与gp120蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一组与gp120蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用。该组多肽与gp120蛋白有很强的特异性结合能力，能够实现了对gp120蛋白在低浓度时的检测。该多肽芯片利用表面等离激元共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)原理制备而成，当所有该组多肽分子均与目标发生结合时，判断gp120蛋白存在，减少了实验过程中假阳性结果。此外，本发明还提供包含该组多肽的药物组合物。本发明在HIV感染引起的疾病的诊断方面有重要应用价值。
【专利说明】与gp120蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学【技术领域】，具体涉及与gpl20蛋白结合的多肽、多肽芯片、其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)是因为 感染人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV)而导致免疫缺陷，并发一 系列机会性感染及肿瘤等的综合征。它是一类流行较广，致死率高的疾病。在当前仍然缺 少普适的治疗方法的情况下，尽早地发现人类免疫缺陷病毒，及时地诊断病症，阻断传播途 径,对于减少其危害有着重要的意义。
[0003] HIV可以感染多种细胞，包括在表面表达⑶4分子的T4淋巴细胞、单核巨噬细胞和 树突状细胞等。⑶4分子是HIV入侵细胞的受体，而糖蛋白gpl20在HIV识别⑶4分子的过 程中，发挥着重要的作用。位于HIV囊膜上的gpl20分子会与CD4分子结合，使跨膜糖蛋白 gp41发生构象转变。gp41使HIV与靶细胞膜融合，从而病毒的核衣壳进入细胞。此外，游 离的gpl20分子还能激活体内过量的T细胞及其他的主要免疫细胞，加速HIV病毒的入侵。 故gpl20分子可能是诊断HIV相关疾病的重要靶标分子。以gpl20分子为药物设计靶点， 可能是实现对HIV有效检测与治疗免疫缺陷综合征的一种途径。
[0004] 基于gpl20的分子结构，目前已经开发出了多种相关的抑制剂与单克隆抗体，并 有些基于这些抗体的芯片产生。但是目前用于检测gpl20蛋白的单克隆抗体芯片存在以下 问题：
[0005] (1)使用的单克隆抗体与gp 120蛋白的相互作用力较弱，造成对gp 120蛋白的检出 限较低，传统的gpl20单克隆抗体制备的芯片检出限高于35nM ;
[0006] (2)由于仅基于一种或少数几种gpl20单克隆抗体的阳性结果进行判断，导致实 验过程中较多假阳性结果的产生；
[0007] (3) gpl20单克隆抗体芯片很容易因抗体的构象变化导致抗体失活，芯片失效；
[0008] (4) gpl20单克隆抗体的成本较高，导致gpl20单克隆抗体芯片的成本难以降低， 大规模应用受到限制。
[0009] 因此，针对gpl20蛋白，开发出检出限低、特异性高、性能稳定及成本较低的芯片， 对于HIV病毒的检测具有重要意义。
【发明内容】
[0010] 本发明人经过大量实验和创造性劳动，得到了一组多肽，并发现这组多肽与gpl20 蛋白有很强的特异性结合能力，能够制备成多肽芯片或药物组合物等，应用于诊断或辅助 性诊断HIV感染引起的疾病。
[0011] 本发明提供以下技术方案：
[0012] 在第一方面，本发明提供一种与gpl20蛋白结合的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO :1?9所示的氨基酸序列：
[0013] (I) GGSRADAYRTRVDN (SEQ ID NO ：1)；
[0014] (2)GGTDACVPTRPNPQRV (SEQ ID NO ：2)；
[0015] (3) GGSLffRQSLDPCV (SEQ ID NO ：3)；
[0016] (4)GGVDLTPLCVSLDCTRLDN (SEQ ID NO ：4)；
[0017] (5)GGPDVSFRPIPIDY (SEQ ID NO ：5)；
[0018] (6)GGLARRRVVIDSANFTRNADTII (SEQ ID NO ：6)；
[0019] (7)GGNNDTIIFDQSSGGRPRIVTDS (SEQ ID NO ：7)；
[0020] (8)GGCDIDQIINMWQDVGDAMY (SEQ ID NO :8);和
[0021] (9)GGSRIFDPGGGRM (SEQ ID NO ：9)〇
[0022] 所述多肽可以通过人工化学合成制得，其与gpl20蛋白有很强的特异性结合能 力。
[0023] 在第二方面，本发明提供一种多肽芯片，其包括固定于固相载体上的、能够与 gp 120蛋白结合的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO :1?9所示的氨基酸序列。
[0024] 所述多肽芯片上的多肽与gpl20蛋白有很强的特异性结合能力，可以用于gpl20 蛋白的检测，并据此判断HIV病毒的感染情况。
[0025] 在本发明一个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1?9所示，即包 含上述九条多肽。
[0026] 在第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的多肽芯片的制备方法，利用表面 等离激元共振（Surface Plasmon Resonance, SPR)原理，所述方法包括：
[0027] (1)对固相载体进行预处理，形成备用固相载体；
[0028] (2)将稀释好的所述多肽点样到所述备用固相载体上。
[0029] 在本发明一个实施方案中，所述步骤（1)具体包括：
[0030] (Ia)在SPR芯片表面通过共价键，修饰上一层含羧基的硫醇分子自组装层；
[0031] (Ib)以乙醇清洗SPR芯片表面两次；
[0032] (Ic)使用碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺活化SPR芯片表面，使醇分子自组装层上 的羧基形成不稳定的琥珀酰亚胺酯；
[0033] (Id)以乙醇清洗SPR芯片表面两次。
[0034] 在本发明一个实施方案中，所述步骤（2 )还包括对所述多肽进行预处理，及点样后 的处理；具体地，所述步骤（2)包括：
[0035] (2a)将链霉亲和素与N端修饰生物素的多肽分子按摩尔比为1 :1的比例混合，且 混合后链霉亲和素的质量浓度为lmg/mL，形成链霉亲和素-多肽混合液；
[0036] (2b)将0· 2 μ L链霉亲和素-多肽混合液滴在SPR芯片表面，以gpl20的单克隆抗 体作为阳性对照，取〇. 2 μ L滴在SPR芯片表面；
[0037] (2c)以乙醇胺封闭表面未参与反应的琥珀酰亚胺酯与双硫醇上的羧基；
[0038] (2d)以乙醇清洗SPR芯片表面两次；
[0039] (2e)将SPR芯片用微流控膜封装，装入SPR仪器中；
[0040] (2f)以0· 5% (体积比）磷酸与I X PBS (磷酸盐缓冲液)反复交替清洗SPR芯片表 面，直到SPR芯片表面的固定相SPR信号保持平稳为止；
[0041] (2g)以IXPBS作为解离相，以0. 5%(体积比）磷酸作为重生液，测试SPR芯片对 gp 120的IXPBS溶液的响应。
[0042] 本发明还提供一种多参数检测样品中gpl20蛋白的方法，包括如下步骤：
[0043] (1)同时记录所述多肽芯片上所设计的多肽在通过样品时的SPR信号；
[0044] (2)当九条多肽（SEQ ID NO :1?9)都能产生吸附峰信号时，证明样品中存在 gpl20。
[0045] 本发明提供的与gpl20蛋白有强相互作用的多肽序列，其一级结构序列中同源性 较低，可能对应于gpl20蛋白表面不同的结合位点。只有当九条多肽分子均与目标发生结 合时，才判断gpl20蛋白的存在，这在一定程度上减少了实验过程中假阳性结果的产生。
[0046] 在第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面所述 的多肽，还可以包括任选的可药用载体。
[0047] 在第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的多肽、如第二方面所述的多肽芯 片或如第四方面所述的药物组合物在制备用于诊断或辅助性诊断HIV感染引起的疾病的 药物中的应用。
[0048] 本发明的有益效果为：
[0049] (1)本发明提供的多肽与gp 120蛋白的亲和力强，实现了对gp 120蛋白在低浓度时 的检测，基于所述多肽制备的多肽芯片可以检出4nM的gpl20蛋白，而传统的gpl20单克隆 抗体制备的芯片检出限高于35nM，本发明多肽芯片可辅助临床准确诊断HIV相关疾病；
[0050] (2)本发明提供的多肽芯片只有当九条多肽分子均与目标发生结合时，才判断 gpl20蛋白的存在，这在一定程度上减少了实验过程中假阳性结果的产生；
[0051] (3)本发明提供的多肽相比gpl20单克隆抗体的稳定性高，不会发生由于构象变 化导致的失活，芯片的效期更长；
[0052] (4)本发明提供的多肽相比gpl20单克隆抗体成本更低，可以大规模应用；
[0053] (5)本发明提供的多肽对于gpl20相关疾病的多肽类先导化合物的发现和预测， 提供药物母核的设计模型，并为已有的药物结构改造提供参考依据与标准；
[0054] (6)本发明提供的靶向gpl20分子的多肽序列可以被应用于通过酶联免疫吸附方 法、表面等离激元共振技术、石英振动微天平技术分析、飞行时间质谱及等温滴定微量热检 测gpl20 ;此外，本发明提供的靶向gpl20分子的多肽可以经过量子点修饰、荧光素基团修 饰及辣根过氧化物酶修饰等用于酶联免疫吸附、荧光发射光谱及紫外吸收光谱等分析方法 中检测gp 120分子。
【专利附图】
【附图说明】
[0055] 图1为基于本发明开发的多肽120-1?120-9、24-5及gpl20单克隆抗体与gpl20 的结合解离过程的SPR曲线。其中：图Ia为gpl20单克隆抗体与gpl20结合解离过程的 SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gpl20的SPR信号；图Ib为24-5、链霉亲和素（SA)共 混体系与gpl20结合解离过程的SPR曲线；图Ic为120-1、SA共混体系与gpl20结合解离 过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gpl20的SPR信号；图Id为120-2、SA共混体系 与gpl20结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gpl20的SPR信号；图Ie为 gl20-3、SA共混体系与gpl20结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gpl20的 SPR信号；图If为120-4、SA共混体系与gpl20结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照 24-5对gpl20的SPR信号；图Ig为120-5、SA共混体系与gpl20结合解离过程的SPR曲 线，已扣除阴性对照24-5对gpl20的SPR信号；图Ih为120-6、SA共混体系与gpl20结合 解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gpl20的SPR信号；图Ii为120-7、SA共混 体系与gpl20结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gpl20的SPR信号；图Ij 为120-8、SA共混体系与gpl20结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gpl20 的SPR信号；图Ik为120-9、SA共混体系与gpl20结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对 照24-5对gpl20的SPR信号。其中，" 表示gpl20浓度为4· 3nM对应的曲线；" "表 示gpl20浓度为8. 7nM对应的曲线；" "表示gpl20浓度为17. 3nM对应的曲线；" " 表示gpl20浓度为34. 7nM对应的曲线；" "表示gpl20浓度为69. 3nM对应的曲线。
[0056] 图2为基于本发明开发的多肽120-1?120-9及gpl20单克隆抗体与1 μ g/mL的 gp 120、gp41和p24解离过程中的平衡态下的吸附量的SPR相应值，其中，"国"表示1 μ g/ mL gpl20对应的柱状图；" ? '，，表示1 μ g/mL gp41对应的柱状图；《丨：，，表示1 μ g/mL p24对应的柱状图。
【具体实施方式】
[0057] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理 解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用 试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0058] 实施例1 :检测溶液中的gD120与芯片表面多狀的结合解离动力学讨稈
[0059] 1、按照表1所示的序列合成多肽，实验中按照需要稀释成合适的浓度。
[0060] 表1合成的多肽
[0061]
【权利要求】
1. 一种与gpl20蛋白结合的多肽，其特征在于，所述多肽具有选自SEQ ID NO :1?9所 示的氨基酸序列。
2. -种多肽芯片，其特征在于，所述多肽芯片包括固定于固相载体上的、能够与gpl20 蛋白结合的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO :1?9所示的氨基酸序列。
3. 根据权利要求2所述的多肽芯片，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1?9所示。
4. 一种如权利要求2或3所述的多肽芯片的制备方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 对固相载体进行预处理，形成备用固相载体； (2) 将稀释好的所述多肽点样到所述备用固相载体上。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)具体包括： (la) 在SPR芯片表面通过共价键，修饰上一层含羧基的硫醇分子自组装层； (lb) 以乙醇清洗SPR芯片表面两次； (lc) 使用碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺活化SPR芯片表面，使醇分子自组装层上的羧 基形成不稳定的琥珀酰亚胺酯； (ld) 以乙醇清洗SPR芯片表面两次。
6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)还包括对所述多肽进行 预处理，及点样后的处理；具体地，所述步骤（2)包括： (2a)将链霉亲和素与N端修饰生物素的多肽分子按摩尔比为1 :1的比例混合，且混合 后链霉亲和素的质量浓度为lmg/mL，形成链霉亲和素-多肽混合液； (2b)将0. 2 μ L链霉亲和素-多肽混合液滴在SPR芯片表面，以gpl20的单克隆抗体作 为阳性对照，取0. 2 μ L滴在SPR芯片表面； (2c)以乙醇胺封闭表面未参与反应的琥珀酰亚胺酯与双硫醇上的羧基； (2d)以乙醇清洗SPR芯片表面两次； (2e)将SPR芯片用微流控膜封装，装入SPR仪器中； (2f)以0. 5% (体积比）磷酸与1 XPBS反复交替清洗SPR芯片表面，直到SPR芯片表面 的固定相SPR信号保持平稳为止； (2g)以1XPBS作为解离相，以0. 5%(体积比）磷酸作为重生液，测试SPR芯片对gpl20 的1 XPBS溶液的响应。
7. -种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1所述的多肽。
8. -种如权利要求1所述的多肽、如权利要求2或3所述的多肽芯片或如权利要求7 所述的药物组合物在制备用于诊断或辅助性诊断HIV感染引起的疾病的药物中的应用。
【文档编号】C07K7/08GK104292304SQ201310298450
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】王琛, 王晨轩, 王艳梅, 朱劲松, 杨延莲 申请人:国家纳米科学中心