵产物。由林(Lin)等人,2006,《应用微生物学与生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.) 69:627-642描述了产生乙醇的细菌和真菌发酵有机体的实例。
[0339]可以发酵己糖的发酵微生物的实例包括细菌和真菌有机体，例如酵母。优选的酵母包括假丝酵母、克鲁维酵母菌、和酵母菌属酵母的株系，例如萨纳瑞西斯假丝酵母、马克思克鲁维酵母、和酿酒酵母。
[0340]在其天然状态可以发酵戊糖的发酵有机体的实例包括细菌和真菌有机体，例如某些酵母。优选的木糖发酵酵母包括假丝酵母株系，优选是休哈塔假丝酵母(C.sheatae)或萨纳瑞西斯假丝酵母(C.sonorensis);以及毕赤酵母的株系,优选是树干毕赤酵母,例如树干毕赤酵母CBS5773。优选的戊糖发酵酵母包括管囊酵母的株系，优选是嗜单宁管囊酵母。可以通过本领域已知的方法，将不能够发酵戊糖，例如木糖和阿拉伯糖的有机体经基因改造为能够这样做。
[0341]例如可以有效发酵己糖和戊糖为乙醇的细菌的实例包括例如凝结芽孢杆菌、丙酮丁醇梭杆菌、热纤梭菌、发酵植物多糖梭菌(Clostridium phytofermentans)、土芽孢杆菌属物种、解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)、以及运动发酵单胞菌(菲力皮迪斯(Philippidis)，1996，同上)。
[0342]其他发酵有机体包括芽孢杆菌属的株系，例如凝结芽孢杆菌；假丝酵母属，例如萨纳瑞西斯假丝酵母(C.sonorensis)、甲醇山梨糖假丝酵母(C.methanosorbosa)、迪丹斯假丝酵母、近平滑念珠菌、一种假丝酵母(C.naedodendra)、布朗克假丝酵母、一种假丝酵母(C.entomophilia)、芸薹假丝酵母、热带假丝酵母、博伊丁假丝酵母(C.boidinii)、产朊假丝酵母、和休哈塔假丝酵母；梭菌属，例如丙酮丁醇梭菌、一种热纤梭菌(C.thermocellum)、和发酵植物多糖梭菌(C.phytofermentans);大肠杆菌属，尤其是已经基因改造以改进乙醇产率的大肠杆菌株系；土芽孢杆菌属物种；汉逊酵母属，例如异常汉森酵母；克雷白氏菌属，例如产酸克雷白氏菌；克鲁维酵母菌属，例如马克思克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、耐温克鲁维酵母、和脆壁克鲁维酵母；裂殖酵母属，例如粟酒裂殖酵母(S.pombe);高温厌氧杆菌属，例如解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter saccharolyticum)；以及发酵单胞菌,例如运动发酵单胞菌。
[0343]在一个优选的方面，酵母是酒香酵母属。在一个更优选的方面，酵母是克劳森酒香酵母。在另一优选的方面，酵母是假丝酵母。在另一更优选的方面，酵母是萨纳瑞西斯假丝酵母。在另一更优选的方面，酵母是博伊丁假丝酵母。在另一更优选的方面，酵母是布朗克假丝酵母。在另一更优选的方面，酵母是芸薹假丝酵母。在另一更优选的方面，酵母是丹斯假丝酵母。在另一更优选的方面，酵母是一种假丝酵母(Candida entomophiliia)。在另一更优选的方面，酵母是热带假丝酵母。在另一更优选的方面，酵母是休哈塔假丝酵母。在另一更优选的方面，酵母是产朊假丝酵母。在另一优选的方面，酵母是棒孢酵母。在另一更优选的方面，酵母是葡萄牙棒孢酵母。在另一更优选的方面，酵母是一种仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)。在另一优选的方面,酵母是克鲁维酵母菌。在另一更优选的方面，酵母是脆壁克鲁维酵母。在另一更优选的方面，酵母是马克思克鲁维酵母。在另一更优选的方面，酵母是耐温克鲁维酵母。在另一优选的方面，酵母是管囊酵母属。在另一更优选的方面，酵母是嗜鞣管囊酵母。在另一优选的方面，酵母是毕赤酵母。在另一优选的方面，酵母是树干毕赤酵母。在另一优选的方面，酵母是酵母菌属物种。在另一更优选的方面，酵母是酿酒酵母。在另一更优选的方面，酵母是糖化酵母(Saccharomyces distaticus)。在另一更优选的方面，酵母是葡萄汁酵母。
[0344]在一个优选的方面，细菌是芽孢杆菌属。在一个更优选的方面，细菌是凝结芽孢杆菌。在另一优选的方面，细菌是梭菌属。在另一更优选的方面，细菌是丙酮丁醇梭菌。在另一更优选的方面，细菌是发酵植物多糖梭菌。在另一更优选的方面，细菌是热纤梭菌。在另一更优选的方面，细菌是土芽孢杆菌属(Geobacilus)的物种。在另一更优选的方面，细菌是高温厌氧杆菌。在另一更优选的方面，细菌是解糖高温厌氧杆菌(Thermoanaerobactersaccharolyticum)。在另一优选的方面,细菌是发酵单胞菌属。在另一更优选的方面，细菌是运动发酵单胞菌。
[0345]适合乙醇生产的可商购酵母包括例如BIOFERM?AFT和XR(NABC-北美生物产物公司(North American Bioproducts Corporation),佐治亚州，美国)，乙醇红酵母(ETHANOLRED?yeast) (Fermentis/Lesaffre 公司，美国)，FALI? (Fleischmann，s Yeast 公司，美H), FERMIOL? (DSM Specialties 公司)，GERT STRAND? (Gert Strand AB 公司，瑞典)，以及SUPERSTART?和THERMOSACC?新鲜酵母(乙醇技术公司(Ethanol Technology),威斯康星州，美国)。
[0346]在一个优选的方面，已经对发酵微生物进行基因改造以提供发酵戊糖的能力，例如利用木糖的，利用阿拉伯糖的，以及共利用木糖和阿拉伯糖的微生物。
[0347] 克隆异源基因到不同发酵微生物中已经导致构建了能够转化己糖和戊糖为乙醇的有机体(共发酵)(陈(Chen)和何(Ho)，1993，在酿酒酵母中克隆和改进树干毕赤酵母木糖还原酶基因的表达(Cloning and improving the expression of Pichia stipitisxylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae),《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.) 39-40:135-147 ;何(Ho)等人，1998,能够有效共发酵葡萄糖和木糖的基因工程化酵母菌属酵母(Genetically engineered Saccharomyces yeastcapable of effectively cofermenting glucose and xylose),《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.) 64:1852-1859 ;科特(Kotter)和西里阿希(Ciriacy), 1993,用酿酒酵母进行木糖发酵(Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae),《应用微生物学与生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.) 38:776-783 ;瓦尔弗里德松(Walfridsson)等人，1995，共表达编码戊醣磷酸途径酶转羟乙醛酶和转醛醇酶的TKLl和TALl 基因的木糖代谢酿酒酵母株系(Xylose-metabolizing Saccharomyces cerevisiaestrains overexpressing the TKLland TALlgenes encoding the pentose phosphatepathway enzymes transketolase and transaldolase),《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.) 61:4184-4190等人，2004,用于有效厌氧木糖发酵的酿酒酵母的最小新陈代谢工程化:一个证据原理(Minimal metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation:a proofprinciple),((FEMS 酵母研究》(FEMSYeast Research)4:655-664 ;北奥(Beall)等人,1991,用重组大肠杆菌从木糖和其他糖产生乙醇的参数研究(Parametric studies of ethanolproduction from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli),〈〈生物技术与生物工程》(Biotech.Bioeng.) 38:296-303 ;英格拉姆(Ingram)等人，1998,用于乙醇生产的新陈代谢工程化(Metabolic engineering of bacteria for ethanolproduction),《生物技术与生物工程》(Biotechnol.Bioeng.) 58:204-214 ;张(Zhang)等人，1995，在产乙醇运动发酵单胞菌中戊糖新陈代谢途径的新陈代谢工程化(Metabolicengineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonasmob i I i s )，科学(Science)267:240-243 ;迪恩达(Deanda)等人，1996，通过新陈代谢途径工程化的阿拉伯糖发酵运动发酵单胞菌的开发(Development of an arabinose-fermentingZymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering),《应用与环境微生物学》(Appl.Environ.Microbiol.) 62:4465-4470 ;W02003/062430,木糖异构酶(xyloseisomerase)。
[0348]在一个优选的方面，基因改造的发酵微生物是萨纳瑞西斯假丝酵母。在另一优选的方面，基因改造的发酵微生物是大肠杆菌。在另一优选的方面，基因改造的发酵微生物是产酸克雷白氏菌。在另一优选的方面，基因改造的发酵微生物是马克思克鲁维酵母。在另一优选的方面，基因改造的发酵微生物是酿酒酵母。在另一优选的方面，基因改造的发酵微生物是运动发酵单胞菌。
[0349]在本领域熟知上述有机体也可以用于产生其他物质，如在此所述。
[0350]典型地将发酵微生物添加至降解的纤维素材料或水解产物，并且进行发酵，持续约8至约96小时，例如约24至约60小时。温度典型地在约26°C至约60°C之间，例如约32。。或50°C，并且约pH3至约pH8，例如pH4_5、6、或7。
[0351]在一个方面，应用酵母和/或另一种微生物至降解的纤维素材料并且进行发酵，持续约12至约96小时，例如典型地24-60小时。在另一方面，温度优选在约20°C至约60°C之间，例如约25°C至约50°C、约32°C至约50 V、或约32°C至约50°C，并且pH —般是从约pH3至约PH7，例如约pH4至约pH7。然而，一些发酵有机体，例如细菌具有更高的发酵温度最佳条件。优选以约IO5至IO12的量，优选是从约IO7至101(1，尤其是约2xl08个活细胞计数/ml发酵液应用酵母或另一种微生物。关于使用酵母用于发酵的另外指导可以发现于，例如“醇教科书(The Alcohol Textbook)”(编辑:里昂(Τ.P.Lyons)和凯尔索尔(D.R.Kelsall)，诺丁汉大学出版社(Nottingham University Press),英国),将其通过引用特此结合。
[0352]发酵刺激剂 可与在此描述的任何方法结合使用以进一步改进发酵过程，并且特别是，改进发酵微生物的性能，例如，提高速度和乙醇产率。“发酵刺激剂”是指用于发酵微生物，特别是酵母的生长的刺激剂。优选的用于生长的发酵刺激剂包括维生素和矿物质。维生素的实例包括多种维生素、生物素、泛酸盐(酯)、烟酸、内消旋肌醇、硫胺素、吡哆素、对氨基苯酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E，例如参见阿芬诺尔(Alfenore)等人，“通过在补料分批过程期间维生素进料策略改进乙醇生产和酿酒酵母活力(Improving ethanolproduction and viability of Saccharomyces cerevisia by a vitamin feedingstrategy during fed-batch process)”,施普林格出版社(Springer-Verlag) (2002),将其通过引用特此结合。矿物质的实例包括可以供应包含P、K、Mg、S、Ca、Fe、Zn、Mn和Cu营养素的矿物质和矿物盐。
[0353]发酵产物:发酵产物可以是衍生自发酵的任何物质。发酵产物可以是，而不局限于一种醇(例如阿拉伯糖醇、正丁醇、异丁醇、乙醇、甘油(glycerol)、甲醇、乙二醇、1，3-丙二醇[丙二醇]、丁二醇、甘油(glycerin)、山梨醇和木糖醇)；一种烷烃(例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、和十二烷)；一种环烷(例如环戊烷、环己烷、环庚烷、和环辛烷)，一种烯烃(例如戊烯、己烯、庚烯、和辛烯)；一种氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、和苏氨酸);一种气体(例如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(C02)、和一氧化碳(CO));异戊二烯；一种酮(例如丙酮)；一种有机酸(例如乙酸、醋酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2，5- 二酮-D-葡糖酸、甲酸、富马酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸、和木糖酸)；以及聚酮化合物。发酵产物还可以是作为高价值产物的蛋白。
[0354]在一个优选的方面，发酵产物是一种醇。将理解，术语“醇”涵盖含有一个或多个羟基部分的物质。在一个更优选的方面，醇是正丁醇。在另一个更优选的方面，醇是异丁醇。在另一个更优选的方面，醇是乙醇。在另一个更优选的方面，醇是甲醇。在另一个更优选的方面，醇是阿拉伯糖醇。在另一个更优选的方面，醇是丁二醇。在另一个更优选的方面，醇是乙二醇。在另一个更优选的方面，醇是甘油(glycerin)。在另一个更优选的方面，醇是甘油(glycerol)。在另一个更优选的方面，醇是1，3_丙二醇。在另一个更优选的方面，醇是山梨醇。在另一个更优选的方面，醇是木糖醇。参见例如宫(Gong)等人，1999，;来自可再生资源的乙醇生产，《生物化学工程/生物技术进展》(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology),谢佩尔(Scheper, Τ.)编辑，Springer-Verlag Berlin Heidelberg 公司,德国，65:207-241 ;西尔韦拉(Silveira)和乔纳斯(Jonas)，2002，山梨醇的生物技术生产(The biotechnological production of sorbitol),《应用微生物学与生物技术》(Appl.Microbiol.Biotechnol.) 59:400-408 ;尼格姆(Nigam)和辛格(Singh), 1995,用于发酵生
产木糖醇的过程-糖取代(Processes for fermentative production of xylitol - a
sugar substitute),《过程生物化学》(Process Biochemistry) 30 (2): 117-124 ;埃策吉(Ezeji)等人，2003，用拜氏梭菌BAlOl生产丙酮、丁醇和乙醇和通过气体汽提进行原位回收(Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckiiBAlOland in situ recovery by gas stripping),《世界微生物学与生物技术杂志》(WorldJournal of Microbiology and Biotechnology) 19 (6):595-603。
[0355]在另一个优选的方面，发酵产物是一种烷烃。烷烃可以是无支链的或分支的烷烃。在另一更优选的方面，烷烃是戊烷。在另一更优选的方面，烷烃是己烷。在另一更优选的方面，烷烃是庚烷。在另一更优选的方面，烷烃是辛烷。在另一更优选的方面，烷烃是壬烷。在另一更优选的方面，烷烃是癸烷。在另一更优选的方面，烷烃是十一烷。在另一更优选的方面，烷烃是十二烷。
[0356]在另一优选的方面，发酵产物是环烷。在另一更优选的方面，环烷是环戊烷。在另一更优选的方面，环烷是环己烷。在另一更优选的方面，环烷是环庚烷。在另一更优选的方面，环烷是环辛烷。
[0357]在另一优选的方面，发酵产物是烯烃。烯烃可以是无支链的或分支的烯烃。在另一更优选的方面，烯烃是戊烯。在另一更优选的方面，烯烃是己烯。在另一更优选的方面，烯烃是庚烯。在另一更优选的方面，烯烃是辛烯。
[0358]在另一优选的方面，发酵产物是氨基酸。在另一更优选的方面，有机酸是天冬氨酸。在另一更优选的方面，氨基酸是谷氨酸。在另一更优选的方面，氨基酸是甘氨酸。在另一更优选的方面，氨基酸是赖氨酸。在另一更优选的方面，氨基酸是丝氨酸。在另一更优选的方面，氨基酸是苏氨酸。参见例如理查德(Richard)和马加里蒂(Margaritis),2004，用于聚(谷氨酸)生产和其他微生物生物聚合物的分批发酵动力学的实验建模(Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid)production and other microbial biopolymers),《生物技术和生物工程》(Biotechnologyand Bioengineering) 87 (4):501-515。
[0359]在另一优选的方面，发酵产物是气体。在另一更优选的方面，气体是甲烷。在另一更优选的方面，气体是h2。在另一更优选的方面，气体是co2。在另一更优选的方面，气体是CO。参见例如片网(Kataoka)等人，1997，关于通过产氢气厌氧细菌的连续培养系统的氢气生产的石开究(Studies on hydrogen production by continuous culture systemof hydrogen-producing anaerobic bacteria),〈〈7jC科学与技术〉〉(Water Science andTechnology) 36 (6-7):41-47 ；以及古那森兰(Gunaseelan), 1997,《生物质与生物能源》(Biomass and Bioenerg) 13, (1-2):83-114,用于甲烧生产的厌氧消化:一篇综述(Anaerobic digestion of biomass for methane production:A review)。
[0360]在另一优选的方面，发酵产物是异戊二烯。
[0361]在另一优选的方面，发酵产物是酮。将理解，术语“酮”涵盖含有一个或多个酮部分的物质。在另一更优选的方面，酮是丙酮。参见例如库雷希(Qureshi)和布拉舍克(Blaschek), 2003，同上。
[0362] 在另一优选的方面，发酵产物是有机酸。在另一更优选的方面，有机酸是乙酸。在另一更优选的方面，有机酸是醋酮酸。在另一更优选的方面，有机酸是己二酸。在另一更优选的方面，有机酸是抗坏血酸。在另一更优选的方面，有机酸是柠檬酸。在另一更优选的方面，有机酸是2，5- 二酮-D-葡糖酸。在另一更优选的方面，有机酸是甲酸。在另一更优选的方面，有机酸是富马酸。在另一更优选的方面，有机酸是葡糖二酸。在另一更优选的方面，有机酸是葡糖酸。在另一更优选的方面，有机酸是葡糖醛酸。在另一更优选的方面，有机酸是戊二酸。在另一更优选的方面，有机酸是3-羟基丙酸。在另一更优选的方面，有机酸是衣康酸。在另一更优选的方面，有机酸是乳酸。在另一更优选的方面，有机酸是苹果酸。在另一更优选的方面，有机酸是丙二酸。在另一更优选的方面，有机酸是草酸。在另一更优选的方面，有机酸是丙酸。在另一更优选的方面，有机酸是琥珀酸。在另一更优选的方面，有机酸是木糖酸。参见例如陈(Chen)和李(Lee)，1997，用于从纤维素生物质生产乳酸的膜介导的抽提发酵(Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid productionfrom cellulosic biomass)《应用生物化学与生物技术》(Appl.Biochem.Biotechnol.),63-65:435-448 ο
[0363]在另一优选的方面，发酵产物是聚酮化合物。
[0364]回收。可以使用本领域已知的任何方法，包括但不局限于色谱法、电泳程序、溶解度差异、蒸馏、或提取，从发酵培养基任选地回收这一种或多种发酵产物。例如，从发酵的纤维素材料分离醇，并且通过蒸馏的常规方法进行纯化。可以获得具有高达约96vol.%的纯度的乙醇，这可以用作例如燃料乙醇、引用乙醇，即饮用中性乙醇、或工业乙醇。
[0365]植物[0366]本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，该分离的植物包含本发明的多核苷酸，以用来按可回收的量表达并且产生嵌合β_葡糖苷酶或其变体。可以从植物或植物部分回收嵌合β_葡糖苷酶或其变体。可替代地，可以像这样使用含有嵌合β -葡糖苷酶或其变体的植物或植物部分，以改进食品或饲料的质量，例如改进营养价值，适口性和流变性质，或破坏抗营养因子。
[0367]转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，例如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium);温带草例如剪股颖属(Agrostis)和谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。
[0368]双子叶植物的实例是烟草，豆类，例如羽扇豆、马铃薯、甜菜、豌豆、菜豆和大豆，以及十字花的植物(十字花科)、例如花椰菜、油菜籽，以及紧密相关的模式生物拟南芥。
[0369]植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎连同包含这些部分的单个组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定的植物细胞区室，例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也被认为是植物部分。此外,任何植物细胞，无论组织来源，也被认为是植物部分。同样，植物部分，例如分离以促进本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
[0370]还包括在本发明的范围内的是这类植物、植物部分、和植物细胞的后代。
[0371]表达本发明嵌合β -葡糖苷酶或其变体的转基因植物或植物细胞的构建可根据本领域已知的方法进行。简言之，通过将一个或多个(例如若干个)编码嵌合β_葡糖苷酶或其变体的表达构建体并入该植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并使所得经过修饰的植物或植物细胞繁殖到转基因植物或植物细胞中来构建该植物或植物细胞。
[0372]该表达构建体便利地为一种核酸构建体，该核酸构建体包含了对嵌合β -葡糖苷酶或其变体进行编码的多核苷酸，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达多核苷酸所需的适当调节序列是可操作地连接的。此外，该表达构建体可以包含一种适用于对已经整合入该表达构建体的植物细胞进行鉴别的选择性标记，及将该构建体引入所讨论的植物中必需的DNA序列(后者取决于打算使用的DNA引入方法)。
[0373]调节序列(例如启动子和终止子序列及可任选地信号或转运序列)的选择是例如基于希望在何时、在何处并且如何表达嵌合葡糖苷酶或其变体来确定。例如，编码嵌合β_葡糖苷酶或其变体的基因的表达可以是组成性的或可诱导的，或可以为发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，例如种子或叶。调节序列是例如由塔格(Tague)等人，1988,《植物生理学》(Plant Physiology)86:506描述的调节序列。
[0374]对于组成性表达,可以使用35S_CaMV、玉蜀黍泛素1、和水稻肌动蛋白I启动子(弗兰克(Franck)等人，1980,《细胞》(Cell) 21: 285-294 ;克里斯滕森(Christensen)等人，1992，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.) 18:675-689 ;&(Zhang)等人，1991，《植物细胞》(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是以下各项的启动子，例如来自贮藏库组织(例如种子、马铃薯块莖、和果实)(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi), 1990,《遗传学年鉴》(Ann.Rev.Genet.) 24:275-303),或来自代谢库组织(例如分生组织)(伊藤(Ito)等人，1994，《植物分子生物学》(Plant Mol.Biol.)24:863_878)，种子特异性启动子，例如来自水稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白、或白蛋白启动子(吴(Wu)等人，1998，《植物与细胞生理学》(Plant Cell Physiol.) 39:885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆启动子和来自蚕豆的未知的种子蛋白基因(康拉德(Conrad)等人，1998,《植物生理学杂志》(J.PlantPhysiol.) 152:708-711 )，来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人，1998，《植物与细胞生理学》(Plant Cell Physiol.) 39:935-941),来自欧洲油菜的忙藏蛋白napA启动子，或本领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在W091/14772中所述的。此外，启动子可以是叶特异性启动子，例如来自水稻或番爺的rbcs启动子(Kyozuka (京冢)等人，1993，Plant Physiol.(植物生理学))，102:991-1000)，小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra (密特拉)和Higgins (希金斯)，1994，Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)26:85-93)，来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya (加贺)等人，1995，Mol.Gen.Genet.(分子和普通遗传学)248:668-674)，或伤口可诱导的启动子，例如马铃薯pin2启动子(Xu (徐)等人，1993，Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)22:573-588)。同样，启动子可通过非生物处理，例如温度、干旱、或盐度变化来诱导，或通过外源施加激活启动子的物质，例如乙醇，雌激素，植物激素例如乙烯、脱落酸、和赤霉酸、以及重金属来诱导。
[0375]还可以使用启动子增强子元件来实现嵌合β -葡糖苷酶或其变体在该植物中的更高表达。例如，该启动子增强子元件可以是放置在该启动子与编码嵌合葡糖苷酶或其变体的多核苷酸之间的一个内含子。例如Xu (徐)等人，1993，同上，披露了使用水稻肌动蛋白I基因的第一内含子来增强表达。
[0376]该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。
[0377]可以根据本领域已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括土壤杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser (加塞尔)等人，1990, Science (科学)244:1293 ；Potrykus (波特里库斯),1990, Bio/Technology (生物 / 技术)8:535 ;Shimamoto (岛本)等人，1989, Nature (自然)338:274)。
[0378]根癌土壤杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(有关评述，参看Hooykas (霍伊卡)和Schilperoort (斯查拍特)，1992,Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)19:15-38)和用于转化单子叶植物的方法，尽管其他转化方法也可以用于这些植物。用于产生转基因单子叶植物的一个方法是胚性愈伤组织或发育的胚的粒子轰击(用转化DNA包被的微观金或钨颗粒)(Christou (克里斯托)，1992，Plant J.(植物杂志)2:275-281 ;Shimamoto (岛本)，1994,Curr.0pin.Biotechnol.(生物技术新见)5:158-162 ;Vasil (瓦西尔)等人，1992, Bio/Technology (生物 / 技术)10:667-674)。如 Omirulleh (奥米如列)等人，1993, Plant Molecular Biology(植物分子生物学)21:415-428中所述,单子叶植物转化的替代方法基于原生质体转化。另外的转化方法包括美国专利号6，395，966和7，151，204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。
[0379]在转化之后，根据本领域中众所周知的方法对并入了该表达构建体的转化体进行选择并且使其再生成为完整植物。通常转化程序被设计成通过使用例如用两种分开的T-DNA构建体共转化或通过特异性重组酶进行的选择基因的位点特异性切除，在再生期间或在后代中选择性清除选择基因。
[0380]除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码嵌合β-葡糖苷酶或其变体的构建体引入具体植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包含根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7，151，204 中。
[0381]可以通过回交转换过程产生植物。例如，植物包括被称为回交转换的基因型、系、近交、或杂交的植物。
[0382]遗传标记可以用于协助将本发明的一种或多种转基因从一种遗传背景渗入到另一种遗传背景中。相对于常规育种，标记辅助选择提供了很多优点，其中它可以用于避免由表型变异引起的错误。此外，遗传标记可以提供关于具体杂交的个体后代中的精英种质的相对程度的数据。例如，当具有希望的性状(否则会具有非农艺学上希望的遗传背景)的植物与精英亲本杂交时，遗传标记可以用于选择不仅拥有感兴趣的性状、而且还具有较大比例的希望的种质的后代。以此方式，将一个或多个性状渗入具体的遗传背景所需的世代数被最小化。
[0383]本发明还涉及产生本发明的嵌合葡糖苷酶或其变体的方法，这些方法包括Ca)在有益于产生嵌合β -葡糖苷酶或其变体的条件下培养一个转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含了编码嵌合β_葡糖苷酶或其变体的多核苷酸；并且(b)回收嵌合β-葡糖苷酶或其变体。
[0384]以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
[0385]实例
[0386]质粒和株系
[0387]将质粒pDFngll6 (SEQ ID NO:9)用作编码棘孢曲霉家族3Aβ -葡糖苷酶的DNA来源。将质粒pAG114 (SEQ ID NO: 10)用作编码烟曲霉家族3Α β -葡糖苷酶的DNA来源。将米曲霉JaL250株系(W099/61651)用于表达嵌合β -葡糖苷酶活性和其变体。
[0388]培养基
[0389]PDA板由39克马铃薯右旋糖琼脂和加至I升的去离子水组成。
[0390]MDU2BP培养基由以下组成:45g的麦芽糖、Ig的MgSO4.7H20、lg的NaCl、2g的K2SO4U2g的KH2P04、7g的酵母提取物、2g的脲、0.5ml的AMG痕量金属溶液，以及去离子水补足I升，pH至5.0。
[0391]AMG 痕量金属溶液由以下组成:14.3g 的 ZnSO4.7Η20、2.5g 的 CuSO4.5Η20、0.5g 的NiCl2.6Η20、13.8g 的 FeSO4.7Η20、8.5g 的 MnSO4.H20、3g 的柠檬酸，以及去离子水补足 I升。
[0392]实例1:棘孢曲霉GH3A β -葡糖苷酶和烟曲霉GH3A β -葡糖苷酶的制备和纯化
[0393] 根据W02011/057140制备图1A和IB中示出的棘孢曲霉GH3Aβ -葡糖苷酶(SEQID NO:1 [DNA序列]和SEQ ID NO: 2 [推导的氨基酸序列])。根据美国专利号7，244，605制备图2Α和2Β中示出的烟曲霉6Η3Αβ-葡糖苷酶(SEQ ID NO:3[DNA序列]和SEQ IDN0:4[推导的氨基酸序列])。使用微量滴定板BCA?蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔科学(Thermo Fischer Scientific)公司，沃尔瑟姆(Waltham),马萨诸塞州，美国)确定蛋白浓度，其中将牛血清白蛋白用作蛋白标准。
[0394]将含有烟曲霉GH3Ai3 -葡糖苷酶或棘孢曲霉GH3Ai3 -葡糖苷酶的培养液上清进行浓缩，并且使用ECONOPAC? IODG柱(Bio-Rad Laboratories公司，赫拉克勒斯(Hercules)加利福尼亚州，美国)进行脱盐，该柱用含有IOOmM NaCl的50mM乙酸钠pH5平衡。
[0395]实例2:烟曲霉GH3A β -葡糖苷酶和棘孢曲霉GH3A β -葡糖苷酶嵌合多肽的构建
[0396]将具有β-葡糖苷酶活性的由烟曲霉GH3Ai3-葡糖苷酶和棘孢曲霉GH3Ai3-葡糖苷酶片段组成的嵌合多肽构建并且表达在米曲霉JaL250中。β-葡糖苷酶嵌合多肽由三个不同片段的烟曲霉GH3Ai3 -葡糖苷酶和棘孢曲霉GH3Ai3 -葡糖苷酶组成。第一 GH3A片段含有棘孢曲霉GH3Ai3-葡糖苷酶的SEQ ID NO: 2的氨基酸I至404(氨基酸I至19为信号肽)，第二 GH3A片段含有烟曲霉GH3Ai3-葡糖苷酶的SEQ ID NO:4的氨基酸406至589，并且第三GH3A片段含有棘孢曲霉6Η3Αβ-葡糖苷酶的SEQ ID NO: 2的氨基酸589至860。
[0397]从质粒PAG114对编码第一和第三片段的多核苷酸进行PCR扩增(图3)，并且从质粒pDFngll6对编码第二片段的多核苷酸进行PCR扩增(图4)。然后根据朱(Zhu)等人，2007，《生物技术》(BioTechniques)43:354-359的方法，使用IN-FUS10N?优势PCR克隆试剂盒(Advantage PCR Cloning Kit,Clontech Laboratories公司，山景城,加利福尼亚州,美国)，将第一、第二、和第三β -葡糖苷酶多肽片段的PCR扩增的部分同时亚克隆至用PacI和Nco I切开缺口的质粒pAlLo2 (W02004/099228)。设计了以下示出的引物来从编码棘孢曲霉GH3Ai3 -葡糖苷酶的质粒PAG114中的多核苷酸的5’端扩增第一多肽片段的多核苷酸。
[0398]正向引物(610232):
[0399]5’-Atacacaactggatttacatgaagctcagttggcttgaggc-3’ (SEQ ID NO:11)
[0400]反向引物(69937):
[0401]5’-AAGAGCACCCGTGTTCTTCAGTAGAACAGTACTGTCTGC-3’ (SEQ ID NO:12)
[0402]引物610232被设计为启动质粒PAlLo2上的唯一 Nco I限制性内切酶位点的18bp上游和对应棘孢曲霉GH3Ai3 -葡糖苷酶的氨基酸1-8的23个核苷酸。引物69937被设计为:除了含有对应于烟曲霉GH3Ai3-葡糖苷酶的氨基酸406-410的15bp区域，还含有对应于棘孢曲霉GH3Ai3 -葡糖苷酶的氨基酸397-404的24bp区域。
[0403]设计了以下示出的引物来从编码烟曲霉GH3Ai3 -葡糖苷酶的质粒pDFngll6扩增第二多肽片段的多核苷酸。
[0404]正向引物(69938):
[0405]5’-Actgttctactgaagaacacgggtgctcttcctttgacc-3’ (SEQ ID NO:13)
[0406]反向引物(69939):
[0407]5’-GCCCGGGTTGACGCGGCCATAGAGCACGTCGACCAGGGA-3’
[0408](SEQ ID NO: 14)
[0409]引物69938被设计为:除了含有编码烟曲霉GH3A β -葡糖苷酶的氨基酸406-410的24bp区域，还含有编码棘孢曲霉GH3A0 -葡糖苷酶的氨基酸399-404的15bp区域。引物69939被设计为:除了含有编码棘孢曲霉6Η3Αβ-葡糖苷酶的氨基酸585-589的15bp区域，还含有编码烟曲霉GH3A β -葡糖苷酶的氨基酸582-589的24bp区域。
[0410]设计了以下示出的引物来从编码棘孢曲霉GH3A0 -葡糖苷酶的质粒pAG114扩增第三多肽片段的多核苷酸。
[0411]正向引物(69940):
[0412]5’-Gacgtgctctatggccgcgtcaacccgggcgccaaatct-3’ (SEQ ID NO:15)
[0413]反向引物(69941):
[0414]5’-GTCAGTCACCTCTAGTTAATTAATTATTGCACCTTCGGGAGCGCC GCGTG-3’ (SEQ IDNO:16)
[0415]引物69940被设计为:除了含有对应于棘孢曲霉GH3Ai3 -葡糖苷酶的氨基酸589-596的24bp区域，还含有编码烟曲霉GH3A β -葡糖苷酶的氨基酸585-589的15bp区域。弓丨物69941被设计为:除了含有包括Pac I限制性内切酶位点和来自质粒PAlLo2的AMG终止子的5’端的23bp区域，还含有对应于棘孢曲霉6Η3Αβ-葡糖苷酶的氨基酸852-860的27bp区域。
[0416]
【权利要求】
1.一种具有β-葡糖苷酶活性的分离的嵌合多肽，包括: (a)在该嵌合多肽N末端的一个第一多肽片段，选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO: 2的氨基酸20至404具有至少60% —致性的一个多肽片段；(ii)由在至少低严谨度条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸131至1455或其cDNA序列杂交、或者与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一个多肽片段；(iii)由与SEQ ID NO:1的核苷酸131至1455或其cDNA序列具有至少60%—致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iv) —个多肽片段，包括SEQ ID NO:2的氨基酸20至404或由其组成； (b)在该第一多肽片段C末端的一个第二多肽片段，选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO:4的氨基酸406至589具有至少60% —致性的一个多肽片段；(ii)由在至少低严谨度条件下与SEQ ID NO: 3的核苷酸1570至2184或其cDNA序列杂交、或者与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一个多肽片段；(iii)由与SEQ ID NO:3的核苷酸1570至2184或其cDNA序列具有至少60% —致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iv) 一个多肽片段，包括SEQ ID NO: 4的氨基酸406至589或由其组成；以及 (c)在该第二多肽片段C末端的一个第三多肽片段，选自下组，该组由以下各项组成:(i)与SEQ ID NO:2的氨基酸589至860具有至少60%—致性的一个多肽片段；(ii)由在至少低严谨度条件下与SEQ ID NO:1的核苷酸2072至2937或其cDNA序列杂交、或者与前两者的全长互补体杂交的多核苷酸编码的一个多肽片段；(iii)由与SEQ ID NO:1的核苷酸2072至2937或其cDNA序列具有至少60% —致性的多核苷酸编码的一个多肽片段；以及(iv) 一个多肽片段，包括SEQ ID NO:2的氨基酸589至860或由其组成。
2.如权利要求1所述的嵌合多肽，它包括以下或由以下组成:SEQIDNO:2的氨基酸20至404作为在该嵌合多肽N-末端的该第一多肽片段，SEQID NO:4的氨基酸406-589作为在该第一多肽片段C-末端的该第二多肽片段，以及SEQ ID NO: 2的氨基酸589至860作为在该第二多肽片段C-末端的该第三多肽片段。
3.如权利要求1所述的嵌合多肽，它包括SEQID NO:6的成熟多肽或由其组成。
4.如权利要求1-3中任一项所述的嵌合多肽，进一步包括在对应于SEQIDNO:6的成熟多肽的位置455和511的一个或两个位置处的一个取代，其中该变体具有β -葡糖苷酶活性。
5.如权利要求4所述的嵌合多肽，其中该亲本β-葡糖苷酶是 (a)与SEQID NO: 6的成熟多肽具有至少60%序列一致性的一种多肽； (b)由在至少低严谨度条件下与以下项杂交的多核苷酸编码的一种多肽:(i)SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列，(ii)在SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列中含有的cDNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全长互补体； (c)由与SEQID NO: 5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60%序列一致性的多核苷酸编码的一种多肽； (d)包括SEQID NO:6的成熟多肽或由其组成的一种多肽；或者 (e)SEQ ID NO:6的成熟多肽的一个片段，它具有β-葡糖苷酶活性。
6.如权利要求4或5所述的嵌合多肽，包括取代Ν455Ε和F511Y的一个或两个。
7.如权利要求1-6中任一项所述的嵌合多肽,进一步包括一个在该第一多肽片段N-末端的信号肽。
8.如权利要求37所述的嵌合多肽，其中该信号肽是SEQID NO: 2或SEQ ID NO: 4的信号肽。
9.一种分离的多核苷酸,该多核苷酸编码如权利要求1-8中任一项所述的嵌合多肽。
10.一种产生具有β-葡糖苷酶活性的嵌合多肽的方法，包括: (a)在适合表达该嵌合多肽的条件下,培养包含如权利要求9所述的多核苷酸的一种宿主细胞；并且任选地 (b)回收该嵌合多肽。
11.用如权利要求9所述的多核苷酸转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞。
12.—种产生如权利要求1-8中任一项所述的嵌合多肽的方法,包括: (a)在有益于产生该嵌合多肽的条件下，培养包含编码该嵌合多肽的多核苷酸的一种转基因植物或植物细胞；并且任选地 (b)回收该嵌合多肽。
13.一种用于降解或转化纤维素材料的方法，包括:在如权利要求1-8中任一项所述的嵌合多肽的存在下，用一种酶组合物处理该纤维素材料。
14.如权利要求13所述的方法，进一步包括回收降解的纤维素材料。
15.一种用于产生一种发酵产物的方法，包括: (a)在如权利要求1-8中任一项所述的嵌合多肽的存在下，用一种酶组合物对一种纤维素材料进行糖化； (b)用一种或多种(例如若干种)发酵微生物对糖化的纤维素材料进行发酵，以产生该发酵产物；并且 (c)从该发酵中回收该发酵产物。
16.—种对纤维素材料进行发酵的方法,包括:用一种或多种(例如若干种)发酵微生物对该纤维素材料进行发酵，其中该纤维素材料是在如权利要求1-8中任一项所述的嵌合多肽的存在下用酶组合物糖化的。
17.如权利要求16所述的方法,其中对该纤维素材料进行的该发酵产生一种发酵产物。
18.如权利要求17所述的方法，进一步包括从该发酵中回收该发酵产物。
19.全发酵液配制品或细胞培养组合物，包括如权利要求1-8中任一项所述的嵌合多肽。
【文档编号】C07K14/435GK103930438SQ201280047784
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2011年9月30日
【发明者】M.沃格里斯, D.奥斯伯恩, T.休 申请人:诺维信股份有限公司