与gp41蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一组与gp41蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用。该组多肽与gp41蛋白有很强的特异性结合能力，能够实现了对gp41蛋白在低浓度时的检测。该多肽芯片利用表面等离激元共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)原理制备而成，当所有该组多肽分子均与目标发生结合时，判断gp41蛋白存在，减少了实验过程中假阳性结果。此外，本发明还提供包含该组多肽的药物组合物。本发明在HIV感染引起的疾病的诊断方面有重要应用价值。
【专利说明】与gp41蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学【技术领域】，具体涉及与gp41蛋白结合的多肽、多肽芯片、其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)是因为 感染人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV)而导致免疫缺陷，并发一 系列机会性感染及肿瘤等的综合征。它是一类流行较广，致死率高的疾病。在当前仍然缺 少普适的治疗方法的情况下，尽早地发现人类免疫缺陷病毒，及时地诊断病症，阻断传播途 径,对于减少其危害有着重要的意义。
[0003] HIV可以感染多种细胞，包括在表面表达⑶4分子的T4淋巴细胞、单核巨噬细胞和 树突状细胞等。⑶4分子是HIV入侵细胞的受体，而糖蛋白gp41介导了 HIV病毒与⑶4细 胞的融合，从而使HIV进入细胞内。以gp41分子为药物设计靶点，可能是实现对HIV有效 检测与治疗获得性免疫缺陷综合征的一种途径。
[0004] 基于gp41的分子结构，目前已经开发出了多种相关的抑制剂与单克隆抗体，并有 些基于这些抗体的芯片产生。但是目前用于检测gp41蛋白的单克隆抗体芯片存在以下问 题：
[0005] (1)使用的单克隆抗体与gp41蛋白的相互作用力较弱，造成对gp41蛋白的检出限 较低，传统的gp41单克隆抗体制备的芯片检出限高于200nM ;
[0006] (2)由于仅基于一种或少数几种gp41单克隆抗体的阳性结果进行判断，导致实验 过程中较多假阳性结果的产生；
[0007] (3) gp41单克隆抗体芯片很容易因抗体的构象变化导致抗体失活，芯片失效；
[0008] (4) gp41单克隆抗体的成本较高，导致gp41单克隆抗体芯片的成本难以降低，大 规模应用受到限制。
[0009] 因此，针对gp41蛋白，开发出检出限低、特异性高、性能稳定及成本较低的芯片， 对于HIV病毒的检测具有重要意义。
【发明内容】
[0010] 本发明人经过大量实验和创造性劳动，得到了一组多肽，并发现这组多肽与gp41 蛋白有很强的特异性结合能力，能够制备成多肽芯片或药物组合物等，应用于诊断或辅助 性诊断HIV感染引起的疾病。
[0011] 本发明提供以下技术方案：
[0012] 在第一方面，本发明提供一种与gp41蛋白结合的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO :1?7所示的氨基酸序列：
[0013] (l)GGLDAIRAQQDL (SEQ ID NO ：1)；
[0014] (2)GGSNDSLRQIWNDTTWMRWRDRI (SEQ ID NO :2);
[0015] (3)GGIDSLIRRSQN (SEQ ID NO ：3)；
[0016] (4) GGffRRLDSLCLFSYDDLDRLL (SEQ ID NO ：4)；
[0017] (5) GGTDIVRLLGDDGffRALDY (SEQ ID NO ：5)；
[0018] (6)GGSQRLDNS (SEQ ID NO :6);和
[0019] (7)GGNNLLDAIRAQQDL (SEQ ID NO ：7)〇
[0020] 所述多肽可以通过人工化学合成制得，其与gp41蛋白有很强的特异性结合能力。
[0021] 在第二方面，本发明提供一种多肽芯片，其包括固定于固相载体上的、能够与gp41 蛋白结合的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO :1?7所示的氨基酸序列。
[0022] 所述多肽芯片上的多肽与gp41蛋白有很强的特异性结合能力，可以用于gp41蛋 白的检测，并据此判断HIV病毒的感染情况。
[0023] 在本发明一个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1?7所示，即包 含上述七条多肽。
[0024] 在第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的多肽芯片的制备方法，利用表面 等离激元共振（Surface Plasmon Resonance, SPR)原理，所述方法包括：
[0025] (1)对固相载体进行预处理，形成备用固相载体；
[0026] (2)将稀释好的所述多肽点样到所述备用固相载体上。
[0027] 在本发明一个实施方案中，所述步骤（1)具体包括：
[0028] (Ia)在SPR芯片表面通过共价键，修饰上一层含羧基的硫醇分子自组装层；
[0029] (Ib)以乙醇清洗SPR芯片表面两次；
[0030] (Ic)使用碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺活化SPR芯片表面，使醇分子自组装层上 的羧基形成不稳定的琥珀酰亚胺酯；
[0031] (Id)以乙醇清洗SPR芯片表面两次。
[0032] 在本发明一个实施方案中，所述步骤（2 )还包括对所述多肽进行预处理，及点样后 的处理；具体地，所述步骤（2)包括：
[0033] (2a)将链霉亲和素与N端修饰生物素的多肽分子按摩尔比为1 :1的比例混合，且 混合后链霉亲和素的质量浓度为lmg/mL，形成链霉亲和素-多肽混合液；
[0034] (2b)将0· 2 μ L链霉亲和素-多肽混合液滴在SPR芯片表面，以gp41的单克隆抗 体作为阳性对照，取〇. 2 μ L滴在SPR芯片表面；
[0035] (2c)以乙醇胺封闭表面未参与反应的琥珀酰亚胺酯与双硫醇上的羧基；
[0036] (2d)以乙醇清洗SPR芯片表面两次；
[0037] (2e)将SPR芯片用微流控膜封装，装入SPR仪器中；
[0038] (2f)以0· 5% (体积比）磷酸与I X PBS (磷酸盐缓冲液)反复交替清洗SPR芯片表 面，直到SPR芯片表面的固定相SPR信号保持平稳为止；
[0039] (2g)以IXPBS作为解离相，以0. 5%(体积比）磷酸作为重生液，测试SPR芯片对 gp41的IXPBS溶液的响应。
[0040] 本发明还提供一种多参数检测样品中gp41蛋白的方法，包括如下步骤：
[0041] (1)同时记录所述多肽芯片上所设计的多肽在通过样品时的SPR信号；
[0042] (2)当七条多肽（SEQ ID NO :1?7)都能产生吸附峰信号时，证明样品中存在 gp41。
[0043] 本发明提供的与gp41蛋白有强相互作用的多肽序列，其一级结构序列中同源性 较低，可能对应于gp41蛋白表面不同的结合位点。只有当七条多肽分子均与目标发生结合 时，才判断gp41蛋白的存在，这在一定程度上减少了实验过程中假阳性结果的产生。
[0044] 在第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面所述 的多肽，还可以包括任选的可药用载体。
[0045] 在第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的多肽、如第二方面所述的多肽芯 片或如第四方面所述的药物组合物在制备用于诊断或辅助性诊断HIV感染引起的疾病的 药物中的应用。
[0046] 本发明的有益效果为：
[0047] (1)本发明提供的多肽与gp41蛋白的亲和力强，实现了对gp41蛋白在低浓度时的 检测，基于所述多肽制备的多肽芯片可以检出50nM的gp41蛋白，而传统的gp41单克隆抗 体制备的芯片检出限高于200nM，本发明多肽芯片可辅助临床准确诊断HIV相关疾病；
[0048] (2)本发明提供的多肽芯片只有当七条多肽分子均与目标发生结合时，才判断 gp41蛋白的存在，这在一定程度上减少了实验过程中假阳性结果的产生；
[0049] (3)本发明提供的多肽相比gp41单克隆抗体的稳定性高，不会发生由于构象变化 导致的失活，芯片的效期更长；
[0050] (4)本发明提供的多肽相比gp41单克隆抗体成本更低，可以大规模应用；
[0051] (5)本发明提供的多肽对于gp41相关疾病的多肽类先导化合物的发现和预测，提 供药物母核的设计模型，并为已有的药物结构改造提供参考依据与标准；
[0052] (6)本发明提供的靶向gp41分子的多肽序列可以被应用于通过酶联免疫吸附方 法、表面等离激元共振技术、石英振动微天平技术分析、飞行时间质谱及等温滴定微量热检 测gp41 ;此外，本发明提供的靶向gp41分子的多肽可以经过量子点修饰、荧光素基团修饰 及辣根过氧化物酶修饰等用于酶联免疫吸附、荧光发射光谱及紫外吸收光谱等分析方法中 检测gp41分子。
【专利附图】
【附图说明】
[0053] 图1为基于本发明开发的多肽41-1?41-7、24_5及gp41单克隆抗体与gp41的 结合解离过程的SPR曲线。其中：图Ia为gp41单克隆抗体与gp41结合解离过程的SPR曲 线，已扣除阴性对照24-5对gp41的SPR信号；图Ib为24-5、链霉亲和素（SA)共混合体系 与gp41结合解离过程的SPR曲线；图Ic为41-1、SA共混合体系与gp41结合解离过程的 SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gp41的SPR信号；图Id为41-2、SA共混合体系与gp41 结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gp41的SPR信号；图Ie为41-3、SA共 混合体系与gp41结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gp41的SPR信号；图 If为41-4、SA共混合体系与gp41结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gp41 的SPR信号；图Ig为41-5、SA共混合体系与gp41结合解离过程的SPR曲线，已扣除阴性对 照24-5对gp41的SPR信号；图Ih为41-6、SA共混合体系与gp41结合解离过程的SPR曲 线，已扣除阴性对照24-5对gp41的SPR信号；图Ii为41-7、SA共混合体系与gp41结合解 离过程的SPR曲线，已扣除阴性对照24-5对gp41的SPR信号。其中，" 表示gp41浓度 为12. 9nM对应的曲线；" _ "表示gp41浓度为25. 4nM对应的曲线；"*，，表示gp41浓度 为50. 7nM对应的曲线；表示gp41浓度为IOlnM对应的曲线；"?，，表示gp41浓度为 203nM对应的曲线。
[0054] 图2为基于本发明开发的多肽41-1?41-7及gp41单克隆抗体与4. 2 μ g/mL的 gp41和p24解离过程中的平衡态下吸附量的SPR相应值，其中，" _ "表示4. 2 μ g/mL p24 对应的柱状图；" O "表示4. 2 μ g/mL gp41对应的柱状图。
【具体实施方式】
[0055] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理 解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用 试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0056] 实施例1 :检测溶液中的gD41与芯片表面多狀的结合解离动力学讨稈
[0057] 1、按照表1所示的序列合成多肽，实验中按照需要稀释成合适的浓度。
[0058] 表1合成的多肽
[0059]
【权利要求】
1. 一种与gp41蛋白结合的多肽，其特征在于，所述多肽具有选自SEQ ID NO :1?7所 示的氨基酸序列。
2. -种多肽芯片，其特征在于，所述多肽芯片包括固定于固相载体上的、能够与gp41 蛋白结合的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO :1?7所示的氨基酸序列。
3. 根据权利要求2所述的多肽芯片，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :1?7所示。
4. 一种如权利要求2或3所述的多肽芯片的制备方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 对固相载体进行预处理，形成备用固相载体； (2) 将稀释好的所述多肽点样到所述备用固相载体上。
5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1)具体包括： (la) 在SPR芯片表面通过共价键，修饰上一层含羧基的硫醇分子自组装层； (lb) 以乙醇清洗SPR芯片表面两次； (lc) 使用碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺活化SPR芯片表面，使醇分子自组装层上的羧 基形成不稳定的琥珀酰亚胺酯； (ld) 以乙醇清洗SPR芯片表面两次。
6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)还包括对所述多肽进行 预处理，及点样后的处理；具体地，所述步骤（2)包括： (2a)将链霉亲和素与N端修饰生物素的多肽分子按摩尔比为1 :1的比例混合，且混合 后链霉亲和素的质量浓度为lmg/mL，形成链霉亲和素-多肽混合液； (2b)将0. 2 μ L链霉亲和素-多肽混合液滴在SPR芯片表面，以gp41的单克隆抗体作 为阳性对照，取0. 2 μ L滴在SPR芯片表面； (2c)以乙醇胺封闭表面未参与反应的琥珀酰亚胺酯与双硫醇上的羧基； (2d)以乙醇清洗SPR芯片表面两次； (2e)将SPR芯片用微流控膜封装，装入SPR仪器中； (2f)以0. 5% (体积比）磷酸与1 XPBS反复交替清洗SPR芯片表面，直到SPR芯片表面 的固定相SPR信号保持平稳为止； (2g)以1XPBS作为解离相，以0. 5%(体积比）磷酸作为重生液，测试SPR芯片对gp41 的1 XPBS溶液的响应。
7. -种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1所述的多肽。
8. -种如权利要求1所述的多肽、如权利要求2或3所述的多肽芯片或如权利要求7 所述的药物组合物在制备用于诊断或辅助性诊断HIV感染引起的疾病的药物中的应用。
【文档编号】C07K7/08GK104292303SQ201310298420
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】王琛, 王晨轩, 王艳梅, 朱劲松, 杨延莲 申请人:国家纳米科学中心