串联fc双特异性抗体的制作方法

串联fc双特异性抗体的制作方法
【专利摘要】本文中提供了串联Fc和串联Fc抗体(“TFcA”)，例如串联Fc双特异性抗体(“TFcBA”)，其包含一个或至少两个特异性结合一个或多个细胞表面受体的结合位点。所述结合位点经由TFc连接，所述TFc包含第一Fc区和第二Fc区，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区经由TFc接头连接以形成连续多肽并且二聚以形成Fc二聚体。示例性TFcBA抑制经由TFcBA结合位点特异性细胞表面受体进行的信号转导。
【专利说明】串联FC双特异性抗体
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2011年8月26日提交的美国临时申请号61/527,802的优先权。在允许的情况下，上述申请出于任何及所有目的以全文引用的方式并入。
[0003]背景
[0004]已确定肿瘤细胞表达能刺激细胞增殖的生长因子和细胞因子的受体，且此外，针对这些受体的抗体可。有效阻断由生长因子和细胞因子介导的细胞增殖刺激以抑制肿瘤细胞生长。靶向癌细胞上的受体的市售治疗性抗体包括例如用于治疗乳腺癌的曲妥珠单抗(trastuzumab) (Herceptirr.!?),其靶向HER2受体(也称为ErbB2);及用于治疗结肠直肠癌
和头颈癌的西妥昔单抗(cetuximab) (Erbitux?),其靶向表皮生长因子受体(EGFR，也称为HERl 或 ErbBl)。
[0005]尽管这种施用仅包含单一治疗性单克隆抗体的治疗剂的方法(当在不施用另一种治疗性抗体的情况下施用时，在本文中称为单疗法)已经显示出在癌症治疗方面相当成功，但存在许多可能导致这种治疗失败或在初步抑制后发生肿瘤生长复发的因素。举例来说，某些肿瘤依赖于多于一种生长因子介导的细胞增殖信号转导途径，且因而靶向单一途径可能被证实不足以显著影响肿瘤细胞生长。换句话说，即使在一种途径为唯一或主要生长刺激途径的情况下，某些肿瘤细胞也能够在原始途径被抗体阻断时激活另一种信号传导途径以进行生长刺激(先天性治疗抗性)。更进一步，一些肿瘤对抗体单疗法展现出初步反应，但稍后通过切换到使用另一种信号传导途径而发展出治疗抗性(获得型治疗抗性)。
[0006]因此，需要用于癌症治疗的其它治疗方法以克服抗体单疗法的限制并且提供其它益处。
`[0007]概述
[0008]本文中提供了经过工程改造的抗体，如串联Fe抗体(“TFcA” )。示例性TFcA为串联Fe双特异性抗体(TFcBA)。TFcBA包含串联Fe，所述串联Fe为包含第一 Fe区和第二Fe区的多肽部分，所述第一 Fe区和第二 Fe区各自具有C末端和N末端；所述第一 Fe区和所述第二 Fe区经由具有C末端和N末端的TFc接头连接为单一多肽链(即，所述第一 Fe区的C末端被肽键连接至所述TFc接头的N末端，所述TFc接头的C末端又被肽键连接至所述第二 Fe区的N末端)。TFcBA可以包含至少两个结合位点(至少一个第一结合位点和一个第二结合位点)。这些结合位点各自特异性结合到细胞表面受体的特定部分。示例性细胞表面受体为由癌细胞表达或过度表达的细胞表面受体。示例性结合位点包括能免疫特异性结合到细胞表面受体的细胞外域的来源于抗体的结合位点。TFcA或TFcBA的第一或第二结合位点可以特异性结合从由以下各项组成的群组中选出的人类受体蛋白:ErbB2、ErbB3 (例如US7, 846，440中所描述的结合位点)、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、c-Met、EGFR、VEGFRl、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α 和 β )、c_Kit、EPCAM 以及 EphA2。通常，这种结合将对受体蛋白的细胞外部分具有特异性。在本文中所公开的某些实施方案中，TFcBA所包含的至少两个结合位点之一是c-Met特异性结合位点,例如抗c_Met Fab或抗cMet ScFv0在某些例示的实施方案中，提供了一种TFcBA,其包含单一抗c-Met结合位点和至少一个不结合c-Met的第二结合位点，例如ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、EGFR、VEGFRl、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR (α 和 β )、c_Kit、EPCAM 以及EphA2特异性结合位点,其中所述抗c-Met结合位点与所述第二结合位点经由TFc连接以形成连续多肽。提供了 TFcBA，所述TFcBA结合单一受体上的两个表位(例如细胞外表位)或两种不同的细胞表面受体，并且在所述结合后强烈抑制由TFcBA所结合的至少一个细胞表面受体的同源配体在正常情况下刺激的信号转导。举例来说，抗c-Met+抗EGFRTFcBA可以抑制由肝细胞生长因子(HGF，C-met的同源配体)和表皮生长因子(EGF，EGFR的同源配体)中的任一者或两者诱导的信号转导，或抗c-Kit+抗RON TFcBA可以抑制由巨噬细胞刺激蛋白(RON的同源配体)和干细胞因子(c-Kit的同源配体)中的任一者或两者诱导的信号转导，或抗c-Met+抗EPCAMTFcBA可以抑制由HGF诱导的信号转导；如对配体诱导的受体磷酸化(即，受TFcBA抑制的信号转导)的抑制所指示，各所述抑制的IC50等于或小于IOnM,或者等于或小于InM,或者等于或小于IOOpM,或其最大抑制百分比为至少70%或至少80%或至少90%。在某些实施方案中，TFcBA在细胞中的表达产生(i)更多(即，更大百分比的)正确形成的TFcAB分子，相对于结合相同受体但不包含TFc的多价抗体的表达而言；或(ii)超过80%正确形成的TFcAB分子，如通过例如尺寸排除色谱法(SEC)所确定。
[0009]本文中还提供了 Ab，所述Ab为TFcBA，其中所述TFcBA包含第一结合位点和第二结合位点，其中所述第一结合位点结合第一标靶且所述第二结合位点结合第二标靶，并且其中Q)所述第一结合位点和所述第二结合位点经由TFc连接；(ii)所述TFc包含第一 Fe区和第二 Fe区，所述第一 Fe区和第二 Fe区各自具有C末端和N末端；(iii)所述第一 Fe区和所述第二 Fe区经由具有C末端和N末端的TFc接头连接，以形成连续多肽；(iv)所述第一 Fe区与所述第二 Fe区缔合(结合)以形成Fe 二聚体；并且(V)所述第一 Fe区和所述第二 Fe区中的任一者或两者包含一个或多个氨基酸(aa)修饰以增强或稳定所述第一 Fe区与所述第二 Fe区之间的结合。所述TFcBA可以抑制经由所述第一标靶和所述第二标靶中的任一者或两者进行的信号转导。在某些实施方案中，TFcBA在宿主细胞中在表达产生(i)更多正确形成的TFcAB分子，相对于在结合(多个)相同受体但不包含TFc的多价抗体的匹配宿主细胞中的表达而言；或(ii)超过80%正确形成的TFcBA分子，如通过例如SEC所确定。
`[0010]本文中还提供了单价串联FC抗体(TFcA)。单价TFcA可以包含结合一个标靶的单一结合位点，其中所述结合位点连接至包含第一 Fe区和第二 Fe区的TFc，所述第一 Fe区和第二 Fe区各自各自具有C末端和N末端；且其中(i)所述第一 Fe区和所述第二 Fe区经由具有C末端和N末端的TFc接头而连接，以形成连续多肽；(ii)所述第一 Fe区和所述第二Fe区缔合以形成Fe 二聚体；并且(iii)所述第一 Fe区和所述第二 Fe区中的任一者或两者包含一个或多个aa修饰以增强或稳定所述第一 Fe区与所述第二 Fe区之间的结合。所述单价TFcA可以抑制经由所述标靶进行的信号转导。在某些实施方案中，单价TFcA在宿主细胞中的表达产生(i)更多正确形成的TFcA分子，相对于在不包含TFc的抗体的匹配宿主细胞中的表达而言；或(ii)超过80%正确形成的TFcA分子，如通过例如SEC所确定。
[0011]TFcA (如TFcBA)所包含的TFc的第一 Fe区和第二 Fe区分别可以包含第一 CH3域和第二 CH3域，各所述CH3域具有C末端和N末端。TFcA所包含的TFc的第一 Fe区和第二Fe区分别可以包含第一 CH2域和第二 CH2域，各所述CH2域具有C末端和N末端。TFcA所包含的TFc的第一 Fe区和第二 Fe区分别可以包含第一铰链和第二铰链，所述第一铰链和所述第二铰链各自具有C末端和N末端。在某些实施方案中，所述第二铰链不包含上铰链亚域。TFcA中所包含的TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含:第一 CH2域、第一 CH3域、TFc接头、第二 CH2域以及第二 CH3域。TFcA中所包含的TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、TFc接头、第二 CH2域以及第二 CH3域。TFcA中所包含的TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、TFc接头、第二铰链、第二 CH2域以及第二 CH3域。所述第一铰链可以包含上铰链亚域、核心铰链亚域以及下铰链亚域，且所述第二铰链可以包含核心铰链亚域和下铰链亚域，但不包含上铰链亚域，各所述铰链亚域具有C末端和N末端。TFcA所包含的TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链，所述第一铰链在其C末端处连接至第一 CH2域的N末端，所述第一 CH2域在其C末端处连接至第一 CH3域的N末端，所述第一 CH3域在其C末端处连接至TFc接头的N末端，所述TFc接头在其C末端处连接至第二铰链的N末端，所述第二铰链在其C末端处连接至第二 CH2域的N末端，所述第二 CH2域在其C末端处连接至第二 CH3域的N末端。
[0012]TFcA所包含的TFc的TFc接头可以包含20到50个aa。TFc接头可以是Gly-Ser接头，如(Gly4Ser)n，其中η为4、5、6、7或8。TFc接头还可以包含与Gly-Ser接头的aa序列具有至少约70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或与其在至多20、15、10、5、4、3、2或I个aa添加、缺失或取代方面不同的aa序列。
[0013]TFcA 的 TFc 可以是 IgGlTFc。TFc 可以是杂合 TFc,例如 IgGl/IgG4 杂合 TFc。TFcA的TFc可以是IgGlTFc并且可以按氨基到羧基末端的顺序包含:第一 IgGl铰链、第一IgGlCH2 域、第一 IgGlCH3 域、TFc 接头、第二 IgGl 铰链、第二 IgGlCH2 域以及第二 IgGlCH3域。杂合TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含:第一 IgGl/IgG4铰链、第一 IgG4CH2域、第一 IgGlCH3域、TFc接头、第二 IgG4铰链、第二 IgG4CH2域以及第二 IgGlCH3域。
[0014]TFc的第一 CH3域和第二 CH3域中的任一者或两者可以包含一个或多个能增强或稳定所述第一 Fe区与所述第·二 Fe区之间的结合的aa修饰，如由例如非变性SDS-Page凝胶上的基本上均匀的产物(或色带)所证明。TFc的第一 CH3域和第二 CH3域各自可以包含氨基酸修饰，所述修饰是能增强第一 CH3域与第二 CH3域的缔合的缔合增强修饰(Association Enhancing Modification, “AEM”)。所述 AEM 可以由从由 AEM 模块 1、AEM模块2、AEM模块3以及AEM模块4组成的群组中选出的模块构成。TFc的第一 Fe区和第二Fe区中的任一者或两者可以包含aa修饰，所述修饰添加半胱氨酸作为插入或置换，所述半胱氨酸与另一个Fe区中的半胱氨酸一起形成二硫键(“DiS”修饰)。TFc的第一 Fe区和第二 Fe区中的任一者或两者可以在铰链中包含DiS修饰。在某些实施方案中，第一 Fe区和第二 Fe区中的任一者或两者在CH3域中包含DiS修饰。所述DiS修饰可以由DiS模块I或DiS模块2构成。TFc的第一 CH3域和第二 CH3域各自可以包含一个或多个AEM修饰和一个或多个DiS修饰。
[0015]TFc的第一 CH3域和第二 CH3域中的任一者或两者所包含的aa序列可以与本文中所提供，例如从由SEQ ID NO:27-98组成的群组中选出的CH3域的aa序列具有至少约70%、80%、90%、95%、97%、98% 或 99% 同一性，或与其在至多 30、25、20、15、10、5、4、3、2 或 I 个aa添加、缺失或取代方面不同。在某些实施方案中，如果CH3域的aa序列不与从由序列群组SEQ ID NO:27-98中选出的序列相同，则CH3域的aa序列仍然包含与其相似的序列的特定AEM和/或DiS。TFc的第一 CH3域或第二 CH3域可以包含本文中所提供，例如从由SEQID NO: 27-98组成的群组中选出的aa序列。TFc的第一 CH3域与第二 CH3域一起可以包含两个不同的成员的配对，各成员是CH3aa序列，各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出:SEQ ID N0:31 和 35;SEQ ID N0:33和37;SEQ ID N0:39和43;SEQ ID NO:41 和 45;SEQ ID NO: 47 和 51 ；SEQ ID NO: 49 和 53 ；SEQ ID NO: 55 和 59 ；SEQ ID NO: 57 和 61 ；SEQ IDN0:63和67;SEQ ID N0:65和69;SEQ ID N0:71 和 73;SEQ ID N0:72和74;SEQ ID NO:75和 79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID N0:84和86;SEQ ID NO: 87 和 89;SEQ ID N0:88 和 90;SEQ ID N0:91 和 93;SEQ ID N0:92 和 94;SEQ ID NO: 95 和 97;以及SEQ ID NO:96和98，各成员aa序列与各所述配对的各序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，或在至多30、25、20、15、10、5、4、3、2或I个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一 CH3域所包含的配对成员与所述第二 CH3域所包含的配对成员不同。TFc的第一 CH3域和第二 CH3域各自所包含的aa序列可以与从由以下各项组成的群组中选出的CH3aa序列配对的一个成员的aa序列相同:SEQ ID N0:31和35;SEQ ID N0:33和37;SEQ ID N0:39和 43;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID N0:47和 51 ；SEQ ID N0:49和 53;SEQ IDN0:55和59;SEQ ID N0:57和61;SEQ ID N0:63和67;SEQ ID N0:65和69;SEQ ID NO:71和 73;SEQ ID N0:72和74;SEQ ID N0:75和79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID NO:83 和 85;SEQ ID NO: 84 和 86 ；SEQ ID NO: 87 和 89 ；SEQ ID NO: 88 和 90 ；SEQ ID NO: 91 和 93 ；SEQ IDNO:92 和 94;SEQ ID NO:95 和 97 ;以及 SEQ ID NO:96 和 98。
[0016]TFc的第一铰链所包含的aa序列可以在至多3、2或I个aa缺失、添加或取代方面与本文中所提供，例如从由SEQ ID N0:4、18、19、20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出的铰链的aa序列不同。TFc的第一铰链所包含的aa序列可以是从由SEQ IDN0:4、18、19、20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列。TFc的第二铰链所包含的aa序列可以在至多3、2或I个aa缺失、添加或取代方面与本文中所提供，例如从由SEQ ID N0:23、24、263-265以及267-273组成的群组中选出的铰链的aa序列不同。第二铰链所包含的aa序列可以是从由SEQ ID NO: 23、24、263_265以及267-273组成的群组中选出的aa序列。·
[0017]TFc的CH2域所包含的aa序列可以与本文中所提供的CH2域的aa序列(例如SEQID N0:25、26、261 或 262)具有至少约 70%、80%、90%、95%、97%、98% 或 99% 同一性或与其在至多30、25、20、15、10、5、4、3、2或I个aa缺失、添加或取代方面不同。
[0018]所述TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、第二铰链、第二 CH2域以及第二 CH3域，其中(i)所述第一铰链所包含的aa序列是从由以下各项组成的群组中选出:SEQ ID N0:4、18、19、263-265以及267-273 ；(ii)所述第一 CH2域经去糖基化且包含如SEQ ID N0:25中所示出的aa序列；(iii)所述第一CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ IDN0:31和35;SEQ ID N0:33和37;SEQ ID N0:39和43;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID NO:47和 51;SEQ ID N0:49 和 53;SEQ ID N0:55 和 59;SEQ ID N0:57 和 61;SEQ ID N0:63 和 67;SEQ ID N0:65和69;SEQ ID N0:71 和 73;SEQ ID N0:72和 74;SEQ ID N0:75和 79;SEQ IDN0:77和81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID N0:84和86;SEQ ID N0:87和89;SEQ ID NO:88和 90;SEQ ID N0:91 和 93;SEQ ID N0:92 和 94;SEQ ID NO: 95 和 97 ;以及 SEQ ID NO:96和98 ； (iv)所述第二铰链所包含的aa序列由从SEQ ID NO: 23,263-265以及267-273组成的群组中选出的序列组成；(ν)所述第二 CH2域经去糖基化且包含如SEQ ID NO:25中所示出的aa序列；并且(vi)所述第二 CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ ID N0:31和35 ；SEQ ID N0:33和37 ；SEQ ID NO: 39 和 43 ；SEQ ID NO: 41 和 45 ；SEQ ID NO: 47 和 51 ；SEQ ID NO: 49 和 53 ；SEQ IDN0:55和59;SEQ ID N0:57和61;SEQ ID N0:63和67;SEQ ID N0:65和69;SEQ ID NO:71和 73;SEQ ID N0:72和74;SEQ ID N0:75和79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID NO: 83 和 85;SEQ ID N0:84和 86;SEQ ID N0:87和 89;SEQ ID N0:88 和 90;SEQ ID N0:91 和 93;SEQ IDN0:92和94;SEQ ID NO:95和97 ;以及SEQ ID NO:96和98，其中如果所述第一 CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二 CH3域包含所述序列配对的第二序列；并且如果所述第一 CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二 CH3域包含所述序列配对的第一序列。
[0019]TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、第二铰链、第二 CH2域以及第二 CH3域，其中(i)所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQ IDN0:20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出；(ii)所述第一 CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO: 26中所示出的aa序列；(iii)所述第一 CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ ID N0:31和35 ;SEQ ID N0:33 和 37;SEQ ID N0:39 和 43;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID NO:47 和 51;SEQ ID NO: 49 和 53 ；SEQ ID NO: 55 和 59 ；SEQ ID NO: 57 和 61 ；SEQ ID NO: 63 和 67 ；SEQ IDN0:65和69;SEQ ID N0:71 和 73;SEQ ID N0:72 和 74;SEQ ID N0:75和79;SEQ ID NO: 77和 81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID N0:84和86;SEQ ID N0:87和89;SEQ ID NO: 88 和 90;SEQ ID N0:91 和 93;SEQ ID N0:92 和 94;SEQ ID NO: 95 和 97 ;以及 SEQ ID NO: 96 和 98;(iv)所述第二铰链所包含的aa序列由SEQ ID NO:24,263-265以及267-273组成；(V)所述第二 CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO: 26中所示出的aa序列；并且(vi)所述第二CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ ID NO: 31 和 35 ；SEQ ID NO: 33 和 37 ；SEQ ID NO: 39 和 43 ；SEQ ID NO:41和 45;SEQ ID N0:47和51;SEQ ID N0:49和53;SEQ ID N0:55和59;SEQ ID NO: 57 和 61;SEQ ID N0:63和67;SEQ ID N0:65`和69;SEQ ID NO:70P73;SEQ ID N0:72和74;SEQ IDN0:75和79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID N0:84和86;SEQ ID NO:87和 89;SEQ ID N0:88和90;SEQ ID N0:91和93;SEQ ID N0:92和94;SEQ ID NO:95 和 97;以及SEQ ID N0:96和98，其中如果所述第一 CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第二序列；并且如果所述第一 CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二 CH3域包含所述序列配对的第一序列。
[0020]TFc的第一Fe区或第二Fe区所包含的aa序列可以与本文中所提供，例如从由SEQID NO: 99-166组成的群组中选出的Fe区的aa序列具有至少约70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或与其在至多50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或I个aa缺失、添加或取代方面不同。所述第一 Fe区或所述第二 Fe区所包含的aa序列是从由SEQ ID N0:99_166组成的群组中选出。所述第一 Fe区和所述第二 Fe区所包含的aa序列可以与从由以下各项组成的群组中选出的aa序列配对中的一个aa序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99% 同一性:SEQ ID N0:99 和 100 ;SEQ ID NO: 101 和 102 ;SEQ ID NO: 103 和 104 ;SEQ IDNO: 105 和 106 ；SEQ ID NO: 107 和 108 ；SEQ ID NO: 109 和 110 ；SEQ ID NO: 111 和 112 ；SEQID NO:113和114;SEQ ID NO: 115和 116 ;SEQ ID NO: 117和 118 ;SEQ ID NO: 119和 120 ;SEQID NO:121和122;SEQ ID NO: 123和 124 ;SEQ ID NO: 125和 126 ;SEQ ID NO: 127和 128 ;SEQID N0:129和130;SEQ ID NO: 131 和 132 ;SEQ ID NO: 133和 134 ;SEQ ID NO: 135和 136 ;SEQID NO:137 和 138 ;SEQ ID NO: 139 和 140 ；SEQ ID NO:141 和 142 ；SEQ ID NO: 143 和 144;SEQ ID NO:145^P146;SEQ ID NO: 147 和 148 ;SEQ ID NO: 149 和 150 ;SEQ ID NO: 151 和152 ；SEQ ID NO:153和154;SEQ ID NO: 155 和 156 ;SEQ ID NO: 157 和 158 ;SEQ ID NO: 159和 160 ；SEQ ID NO: 161 和 162 ；SEQ ID NO: 163 和 164 ；以及 SEQ ID NO: 165 和 166，或与其在至多50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或I个aa缺失、添加或取代方面不同，并且其中所述第一 Fe区所包含的配对成员与所述第二 Fe区所包含的配对成员不同。所述第一 Fe区与所述第二 Fe区一起可以包含两个不同成员的配对，各成员是Fe aa序列，其中各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出:SEQ ID NO:99和100 ;SEQ ID NO: 101和102 ;SEQ IDN0:103和104;SEQ ID NO: 105和 106 ;SEQ ID NO: 107和 108 ;SEQ ID NO: 109和 110 ;SEQ IDNO:110P112;SEQ ID NO: 113和 114 ;SEQ ID NO: 115和 116 ;SEQ ID NO: 117和 118 ;SEQ IDN0:119和120;SEQ ID NO: 121 和 122 ;SEQ ID NO: 123和 124 ;SEQ ID NO: 125和 126 ;SEQ IDNO: 127 和 128 ；SEQ ID NO: 129 和 130 ；SEQ ID NO: 131 和 132 ；SEQ ID NO: 133 和 134 ；SEQID NO: 135 和 136 ；SEQ ID NO: 137 和 138 ；SEQ ID NO: 139 和 140 ；SEQ ID NO: 141 和 142 ；SEQ ID N0:143iP144;SEQ ID NO: 145 和 146 ;SEQ ID NO: 147 和 148 ;SEQ ID NO: 149 和150 ;SEQ ID NO:151和152;SEQ ID NO: 153 和 154 ;SEQ ID NO: 155 和 156 ;SEQ ID NO: 157和 158 ；SEQ ID NO: 159 和 160 ；SEQ ID NO: 161 和 162 ；SEQ ID NO: 163 和 164 ；以及 SEQ IDNO: 165和166，各成员aa序列与各所述配对的各序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，或在至多50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或I个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一 Fe区所包含的配对成员与所述第二 Fe区所包含的配对成员不同。
[0021]TFc所包含的aa序列可以与本文中所提供，例如从由SEQ ID NO: 171、173、175、177、179、181、183、185、·187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219以及221组成的群组中选出的TFc的aa序列具有至少约70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，或与其在至多30、25、20、15、10、5、4、3、2或I个aa添加、缺失或取代方面不同。所述TFc所包含的aa序列可以从由SEQ ID NO: 171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219 以及221组成的群组中选出。
[0022]TFcA,例如 TFcBA，例如抗 c_Met+ 抗 EGFR TFcBA 或抗 c_Kit+ 抗 RONTFcBA 或抗FGFR2+抗EPCAM TFcBA，可以包含重链，所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含:第一重链可变(VH)域、TFc、连接性接头以及第二 VH域。所述重链可以按氨基到羧基末端的顺序包含:第一 VH域、CHl域、TFc、连接性接头以及第二 VH域。所述重链可以按氨基到羧基末端的顺序包含:第一 VH域、CHl域、TFc、连接性接头、第二 VH域、scFv接头以及第二轻链可变(VL)域，其中所述第二 VH域与所述第二 VL域缔合以形成第二结合位点。TFcA可以包含轻链，所述轻链包含第一 VL域，所述第一 VL域与所述第一 VH域二聚以形成第一结合位点。所述轻链可以包含轻链恒定(CL)域，所述CL域连接至所述VL域的羧基末端。所述第一结合位点可以是抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰岛素受体、抗 RON、抗 EGFR、抗 VEGFRl、抗 VEGFR2、抗 TNFR、抗 FGFRl、抗 FGFR2、抗 FGFR3、抗FGFR4、抗TOGFRa、抗TOGFRP、抗EPCAM或抗EphA2结合位点，并且所述第二结合位点可以是抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰岛素受体、抗 RON、抗 VEGFRl、抗 VEGFR2、抗 TNFR、抗 FGFRl、抗 FGFR2、抗 FGFR3、抗 FGFR4、抗 PDGFRa、抗TOGFRi1、抗EphA2或抗EGFR结合位点。如果TFcA是单价TFcA，则所述结合位点可以是抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰岛素受体、抗RON、抗 VEGFRl、抗 VEGFR2、抗 TNFR、抗 FGFRl、抗 FGFR2、抗 FGFR3、抗 FGFR4、抗 I3DGFR a、抗PDGFR β、抗EPCAM、抗EphA2或抗EGFR结合位点。示例性抗c-Met结合位点可以包含VH域，所述VH域包含以下两项中的任一者或两者:a) SEQ ID NO: 223或287中的VH互补性决定区(CDR) 3 (VHCDR3)的 aa 序列；和 b) VLCDR3，其包含 SEQ ID NO: 231 或 289 中的 VLCDR3 的 aa序列。另一个示例性抗c-Met结合位点可以包含VH域，所述VH域包含包括VHCDRl、V⑶R2以及VHCDR3的三个VH CDR的集合，其中VHCDR1、VHCDR2以及VHCDR3包含SEQ ID NO: 223或231中的VHCDRl、VHCDR2以及VHCDR3的aa序列；及VL域，所述VL域包含包括VIXDRl、VLCDR2和VLCDR3的三个VLCDR的集合，其中VLCDRl、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ IDNO: 287或289中的VLCDRl、VLCDR2和VLCDR3的aa序列。示例性抗EGFR结合位点可以包含以下两项中的任一者或两者:a) VHCDR3，其包含SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中的 VHCDR3 的 aa 序列;和 b) VLCDR3，其包含 SEQ ID NO: 233、237、258、275、277 或 279 中的VIXDR3的aa序列。示例性抗EGFR结合位点可以包含VH域，所述VH域包含包括VHCDRl、VCDR2以及VHCDR3的三个VHCDR的集合，其中VHCDRl、VHCDR2以及VHCDR3包含SEQ IDN0:233、237、258、275、277 或 279 中的 VHCDRl、VHCDR2 以及 VHCDR3 的 aa 序列;&VL 域，所述VL域包含包括VLCDRl、VLCDR2和VLCDR3的三个VLCDR的集合，其中VLCDRl、VLCDR2和VLCDR3 分别包含 SEQ ID NO:233、237、258、275、277 或 279 中的 VLCDRl、VLCDR2 和 VLCDR3的 aa 序列。抗 c-Met、抗 c_Kit、抗 ErbB2、`抗 ErbB3、抗 ErbB4、抗 IGF1R、抗 IGF2R、抗胰岛素受体、抗 RON、抗 VEGFRl、抗 VEGFR2、抗 TNFR、抗 FGFRl、抗 FGFR2、抗 FGFR3、抗 FGFR4、抗PDGFR α、抗TOGFRP、抗EPCAM、抗EphA2或抗EGFR结合位点可以包含重链的N末端部分和轻链的N末端部分。抗EGFR、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰岛素受体、抗 RON、抗 VEGFRl、抗 VEGFR2、抗 TNFR、抗 FGFRl、抗 FGFR2、抗 FGFR3、抗 FGFR4、抗PDGFRa、抗TOGFRP、抗EPCAM、抗EphA2或抗c-Met结合位点可以由完全被重链包含的C末端scFv包含，以形成连续多肽。
[0023]TFcA (例如TFcBA)的抗c_Met结合位点可以由VH域和VL域中的任一者或两者包含，其中所述VH域所包含的aa序列与抗c-Met结合位点的VH域(例如SEQ ID NO: 223、231,287或289中所示出)具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或与其在至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个aa缺失、添加或取代方面不同；并且所述VL域所包含的aa序列与本文中所提供的抗c-Met结合位点的VL域(例如SEQ ID NO:223、231、287或289中所示出)具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或与其在至多10、9、8、7、6、
5、4、3、2或I个aa缺失、添加或取代方面不同。
[0024]TFcA (例如TFcBA)的抗EGFR结合位点可以由VH域和VL域中的任一者或两者包含，其中所述VH域所包含的aa序列与本文中所提供的抗EGFR结合位点的VH域(例如SEQID NO: 233、237、258、275、277 或 279 中所示出)具有至少 70%、80%、90%、95%、97%、98%或 99%同一性或与其在至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个aa缺失、添加或取代方面不同；并且所述VL域所包含的aa序列与本文中所提供的抗EGFR结合位点的VL域(例如SEQ ID NO: 233、237、258、275、277 或 279 中所示出)具有至少 70%、80%、90%、95%、97%、98% 或 99% 同一性或与其在至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或I个aa缺失、添加或取代方面不同。
[0025]TFcA或TFcBA可以是电荷互补配对型TFcA或TFcBA，例如其中:电荷互补配对型TFcA或TFcBA是包含一对带电氨基酸的TFcA或TFcBA，所述一对带电氨基酸包含选自群组A的氨基酸和选自群组B氨基酸(电荷互补对)；其中群组A包含pi大于7的所有天然氨基酸，而群组B包含pi小于7的所有天然氨基酸，或任选地，其中群组A包含His、Lys以及 Arg,而群组 B 包含 Asp、Glu、Asn、Phe、Gin、Tyr> Ser、Met、Thr、lie、Gly、Val、Trp、Leu、Ala以及Pro ;且所述电荷互补对由第一氨基酸残基和第二氨基酸残基组成，并且所述电荷互补对为297位电荷互补对或299位电荷互补对，其中297位电荷互补对是所述第一氨基酸残基位于所述第一 Fe区的EU297位且所述第二氨基酸残基位于所述第二 Fe区的EU297位的电荷互补对，而299位电荷互补对是所述第一氨基酸残基位于所述第一 Fe区的EU299位且所述第二氨基酸残基位于所述第二 Fe区的EU299位的电荷互补对。电荷互补配对型TFcA或TFcBA可以包含297位电荷互补对和299位电荷互补对，其中所述297位电荷互补对的第一氨基酸残基和第二氨基酸残基与所述299位电荷互补对的第一氨基酸残基和第二氨基酸残基相同或不同。电荷互补配对型TFcA或XXX可以包含297位电荷互补对，且其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA与不是电荷互补配对型TFcA或TFcBA但除了对应于所述第一氨基酸残基和所述第二氨基酸残基的氨基酸残基都是由相同带电氨基酸组成的残基以外与所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA —致的TFcA或TFcBA相比更稳定，所述相同带电氨基酸是所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA的297位电荷互补对的氨基酸之一。电荷互补配对型TFcA或TFcBA可以包含299位电荷互补对，且其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA与不是电荷互补配对型TFcA或TFcBA但除了对应于所述第一氨基酸残基和所述第二氨基酸残基的氨基酸残基都是由相同带电氨基酸组成的残基以外与所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA —致的TFc·A或TFcBA相比更稳定，所述相同带电氨基酸是所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA的299位电荷互补对的氨基酸之一。
[0026]TFcA或TFcBA的第一结合位点或第二结合位点可以特异性结合从由以下各项组成的群组中选出的人类受体蛋白:ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、c-Met, EGFR、VEGFRl、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR (a 和 β )、c_Kit、EPCAM 以及 EphA2。
[0027]本文中还提供了包含TFcA或TFcBA和药学上可接受的载体的药物组合物。还提供了核酸分子，所述核酸分子例如包含至少一个编码序列，所述至少一个编码序列编码TFcA或TFcBA的重链或轻链。核酸分子可以包含至少两个编码序列，其中一个编码序列编码TFcA或TFcBA的重链，而第二编码序列编码TFcBA的轻链。还提供了载体，所述载体例如包含一个或多个本文中所提供的核酸分子。还提供了细胞，例如宿主细胞或经分离细胞，所述细胞包含一种或多种本文中所提供的载体和/或核酸分子。细胞可以包含编码TFcA或TFcBA重链的核酸分子和编码TFcA或TFcBA轻链的核酸分子。
[0028]本文中还涵盖产生TFcA或TFcBA的方法，所述方法包括在所述核酸得以表达的条件下培养本文中所描述的宿主细胞，及分离TFcA或TFcBA。用于产生TFcA或TFcBA的方法可以包括在适合于表达TFcA或TFcBA的条件下培养本文中所描述的细胞。
[0029]本文中还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文中所描述的TFcA或TFcBA、核酸分子或载体。
[0030]附图简述
[0031]图1:示例性抗C-Met/抗EGFR串联Fe双特异性抗体(“TFcBA”)(图1A)和串联Fc( “TFc”)的每个域中的示例性突变(图1B)的图。
[0032]图1A:按氨基到羧基末端的顺序包含以下三个模块的示例性抗C-Met/抗EGFRTFcBA的图:1)由抗c-Met结合位点组成的第一模块；2)由TFc组成的第二模块；以及3)由抗EGFR结合位点组成的第三模块。在例示的TFcBA中，所述第一模块是抗c_Met Fab,且所述第三模块是抗EGFR ScFv0所述TFc包含经由TFc接头连接的两个Fe区。在例示的TFcBA中，所述第一 Fe区包含全长IgGl/IgG4杂合铰链、IgG4CH2域以及IgGlCH3域，且所述第二 Fe区包含IgG4核心铰链和下铰链(但不包含上铰链)、IgG4CH2域以及IgGlCH3域。在例示的TFcBA中，所述CH3域包含一个或多个缔合增强修饰(“AEM”)，这些修饰增强两个CH3域或两个Fe区之间的缔合。TFcBA还可以包含一个或多个二硫键形成修饰(“DiS”)，这些修饰引入半胱氨酸，从而允许在两个Fe区之间形成二硫键。
[0033]图1B:按氨基到羧基末端的顺序显示以下各项的TFc的结构的图:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、TFc接头、第二铰链、第二 CH2域以及第二 CH3域。这些域各自的示例性序列和域修饰显示在该图下方。各AEM或DiS中的第一或第二 CH3修饰的名称指示在修饰名称后的括号中，其中“AEM”或“DiS”后的第一个数字分别是指AEM或DiS的模块编号，而第二个数字是指两个CH3域中的第一个或第二个。举例来说，在取代“T366S/L368A/Y407V”后指示“AEM1.1”，这些取代是AEM模块I中的一对修饰的两个CH3域中的一个中的取代的组合。TFc可以包含这·些域中的每一个的任何组合,条件是当所述TFc的一个CH3域包含两种AEM和/或DiS修饰之一时，另一个CH3域包含AEM和/或DiS的第二种(即，相容性)修饰。举例来说，如果TFc的一个CH3域包含AEM1.1，则另一个CH3域包含AEM1.2。“C末端Cys”是指通过用图中所示的那些aa取代CH3域的后三个aa将C末端半胱氨酸添加到CH3域的修饰。本图和其它图中的Aa残基编号是完整抗体重链中的编号(根据Kabat中的EU指数)。
[0034]图2:野生型铰链与变异铰链的aa序列的比对。一个位置上的短划线表示aa与本图第一行中那个位置上的aa—致。A)全长(SEQ ID N0:4、18以及19)或部分(SEQID N0:l、2、3、16、17、23 以及 263-265)野生型(SEQ ID NO: 1-4 和 23)或经修饰(SEQ IDNO: 16-19 和 263-265) IgGl 铰链的 aa 序列。B)全长(SEQ ID NO: 20、21 以及 22)或部分(SEQ ID NO: 1、13、14 以及 24)野生型(SEQ ID NO: 1、13、14、20 以及 24)或经修饰(SEQ ID勵:21和22)1861/1864杂合铰链的&&。C)全长野生型mlgGl铰链(SEQ ID NO: 266)和杂合 mIgGl/mIgG2A 铰链(SEQ ID NO:267)的 aa 序列。D)全长野生型 hIgG2 铰链(SEQ IDNO: 7)和经修饰hIgG2铰链(SEQ ID NO: 268和269)的aa序列。E)全长野生型hIgA2铰链(SEQ ID NO:270)和经修饰 hIgA2 铰链(SEQ ID NO:271-273)的 aa 序列。
[0035]图3:具有或不具有各种aa修饰的IgGlCH3aa序列的比对。各行是不同的CH3域的aa序列。一个位置上的短划线表示aa与本图第一行中那个位置上的aa—致。CH3修饰是根据其模块(例如AEM模块I)加以组织。将各模块分成两组，用两个数字标记:举例来说，将AEM模块I分成群组“AEM11”和“AEM12”，其中AEMll表示对模块AEMl的一个CH3域(域“I”)进行的修饰，而AEM12表示对所述模块的第二个CH3域(域“2”)进行的修饰。模块内的各行表示具有所述模块的修饰且具有或不具有其它修饰的CH3域。一个模块内的CH3aa序列彼此不同，例如，存在或不存在羧基末端赖氨酸和/或存在取代D356E和L358M。
[0036]图4:示例性IgGlFc区的比对。各行是不同的Fe区的aa序列。一个位置上的短划线表示aa与本图第一行中那个位置上的aa—致。各Fe区包含铰链(在第一序列中呈粗体)、CH2以及CH3域(CH3域在第一序列中加下划线)。本图中的各Fe的铰链、CH2以及CH3序列的SEQ ID NO提供于表8中。这些Fe被组织成对，这些配对与其它配对用行分开，并且其中各配对表示相容性Fe，即，可以彼此缔合以形成Fe 二聚体的Fe。
[0037]图5:示例性IgGl/IgG4杂合Fe区的比对。各行是不同的Fe区的aa序列。一个位置上的短划线表示aa与本图第一行中那个位置上的aa—致。各Fe区包含铰链(在第一序列中呈粗体)、CH2以及CH3域(CH3域在第一序列中加下划线)。本图中的各Fe的铰链、CH2以及CH3序列的SEQ ID NO提供于表9中。这些Fe被组织成对，这些配对与其它配对用行分开，并且其中各配对表示相容性Fe，即，可以彼此缔合以形成Fe 二聚体的Fe。
[0038]图6:以下 IgGlTFc 的 aa序列:23(SEQ ID NO: 171) ；23A(SEQ ID NO: 173) ；23B(SEQID NO:175) ；23C(SEQ ID NO:177) ；23D(SEQ ID NO:179) ；23E(SEQ ID NO:181) ；23F(SEQID NO: 183) ；23E(35L) (SEQ ID NO: 185) ;23E(35L 反向)(SEQ ID NO: 187) ；23E(30L) (SEQID NO: 189) ；23E(25L) (SEQ ID NO: 191) ；23I (SEQ ID NO: 193);以及 23J(SEQ ID NO: 195)。这些序列各自按氨基到羧基末端的顺序由以下域组成:第一 IgGl铰链(加双下划线)、IgGlCH2域、IgGlCH3域(加下划线)、(G4S)n接头(呈斜体)、第二 IgGl铰链(加双下划线且仅由核心铰链和下铰链组成)、第二 IgGlCH2域以及第二 IgGlCH3域(加下划线)。这些分子各自的特异性aa变化以粗体显示，并且在序列上方指出。
[0039]图7:以下 IgGl/IgG4 杂合 `TFc 的 aa 序列:39 (SEQ ID NO: 197) ；39A(SEQ IDNO:199) ；39B(SEQ ID NO:201) ；39C(SEQ ID NO:203) ；39D(SEQ ID NO:205) ；39E(SEQID NO:207) ；39F(SEQ ID NO:209) ；39E(35L)(SEQ ID N0:211) ;39E(35L 反向)(SEQ IDN0:213) ；39E(30L)(SEQ ID N0:215) ；39E(25L)(SEQ ID N0:217) ；39I(SEQ ID N0:219)；39J (SEQ ID NO: 221)。这些序列各自按氨基到羧基末端的顺序由以下域组成:由IgGl上铰链与IgG4核心铰链和下铰链组成的第一 IgGl/IgG4杂合铰链(加双下划线)、IgG4CH2域、IgGlCH3域(加下划线)、(G4S)n接头(呈斜体)、第二 IgG4铰链(加双下划线且仅由核心铰链和下铰链组成)、第二 IgG4CH2域以及第二 IgGlCH3域(加下划线)。IgGl序列以大写字母显示，而IgG4序列以小写字母显示。这些分子各自的特异性aa变化以粗体显示，并且在序列上方指出。
[0040]图8:在4%到12%SDS_PAGE凝胶上在A)非还原性或B)还原性条件下分离的TFc23A、23B、23D、23E、39B 以及 39G 的样品。泳道 I 的分子量标记物(Biorad PrecisionPlus Marker)的蛋白质分子量(以KDa表示)显示在凝胶的左侧。
[0041]图9:以下示例性抗C-Met/抗EGFR TFcBA的重链aa序列:包含人源化OT5VH域和抗EGFR scFv的TFcBA,其包含A)、B)、C)、D)、E)、L)以及M)帕尼单抗的VH和VL域的aa序列(SEQ ID NO: 235) ；F) 2224 (SEQ ID NO:239) ;G)西妥昔单抗HlLl (SEQ ID NO:260)；H)西妥昔单抗H1L2(SEQ ID NO: 281) ；1)西妥昔单抗H2L1 (SEQ ID NO:283);以及J)西妥昔单抗H2L2 (SEQ ID NO:285)。K)包含抗c_Met结合位点2的VH域和人源化抗EGFR西妥昔单抗scFv HlLl的抗c-Met/抗EGFR TFcBA的重链aa序列。出于人源化目的引入到西妥昔单抗VH域中的aa以小写字母指示。抗c-Met Fab的⑶R用虚线加下划线。CHl域用波状线加下划线。铰链加双下划线。TFc接头呈斜体。CH3域加下划线。CH3域中的AEM和DiS修饰呈粗体。scFv接头呈斜体且加下划线。连接性接头呈斜体且加双下划线。
[0042]图10:编码图和说明书中所示出的aa序列的核苷酸序列。
[0043]图11:实施例1和2中所使用的TFc的核苷酸和aa序列。各aa序列按氨基到羧基末端的顺序由以下域组成:信号肽(加下划线且呈粗体)、第一 IgGl铰链(加双下划线)、IgGlCH2域、IgGlCH3域(加下划线)、TFc接头(呈斜体)、第二 IgGl铰链(加双下划线且仅由核心铰链和下铰链组成)、第二 IgGlCH2域以及第二 IgGlCH3域(加下划线)。IgGlaa以大写字母表示，而IgG4aa以小写字母表示。这些分子各自的特异性aa变化，例如AEM和DiS修饰，以粗体显示，并且在序列上方指出。
[0044]图12A:选择奥那单抗(onartuzumab, 0ΤΖΜ)单克隆细胞系:泳道1=尺寸标准物；泳道 2-12:2=0TZM 系 1，3=0TZM 系 2，4=0TZM 系 3，5=0TZM 系 4，6=0TZM 系 5，7=0TZM 系 6，8=0TZM 系 7，9=0TZM 系 8，IO=OTZM 系 9，Il=OTZM 系 10，12=0TZM 系 11。
[0045]图12B:选择奥那单抗(OTZM)单克隆细胞系:泳道1=尺寸标准物；泳道2_9:2=0TZM 系 12，3=0TZM 系 13，4=0TZM 系 14，5=0TZM 系 15，6=0TZM 系 16，7=0TZM 系 17，8=0TZM系 18，9=0TZM 系 19。
[0046]图13A:带电糖基化突变体的非还原型SDS-PAGE:泳道1=尺寸标准物；泳道2_8:2=糖基化野生型，3=糖基化1，4=糖基化2，5=糖基化3，6=糖基化4，7=糖基化5，8=糖基化6。·
[0047]图13B:带电糖基化突变体的还原型SDS-PAGE:泳道1=尺寸标准物；泳道2_8:2=糖基化野生型，3=糖基化1，4=糖基化2，5=糖基化3，6=糖基化4，7=糖基化5，8=糖基化6。
[0048]图14:示例性TFcBA的核苷酸和aa序列。
[0049]图15:显示包含39E糖型4骨架、奥那单抗抗体以及2224或帕尼单抗抗体的TFcBA与cMet-Fc和EGFR-his的结合的图。
[0050]图16:显示TFc对pMet的抑制的图，所述TFc包含奥那单抗抗体和各种骨架(包括23、23E、39、39E糖型4骨架)，且包括了包含39E糖型4骨架和2224、西妥昔单抗或帕尼单抗抗体的TFcBA。
[0051]图17:表23中所示出的示例性TFcBA的糖基化突变体的核苷酸和aa序列。
[0052]序列简述:
[0053]以下鉴别本文中提到的和序列表中列出的氨基酸(“aa”)序列。
[0054]SEQ ID NO: 1、2以及3分别是野生型IgGl上铰链、中(或核心)铰链以及下铰链的aa序列(参见表2)。
[0055]SEQ ID NO:4是按氨基到羧基末端的顺序由SEQ ID NO: 1、2以及3组成的呈连续序列形式的完整野生型IgGl铰链的aa序列(参见表2)。
[0056]SEQ ID NO: 5和6分别是野生型IgG2上铰链和下铰链的aa序列(参见表2)。IgG2中铰链与IgGl的相同，即，SEQ ID NO:2。
[0057]SEQ ID NO:7是按氨基到羧基末端的顺序由SEQ ID NO:5、2以及6组成的呈连续序列形式的完整野生型IgG2铰链的aa序列(参见表2)。
[0058]SEQ ID N0:8、9以及10分别是野生型IgG3上铰链、中铰链以及下铰链的aa序列(参见表2) ο
[0059]SEQ ID NO: 11是按氨基到羧基末端的顺序由SEQ ID N0:8、9以及10组成的呈连续序列形式的完整野生型IgG3铰链的aa序列(参见表2)。
[0060]SEQ ID NO: 12、13以及14分别是IgG4上铰链、中铰链以及下铰链的aa序列(参见表2)。
[0061]SEQ ID NO: 15是按氨基到羧基末端的顺序由SEQ ID NO: 12、13以及14组成的呈连续序列形式的全长IgG4铰链的aa序列(参见表2)。
[0062]SEQ ID NO: 16 是包含 aa 取代 H224C 和 T225C 的 IgGl 上铰链(SEQ ID NO:1)的aa序列(参见表4和图2)。`
[0063]SEQ ID NO: 17 是包含 aa 取代 T223C 的 IgGl 上铰链(SEQ ID NO:1)的 aa 序列(参见表4和图2)。
[0064]SEQ ID NO: 18 是包含 aa 取代 H224C 和 T225C 的全长 IgGl 铰链(SEQ ID NO: 4)的aa序列(参见表4和图2)。
[0065]SEQ ID NO: 19 是包含 aa 取代 T223C 的全长 IgGl 铰链(SEQ ID NO:4)的 aa 序列(参见表4和图2)。
[0066]SEQ ID NO: 20是由IgGl上铰链(SEQ ID NO:1)与IgG4中铰链和下铰链(分别为SEQ ID NO: 13和14)组成的全长杂合IgGl/IgG4铰链的aa序列(参见表4和图2)。
[0067]SEQ ID NO: 21 是由包含 aa 取代 H224C 和 T225C 的 IgGl 上铰链(SEQ ID NO: 16)与IgG4中铰链和下铰链(分别为SEQ ID NO: 13和14)组成的全长杂合IgGl/IgG4铰链的aa序列(参见表4和图2)。
[0068]SEQ ID NO: 22 是由包含 aa 取代 T223C 的 IgGl 上铰链(SEQ ID NO: 17)与 IgG4中铰链和下铰链(分别为SEQ ID NO: 13和14)组成的全长杂合IgGl/IgG4铰链的aa序列(参见表4和图2)。
[0069]SEQ ID N0:23是包含IgGl中铰链和下铰链(SEQ ID NO:2和3)，但不包含上铰链的部分IgGl铰链的aa序列(参见表4和图2)。
[0070]SEQ ID NO: 24是包含IgG4中铰链和下铰链(SEQ ID NO: 13和14)，但不包含上铰链的部分IgG4铰链的aa序列(参见表4和图2)。
[0071]SEQ ID NO: 25是在aa297处具有减弱糖基化的aa取代N297Q的全长IgGlCH2域的aa序列。
[0072]SEQ ID NO:26是在aa297处具有减弱糖基化的aa取代T299K的全长野生型IgG4CH2域的aa序列。
[0073]SEQ ID NO:27是全长野生型人类IgGlCH3域的aa序列(参见表6和图3)。
[0074]SEQ ID N0:28是具有SEQ ID NO:27，但缺乏C末端赖氨酸的野生型IgGlCH3域的`aa序列(参见表6和图3)。
[0075]SEQ ID NO: 29 是具有含取代 D356E 和 L358M 的 SEQ ID NO: 27 的 IgGlCH3 域的 aa序列(参见表6和图3)。
[0076]SEQ ID NO: 30是具有SEQ ID NO: 29，但缺乏C末端赖氨酸的IgGlCH3域的aa序列(参见表6和图3)。
[0077]SEQ ID NO: 31是具有含产生“孔”的取代T366S、L368A以及Y470V(缔合增强修饰或“AEM” 1.1)的SEQ ID NO:27的IgGlCH3域的aa序列(参见表6和图3)。
[0078]SEQ ID N0:32是具有SEQ ID NO:31，但缺乏C末端赖氨酸的IgGlCH3域的aa序列(参见表6和图3)。
[0079]SEQ ID NO:33 是具有含产生“孔”的取代 T366S、L368A 以及 Y470V( “AEM” 1.1)的SEQ ID NO:29的IgGlCH3域的aa序列(参见表6和图3)。
[0080]SEQ ID NO: 34是具有SEQ ID NO: 33，但缺乏C末端赖氨酸的IgGlCH3域的aa序列(参见表6和图3)。
[0081]SEQ ID N0:35是具有含产生“隆突”或“钮”的取代T366W(AEM1.2)的SEQ ID NO:27的IgGlCH3域的aa序列(参见表6和图3)。
[0082]SEQ ID NO: 36是具有SEQ ID NO: 35，但缺乏C末端赖氨酸的IgGlCH3域的aa序列(参见表6和图3)。
[0083]SEQ ID N0:37是具有含产生“隆突”或“钮”的取代T366W(AEM1.2)的SEQ ID NO:29的IgGlCH3域的aa序列(参见表6和图3)。
[0084]SEQ ID NO: 38是具有SEQ ID NO: 37，但缺乏C末端赖氨酸的IgGlCH3域的aa序列(参见表6和图3)。·
[0085]SEQ ID NO:39-98 是相对于具有 SEQ ID N0:27、28、29 或 30 的 IgGlCH3 而言包含一个或多个AEM和/或二硫键形成(“DiS”)修饰的IgGlCH3域的aa序列(参见表6和图3)。
[0086]SEQ ID NO:99-132是按连续氨基到羧基末端的顺序包含以下各项的示例性IgGlFc区的aa序列:(a)从由IgGl铰链、包含一个或多个aa取代的IgGl铰链以及部分IgGl铰链组成的群组中选出的铰链；(b)具有N297Q的IgGlCH2域(SEQ ID NO: 25);以及(c)从由SEQ ID NO:29和包含一个或多个AEM和/或DiS修饰的SEQ ID N0:29组成的群组中选出的IgGlCH3域(图4)。所述铰链、CH2以及CH3域在无插入序列的情况下共价连接。SEQ ID NO:99-132的各域的SEQ ID NO示出于表8中。
[0087]SEQ ID NO: 133-166是按连续氨基到羧基末端的顺序包含以下各项的示例性IgGl/IgG4杂合Fe区的aa序列:(a)从由IgGl/IgG4杂合铰链、包含一个或多个aa取代的IgGl/IgG4杂合铰链以及部分IgG4铰链组成的群组中选出的铰链；(b)具有T299K的IgG4CH2域(SEQ ID NO: 26);以及(c)从由SEQ ID NO: 29和包含一个或多个AEM和/或DiS修饰的SEQ ID NO:29组成的群组中选出的IgGlCH3域。所述铰链、CH2以及CH3域在无插入序列的情况下共价连接。SEQ ID NO: 133-166的各域的SEQ ID NO示出于表9中。
[0088]SEQ ID NO: 167是KS⑶KT，它是引入了半胱氨酸的IgGlCH3域的示例性经修饰羧基末端部分。
[0089]SEQ ID NO: 168是GEC，它是引入了半胱氨酸的IgGlCH3域的示例性经修饰羧基末端部分。
[0090]SEQ ID NO: 169是示例性非Gly-Ser TFc接头的aa序列。[0091]SEQ ID NO: 170-195是示例性IgGlTFc的核苷酸序列(偶数)和aa序列(奇数)，这些序列示出于图6中。构成这些IgGlTFc中的每一个的域的SEQ ID NO示出于表12中。
[0092]SEQ ID NO: 196-221是包含杂合IgGl/IgG4Fc区的示例性TFc的核苷酸序列(偶数)和aa序列(奇数)，这些序列示出于图7中。构成这些杂合TFc中的每一个的域的SEQID NO示出于表13中。
[0093]SEQ ID NO: 222-223分别是无信号肽的抗c_Met Ab5D5的重链Fab域的核苷酸和aa序列。
[0094]SEQ ID NO: 224-225 分别是包含抗 c_Metro5VH 域、IgGlTFc (具有 AEM1)以及帕尼单抗scFv的IgGlTFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
[0095]SEQ ID NO: 226-227 分别是包含抗c_Metro5VH域、IgGl/IgG4杂合TFc (具有AEM1)以及帕尼单抗scFv的IgGl/IgG4杂合TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
[0096]SEQ ID NO: 228-229 分别是包含抗c_Metro5VH域、IgGl/IgG4杂合TFc (具有AEM1)以及帕尼单抗scFv的IgGl/IgG4杂合TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
[0097]SEQ ID NO: 230和231分别是包含人源化5D5抗c_Met VL域和CL域以供例如与包含人源化5D5抗c-Met VH域的重链，例如包含SEQ ID NO: 225、227、229、244或343的重链一起使用的轻链的核苷酸和aa序列。
[0098]SEQ ID NO: 232和233是包含帕尼单抗(VECTIBIX)的可变区的抗EGFRscFv的核苷酸和aa序列。
[0099]SEQ ID NO: 234和235分别是包含以下各项的抗c_Met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(分别示于图9·和图10中):(a)来自人源化5D5的抗c_Met可变域；(b)具有AEMl和DiS2的TFc (SEQ ID NO: 181);以及(c)包含帕尼单抗(VECTIBIX)的可变区的抗 EGFR scFv (SEQ ID NO: 233)。
[0100]SEQ ID NO: 236和237分别是包含Ab2224的可变区的抗EGFR scFv的核苷酸和aa序列。
[0101]SEQ ID NO:238和239分别是包含以下各项的抗C-Met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(分别示于图9和图10中):(a)来自人源化5D5的抗c_Met可变域；(b)具有AEMl和DiS2的TFc (SEQ ID NO: 181);以及(c)包含Ab2224的可变区的抗EGFRscFv(SEQ ID NO:237)。
[0102]SEQ ID NO:240和241分别是示例性信号肽的核苷酸和aa序列。
[0103]SEQ ID NO: 242和243分别是示例性信号肽的核苷酸和aa序列。
[0104]SEQ ID NO: 244 和 245 分别是 5D5 的抗 c-Met VH 域和含具有 SEQ ID NO: 241 的信号肽的CL域的核苷酸和aa序列。
[0105]SEQ ID NO:246 和 247 是含具有 SEQ ID NO:243 的信号肽的具有 SEQ ID N0:231的轻链的核苷酸和aa序列。
[0106]SEQ ID N0:248-254是本说明书中所描述的变异铰链的aa序列。
[0107]SEQ ID NO:255和256分别是含由SEQ ID NO:241组成且示于实施例3中的信号肽的抗c-Met结合位点2 (SEQ ID NO: 287)的重链Fab区的核苷酸和aa序列。
[0108]SEQ ID NO:257和258分别是包含人源化西妥昔单抗(ERBITUX)HlLl的可变区的抗EGFR scFv的核苷酸和aa序列。[0109]SEQ ID NO:259和260分别是包含以下各项的抗c_Met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(分别示于图9和图10中):(a)来自人源化5D5的抗c_Met可变域；(b)具有AEMl和DiS2的TFc (SEQ ID NO: 181);以及(c)包含人源化西妥昔单抗(ERBITUX) HlLl的可变区的抗 EGFR scFv (SEQ ID NO:258) ?
[0110]SEQ ID NO: 261是全长野生型IgGlCH2域的aa序列。
[0111]SEQ ID NO:262是全长野生型IgG4CH2域的aa序列。
[0112]SEQ ID NO: 263,264 以及 265 是变异 hlgGl 铰链的 aa 序列(图 2)。
[0113]SEQ ID NO: 266是野生型小鼠IgGl铰链的aa序列(图2)。
[0114]SEQ ID NO: 267是小鼠IgGl/IgG2A杂合铰链的aa序列(图2)。
[0115]SEQ ID NO: 268 和 269 是变异 hIgG2 铰链的 aa 序列(图 2)。
[0116]SEQ ID NO: 270是野生型hIgA2铰链的aa序列(图2)。
[0117]SEQ ID NO: 271-273 是变异 hIgA2 铰链的 aa 序列(图 2)。
[0118]SEQ ID NO: 274-279是包含实施例3中所描述的人源化西妥昔单抗Ab H1L2、H2L1以及H2L2的可变域的scFv的核苷酸(偶数)和aa (奇数)序列。
[0119]SEQ ID NO:280-285分别是包含以下各项的抗c_Met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸(偶数)和aa (奇数)序列:(a)来自人源化5D5的抗c_Met可变域；(b)包含人源化西妥昔单抗(ERBITUX)Ab H1L2、H2L1以及H2L2的可变区的抗EGFR scFv(分别为SEQ IDN0:275、277 或 279);以及·(c)具有 AEMl 和 DiS2 的 TFc (SEQ ID NO: 181)(图 9)。
[0120]SEQ ID NO: 286和287分别是实施例3中所描述的抗c-Met结合位点2的重链Fab域的核苷酸和aa序列。
[0121]SEQ ID NO: 288和289分别是实施例3中所描述的抗c-Met结合位点2的轻链Fab域的核苷酸和aa序列。
[0122]SEQ ID NO:290和291分别是图9和图10中所示的包含以下各项的抗c_Met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸和aa序列:(a)来自抗c_Met结合位点2的抗c_Met重链Fab域(SEQ ID NO: 287) ； (b)具有 AEMl 和 DiS2 的 TFc (SEQ ID NO: 181);以及(c)包含人源化西妥昔单抗(ERBITUX) HlLl 的可变区的抗 EGFR scFv (SEQ ID N0:258)(图 9)。SEQ IDNO: 291的aa序列与具有SEQ ID NO: 260的aa序列相同，其中抗c_Met结合域已替换为抗c-Met结合位点2的抗c-Met结合域。
[0123]SEQ ID NO: 292-341是实施例1和实施例2中所使用以及图11中所显示的TFc的核苷酸(偶数)和aa(奇数)序列。
[0124]SEQ ID NO: 342 和 343 分别是包含抗 c_Metro5VH 域、IgGlTFc (具有 AEMl 和 DiS反向)以及帕尼单抗scFv的IgGlTFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
[0125]SEQ ID NO: 344和345分别是含由SEQ ID NO: 243组成且示于实施例3中的信号肽的抗c-Met结合位点2 (SEQ ID NO: 289)的轻链Fab区的核苷酸和aa序列。
[0126]SEQ ID NO: 346和347分别是存在人源化抗c_Met和抗EGFR帕尼单抗scFv与IgGlTFc (存在 AEMl 和具有 SEQ ID 勵:169的40&& TFc 接头)的抗 ciet/抗 EGFR TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
[0127]SEQ ID NO: 348和349分别是存在人源化5D5抗c_Met和抗EGFR帕尼单抗scFv与 IgGl/IgG4 杂合 TFc (存在 AEMl 和具有 SEQ ID NO: 169 的 40aaTFc 接头)的抗 c-met/抗EGFRTFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
[0128]SEQ ID NO: 350 是包含抗 RON 重链 Fab 域、抗 EGFR scFv2224 以及 TFc23E (SEQ IDNO:303)的抗RON/抗EGFR TFcBA的重链的aa序列；图14。
[0129]SEQ ID NO: 351 是包含抗 RON 重链 Fab 域、抗 EGFR scFv2224 以及 TFc39Egy4 (39E糖型4)(SEQ ID NO: 394)的抗RON/抗EGFR TFcBA的重链的aa序列；图14。
[0130]SEQ ID NO:352 是包含抗 RON 重链 Fab 域、抗 CEA scFv 以及 Tfc23E(SEQ IDNO:303)的抗RON/抗CEA TFcBA的重链的aa序列；图14。
[0131]SEQ ID NO: 353 是包含抗 RON 重链 Fab 域、抗 CEA scFv 以及 TFc39Egy4 (SEQ IDNO:394)的抗RON/抗CEA TFcBA的重链的aa序列；图14。
[0132]SEQ ID N0:354 是包含抗 CEA 重链 Fab 域、抗 cMet scFv 以及 TFc23E(SEQ IDNO:303)的抗CEA/抗cMet TFcBA的重链的aa序列；图14。
[0133]SEQ ID NO: 355 是包含抗 CEA 重链 Fab 域、抗 RON scFv 以及 Tfc23E (SEQ IDNO:303)的抗CEA/抗RON TFcBA的重链的aa序列；图14。
[0134]SEQ ID NO: 356 是包含抗 CEA 重链 Fab 域、抗 cMet scFv 以及 TFc39Egy4 (SEQ IDNO:394)的抗CEA/抗scMet TFcBA的重链的aa序列；图14。
[0135]SEQ ID N0357-358 是 TFc 野生型 CH2 序列以及 CH3 域中的 T366S/L368A/Y407V/CH3C末端半胱氨酸KSCDKT::T366W/CH3C末端半胱氨酸GEC的aa序列和核苷酸序列；图17。
[0136]SEQ ID N0:359 是包含抗 cMet 重链 Fab 域、抗 CEA scFv 以及 TFc23E(SEQ IDNO:303)的抗cMet/抗CEA TF·cBA的重链的aa序列；图14。
[0137]SEQ ID NO: 360 是包含抗 cMet 重链 Fab 域、抗 CEA scFv 以及 TFc39Egy4 (SEQ IDNO:394)的抗cMet/抗CEA TFcBA的重链的aa序列；图14。
[0138]SEQ ID NO: 361 是包含抗 cMet 重链 Fab 域、抗 CD44scFv 以及 TFc39Egy4 (SEQ IDNO:394)的抗cMet/抗CEA CD44的重链的aa序列；图14。
[0139]SEQ ID NO:362 是包含抗 cMet 重链 Fab 域、抗 CD44scFv 以及 TFc23E(SEQ IDNO:303)的抗cMet/抗CEA CD44的重链的aa序列；图14。
[0140]SEQ ID N0:363 是包含抗 cMet 重链 Fab 域、抗 CD44scFv 以及 TFc23E(SEQ IDNO:303)的抗cMet/抗CEA CD44的重链的aa序列；图14。
[0141]SEQ ID N0:364 是包含抗 cMet 重链 Fab 域、抗 CD44scFv 以及 TFc39Egy4(SEQ IDNO:394)的抗cMet/抗CEA CD44的重链的aa序列，图14。
[0142]SEQ ID NO:365 是包含抗 CD44 重链 Fab 域、抗 cMet scFv 以及 TFc23E(SEQ IDNO:303)的抗CD44/抗cMet的重链的aa序列；图14。
[0143]SEQ ID NO: 366 是包含抗 CD44 重链 Fab 域、抗 cMet scFv 以及 TFc39Egy4 (SEQ IDNO:394)的抗CD44/抗cMet的重链的aa序列；图14。
[0144]SEQ ID NO: 367 是抗 CD44ARH60-16-2 轻链的 aa 序列。
[0145]SEQ ID N0368-369是抗cMet抗体奥那单抗和TFc23轻链的aa序列和核苷酸序列；图14。
[0146]SEQ ID N0370-371是抗cMet抗体奥那单抗和TFc39重链的aa序列和核苷酸序列；图14。
[0147]SEQ ID N0372-373是抗cMet抗体奥那单抗和TFc23E重链的aa序列和核苷酸序列；图14。
[0148]SEQ ID N0374-375是抗cMet抗体奥那单抗和TFc39Egy4重链的aa序列和核苷酸序列；图14。
[0149]SEQ ID N0376-377是包含抗cMet重链Fab域、西妥昔单抗抗EGFR scFv以及TFc23E(SEQ ID NO:303)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
[0150]SEQ ID N0378-379是包含抗cMet重链Fab域、帕尼单抗抗EGFR scFv以及TFc23E(SEQ ID NO:303)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
[0151]SEQ ID N0380-381 是包含抗 cMet 重链Fab 域、2224抗EGFR scFv 以及 TFc23E (SEQID NO:303)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
[0152]SEQ ID N0382-383是包含抗cMet重链Fab域、西妥昔单抗抗EGFR scFv以及TFc39Egy4 (SEQ ID NO:394)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
[0153]SEQ ID N0384-385是包含抗cMet重链Fab域、帕尼单抗抗EGFR scFv以及TFc39Egy4 (SEQ ID NO:394)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
[0154]SEQ ID N0386-387 是包含抗 cMet 重链 Fab 域、2224 抗 EGFR scFv 以及TFc39Egy4 (SEQ ID NO:394)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
[0155]对于图17中所公开的序列，双下划线是铰链，单下划线是CH3域，第二双下划线是第二铰链，第二下划线是第二 CH3。
[0156]SEQ ID N0388-389是糖基`化突变体I的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体I包含CH2域中的N297D/T299S::N297D/T299S氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C末端半胱氨酸KSCDKT:: T366W/CH3C末端半胱氨酸GEC ；图17SEQ ID N0390-391是糖基化突变体2的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体2包含CH2域中的T299K::N297D/T299S氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C 末端半胱氨酸 KSCDKT:: T366W/CH3C 末端半胱氨酸 GEC ;图 17。
[0157]SEQ ID N0392-393是糖基化突变体3的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体3包含CH2域中的N297D/T299S::T299K氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C 末端半胱氨酸 KSCDKT:: T366W/CH3C 末端半胱氨酸 GEC ;图 17。
[0158]SEQ ID N0394-395是糖基化突变体4的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体4包含CH2域中的T299K::T299D氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C 末端半胱氨酸 KSCDKT:: T366W/CH3C 末端半胱氨酸 GEC ;图 17。
[0159]SEQ ID N0396-397是糖基化突变体5的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体5包含CH2域中的T299D::T299K氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C 末端半胱氨酸 KSCDKT:: T366W/CH3C 末端半胱氨酸 GEC ;图 17。
[0160]SEQ ID Ν0398-399是糖基化突变体6的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体6包含CH2域中的T299D::T299D氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C 末端半胱氨酸 KSCDKT:: T366W/CH3C 末端半胱氨酸 GEC ;图 17。
[0161]详述
[0162]本文中提供串联Fe抗体(“TFcA”)，例如串联Fe双特异性抗体(“TFcBA”)。所述分子可以用于治疗细胞增殖性病症，例如癌症。
[0163]定义[0164]为了方便起见，以下提供本说明书、实施例以及所附权利要求书中所使用的某些术语和短语的含义。
[0165]“aa修饰”或“aa变化”是指对aa序列的一个或多个氨基酸(aa)缺失、添加或取代。aa序列插入包括长度在一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基末端和/或羧基末端融合物，以及单个或多个aa残基的序列内插入。序列内插入一般地可以在约I至10个残基范围内，例如I至5，例如I至3。
[0166]“AEM”或“缔合增强修饰”是指对CH3域进行以增强其与另一个CH3域的缔合的aa修饰。AEM可以在TFc的一个或两个Fe中包含一个或多个aa取代、缺失或添加。AEM是按模块分类，例如模块1( “AEM1”)，其中对两个CH3域之一的修饰称为AEM1.1，且对另一个CH3域的修饰称为AEM1.2。举例来说，AEM1.1由取代T366S/L368A与Y407V的组合组成，而AEM1.2由aa取代T366W组成。当CH3域包含两个或更多aa修饰，例如aa取代时，这些修饰以“/”彼此隔开。当指的是两个CH3域中的修饰时，各CH3域中的修饰以“::”隔开。
[0167]“氨基酸取代”是指蛋白质中的一个特定氨基酸(“aa”)被另一个aa置换。取代可以是如下文所定义的保守取代。“抗C-Met结合位点”是指特异性结合人类C-Met的结合位点。“抗EGFR结合位点”是指特异性结合人类EGFR的结合位点。
[0168]“抗原结合位点”是指包含抗体或其至少一个⑶R的VH域和/或VL域的结合位点，条件是所述抗原结合位点特异性结合其标靶抗原。举例来说，抗原结合位点可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成:单独VHCDR3，或与VHCDR2且任选地与VHCDRl —起。在某些实施方案中，抗原结合位点包含可能存在于同一多肽上或两个不同的多肽上VH域和VL域,例如，VH域存在于重链上,而VL域存在于轻链上。
[0169]抗体的“抗原结合部分”是指保留特异性结合抗原(例如c-met或EGFR)的能力的一个或多个抗体片段。已证明抗体的抗原结合功能可以被全长抗体的片段保留。术语抗体的“抗原结合部分”内所涵·盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL以及CHl域组成的单价片段；(ii)F(ab’ )2片段，即包含在铰链区处由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH域和CHl域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL域和VH域组成的Fv片段；(ν)由VH域组成的dAb片段；以及(vi)分离的互补性决定区(“CDR”)。此外，尽管VL和VH是Fv片段的两个域，VL和VH是由独立的基因编码，但它们可以使用重组法由合成接头接合，所述合成接头使它们能够成为其中VL区与VH区配对以形成称作单链Fv(scFv)的单价蛋白质的单一蛋白质链(参见例如美国专利第5，892，019号)。所述单链抗体也打算涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。还涵盖单链抗体的其它形式，如双链抗体。双链抗体是二价双特异性抗体，其中VH域和VL域表达于单一多肽链上，但使用因过短而无法允许同一链上的两个域配对，从而促使这些域与另一个链的互补域配对并且产生两个抗原结合位点的接头。
[0170]“结合亲和力”是指结合相互作用的强度并且包括实际结合亲和力以及表观结合亲和力两者。实际结合亲和力是缔合速率相对于解离速率的比率。表观亲和力可以包括例如由多价相互作用引起的亲合力。解离常数(Kd)典型地为结合亲和力的倒数，并且可以使用表面等离子共振测定(例如，如用BIAC0RE3000仪器(GE Healthcare)确定，例如使用重组EGFR作为分析物且使用抗EGFR抗体作为配体)或细胞结合测定来方便地测量，所述测定各自描述于美国专利第7，846，440号的实施例3中。[0171]“结合部分”、“结合域”或“结合位点”是指结合多肽或在有规定时指其重链或轻链中直接参与调节抗体与标靶分子(即，抗原)特异性结合的部分、区域或位点。示例性结合域包括抗原结合位点、配体的受体结合域、受体的配体结合域或酶域。在优选实施方案中，结合域包含以下或由以下组成:抗原结合位点(例如，包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列)或抗体的放在交替框架区(例如任选地包含一个或多个aa取代的人类框架区)中的六个CDR。在某些实施方案中，结合位点可能基本上仅由VH或VL链序列构成。结合位点可以全部来自一个物种,例如它仅具有来源于一个物种的生殖系序列的序列。举例来说，结合位点可以是人类(即，来自人类)、小鼠或大鼠的。结合位点还可以是经过人源化的，即，CDR来自于一个物种，而框架(FR)来自于另一个物种。举例来说，结合位点可以具有来源于小鼠抗体的CDR和来自人类的FR。某些人源化结合位点在一个或多个CDR中包含突变以使所述CDR看起来更像供体抗体的CDR。某些人源化抗体还可以在一个或多个FR中包含突变。一般来说，结合位点中的突变可以增强结合位点与其标靶抗原的结合亲和力，和/或它们可以稳定所述结合位点，例如延长其半衰期。
[0172]“⑶R”或“互补性决定区”是指在重链多肽和轻链多肽两者的可变区内发现的非连续抗原结合位点。以下文献已经描述了这些特定区域:Kabat等，J.Biol.Chem.252, 6609-6616 (1977)和 Kabat 等,Sequences of protein of immunologicalinterest.(1991)；及 Chothia 等,J.Mol.Biol.196:901-917 (1987)和 MacCallum 等,J.Mol.Biol.262:732-745 (1996)，其中当相对于彼此进行比较时，所述定义包括重叠aa残基或aa残基子集。阐述了涵盖如以上各引用参考文献所定义的CDR的aa残基以供比较。如本文中所使用且如果没有另外规定，则“CDR”如Kabat所定义。
[0173]表1.CDR 定义
【权利要求】
1.一种抗体，其为串联Fe双特异性抗体(“TFcBA”)，其中所述TFcBA包含为单一抗C-Met结合位点的第一结合位点和至少一个特异性结合除C-Met以外的细胞表面受体的第二结合位点；任选地，细胞表面受体选自ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、EGFR、VEGFRl、VEGFR2、TNFR、FGFRl、FGFR2、FGFR3、FGFR4、PDGFR a、PDGFR β、c_Kit、AXL、ALK、CEA、OT44、EPCAM以及EphA2，其中所述抗c_Met结合位点和所述第二结合位点经由串联Fe ( “TFc”)连接； 所述TFc包含第一 Fe区和第二 Fe区，各所述第一 Fe区和第二 Fe区具有C末端和N末端；所述第一 Fe区和所述第二 Fe区经由具有C末端和N末端的TFc接头连接以形成连续多肽；且 所述第一 Fe区与所述第二 Fe区缔合以形成Fe 二聚体。
2.根据权利要求1所述的TFcBA，其中 a.所述TFcBA抑制由HGF和由所述至少一个第二结合位点特异性结合的受体的同源配体中的任一者或两者诱导的信号转导，其中IC50等于或小于IOnM或者等于或小于InM或者等于或小于ΙΟΟρΜ，或最大抑制百分比为至少70%或至少80%或至少90%，如对c-Met和由所述至少一个第二结合位点特异性结合的所述受体中的任一者或两者的磷酸化的抑制所指示；或 b.所述TFcBA在细胞中的表达产生(i)更多正确形成的TFcAB分子，相对于不包含TFc的多价抗体的表达而言；或(ii)超过80%正确形成的TFcAB分子，如利用尺寸排除色谱法(SEC)所确定。
3.根据权利要 求1或2所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区分别包含第一 CH3域和第二 CH3域，各所述CH3域具有C末端和N末端。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区分别包含第一 CH2域和第二 CH2域，各所述CH2域具有C末端和N末端。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区分别包含第一铰链和第二铰链，所述第一铰链和所述第二铰链各自具有C末端和N末端。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的TFcBA，其中所述第二铰链不包含上铰链亚域。
7.根据权利要求6所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一 CH2域、第一 CH3域、TFc接头、第二 CH2域以及第二 CH3域。
8.根据权利要求6所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、TFc接头、第二 CH2域以及第二 CH3域。
9.根据权利要求6所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、TFc接头、第二铰链、第二 CH2域以及第二CH3 域。
10.根据权利要求9所述的TFcBA，其中所述第一铰链包含上铰链亚域、核心铰链亚域以及下铰链亚域，且所述第二铰链包含核心铰链亚域和下铰链亚域，但不包含上铰链亚域，各所述铰链亚域具有C末端和N末端。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的TFcBA，其中所述TFcBA所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链，所述第一铰链在其C末端处连接至第一 CH2域的N末端，所述第一 CH2域在其C末端处连接至第一 CH3域的N末端，所述第一 CH3域在其C末端处连接至TFc接头的N末端，所述TFc接头在其C末端处连接至第二铰链的N末端，所述第二铰链在其C末端处连接至第二 CH2域的N末端，所述第二 CH2域在其C末端处连接至第二 CH3域的N末端。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc接头包含20到50个BBS ο
13.根据权利要求12所述的TFcBA，其中所述TFc接头是Gly-Ser接头。
14.根据权利要求13所述的TFcBA，其中所述TFc接头包含(Gly4Ser)n，其中η为4、5、6、7 或 8。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc是IgGlTFc。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc是杂合TFc。
17.根据权利要求16所述的TFcBA，其中所述TFc是IgGl/IgG4TFc。
18.根据权利要求15所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一IgGl铰链、第一 IgGlCH2域、第一 IgGlCH3域、TFc接头、第二 IgGl铰链、第二 IgGlCH2域以及第二 IgGlCH3域。
19.根据权利要求17所述的TFcBA，其中所述杂合TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一 IgGl/IgG4 铰链、第一 IgG4CH2 域、第一 IgGlCH3 域、TFc 接头、第二 IgG4 铰链、第二IgG4CH2 域以及第二 IgGl·CH3 域。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二 CH3域中的任一者或两者包含一个或多个aa修饰，所述修饰能增强或稳定所述第一 Fe区与所述第二 Fe区之间的结合。
21.根据权利要求20所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二 CH3域各自包含氨基酸修饰，所述修饰是能增强所述第一 CH3域与所述第二 CH3域的缔合的缔合增强修饰(“AEM”)。
22.根据权利要求21所述的TFcBA，其中所述AEM是由从由AEM模块1、AEM模块2、AEM模块3以及AEM模块4组成的群组中选出的模块构成。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区中的任一者或两者包含aa修饰，所述修饰添加半胱氨酸作为插入或置换，所述半胱氨酸与另一个Fe区中的半胱氨酸一起形成二硫键(“DiS”修饰)。
24.根据权利要求23所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区中的任一者或两者在铰链中包含DiS修饰。
25.根据权利要求23所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区中的任一者或两者在CH3域中包含DiS修饰。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的TFcBA，其中所述DiS修饰由DiS模块I或DiS模块2构成。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二 CH3域各自包含一个或多个AEM修饰和一个或多个DiS修饰。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二 CH3域中的任一者或两者所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:27_98组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性或与其在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同。
29.根据权利要求28所述的TFcBA，其中所述第一CH3域或所述第二 CH3域所包含的aa序列是从由SEQ ID NO: 27_98组成的群组中选出。
30.根据权利要求1至28中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二 CH3域一起包含两个不同的成员的配对，各成员是CH3aa序列，各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出:SEQ ID NO:31 和 35;SEQ ID NO:33 和 37;SEQ ID NO:39 和 43;SEQ IDN0:41 和 45;SEQ ID NO:47和51;SEQ ID NO:49和53;SEQ ID NO:55和59;SEQ ID NO:57和 61;SEQ ID NO:63和67;SEQ ID NO:65和69;SEQ ID NO:71和73;SEQ ID NO: 72 和 74;SEQ ID NO: 75 和 79 ；SEQ ID NO: 77 和 81 ；SEQ ID NO: 83 和 85 ；SEQ ID NO: 84 和 86 ；SEQ IDNO:87和89;SEQ ID N0:88和90;SEQ ID NO:91 和 93;SEQ ID NO:92和94;SEQ ID NO:95和97 ;以及SEQ ID NO:96和98，各成员aa序列与各所述配对的各序列具有至少70%同一性，或在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一 CH3域所包含的配对成员与所述第二 CH3域所包含的配对成员不同。
31.根据权利要求30所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二 CH3域各自所包含的aa序列与从由以下各项组成的群组中选出的CH3aa序列配对的一个成员的aa序列相同:SEQ ID NO:31 和 35;SEQ ID NO:33 和 37;SEQ ID NO:39 和 43;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID NO: 47 和 51 ；SEQ ID NO: 49 和 53 ；SEQ ID NO: 55 和 59 ；SEQ ID NO: 57 和 61 ；SEQ IDNO:63和67;SEQ ID NO:65和69;SEQ ID NO:71 和 73;SEQ ID NO:72和74;SEQ ID NO:75和 79;SEQ ID NO:77和81;SEQ ID NO:83和85;SEQ ID N0:84和86;SEQ ID NO:87 和 89;SEQ ID NO:88 和 90;SEQ ID NO:91 和 93;SEQ ID NO:92 和 94;SEQ ID NO:95 和 97;以及SEQ ID NO:96 和 98。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的TFcBA，其中所述第一铰链所包含的aa序列与从由SEQ ID N0:4、18、19、20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列在至多3个aa缺失、添加或取代方面不同。
33.根据权利要求32所述的TFcBA，其中所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQIDN0:4、18、19、20、21、22、263-265`以及267-273组成的群组中选出的aa序列。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的TFcBA，其中所述第二铰链所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:23、24、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列在至多3个aa缺失、添加或取代方面不同。
35.根据权利要求34所述的TFcBA，其中所述第二铰链所包含的aa序列是从由SEQIDNO: 23,24,263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的TFcBA，其包含CH2域，所述CH2域所包含的aa序列与SEQ ID NO: 25、26、261或262具有至少70%同一性或与其在至多30个aa缺失、添加或取代方面不同。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、第二铰链、第二 CH2域以及第二 CH3域，其中 a.所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQID NO:4、18、19、263_265以及267-273组成的群组中选出； b.所述第一CH2域经去糖基化且包含如SEQ ID NO: 25所示出的aa序列； c.所述第一CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ ID N0:31 和 35;SEQ ID N0:33 和 37;SEQ ID NO:3943 ;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID N0:47 和 51;SEQ ID N0:49 和 53;SEQ ID NO:55 和 59;SEQ ID NO: 57 和 61 ；SEQ ID NO: 63 和 67 ；SEQ ID NO: 65 和 69 ；SEQ ID NO: 71 和 73 ；SEQ IDN0:72 和 74;SEQ ID N0:75和79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID NO:84和 86;SEQ ID N0:87和89;SEQ ID N0:88和90;SEQ ID N0:91和93;SEQ ID NO:92 和 94;SEQ ID NO:95 和 97 ;以及 SEQ ID NO:96 和 98 ； d.所述第二铰链所包含的aa序列由从SEQID NO: 23、263_265以及267-273组成的群组中选出的序列组成； e.所述第二CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO: 25中所示出的aa序列；且 f.所述第二CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ ID N0:31 和 35;SEQ ID N0:33 和 37;SEQ ID NO:3943 ;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID N0:47 和 51;SEQ ID N0:49 和 53;SEQ ID NO:55 和 59;SEQ ID NO: 57 和 61 ；SEQ ID NO: 63 和 67 ；SEQ ID NO: 65 和 69 ；SEQ ID NO: 71 和 73 ；SEQ IDN0:72 和 74;SEQ ID N0:75和79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID NO:84和 86;SEQ ID N0:87和89;SEQ ID N0:88和90;SEQ ID N0:91和93;SEQ ID NO: 92 和 94;SEQ ID NO:95和97 ;以及SEQ ID NO:96和98，其中如果所述第一 CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二 CH3域包含所述序列配对的第二序列；且如果所述第一 CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二 CH3域包含所述序列配对的第一序列。
38.根据权利要求1至36中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、第二铰链、第二 CH2域以及第二 CH3域，其中 a.所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQID NO: 20、21、22、263_265以及267-273组成的群组中选出；· b.所述第一CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO: 26中所示出的aa序列； c.所述第一CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ ID N0:31 和 35;SEQ ID N0:33 和 37;SEQ ID NO:3943 ;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID N0:47 和 51;SEQ ID N0:49 和 53;SEQ ID NO:55 和 59;SEQ ID NO: 57 和 61 ；SEQ ID NO: 63 和 67 ；SEQ ID NO: 65 和 69 ；SEQ ID NO: 71 和 73 ；SEQ IDN0:72 和 74;SEQ ID N0:75和79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID NO:84和 86;SEQ ID N0:87和89;SEQ ID N0:88和90;SEQ ID N0:91和93;SEQ ID NO:92 和 94;SEQ ID NO:95 和 97 ;以及 SEQ ID NO:96 和 98 ； d.所述第二铰链所包含的aa序列由SEQID NO:24,263-265以及267-273组成； e.所述第二CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO: 26中所示出的aa序列；且 f.所述第二CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ ID N0:31 和 35;SEQ ID N0:33 和 37;SEQ ID NO:3943 ;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID N0:47 和 51;SEQ ID N0:49 和 53;SEQ ID NO:55 和 59;SEQ ID NO: 57 和 61 ；SEQ ID NO: 63 和 67 ；SEQ ID NO: 65 和 69 ；SEQ ID NO: 71 和 73 ；SEQ IDN0:72 和 74;SEQ ID N0:75和79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID NO:84和 86;SEQ ID N0:87和89;SEQ ID N0:88和90;SEQ ID N0:91和93;SEQ ID NO: 92 和 94;SEQ ID NO: 95和97 ;以及SEQ ID NO: 96和98，其中如果所述第一 CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二 CH3域包含所述序列配对的第二序列；且如果所述第一 CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二 CH3域包含所述序列配对的第一序列。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fe区或所述第二 Fe区所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性或与其在至多50个aa缺失、添加或取代方面不同。
40.根据权利要求39中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fe区或所述第二 Fe区所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出。
41.根据权利要求39所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二Fe区中的任一者或两者所包含的aa序列与从由以下各项组成的群组中选出的aa序列配对中的一个aa序列具有至少 70% 同一性:SEQ ID NO:99 和 100 ;SEQ ID NO: 101 和 102 ;SEQ ID NO: 103 和 104;SEQ ID N0:105和106;SEQ ID NO: 107 和 108 ;SEQ ID NO: 109 和 110 ;SEQ ID NO: 111 和112 ；SEQ ID NO:113和 114；SEQ ID NO:115和 116 ；SEQ ID NO:117和 118 ；SEQ ID NO:119和 120 ；SEQ ID NO: 121 和 122 ；SEQ ID NO: 123 和 124 ；SEQ ID NO: 125 和 126 ；SEQ IDNO: 127 和 128 ；SEQ ID NO: 129 和 130 ；SEQ ID NO: 131 和 132 ；SEQ ID NO: 133 和 134 ；SEQID NO: 135 和 136 ；SEQ ID NO: 137 和 138 ；SEQ ID NO: 139 和 140 ；SEQ ID NO: 141 和 142 ；SEQ ID N0:143iP144;SEQ ID NO: 145 和 146 ;SEQ ID NO: 147 和 148 ;SEQ ID NO: 149 和150 ;SEQ ID NO:151和152;SEQ ID NO: 153 和 154 ;SEQ ID NO: 155 和 156 ;SEQ ID NO: 157和 158 ；SEQ ID NO: 159 和 160 ；SEQ ID NO: 161 和 162 ；SEQ ID NO: 163 和 164 ；以及 SEQ IDNO: 165和166，或与其在至多50个aa缺失、添加或取代方面不同，且其中所述第一 Fe区所包含的配对成员与所述第二 Fe区所包含的配对成员不同。
42.根据权利要求40所述的TFcBA，其中所述第一Fe区与所述第二 Fe区一起包含两个不同的成员的配对，各成员是Fe aa序列，其中各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出:SEQ ID NO: 99 和 100 ;SEQ ID NO: 101 和 102 ;SEQ ID NO: 103 和 104 ;SEQ ID NO: 105 和106 ；SEQ ID NO:107和 108 ；SEQ ID NO:109和 110 ;SEQ ID NO:111和 112 ;SEQ ID NO:113和 114 ；SEQ ID NO: 115 和 116 ；SEQ ID NO: 117 和 118 ；SEQ ID NO: 119 和 120 ;SEQ IDNO:120P122;SEQ ID NO: 123和 124 ;SEQ ID NO: 125和 126 ;SEQ ID NO: 127和 128 ;SEQ IDNO: 129 和 130 ；SEQ ID NO: 131 和 132 ；SEQ ID NO: 133 和 134 ；SEQ ID NO: 135 和 136 ；SEQID NO: 137 和 138 ；SEQ ID NO: 139 和 140 ；SEQ ID NO: 141 和 142 ；SEQ ID NO: 143 和 144 ；SEQ ID NO:145 和 146 ;SEQ ID NO: 147 和 148 ;SEQ ID NO: 149 和 150 ;SEQ ID NO: 151 和152 ；SEQ ID NO:153和154;SEQ ID NO: 155 和 156 ;SEQ ID NO: 157 和 158 ;SEQ ID NO: 159和 160 ；SEQ ID NO:161 和 162 ;SEQ ID NO: 163 和 164;以及 SEQ ID NO: 165 和 166，各成员aa序列与各所述配对的各序列具有至少70%同一性，或在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一 Fe区所包含的配对成员与所述第二 Fe区所包含的配对成员不同。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的TFcBA，其包含TFc，所述TFc所包含的aa序列与从由 SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219 以及221 组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性，或与其在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同。
44.根据权利要求43所述的TFcBA，其包含TFc，所述TFc所包含的aa序列是从由SEQID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、.205、207、209、211、213、215、217、219 以及 221 组成的群组中选出。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的TFcBA，其包含重链，所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含:第一重链可变(VH)域、TFc、连接性接头以及第二 VH域。
46.根据权利要求45所述的TFcBA，其中所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含:第一VH域、CHl域、TFc、连接性接头以及第二 VH域。
47.根据权利要求46所述的TFcBA，其中所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含:第一VH域、CHl域、TFc、连接性接头、第二 VH域、scFv接头以及第二轻链可变(VL)域，其中所述第二 VH域与所述第二 VL域缔合以形成第二结合位点。
48.根据权利要求47所述的TFcBA，其包含轻链，所述轻链包含第一VL域，所述第一 VL域与所述第一 VH域二聚以形成第一结合位点。
49.根据权利要求48所述的TFcBA，其中所述轻链包含轻链恒定(CL)域，所述CL域连接至所述VL域的羧基末端。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的TFcBA，其中所述第一结合位点是N末端结合位点，且所述第二结合位点是C末端结合位点。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的TFcBA，其中所述抗c-Met结合位点包含VH域，所述VH域包含以下各项中的任一者或两者:a)SEQ ID NO: 223或287中的VH互补性决定区(CDR) 3 (VHCDR3)的 aa 序列；和 b)VLCDR3，其包含 SEQ ID NO: 231 或 289 中的 VLCDR3的aa序列。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的TFcBA，其中所述c-Met结合位点包含VH域，所述VH域包含包括VHCDRl、V⑶R2以及VHCDR3的三个VH互补性决定区(OTR)的集合，其中VHCDRU VHCDR2 以及 VHCDR3 包含 SEQ ID NO: 223 或 231 中的 VHCDRl、VHCDR2 以及 VHCDR3的aa序列；及VL域，所述VL域包含包括VLCDRl、VLCDR2和VLCDR3的三个VLCDR的集合，其中 VLCDRl、VLCDR2 和 VLCDR3 分别包含 SEQ ID NO: 287 或 289 中的 VLCDRl、VLCDR2 和VLCDR3的aa序列。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的TFcBA，其中所述第二结合位点为包含以下两项中的任一者或两者的抗EGFR结合位点:a) VHCDR3，其包含SEQ ID NO: 233、237、258、.275、277或279 中的￥!?1?3的33序列;和 b) VLCDR3，其包含 SEQ ID NO: 233、237、258、.275、277或279中的VLCDR3的aa序列。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的TFcBA，其中所述第二结合位点为抗EGFR结合位点，其包含VH域，所述VH域包含包括VHCDRl、VCDR2以及VHCDR3的三个VHCDR的集合，其中 VHCDR1、VHCDR2 以及 VHCDR3 包含 SEQ ID NO:233、237、258、275、277 或 279 中的VHCDRl、VHCDR2以及VHCDR3的aa序列；及VL域，所述VL域包含包括VLCDRl、VLCDR2和VLCDR3 的三个 VLCDR 的集合，其中 VLCDRl、VLCDR2 和 VLCDR3 包含 SEQ ID NO: 233、237、.258、.275、277 或 279 中的 VLCDRl、VLCDR2 和 VLCDR3 的 aa 序列。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的TFcBA，其中所述抗c-Met结合位点包含所述重链的N末端部分和所述轻链的N末端部分。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的TFcBA，其中所述第二结合位点被完全被所述重链包含的C末端scFv包含。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的TFcBA，其中所述抗c-Met结合位点被VH域和VL域中的任一者或两者包含，其中所述VH域所包含的aa序列与SEQ ID N0:223、231、287或289中所示出的VH域具有至少70%同一性或与其在至多10个aa缺失、添加或取代方面不同；且所述VL域所包含的aa序列与SEQ ID NO: 223、231、287或289中所示出的VL域具有至少70%同一性或与其在至多10个aa缺失、添加或取代方面不同。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的TFcBA，其中所述第二结合位点为抗EGFR结合位点，其被VH域和VL域中的任一者或两者包含，其中所述VH域所包含的aa序列与SEQID NO:233、237、258、275、277或279中所示出的VH域具有至少70%同一性或与其在至多10个aa缺失、添加或取代方面不同；且所述VL域所包含的aa序列与SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中所示出的VL域具有至少70%同一性或与其在至多10个aa缺失、添加或取代方面不同。
59.—种Ab，其为TFcBA，其中所述TFcBA包含第一结合位点和第二结合位点，其中所述第一结合位点结合第一标靶且所述第二结合位点结合第二标靶，其中 所述第一结合位点与所述第二结合位点经由TFc连接； 所述TFc包含第一 Fe区和第二 Fe区，所述第一 Fe区和第二 Fe区各自具有C末端和N末端；所述第一 Fe区和所述第二 Fe区经由具有C末端和N末端的TFc接头连接以形成连续多肽； 所述第一 Fe区与所述第二 Fe区缔合以形成Fe 二聚体；且 所述第一 Fe区和所述第二 Fe区中的任一者或两者包含一个或多个aa修饰以增强或稳定所述第一 Fe区与所述第二 Fe区之间的结合。
60.根据权利要求59所述的TFcBA，其中· a.所述TFcBA抑制经由所述第一标靶和所述第二标靶中的任一者或两者进行的信号转导；或 b.所述TFcBA在细胞中的表达产生(i)更多正确形成的TFcAB分子，相对于不包含TFc的多价抗体的表达而言；或(?)超过80%正确形成的TFcAB分子，如利用尺寸排除色谱法(SEC)所确定。
61.根据权利要求59或60所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区分别包含第一 CH3域和第二 CH3域，所述CH3域各自具有C末端和N末端。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区分别包含第一 CH2域和第二 CH2域，所述CH2域各自具有C末端和N末端。
63.根据权利要求59至62中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区分别包含第一铰链和第二铰链，所述第一铰链和所述第二铰链各自具有C末端和N末端。
64.根据权利要求59至63中任一项所述的TFcBA，其中所述第二铰链不包含上铰链亚域。
65.根据权利要求64所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一 CH2域、第一 CH3域、TFc接头、第二 CH2域以及第二 CH3域。
66.根据权利要求64所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、TFc接头、第二 CH2域以及第二 CH3域。
67.根据权利要求64所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、TFc接头、第二铰链、第二 CH2域以及第二 CH3 域。
68.根据权利要求67所述的TFcBA，其中所述第一铰链包含上铰链亚域、核心铰链亚域以及下铰链亚域，且所述第二铰链包含核心铰链亚域和下铰链亚域，但不包含上铰链亚域，所述铰链亚域各自具有C末端和N末端。
69.根据权利要求59至68中任一项所述的TFcBA，其中所述TFcBA所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链，所述第一铰链在其C末端处连接至第一 CH2域的N末端，所述第一 CH2域在其C末端处连接至第一 CH3域的N末端，所述第一 CH3域在其C末端处连接至TFc接头的N末端，所述TFc接头在其C末端处连接至第二铰链的N末端，所述第二铰链在其C末端处连接至第二 CH2域的N末端，所述第二 CH2域在其C末端处连接至第二 CH3域的N末端。
70.根据权利要求59至69中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc接头包含20到50个BBS
71.根据权利要求70所述的TFcBA，其中所述TFc接头是Gly-Ser接头。
72.根据权利要求71所述的TFcBA，其中所述TFc接头包含(Gly4Ser)n，其中η为4、5、6、7 或 8。
73.根据权利要求59至72中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc是IgGlTFc。
74.根据权利要求59至72中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc是杂合TFc。
75.根据权利要求74所述的TFcBA，其中所述TFc是IgGl/IgG4TFc。
76.根据权利要求73所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一IgGl铰链、第一 IgGlCH2域、第一 IgGlCH3域、TFc接头、第二 IgGl铰链、第二 IgGlCH2域以及第二 IgGlCH3域。
77.根据权利要求75所述的TFcBA，其中所述杂合TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一 IgGl/IgG4 铰链、第一 IgG4CH2 域、第一 IgGlCH3 域、TFc 接头、第二 IgG4 铰链、第二IgG4CH2 域以及第二 IgGlCH3 域。
78.根据权利要求59至77中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域与所述第二CH3域中的任一者或两者包含一个或多个aa修饰，所述修饰能增强或稳定所述第一 Fe区与所述第二 Fe区之间的结合。
79.根据权利要求78所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二 CH3域各自包含氨基酸修饰，所述修饰是能增强所述第一 CH3域与所述第二 CH3域的缔合的缔合增强修饰(“AEM”)。
80.根据权利要求79所述的TFcBA，其中所述AEM是由从由AEM模块1、AEM模块2、AEM模块3以及AEM模块4组成的群组中选出的模块构成。
81.根据权利要求1至80中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区中的任一者或两者包含aa修饰，所述修饰添加半胱氨酸作为插入或置换，所述半胱氨酸与另一个Fe区中的半胱氨酸一起形成二硫键(“DiS”修饰)。
82.根据权利要求81所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区中的任一者或两者在铰链中包含DiS修饰。
83.根据权利要求81所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二 Fe区中的任一者或两者在CH3域中包含DiS修饰。
84.根据权利要求80至83中任一项所述的TFcBA，其中所述DiS修饰是由DiS模块I或DiS模块2构成。
85.根据权利要求59至84中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域各自包含一个或多个AEM修饰和一个或多个DiS修饰。
86.根据权利要求1至85中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二 CH3域中的任一者或两者所包含的aa序列与从由SEQ ID NO: 27_98组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性或与其在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同。
87.根据权利要求28所述的TFcBA，其中所述第一CH3域或所述第二 CH3域所包含的aa序列是从由SEQ ID NO: 27_98组成的群组中选出。
88.根据权利要求1至86中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二 CH3域一起包含两个不同的成员的配对，各成员是CH3aa序列，各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出:SEQ ID NO:31 和 35;SEQ ID NO:33 和 37;SEQ ID NO:39 和 43;SEQ IDN0:41 和 45;SEQ ID NO:47和51;SEQ ID N0:49 和 53;SEQ ID NO:55和59;SEQ ID NO: 57和 61;SEQ ID NO:63和67;SEQ ID NO:65和69;SEQ ID NO:71和73;SEQ ID NO: 72 和 74;SEQ ID NO: 75 和 79 ；SEQ ID NO: 77 和 81 ；SEQ ID NO: 83 和 85 ；SEQ ID NO: 84 和 86 ；SEQ IDNO:87和89;SEQ ID N0:88和90;SEQ ID NO:91 和 93;SEQ ID NO:92和94;SEQ ID NO:95和97 ；以及SEQ ID NO:96和98，各成员aa序列与各所述配对的各序列具有至少70%同一性，或在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一 CH3域所包含的配对成员与所述第二 CH3域所包含的配对成员不同。
89.根据权利要求88所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二 CH3域各自所包含的aa序列与从由以下各项组成的群组中选出的CH3aa序列配对的一个成员的aa序列相同:SEQ ID NO:31 和 35;SE·Q ID NO:33 和 37;SEQ ID NO:39 和 43;SEQ ID NO:41 和 45;SEQ ID NO: 47 和 51 ；SEQ ID NO: 49 和 53 ；SEQ ID NO: 55 和 59 ；SEQ ID NO: 57 和 61 ；SEQ IDNO:63和67;SEQ ID NO:65和69;SEQ ID NO:71 和 73;SEQ ID NO:72和74;SEQ ID NO:75和 79;SEQ ID NO:77和81;SEQ ID NO:83和85;SEQ ID N0:84和86;SEQ ID NO:87 和 89;SEQ ID NO:88 和 90;SEQ ID NO:91 和 93;SEQ ID NO:92 和 94;SEQ ID NO: 95 和 97;以及SEQ ID NO:96 和 98。
90.根据权利要求59至89中任一项所述的TFcBA，其中所述第一铰链所包含的aa序列与从由SEQ ID N0:4、18、19、20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列在至多3个aa缺失、添加或取代方面不同。
91.根据权利要求90所述的TFcBA，其中所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQIDN0:4、18、19、20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列。
92.根据权利要求59至91中任一项所述的TFcBA，其中所述第二铰链所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:23、24、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列在至多3个aa缺失、添加或取代方面不同。
93.根据权利要求92所述的TFcBA，其中所述第二铰链所包含的aa序列是从由SEQIDNO: 23,24,263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列。
94.根据权利要求59至93中任一项所述的TFcBA，其包含CH2域，所述CH2域所包含的aa序列与SEQ ID NO: 25、26、261或262具有至少70%同一性或与其在至多30个aa缺失、添加或取代方面不同。
95.根据权利要求1至94中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、第二铰链、第二 CH2域以及第二 CH3域，其中 a.所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQID NO:4、18、19、263_265以及267-273组成的群组中选出； b.所述第一CH2域经去糖基化且包含如SEQ ID NO: 25所示出的aa序列； c.所述第一CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ ID N0:31 和 35;SEQ ID N0:33 和 37;SEQ ID NO:3943 ;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID N0:47 和 51;SEQ ID N0:49 和 53;SEQ ID NO:55 和 59;SEQ ID N0:57和 61 ；SEQ ID N0:63和 67 ；SEQ ID N0:65和 69 ；SEQ ID N0:71 和 73 ；SEQ IDN0:72 和 74;SEQ ID N0:75和79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID NO:84和 86;SEQ ID N0:87和89;SEQ ID N0:88和90;SEQ ID N0:91和93;SEQ ID NO:92 和 94;SEQ ID NO:95 和 97 ;以及 SEQ ID NO:96 和 98 ； d.所述第二铰链所包含的aa序列由从SEQID NO: 23、263_265以及267-273组成的群组中选出的序列组成； e.所述第二CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO: 25中所示出的aa序列；且 f.所述第二CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ ID N0:31 和 35;SEQ ID N0:33 和 37;SEQ ID NO:3943 ;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID N0:47 和 51;SEQ ID N0:49 和 53;SEQ ID NO:55 和 59;SEQ ID NO: 57 和 61 ；S·EQ ID NO: 63 和 67 ；SEQ ID NO: 65 和 69 ；SEQ ID NO: 71 和 73 ；SEQ IDN0:72 和 74;SEQ ID N0·:75和79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID NO:84和 86;SEQ ID N0:87和89;SEQ ID N0:88和90;SEQ ID N0:91和93;SEQ ID NO:92 和 94;SEQ ID NO: 95和97 ;以及SEQ ID NO: 96和98，其中如果所述第一 CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二 CH3域包含所述序列配对的第二序列；且如果所述第一 CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二 CH3域包含所述序列配对的第一序列。
96.根据权利要求59至94中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含:第一铰链、第一 CH2域、第一 CH3域、第二铰链、第二 CH2域以及第二 CH3域，其中 a.所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQID NO: 20、21、22、263_265以及267-273组成的群组中选出； b.所述第一CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO: 26中所示出的aa序列； c.所述第一CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ ID N0:31 和 35;SEQ ID N0:33 和 37;SEQ ID NO:39·43 ;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID N0:47 和 51;SEQ ID N0:49 和 53;SEQ ID NO:55 和 59;SEQ ID NO: 57 和 61 ；SEQ ID NO: 63 和 67 ；SEQ ID NO: 65 和 69 ；SEQ ID NO: 71 和 73 ；SEQ IDN0:72 和 74;SEQ ID N0:75和79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID NO:84和 86;SEQ ID N0:87和89;SEQ ID N0:88和90;SEQ ID N0:91和93;SEQ ID NO:92 和 94;SEQ ID NO:95 和 97 ;以及 SEQ ID NO:96 和 98 ； d.所述第二铰链所包含的aa序列由SEQID NO:24,263-265以及267-273组成； e.所述第二CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO: 26中所示出的aa序列；且f.所述第二 CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列:SEQ ID N0:31 和 35;SEQ ID N0:33 和 37;SEQ ID NO:39.43 ;SEQ ID N0:41 和 45;SEQ ID N0:47 和 51;SEQ ID N0:49 和 53;SEQ ID NO:55 和 59;SEQ ID NO: 57 和 61 ；SEQ ID NO: 63 和 67 ；SEQ ID NO: 65 和 69 ；SEQ ID NO: 71 和 73 ；SEQ IDN0:72 和 74;SEQ ID N0:75和79;SEQ ID N0:77和81;SEQ ID N0:83和85;SEQ ID NO:84和 86;SEQ ID N0:87和89;SEQ ID N0:88和90;SEQ ID N0:91和93;SEQ ID NO:92 和 94;SEQ ID NO:95和97 ;以及SEQ ID NO:96和98，其中如果所述第一 CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二 CH3域包含所述序列配对的第二序列；且如果所述第一 CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二 CH3域包含所述序列配对的第一序列。
97.根据权利要求59至96中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fe区或所述第二 Fe区所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性或与其在至多50个aa缺失、添加或取代方面不同。
98.根据权利要求97中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fe区或所述第二 Fe区所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出。
99.根据权利要求97所述的TFcBA，其中所述第一Fe区和所述第二Fe区中的任一者或两者所包含的aa序列与从由以下各项组成的群组中选出的aa序列配对中的一个aa序列具有至少 70% 同一性:SEQ ID NO:99 和 100 ;SEQ ID NO: 101 和 102 ;SEQ ID NO: 103 和 104;SEQ ID N0:105和106;SEQ ID NO: 107 和 108 ;SEQ ID NO: 109 和 110 ;SEQ ID NO: 111 和.112 ；SEQ ID NO:113和 114 ；SEQ ID NO:115和 116 ；SEQ ID NO:117和 118 ；SEQ ID NO:119和 120 ；SEQ ID NO: 121 和 122 ；SEQ ID NO: 123 和 124 ；SEQ ID NO: 125 和 126 ；SEQ IDNO: 127 和 128 ；SEQ ID NO: 129 和 130 ；SEQ ID NO: 131 和 132 ；SEQ ID NO: 133 和 134 ；SEQID NO: 135 和 136 ；SEQ ID NO: 137 和 138 ；SEQ ID NO: 139 和 140 ；SEQ ID NO: 141 和 142 ；SEQ ID N0:143^P144;SEQ ID NO: 145 和 146 ;SEQ ID NO: 147 和 148 ;SEQ ID NO: 149 和.150 ;SEQ ID NO:151和152;SEQ ID NO: 153 和 154 ;SEQ ID NO: 155 和 156 ;SEQ ID NO: 157和 158 ;SEQ ID NO: 159 和 160 ；SEQ ID NO: 161 和 162 ；SEQ ID NO: 163 和 164;以及 SEQ IDNO: 165和166，或与其在至多50个aa缺失、添加或取代方面不同，且其中所述第一 Fe区所包含的配对成员与所述第二 Fe区所包含的配对成员不同。
100.根据权利要求99所述的TFcBA，其中所述第一Fe区与所述第二 Fe区一起包含两个不同的成员的配对，各成员是Fe aa序列，其中各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出:SEQ ID NO:99 和 100 ;SEQ ID NO: 101 和 102 ;SEQ ID NO: 103 和 104 ;SEQ IDN0:105和106;SEQ ID NO: 107和 108 ;SEQ ID NO: 109和 110 ;SEQ ID NO: 111和 112 ;SEQ IDNO:113和114;SEQ ID NO: 115和 116 ;SEQ ID NO: 117和 118 ;SEQ ID N0:119和120;SEQ IDNO:120P122;SEQ ID NO: 123和 124 ;SEQ ID NO: 125和 126 ;SEQ ID NO: 127和 128 ;SEQ IDNO: 129 和 130 ；SEQ ID NO: 131 和 132 ；SEQ ID NO: 133 和 134 ；SEQ ID NO: 135 和 136 ；SEQID NO: 137 和 138 ；SEQ ID NO: 139 和 140 ；SEQ ID NO: 141 和 142 ；SEQ ID NO: 143 和 144 ；SEQ ID NO:145 和 146 ;SEQ ID NO: 147 和 148 ;SEQ ID NO: 149 和 150 ;SEQ ID NO: 151 和.152 ；SEQ ID NO:153和154;SEQ ID NO: 155 和 156 ;SEQ ID NO: 157 和 158 ;SEQ ID NO: 159和 160 ；SEQ ID NO: 161 和 162 ；SEQ ID NO: 163 和 164;以及 SEQ ID NO: 165 和 166，各成员aa序列与各所述 配对的各序列具有至少70%同一性，或在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一 Fe区所包含的配对成员与所述第二 Fe区所包含的配对成员不同。
101.根据权利要求59至100中任一项所述的TFcBA，其包含TFc，所述TFc所包含的aa序列与从由以下各项组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性:SEQ ID NO: 171,173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219以及221，或与其在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同。
102.根据权利要求101所述的TFcBA，其包含TFc，所述TFc所包含的aa序列是从由以下各项组成的群组中选出:SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219 以及 221。
103.根据权利要求59至102中任一项所述的TFcBA，其包含重链，所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含:第一重链可变(VH)域、TFc、连接性接头以及第二 VH域。
104.根据权利要求103所述的TFcBA，其中所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含:第一 VH域、CHl域、TFc、连接性接头以及第二 VH域。
105.根据权利要求104所述的TFcBA，其中所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含:第一 VH域、CHl域、TFc、连接性接头、第二 VH域、scFv接头以及第二轻链可变(VL)域，其中所述第二 VH域与所述第二 VL域缔合以形成第二结合位点。
106.根据权利要求105所述的TFcBA，其包含轻链，所述轻链包含第一VL域，所述第一VL域与所述第一 VH域二聚以形成第一结合位点。
107.根据权利要求106所述的TFcBA，其中所述轻链包含连接至所述VL域的羧基末端的轻链恒定(CL)域。
108. 根据权利要求59至107中任一项所述的TFcBA，其中所述第一结合位点是抗c-Met结合位点，且所述第二结合位点是抗EGFR结合位点。
109.一种单价TFcA，其包含与TFc连接的结合位点，所述TFc包含经由TFc接头连接的第一 Fe区和第二 Fe区，其中所述第一 Fe区和所述第二 Fe区缔合以形成Fe，且其中所述第一 Fe区和所述第二 Fe区中的任一者或两者包含一个或多个aa修饰以增强或稳定所述第一 Fe区与所述第二 Fe区之间的结合。
110.根据权利要求1至109中任一项所述的TFcA或TFcBA，其为电荷互补配对型TFcA或TFcBA，其中 电荷互补配对型TFcA或TFcBA是包含一对带电氨基酸的TFcA或TFcBA，所述一对带电氨基酸包含选自群组A的氨基酸和选自群组B的氨基酸(电荷互补对)； 其中群组A包含pi大于7的所有天然氨基酸，且群组B包含pi小于7的所有天然氨基酸，或任选地，其中群组A包含His、Lys以及Arg,且群组B包含Asp、Glu、Asn、Phe、Gln、Tyr> Ser、Met、Thr、lie、Gly、Val、Trp> Leu、Ala 以及 Pro ;且 所述电荷互补对由第一氨基酸残基和第二氨基酸残基组成；并且 所述电荷互补对为297位电荷互补对或299位电荷互补对，其中 297位电荷互补对是所述第一氨基酸残基位于所述第一 Fe区的EU297位且所述第二氨基酸残基位于所述第二 Fe区的EU297位的电荷互补对，并且299位电荷互补对是所述第一氨基酸残基位于所述第一 Fe区的EU299位且所述第二氨基酸残基位于所述第二 Fe区的EU299位的电荷互补对。
111.根据权利要求110所述的电荷互补配对型TFcA或TFcBA，其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA包含297位电荷互补对和299位电荷互补对，其中所述297位电荷互补对的第一氨基酸残基和第二氨基酸残基与所述299位电荷互补对的第一氨基酸残基和第二氨基酸残基相同或不同。
112.根据权利要求110或111所述的电荷互补配对型TFcA或TFcBA，其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA包含297位电荷互补对，且其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA与不是电荷互补配对型TFcA或TFcBA但除了对应于所述第一氨基酸残基和所述第二氨基酸残基的氨基酸残基都是由相同带电氨基酸组成的残基以外与所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA —致的TFcA或TFcBA相比更稳定，所述相同带电氨基酸是所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA的297位电荷互补对的氨基酸之一。
113.根据权利要求110、111或112所述的电荷互补配对型TFcA或TFcBA，其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA包含299位电荷互补对，且其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA与不是电荷互补配对型TFcA或TFcBA但除了对应于所述第一氨基酸残基和所述第二氨基酸残基的氨基酸残基都是由相同带电氨基酸组成的残基以外与所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA —致的TFcA或TFcBA相比更稳定，所述相同带电氨基酸是所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA的299位电荷互补对的氨基酸之一。
114.根据权利要求59至113中任一项所述的TFcA或TFcBA，其中所述第一结合位点或所述第二结合位点特异性结合从由以下各项组成的群组中选出的人类蛋白质:ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、Ron、c-Met, EGFR、VEGFRl、VEGFR2、TNFR、FGFR1FGFR2、FGFR3、FGFR4、PDGFR a、PDGFR β、c_Kit、EPCAM 以及 EphA2。
115.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至114中任一项所述的TFcA或TFcBA和药学上可接受的载体。
116.一种核酸分子，其包含至少一个编码序列，所述至少一个编码序列编码根据权利要求I至114中任一项所述的T·FcA或TFcBA的重链或轻链。
117.—种核酸分子，其包含至少两个编码序列，其中一个编码序列编码根据权利要求1至114中任一项所述的TFcA或TFcBA的重链，且第二编码序列编码所述TFcBA的轻链。
118.—种载体,其包含一个或多个根据权利要求116或117所述的核酸分子。
119.一种细胞，其包含一种或多种根据权利要求118所述的载体或根据权利要求116或117所述的核酸分子。
120.—种细胞，其包含编码根据权利要求1至114中任一项所述的TFcA或TFcBA的重链的核酸分子和编码所述TFcA或TFcBA的轻链的核酸分子。
121.—种产生TFcA或TFcBA的方法,其包括在表达核酸的条件下培养根据权利要求119或120所述的宿主细胞，以及分离所述TFcA或TFcBA。
122.—种用于产生TFcA或TFcBA的方法，其包括在适合于表达所述TFcA或TFcBA的条件下培养根据权利要求119或120所述的细胞。
123.—种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至120中任一项所述的TFcA或TFcBA、核酸分子或载体。
【文档编号】C07K16/46GK103857700SQ201280049900
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年8月27日 优先权日:2011年8月26日
【发明者】B·哈姆斯, N·科利, A·卢戈维斯科, S·苏, M·格迪 申请人:梅里麦克制药股份有限公司